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Biology

Imagem semi-automatizada de Fluorescência de tecidos específicos em embriões Zebrafish

Published: May 17, 2014 doi: 10.3791/51533

Summary

Descrito aqui é um protocolo para a imagem semi-automatizada de fluorescência de tecido específico em embriões de peixe-zebra.

Abstract

Embriões de peixe-zebra são uma poderosa ferramenta para a triagem em larga escala de pequenas moléculas. Zebrafish transgênicos que expressam proteínas repórter fluorescentes são freqüentemente usados ​​para identificar os produtos químicos que modulam a expressão do gene. Telas químicas que ensaio de fluorescência no peixe-zebra ao vivo muitas vezes dependem de caros, equipamentos especializados para rastreio de alto conteúdo. Nós descrevemos um procedimento usando um microscópio de epifluorescência padrão com um palco motorizado a imagem automaticamente embriões de peixes-zebra e detectar a fluorescência de tecido específico. Usando zebrafish transgênicos que relatam a atividade do receptor de estrogênio via expressão de GFP, foi desenvolvido um processo semi-automatizado para triagem de ligantes do receptor de estrogênio que ativam o repórter de uma forma específica de tecido. Neste vídeo, descrevemos os procedimentos para arraying embriões de peixe-zebra em 24-48 horas pós fertilização (hpf) em uma placa de 96 poços e adicionando pequenas moléculas que se ligam receptores de estrogênio. Em 72-96 hpf, imagens de cada poço a partir detoda a placa são coletados automaticamente e inspecionados manualmente para fluorescência de tecido específico. Este protocolo demonstra a capacidade para detectar os estrogénios que activam os receptores de válvulas cardíacas, mas não no fígado.

Introduction

Paulistinha transgênico foram desenvolvidos que permitem a visualização direta de atividade em vias de sinalização, como fatores de crescimento de fibroblastos 1, o ácido retinóico 2 e 3 estrógenos, em embriões vivos. Estas ferramentas permitem o rastreio de produtos químicos que perturbam as vias de sinalização (ensaiado como uma mudança na intensidade de fluorescência) ou por produtos químicos que modulam a sinalização de um modo específico do tecido (alteração na fluorescência de localização) 4. Captura de imagem automatizado aumenta a taxa de transferência de telas químicas dramaticamente 5,6. Telas que fluorescência automaticamente ensaio no peixe-zebra ao vivo muitas vezes dependem de caros, equipamentos especializados. O chamado de triagem de alto teor fornece o benefício de alta resolução, imagens quantitativas, mas ao custo de usar leitores de placas especializadas equipadas para microscopia confocal 7,8. O objectivo deste método é a fluorescência específica de tecido automaticamente ensaio em embriões de peixe-zebraem uma placa de 96 poços, utilizando um microscópio de epifluorescência padrão. Fluorescência de tecidos específicos podem ser distinguidos utilizando esta técnica e pode ser uma abordagem razoável para laboratórios que não têm acesso a leitores de placas especializadas ou equipamentos de alta teor de triagem.

Neste protocolo, usamos de imagens automatizado para detectar receptor de estrogênio tecido específico (ER) agonistas em peixe-zebra ao vivo em três dias após a fertilização (dpf). A linhagem transgênica Tg (5xERE: GFP) c262/c262 contém 5 seqüências em tandem de resposta de estrogênio elementos de DNA (ERE) a montante da proteína verde fluorescente (GFP) 3. Na ausência de ligando, ERs são normalmente inactivos. Ligação do ligante desencadeia uma mudança conformacional, permitindo que os receptores para ligar DNA ERE e regulam a transcrição 9. 5xERE: peixe GFP pode ser utilizado para pesquisar bibliotecas químicas para moduladores de ER e pode ser utilizado para rastrear as amostras de água do meio ambiente para os contaminantes estrogênicos.

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Protocol

NOTA: Este protocolo foi aprovado pela Universidade de Alabama em Comitê Animal Care e Use Institucional Birmingham.

1. Breeding Zebrafish e ovo Coleções

  1. Três dias antes do início da exposição a produtos químicos, montar tanques de criação com divisórias para machos e fêmeas separados. Encha cada metade do caminho tanque com água do sistema de aquicultura. Usando uma rede, transferir Tg (5xERE: GFP) peixe c262/c262 para tanques de criação, colocando 2 machos e 3 fêmeas em cada tanque separado por uma divisória. Coloque uma tampa em cada tanque e etiqueta com data e as tensões a serem cruzados.
  2. Na manhã seguinte, retire todas as barreiras e inclinação defletores para criar uma área rasa em uma extremidade do tanque de criação. Permitir peixe-zebra para acasalar, a coleta de embriões em intervalos de 10 min para garantir a encenação de desenvolvimento precisa. Ovos limpos lavando através de um coador de chá usando E3B médio e lave delicadamente embriões em placas de Petri. Retornar peixes adultos para permanentetanques.
  3. Usando um microscópio de dissecação, classificar, contar, e remover todos os embriões não fertilizados, anormais ou danificados. Coloque embriões em placas de Petri em E3B médio e casa de 28,5 ° C, com 14:10 de luz: ciclo de escuro. Densidade de embriões pode afetar o desenvolvimento. Coloque no máximo 100 embriões em um prato de 100 mm x 35 e não mais de 50 embriões em um prato mm 60 x 15.
  4. Por 24 hpf, substituir a mídia com E3B contendo 200 mM 1-fenil-2-tiouréia (PTU). PTU evita a formação de pigmento e mantém embriões de peixes-zebra e larvas transparente para melhorar a nitidez da imagem. CUIDADO: estoque PTU concentrado é perigoso; usar luvas ao fazer solução E3B + PTU.
  5. Em 1 º dia pós fertilização (dpf), remover manualmente o córion de cada embrião usando uma pinça fina. O córion não parece afetar a penetração de estrogênios, porém remoção aumenta a nitidez da imagem. Não há necessidade de remover córions da mídia. NOTA: Como alternativa ao dechorionation manual, lotes de embriões pode ser checamente dechorionated utilizando 1 mg / mL de pronase de tratamento, como anteriormente descrito 11.

2. Química Tratamento de embriões

  1. No dia antes do tratamento, preparam-se soluções de estoque de cada produto químico, na concentração de 1000 vezes em DMSO (ou num solvente adequado). Por exemplo, para expor os embriões a 10 uM de bisfenol A (BPA), preparar uma solução de estoque 10 mM de BPA em 100% de DMSO. Isto assegura a concentração de DMSO uniforme em cada tratamento e permite uma diluição 1:1.000 não-tóxico de DMSO para servir como um controlo do veículo. As soluções de armazenar a -20 ° C. Para este protocolo, os embriões serão expostos a 1 uM e 10 uM de BPA, 18,5 nM e 1,85 uM de genisteína, 367 nM de estradiol (controlo positivo) e veículo (DMSO a 0,1%, de controlo negativo).
    ATENÇÃO: Produtos químicos, como BPA e estradiol são perigosos e podem ter efeitos deletérios sobre o feto humano. Lidar com disruptores endócrinos com cuidado e use sempre equipamento de protecção individual adequado.
  2. No dia do tratamento, descongele preparadas soluções químicas de ações. Dilui-se 1:1000 pipetando 1 ml + E3B PTU para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e a adição de 1 ml de solução de estoque de produtos químicos. Vortex vigorosamente. Dilui-se 1:1000 em DMSO + E3B PTU como um controlo do veículo. Use 1 mL + E3B PTU num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, como um controlo não tratado.
  3. Usando uma pipeta de transferência de plástico grande furo, embriões de transferência a partir de placas de Petri para cada poço de uma placa de 96 poços, 3 embriões por poço, 3 poços por condição. Para evitar a evaporação durante o tratamento prolongado, omitir embriões de linhas exteriores e as colunas da placa (linhas A e E, as colunas 1 e 12). Poços exteriores podem ser preenchidos com 300 ul de E3B + PTU. Rotular a tampa da placa de forma adequada.
  4. Remova a mídia de cada poço com uma fina ponta da pipeta de transferência de plástico. Trabalhe rapidamente para evitar a secagem dos embriões.
  5. Adicionar 200 ul de solução de tratamento em cavidade correspondente. Coloque a tampa underneath a placa como um guia para assegurar a adição de tratamentos para os poços apropriados. Vortex cada tubo antes da pipetagem para distribuir o produto químico em solução. Confirmar visualmente cada embrião é na solução de tratamento. Se os embriões estão do lado do poço, utilizar uma pipeta de transferência limpa para lavá-los para dentro do poço, com a solução de tratamento.
  6. Colocar a placa na incubadora a 28,5 ° C. Embriões serão analisados ​​quanto à fluorescência no 72 hpf.

3. Automated imagem de embriões em placas de 96 poços

  1. Anestesiar os embriões por adição de 10 uL de 4 mg / ml tricaina a cada poço.
    NOTA: Anestesie embriões antes da imagem. Na 24-96 hpf, peixe-zebra exibem movimento espontâneo e uma resposta de sobressalto para a fonte de luz mudando durante a captura da imagem. Anestesiar embriões reduz o movimento durante o exame.
  2. Colocar a placa de 96 poços na plataforma motorizada e calibrar o palco. Usando 2011 software para microscopia automatica Zeiss Zen Azulon e controle, selecione a opção transportadora amostra e selecione multiwell 96. Selecione Calibrar. Siga as instruções passo a passo para calibrar o palco.
    NOTA: Não desmarque o botão azulejos após esta etapa. Se o botão de telhas é desmarcada, as configurações de calibragem podem ser perdidos ea placa de 96 poços terão de ser recalibrado.
  3. Usando uma objetiva de 10x eo campo claro (BF) definir, identificar um embrião controle positivo e definir as configurações de exposição adequadamente para BF e canais de GFP, certificando-se que o sinal de fluorescência não está saturando a câmera. Concentre-se em um único embrião e programar o microscópio para adquirir 3 total de Z-seções, uma imagem 50 mm acima e outra 50 mm abaixo do plano focal atual.
    NOTA: Uma vez que os tecidos diferentes ocupam diferentes planos focais, o que irá garantir que para cada peixe-zebra imagens são capturadas com o coração eo fígado em foco.
  4. Defina os parâmetros de software para adquirir uma imagem em mosaico usando GFP e BF channels. Sob a guia de aquisição, selecionar a configuração avançada. Selecionar as regiões de azulejos, então telhas. Escolha a opção de círculo bem.
    NOTA: ladrilhos é usada para criar uma imagem composta de cada poço. Um campo de visão-single captura apenas uma pequena parte de cada poço. A função de azulejos pode capturar automaticamente várias adjacente campos de visão de cada poço, criando uma imagem composta de todo o bem. Por conseguinte, é possível captar automaticamente 96 imagens compostas por placa, em que cada imagem composta contém várias dezenas de imagens individuais a partir de um único poço.
  5. Escolha operadora e preencher fator de 90%. A seleção de um fator de preenchimento de 90% irá capturar várias imagens dos poços selecionados de tal forma que 90% da área de cada poço será visível na imagem composta.
    NOTA: Ao selecionar o fator de preenchimento, um diagrama será exibido representando a área a ser trabalhada. Selecione uma porcentagem que vai incluir a área do poçoque é apropriado para a experiência.
  6. Em Opções, selecione a quantidade de sobreposição desejado.
    NOTA: Quando costurando telhas para uma única imagem representativa, uma sobreposição de 5-10% permite uma costura suave entre imagens. No entanto, se a imagem de costura é necessário, utilizando uma sobreposição 0% irá reduzir o tempo de imagiologia. Utilização de factor de enchimento de 90% e 5% de sobreposição, uma imagem composta de um único poço consiste de 59 imagens individuais.
  7. Comece imagem. O microscópio irá adquirir automaticamente as imagens.
  8. Inspeccionar manualmente imagens compostas de cada poço para fluorescência específica de tecido (Figura 1).
  9. NOTA: É melhor começar com o controle positivo para confirmar que a exposição a substâncias químicas trabalhou antes de observar poços de tratamento experimental.

4. Manual de captura de imagem de Embriões em placa de 96 poços

NOTA: Para confirmar os resultados, use uma objetiva de 20x distância de trabalho longa para acquire imagens mais detalhadas manualmente (Figura 2).

  1. Usando uma objetiva de 20x eo campo claro (BF) definir, identificar um embrião controle positivo e definir as configurações de exposição para os canais de BF e GFP adequadamente, certificando-se que o sinal de fluorescência não está saturando a câmera.
  2. Identificar embriões individuais e capturar imagens manualmente.
    NOTA: Uma vez que as configurações de exposição foram selecionados para o embrião controle positivo, não alteram as configurações. Esta permite uma comparação da intensidade de fluorescência para cada imagem é capturada em condições uniformes.

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Representative Results

A Figura 1 mostra imagens compósitas a partir de poços individuais de uma placa de 96 poços. Cada imagem composta é composta de 59 imagens individuais com 5% de imagem de sobreposição. Note-se que o peixe-zebra vivos são orientadas aleatoriamente dentro de cada poço, ainda que são capazes de distinguir da fluorescência no coração a partir do fígado. Imagens de campo claro, são úteis como referências para avaliar a orientação peixe-zebra e visualizar anormalidades morfológicas (Figuras 1A e 1C). Imagem automatizada usando uma objetiva de 10x é utilizado para rastrear produtos químicos e determinar que merecem avaliação manual, com uma ampliação superior. Figura 2 mostra imagens capturadas com uma objetiva de 20x longa distância de trabalho para análise mais detalhada. Estas imagens foram tiradas logo após a varredura automática descrito na Figura 1 sem remover a placa do estágio do microscópio. Utilizando uma objectiva de 20x, a fluorescência no coração pode ser localizado com exactidão val coraçãoves (Figuras 2C-2F). Ocasionalmente, a orientação dos embriões pode ser sub-óptimas para a captação de imagens e pode conduzir a resultados ambíguos. Colocar 3 zebrafish por poço e realizar cada tratamento em triplicata (protocolo passo 2.3) oferece múltiplas oportunidades para visualizar fluorescência com precisão.

Figura 1
. Figura 1 automatizada de imagem composta revela fluorescência específica de tecido das válvulas do coração e fígado de campo claro (A, C) e fluorescentes (B, DH) as imagens de Tg (5xERE: GFP). C262/c262 embriões tratados com produtos químicos indicados aos 2 dias pós fertilização (DPF) e fotografada em 3 dpf. Cada painel mostra uma imagem composta de um único poço (composta de 59 imagens individuais com 5%sobreposição) a partir de uma placa de 96 poços. A e B, os embriões foram incubadas em DMSO 0,1% (controlo de veículo) são GFP-negativo. CH, Embriões incubadas com 100 ng / ml 17β-estradiol (E2), 1,85 uM de genisteína (gen) , ou 10 pM de fluorescência BPA exposição nas válvulas cardíacas (setas) e no fígado (pontas de seta), os embriões tratados com 18,5 nM gen ou 1 uM BPA exibem fluorescência em válvulas cardíacas, mas não hepática. B ', imagem digital ampliada de uma única larva da região em caixa no painel B. D', digitalmente imagem ampliada da região em caixa do painel D, e assim por diante. Barra de escala = 500 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
.. g> Figura 2 visualização detalhada das válvulas cardíacas GFP positivas Tg (5xERE: GFP) c262/c262 embriões expostos aos produtos químicos indicados na placa de 96 poços (ver Figura 1) foram fotografadas manualmente em uma ampliação maior, permitindo a visualização da GFP em as válvulas atrioventriculares (setas) e as válvulas aórticas (setas) do coração. B, D e fluorescência de campo claro imagens mescladas. Todas as imagens são vista lateral, anterior à esquerda e dorsal ao topo. Barra de escala = 50 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este protocolo descreve um método simples para automaticamente a imagem de fluorescência de tecido específico em embriões de peixe-zebra. O protocolo foi desenvolvido utilizando uma Zeiss Axio Observer. Z1 com software Zen azul 2011, no entanto, a técnica pode ser adaptada usando qualquer microscópio invertido com uma platina motorizada e software de controlo do microscópio que possa realizar a telha para criar imagens compostas. Equipar um microscópio invertido com um palco motorizado pode fornecer uma alternativa prática, menos dispendioso para a compra de equipamentos especializados para triagem de alto conteúdo. Estágios motorizados variam de alguns milhares a dezenas de milhares de dólares, dependendo da marca e modelo do microscópio e qualidade do palco.

Há vários passos críticos no âmbito do protocolo. Alguns produtos químicos são sensíveis à luz, por isso, pode ser benéfico para incubar os embriões no escuro, durante o tratamento. Embriões de peixe-zebra são sensíveis à dessecação. Portanto, para químicomais de um dia cal exposições duração é crítica para encher os poços ao longo das bordas da placa de 96 poços com meio para limitar a evaporação (protocolo passo 2.3).

É também importante assegurar que a fase é cuidadosamente calibrado (passo protocolo 3.2). Um erro comum é colocar a placa para o palco sem assegurar a placa completamente. Neste caso, a posição da placa na fase pode mudar quando o palco se move, o que poderia causar alguns poços a ser trabalhada parcialmente ou não em todos. Quando imagiologia várias placas em sucessão, isto não é absolutamente necessário recalibrar a fase para cada placa, enquanto as placas são do mesmo fabricante e estão todos colocados na fase em orientações idênticas.

Ao definir os parâmetros de azulejos de imagem automáticos (protocolo passo 3.5), certifique-se de que a maioria de cada poço será trabalhada. Às 3 dpf e mais velhos, larvas de peixe-zebra tendem a se posicionar perto das bordas da well, por conseguinte, recomenda-se um factor de enchimento de 90%, para garantir que as margens de cada poço vai ser visualizado. No entanto, quanto maior for o factor de enchimento maior o tempo de aquisição de imagem.

É possível executar um algoritmo de costura em imagens compostas para melhorar a resolução. Se um algoritmo de costura deve ser realizada, em seguida, definir os parâmetros de azulejos para incluir uma imagem de sobreposição de 5-10% (protocolo passo 3.6). Quanto maior a sobreposição, melhor o desempenho do algoritmo de costura. Em alguns casos, uma sobreposição de 10% pode permitir costura para produzir uma imagem informativa para análise que não exija a visualização utilizando uma objectiva de ampliação maior. No entanto, quanto maior a sobreposição da aquisição de imagem já terá, como mais imagens serão capturadas por poço. Uma sobreposição de 0% podem ser usados ​​para reduzir o tempo de aquisição de imagem e para minimizar a exposição à luz fluorescente e fotobranqueamento. Neste caso, a captura de imagens mais detalhadas de poços selecionados usando um objecti 20xve (Figura 2).

Tempo de captura de imagem para este protocolo vai depender dos parâmetros experimentais. A aquisição de imagens utilizando os parâmetros neste protocolo (fator de preenchimento de 90%, 5% de sobreposição, três z-seções por imagem capturada e um tempo de exposição de 50 ms para o canal de GFP e um ms para o canal de campo claro) leva três minutos e 50 segundo por poço. Portanto, é possível para a tela 60 poços, em três horas e 50 minutos. É possível para a tela 180 poços por dia, ou de 60 compostos únicos, em triplicado.

Este protocolo permite imagens automatizado para fluorescência específica do tecido, mas tem várias limitações. Widefield imagens de fluorescência não tem a resolução de imagem confocal usado em muitas técnicas de triagem de alto conteúdo. Além disso, a fluorescência de quantificação é difícil devido à alta variabilidade na orientação de cada peixe-zebra dentro de um poço. Isso poderia ser evitado pela imagem do peixe-zebra em uniformecondições de orientação, por exemplo, usando moldes ou microplacas com poços que forçam embriões de peixe-zebra em orientações uniformes 5,10. O tempo de aquisição de imagem limita o número de poços que podem ser rastreados por dia a 180. Screening 180 poços por dia é uma melhoria significativa sobre a imagem manual. No entanto, os métodos típicos de elevada capacidade pode rastrear uma média de 10.000 poços por dia, mas requerem estações de trabalho complexos e caros.

Este protocolo representa uma alternativa prática, menos dispendioso para a triagem de alto teor que pode ser facilmente adaptado por laboratórios com um microscópio de fluorescência invertida de campo amplo. O método de imagiologia aqui descrito permite a análise de fluorescência específica para um tecido de embriões que não foram cuidadosamente montadas ou orientada, que melhora drasticamente a velocidade e a facilidade de preparação da amostra. Imagens compostas podem ser arquivados para referência. Este protocolo foi desenvolvido para permitir high-throughput screening of ligantes do receptor de estrogênio de tecidos específicos de bibliotecas químicos e amostras de água ambiental. Alternativamente, este protocolo de imagem podia ser utilizado para rastrear qualquer repórter fluorescente para a actividade específica de tecido.

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Disclosures

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Agradecemos Susan Farmer e os funcionários do centro de pesquisa do peixe-zebra UAB para cuidado zebrafish. O financiamento é fornecido pelos fundos de start-up do Departamento de Farmacologia e Toxicologia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plastic transfer pipettes; wide bore Fisher 13-711-23
Plastic transfer pipettes; fine tip Fisher 13-711-26
96-well, round, flat bottom plates Fisher 21-377-203
100 x 35 mm plates Fisher 08-757-100D
35 x 60 mm plates Fisher 08-757-100B
Dumont #5 fine forceps Fine Science Tools 11254-20 tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos
Tricaine methanesulfonate Sigma Aldrich A5040-25G see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) 
1-phenyl 2-thiourea (PTU) Sigma Aldrich P7629-10G Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B 
Zeiss Axio Observer Z1 Carl Zeiss Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage
20x long working distance objective Carl Zeiss We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance
Axiocam HRm digital camera Carl Zeiss
ZenBlue 2011 microscope control software Carl Zeiss Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage
Methylene Blue Sigma Aldrich MB-1; 25 grams make 2% solution in RO water for use in E3B (below)
E3B 60X E3 SOLUTION:
NaCl                    - 17.2 grams
KCl                       - 0.76 grams
CaCl2-2H2O     - 2.9 grams
MgSO4-7H2O  - 4.9 grams or MgSO4 - 2.39 grams
Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle.

1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH:
60X E3      150 ml
2% methylene blue     100 μl 
Bring to 9 liters with Milli-Q water
 

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References

  1. Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens. BMC Developmental Biology. 7, 62 (2007).
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Romano, S. N., Gorelick, D. A.More

Romano, S. N., Gorelick, D. A. Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (87), e51533, doi:10.3791/51533 (2014).

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