Summary
Descrito aquí es un protocolo para la formación de imágenes semiautomático de la fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra.
Abstract
Embriones de pez cebra son una poderosa herramienta para el cribado a gran escala de las moléculas pequeñas. Pez cebra transgénico que expresan proteínas fluorescentes reportero se utilizan con frecuencia para identificar productos químicos que modulan la expresión génica. Pantallas químicas que ensayo de fluorescencia en el pez cebra en vivo a menudo dependen de un equipo costoso, especializado para el cribado de alto contenido. Se describe un procedimiento utilizando un microscopio de epifluorescencia estándar con una platina motorizada a la imagen automáticamente embriones de pez cebra y detectar la fluorescencia específica del tejido. El uso de pez cebra transgénico que reportan la actividad del receptor de estrógeno a través de la expresión de GFP, hemos desarrollado un procedimiento semi-automático para la detección de ligandos del receptor de estrógeno que activan el reportero en una manera específica de tejido. En este video se describen los procedimientos para poner en orden embriones de pez cebra a las 24-48 horas después de la fecundación (HPF) en una placa de 96 pocillos y la adición de pequeñas moléculas que se unen a receptores de estrógeno. En 72-96 HPF, las imágenes de cada pocillo detoda la placa se recogen de forma automática y la inspección manual de la fluorescencia específica del tejido. Este protocolo demuestra la capacidad para detectar los estrógenos que activan los receptores en las válvulas del corazón, pero no en el hígado.
Introduction
Pez cebra transgénico se han desarrollado que permite la visualización directa de la actividad en las vías de señalización, tales como factores de crecimiento de fibroblastos 1, el ácido retinoico 2 y 3 estrógenos, en embriones vivos. Estas herramientas permiten la detección de productos químicos que perturban las vías de señalización (ensayada como el cambio en la intensidad de fluorescencia) o para los productos químicos que modulan la señalización de una manera específica de tejido (el cambio en la localización de la fluorescencia) 4. Captura de imagen automatizada aumenta el rendimiento de las pantallas químicas dramáticamente 5,6. Pantallas que la fluorescencia de ensayo de forma automática en el pez cebra en vivo a menudo dependen de un equipo caro y especializado. La llamada de cribado de alto contenido proporciona el beneficio de alta resolución, formación de imágenes cuantitativo pero a costa de la utilización de lectores de placas especializadas equipadas para microscopía confocal 7,8. El objetivo de este método es automáticamente ensayo de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebraen una placa de 96 pocillos usando un microscopio de epifluorescencia estándar. La fluorescencia específica del tejido se puede distinguir usando esta técnica y puede ser un enfoque razonable para los laboratorios que no tienen acceso a lectores de placas o equipos especializados-alto contenido de cribado.
En este protocolo, utilizamos imágenes automatizado para detectar los receptores de estrógenos específico de tejido (ER) agonistas en el pez cebra en vivo en 3 días después de la fertilización (dpf). La línea transgénica Tg (5xERE: GFP) c262/c262 contiene 5 secuencias en tándem de respuesta de estrógeno de elementos de ADN (ERE) aguas arriba de la proteína verde fluorescente (GFP) 3. En ausencia de ligando, el ERS son normalmente inactivo. La unión del ligando provoca un cambio conformacional, permitiendo que los receptores de unirse al ADN y regulan la transcripción ERE 9. 5xERE: peces GFP se pueden utilizar para cribar bibliotecas químicas para moduladores de ER y se pueden utilizar para cribar muestras de agua ambiental para los contaminantes estrogénicos.
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Protocol
NOTA: Este protocolo fue aprobado por la Universidad de Alabama en Comité de Cuidado de Animales y el empleo Institucional Birmingham.
1. Cría de pez cebra y huevo Colecciones
- Tres días antes de comenzar la exposición a sustancias químicas, montar tanques de cría con separadores a hombres y mujeres por separado. Rellene cada mitad del tanque con agua del sistema de acuicultura. El uso de una red, transferencia de TG (5xERE: GFP) peces c262/c262 a los tanques de cría, la colocación de 2 machos y 3 hembras en cada tanque separados por un divisor. Coloque una tapa en cada tanque y la etiqueta con la fecha y cepas para ser cruzados.
- A la mañana siguiente, eliminar todos los obstáculos e inclinación desconcierta para crear una zona de poca profundidad en un extremo del tanque de cría. Permita que el pez cebra para aparearse, recogiendo embriones a intervalos de 10 minutos para asegurar la puesta en escena del desarrollo preciso. Huevos limpios de enjuague a través de un colador de té utilizando medio E3B y embriones suavemente rasantes en placas de Petri. Volver a los peces adultos permanentetanques.
- El uso de un microscopio de disección, clasificar, contar y eliminar cualquier embrión no fecundados, anormales o dañados. Coloque los embriones en placas de Petri en medio E3B y la casa de 28,5 ° C con una luz 14:10: oscuridad ciclo. Densidad de embriones puede afectar el desarrollo. Coloque no más de 100 embriones en una placa de 100 mm x 35 y no más de 50 embriones en una placa de 60 mm x 15.
- Por 24 HPF, sustitución de los medios con E3B contiene 200 M 1-fenil-2 tiourea (PTU). PTU impide la formación de pigmento y mantiene embriones de pez cebra y larvas transparentes para mejorar la claridad de la imagen. PRECAUCIÓN: concentrado PTU valores es peligroso; usar guantes al realizar solución E3B + PTU.
- A después de la fecundación de 1 día (dpf), quite manualmente el corion de cada embrión utilizando unas pinzas finas. El corion no parece afectar a la penetración de los estrógenos, sin embargo la eliminación mejora la claridad de la imagen. No hay necesidad de eliminar chorions de los medios de comunicación. NOTA: Como alternativa a dechorionation manual, lotes de embriones pueden ser chemicamente dechorionated utilizando 1 mg / ml de pronasa tratamiento, como se ha descrito previamente 11.
2. Tratamiento Químico de Embriones
- El día antes del tratamiento, preparar soluciones madre de cada producto químico a una concentración 1.000 veces en DMSO (o disolvente apropiado). Por ejemplo, para exponer los embriones a 10 M bisfenol A (BPA), preparar una solución de 10 mM de BPA en 100% de DMSO. Esto asegura concentración de DMSO en cada tratamiento uniforme y permite una dilución 1:1000 no tóxico de DMSO para servir como un control del vehículo. Soluciones de tienda de existencias a -20 ° C. Para este protocolo, los embriones estarán expuestos a 1 M y 10 M de BPA, 18,5 nM y 1,85 M genisteína, 367 nM de estradiol (control positivo) y el vehículo (0,1% de DMSO, control negativo).
PRECAUCIÓN: Los productos químicos como BPA y estradiol son peligrosos y pueden tener efectos nocivos sobre el feto humano. Maneje los disruptores endocrinos con cuidado y use siempre el equipo de protección personal adecuado. - En el día del tratamiento, deshielo prepara soluciones químicas de las acciones. Diluir 1:1.000 con la pipeta 1 ml E3B + PTU en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y añadir 1 l de solución madre química. Vortex vigorosamente. Diluir DMSO 1:1.000 en E3B + PTU como un control del vehículo. Utilice 1 ml E3B + PTU en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml como control no tratado.
- El uso de un gran pipeta de transferencia de plástico orificio, embriones de transferencia de placas de Petri en cada pocillo de una placa de 96 pocillos, 3 embriones por pocillo, 3 pocillos por condición. Para evitar la evaporación durante el tratamiento prolongado, omita los embriones de filas y columnas exteriores de la placa (filas A y E, columnas 1 y 12). Pocillos externos se pueden llenar con 300 l de E3B + PTU. Etiquetar la tapa placa adecuada.
- Retire el medio de cada pocillo con una pipeta de transferencia de plástico de punta fina. Trabaje con rapidez para evitar la desecación de los embriones.
- Añadir 200 l de solución de tratamiento en pocillo correspondiente. Coloque la tapa underneath la placa como una guía para asegurar Además de los tratamientos en los pocillos apropiados. Vortex cada tubo antes de dispensar para distribuir el producto químico en solución. Confirmar visualmente cada embrión es en la solución de tratamiento. Si los embriones están en el lado del pozo, utilizar una pipeta de transferencia limpia para lavarlos en el pozo con la solución de tratamiento.
- Colocar la placa en la incubadora a 28,5 ° C. Se analizarán los embriones de fluorescencia a 72 HPF.
3. Automated Imaging de embriones en placas de 96 pocillos
- Anestesie embriones mediante la adición de 10 l de 4 mg / ml de tricaína a cada pocillo.
NOTA: Anestesie embriones antes de la formación de imágenes. En 24-96 HPF, el pez cebra exhiben movimiento espontáneo y una respuesta de sobresalto a la fuente de luz cambia durante la captura de imágenes. Anestesiar embriones reduce el movimiento durante el procedimiento. - Coloque la placa de 96 pocillos en la etapa motorizada y calibrar la etapa. Usando Zeiss Zen Azul 2011 software para automáticamente microscopíaencendido y de control, seleccione la opción de soporte de muestras y seleccione multiwell 96. Seleccione Calibrar. Siga las instrucciones paso a paso para calibrar el escenario.
NOTA: No desactive el botón de azulejos después de este paso. Si el botón de azulejos está seleccionada, los ajustes de calibración se pueden perder y necesitarán la placa de 96 pocillos ser recalibrado. - Utilizando un objetivo de 10x y el campo claro (BF) establecer, identificar un embrión de control positivo y establecer los ajustes de exposición apropiadamente para BF y canales de GFP, asegurándose de que la señal de fluorescencia no está saturando la cámara. Centrarse en un solo embrión y programar el microscopio para adquirir 3 Z-secciones en total, una imagen de 50 m por encima y otro por debajo de 50 micras el plano focal actual.
NOTA: Debido a los diferentes tejidos ocupan diferentes planos focales, esto asegurará que se capturan para cada imagen de pez cebra con el corazón y el hígado en el enfoque. - Establezca los parámetros de software para adquirir una imagen de mosaico utilizando GFP y BF channels. En la pestaña de adquisición, seleccionar Configuración avanzada. Seleccione las regiones de azulejos, a continuación, azulejos. Elija la opción círculo también.
NOTA: baldosas se utiliza para crear una imagen compuesta de cada pocillo. Un campo de visión de un solo capta sólo una pequeña porción de cada pocillo. La función de mosaico puede capturar de forma automática múltiples adyacentes campos de visión de cada pozo, creando una imagen compuesta de todo el pozo. Por lo tanto, es posible capturar automáticamente 96 imágenes compuestas por placa, donde cada imagen compuesta contiene varias docenas de imágenes individuales de un solo pozo. - Seleccione la compañía y el factor de llenado del 90%. Selección de un factor de llenado de 90% será capturar múltiples imágenes de los pocillos seleccionados tal que el 90% de la superficie de cada pocillo será visible en la imagen compuesta.
NOTA: Al seleccionar factor de relleno, un diagrama se muestra que representa el área a explorar. Seleccione un porcentaje que incluirá el área del pozoque es apropiado para el experimento. - En Opciones, seleccione la cantidad de superposición deseado.
NOTA: Cuando la costura de azulejos para una sola imagen representativa, una superposición de 5 a 10% permite una costura lisa entre las imágenes. Sin embargo, si la imagen de costura es innecesaria, utilizando un solapamiento de 0% reducirá el tiempo de formación de imágenes. El uso de 90% de factor de relleno y 5% de superposición, una imagen compuesta de un solo pozo consta de 59 imágenes individuales. - Iniciar la formación de imágenes. El microscopio adquirirá automáticamente las imágenes.
- Inspeccionar manualmente las imágenes compuestas de cada pocillo para la fluorescencia específico de tejido (Figura 1).
- NOTA: Es mejor comenzar con el control positivo para confirmar que la exposición química trabajó antes de la observación de los pozos de tratamiento experimental.
4. Manual Image Capture de embriones de 96 pocillos Placa
NOTA: Para confirmar los resultados, utilice un objetivo de 20x larga distancia de trabajo de acqui si las imágenes más detalladas manualmente (Figura 2).
- Usando un objetivo de 20x y el campo claro (BF) establecer, identificar un embrión de control positivo y establecer los ajustes de exposición para los canales de BF y GFP adecuadamente, asegurándose de que la señal de fluorescencia no está saturando la cámara.
- Identificar embriones individuales y capturar imágenes de forma manual.
NOTA: Una vez que los ajustes de la exposición han sido seleccionadas por el embrión de control positivo, no modifique los ajustes. Esto permite una comparación de la intensidad de fluorescencia a medida que cada imagen se captura en condiciones uniformes.
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Representative Results
La Figura 1 muestra imágenes compuestas a partir de pocillos individuales de una placa de 96 pocillos. Cada imagen compuesta se compone de 59 imágenes individuales con 5% imagen de superposición. Tenga en cuenta que el pez cebra en vivo están orientadas aleatoriamente dentro de cada pocillo, sin embargo, son capaces de distinguir la fluorescencia en el corazón desde el hígado. Imágenes de campo claro son útiles como referencias para evaluar la orientación del pez cebra y visualizar anormalidades morfológicas (Figuras 1A y 1C). Imágenes automatizada utilizando un objetivo de 10x se utiliza para detectar los productos químicos y determinar que garantiza la evaluación manual con un mayor aumento. Figura 2 muestra las imágenes capturadas con un objetivo de 20x larga distancia de trabajo para un análisis más detallado. Estas imágenes fueron tomadas directamente después de la exploración automatizado representado en la figura 1 sin la eliminación de la placa de la platina del microscopio. Usando un objetivo de 20x, la fluorescencia en el corazón puede ser localizado con precisión a Val corazónves (Figuras 2C-2F). De vez en cuando, la orientación de los embriones puede ser sub-óptimo para la captura de imágenes y puede llevar a resultados ambiguos. Colocar 3 pez cebra por pozo y la realización de cada tratamiento por triplicado (paso protocolo 2.3) proporciona múltiples oportunidades para visualizar la fluorescencia con precisión.
. Figura 1 Automatizado de imágenes compuesto revela la fluorescencia específica del tejido en las válvulas del corazón y el hígado de campo claro (A, C) y fluorescente (D, DH) imágenes de Tg (5xERE: GFP). C262/c262 embriones tratados con productos químicos indicados en 2 días después fertilización (dpf) y fotografiada en 3 dpf. Cada panel muestra una imagen compuesta de un solo pocillo (compuesta de 59 imágenes individuales con 5%superposición) de una placa de 96 pocillos. A y B, los embriones incubados en 0,1% DMSO (control del vehículo) son-GFP negativo. CH, Los embriones se incubaron con 100 ng / ml 17β-estradiol (E2), 1,85 M genisteína (gen) , o 10 mM BPA fluorescencia de exposiciones en las válvulas del corazón (flechas) y hepáticas (puntas de flecha), los embriones tratados con 18,5 nM gen o 1 M BPA exhiben fluorescencia en las válvulas del corazón, pero no en el hígado. B ', imagen ampliada digitalmente de una sola larva de la región en caja en el panel B. D', una imagen ampliada digitalmente de la región en caja del grupo D, y así sucesivamente. Barra de escala = 500 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo describe un método directo para automáticamente una imagen de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra. El protocolo fue desarrollado utilizando un Zeiss Axio Observer. Z1 con el software de Zen Azul 2011, sin embargo, la técnica se puede adaptar usando cualquier microscopio invertido con una platina motorizada y software de control de microscopio que puede realizar suelo de baldosas para crear imágenes compuestas. Equipar a un microscopio invertido con una platina motorizada puede proporcionar una práctica alternativa, menos costosa para la compra de equipo especializado para el cribado de alto contenido. Etapas motorizados van desde varios miles a decenas de miles de dólares, dependiendo de la marca y el modelo del microscopio y la calidad de la etapa.
Hay varios pasos críticos dentro del protocolo. Algunos productos químicos son sensibles a la luz, por lo que puede ser beneficioso para incubar los embriones en la oscuridad durante el tratamiento. Embriones de pez cebra son sensibles a la desecación. Por lo tanto, para ChemiCal exposiciones más de un día de duración es crítico para llenar los pozos a lo largo de los bordes de la placa de 96 pocillos con medios para limitar la evaporación (paso protocolo 2.3).
También es importante asegurarse de que la etapa se calibra cuidadosamente (paso protocolo 3.2). Un error común es colocar la placa en el escenario sin fijar la placa por completo. En este caso, la posición de la placa en el escenario puede cambiar cuando la etapa se mueve, lo que podría causar algunos pozos para ser reflejado parcialmente o nada en absoluto. Cuando varias placas de formación de imágenes en sucesión, no es absolutamente necesario volver a calibrar el escenario para cada placa, siempre y cuando las placas son del mismo fabricante y están colocados en la etapa en orientaciones idénticas.
Al establecer los parámetros de segmentación de imagen automáticos (paso protocolo 3.5), asegúrese de que la mayoría de cada pozo se va a ver. En 3 dpf y mayores, larvas de pez cebra tienden a posicionarse cerca de los bordes de la WELl, por lo tanto, se recomienda un factor de llenado de 90% para asegurar que los bordes de cada pocillo se visualizaron. Sin embargo, cuanto mayor es el factor de llenado más largo el tiempo de adquisición de la imagen.
Es posible llevar a cabo un algoritmo de costura en imágenes compuestas para mejorar la resolución. Si un algoritmo de costura se va a realizar, a continuación, establecer parámetros de mosaico para incluir una imagen de superposición 5-10% (paso protocolo 3.6). Cuanto mayor sea el solapamiento, mejor será el rendimiento del algoritmo de costura. En algunos casos, un solapamiento de 10% puede permitir la costura para producir una imagen informativa para el análisis que no requiere adicionalmente a la visualización utilizando un objetivo de mayor aumento. Sin embargo, cuanto mayor es la superposición de la adquisición de la imagen ya tendrá, como más imágenes serán capturadas por pocillo. Un solapamiento de 0% puede ser utilizado para reducir el tiempo de adquisición de la imagen y para minimizar la exposición de luz fluorescente y fotoblanqueo. En este caso, la captura de imágenes más detalladas de los pozos seleccionados mediante un obje 20xve (Figura 2).
Imagen hora de captura de este protocolo depende de los parámetros del experimento. La adquisición de imágenes usando los parámetros de este protocolo (factor de llenado del 90%, el 5% de superposición, tres z secciones por imagen capturada y un tiempo de exposición de 50 ms para el canal de las buenas prácticas agrarias y 1 ms para el canal de campo claro) toma tres minutos y cincuenta segundos por pocillo. Por lo tanto, es posible detectar 60 pozos en tres horas y cincuenta minutos. Es factible a la pantalla 180 pocillos por día, o 60 compuestos únicos en triplicado.
Este protocolo permite formación de imágenes automatizado para el tejido de fluorescencia específica pero tiene varias limitaciones. Imágenes de fluorescencia de campo amplio carece de la resolución de imagen confocal se utiliza en muchas de las técnicas de selección de alto contenido. Además, la cuantificación de la fluorescencia es difícil debido a la alta variabilidad en la orientación de cada pez cebra dentro de un pozo. Esto podría evitarse mediante la formación de imágenes de pez cebra bajo uniformecondiciones de orientación, por ejemplo mediante el uso de moldes o microplacas con pozos que obligan a embriones de pez cebra en orientaciones uniformes 5,10. El tiempo de adquisición de imagen limita el número de pozos que pueden ser seleccionados por día a 180. Screening 180 pocillos por día es una mejora significativa sobre formación de imágenes manual. Sin embargo, los métodos típicos de alto rendimiento pueden detectar un promedio de 10 000 pozos por día pero requieren estaciones de trabajo complejas y costosas.
Este protocolo representa una práctica alternativa, menos costoso para el cribado de alto contenido que puede ser adaptado fácilmente por los laboratorios con un microscopio de fluorescencia de campo amplio invertida. El método de formación de imágenes se describe aquí permite el análisis de la fluorescencia específica de tejido en los embriones que no se han montado o orientada cuidadosamente, lo que mejora drásticamente la velocidad y facilidad de preparación de la muestra. Las imágenes compuestas pueden ser archivados para referencia. Este protocolo fue desarrollado para permitir el cribado de alto rendimiento of tejidos específicos de ligandos del receptor de estrógeno de las bibliotecas químicas y de las muestras de agua del medio ambiente. Alternativamente, este protocolo de formación de imágenes se podría usar para detectar cualquier indicador fluorescente para la actividad específica de tejido.
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Disclosures
Los autores no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Damos las gracias a Susan Farmer y el personal del centro de investigación de la UAB pez cebra para el cuidado de pez cebra. Financiamiento proporcionado por los fondos de puesta en marcha del Departamento de Farmacología y Toxicología.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic transfer pipettes; wide bore | Fisher | 13-711-23 | |
| Plastic transfer pipettes; fine tip | Fisher | 13-711-26 | |
| 96-well, round, flat bottom plates | Fisher | 21-377-203 | |
| 100 x 35 mm plates | Fisher | 08-757-100D | |
| 35 x 60 mm plates | Fisher | 08-757-100B | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma Aldrich | A5040-25G | see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629-10G | Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B |
| Zeiss Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage | |
| 20x long working distance objective | Carl Zeiss | We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance | |
| Axiocam HRm digital camera | Carl Zeiss | ||
| ZenBlue 2011 microscope control software | Carl Zeiss | Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage | |
| Methylene Blue | Sigma Aldrich | MB-1; 25 grams | make 2% solution in RO water for use in E3B (below) |
| E3B | 60X E3 SOLUTION: NaCl - 17.2 grams KCl - 0.76 grams CaCl2-2H2O - 2.9 grams MgSO4-7H2O - 4.9 grams or MgSO4 - 2.39 grams Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 60X E3 150 ml 2% methylene blue 100 μl Bring to 9 liters with Milli-Q water |
References
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