Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تقييم مساهمات أنواع محددة لتنمية الجمجمة عن طريق الوهم السمان بطة

Published: May 31, 2014 doi: 10.3791/51534
Automatic Translation
1, 1
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California at San Francisco

Summary

توضح هذه المقالة طريقة لتوليد أجنة خيالية التي تم تصميمها لاختبار المساهمات أنواع محددة من قمة العصبية و / أو الأنسجة الأخرى في التنمية القحفي.

Abstract

توليد أجنة خيالية هو نهج واسع النطاق وقوية لدراسة مصير الخلايا والتفاعلات الأنسجة، والمساهمات أنواع محددة إلى النسيجي والتنمية المورفولوجية للأجنة الفقاريات. على وجه الخصوص، وقد أنشأت استخدام الأجنة خيالية على أهمية قمة العصبية في توجيه التشكل أنواع محددة من مجمع القحفي. الطريقة الموصوفة هنا يستخدم اثنين من أنواع الطيور والبط والسمان، مع مختلف بشكل ملحوظ التشكل القحفي. هذا الأسلوب يسهل كثيرا من التحقيق في تنظيم الجزيئية والخلوية من نمط أنواع محددة في مجمع القحفي. تجارب في السمان والبط الأجنة خيالية وقد كشفت بالفعل العصبية التفاعلات الأنسجة بوساطة قمة والسلوكيات خلية مستقلة التي تنظم نمط أنواع محددة في الهيكل العظمي القحفي، الجهاز العضلي، وإهاب. التنوع الكبير في المشتقات قمة العصبية تقترح إمكانية كبيرةللتطبيقات المستقبلية لنظام خيالية السمان بطة لفهم تطور الفقاريات، والمرض، والتطور.

Introduction

الهيكل العظمي الوجه يتطور من النمو واندماج العمليات الوجه المتعددة التي تتكون من قمة العصبية وأرومية متوسطة اللحمة المتوسطة محاطة الأدمة والطبقات الظهارية الأديم الباطن 1-11. تخضع الأحداث التخلق في كل عملية من قبل التفاعلات إشارات متميزة بين اللحمة المتوسطة وظهائر المحيطة 12-16. تعديلات على هذه التفاعلات إشارة و / أو المستجيبات المصب على المساهمة في الظواهر والأمراض قد تكون ذات صلة أيضا تطور الهيكل العظمي القحفي 17، 18. لذلك، توضيح توقيت وطبيعة التفاعلات الأنسجة لديها امكانات كبيرة لزيادة فهمنا للبيولوجيا التطورية والتنموية من الهيكل العظمي في الوجه.

استخدام الأجنة خيالية للتحقيق في التفاعلات الأنسجة لديها تاريخ طويل في البيولوجيا التطورية. كان رائدا هذا النهج هانز سبيمان ومختبرهالذي اكتشف الجنينية "المنظمين" عن طريق زرع أنسجة الأجنة بين الأنواع البرمائية مختلفة. كان سبيمان على درجة الماجستير من التقنيات الجراحية الدقيقة التي تم استكمالها تطوره من الأدوات المتخصصة، ولا سيما ماصة سبيمان مهارات اليد. وكان فيكتور همبرغر وهو طالب دراسات عليا في مختبر هانز سبيمان في فرايبورغ خلال 1920s، وهو عندما أجريت التجارب زرع الأصلية التي أدت إلى جائزة نوبل سبيمان. عندما انتقلت همبرغر لجامعة واشنطن في سانت لويس في عام 1935، وقال انه مفصل عملية صنع micropipette سبيمان في دليل له من علم الأجنة التجريبية 19. كان درو Noden وهو طالب دراسات عليا في مختبر همبرغر في جامعة واشنطن حتى عام 1972، وبعد انتقاله إلى جامعة ماساشوستس، أمهرست ثم إلى جامعة كورنيل، واصلت Noden افتعال وباستخدام بال micropipettes سبيمان لزرع الجراحية التي تنطوي الوهم السمان-الفرخ. و# 160؛ في حين طالب دراسات عليا، واحدة من الكتاب (ريتش شنايدر) تدرب مع درو Noden في جامعة كورنيل 1995-1998 ويستند البروتوكول التالي لصنع micropipette سبيمان على أوصاف مكتوبة من قبل همبرغر وNoden، وتشمل التعديلات اللاحقة التي بواسطة شنايدر.

كان رائدا في استخدام الوهم السمان-الفرخ لدراسة تطوير القحفي وخصوصا لفهم المساهمات من الخلايا العصبية التي كتبها قمة Noden ولو Douarin في أوائل 1970s، استعرض في لو Douarin وآخرون 20. وقد اعتمد هذا النهج على نطاق واسع في العديد من الدراسات والعديد من المحققين الآخرين 1، 4، 5، 21-38. معدلات يعادل النمو والتشكل من السمان وفرخ جعل زرع داخل يجعلها مثالية لدراسة مصير الخلايا وتتبع النسب. ومع ذلك، ونظرا للتشابه بين السمان وفرخ، والتغيرات المورفولوجية دائرة الهجرة والجنسيةuced بواسطة الخلايا المانحة يصعب فك. في المقابل، وشملت غيرها من نظم خيالية الطيور البط المحلية باعتبارها وسيلة لدراسة الآليات التي تجعل الأجنة متميزة تشريحيا 39-50. وبشكل أكثر تحديدا، فإن النظام خيالية السمان بطة يقدم فوائد متعددة لالمميزين آثار المانحة على المضيف، والعكس بالعكس. الأولى، والسمان والبط الأجنة تختلف في حجم الجسم والشكل، والذي يوفر وسيلة مباشرة لاستكشاف أو المانحين آليات المضيف محددة من تشكيل نمط من قبل يعاير للنطاقات الفرق في التعبير الجيني (الشكلان 1 A و B). الثانية، والسمان والبط الأجنة لديهم معدلات مختلفة إلى حد كبير من النضج، مع السمان تفقيس في 17 يوما والبط تفقيس في 28 يوما. يحافظ على قمة العصبية المزروعة معدل نضوج الجوهرية في إطار البيئة المضيفة، وبالتالي، تحديد التغيرات الزمانية في التعبير الجيني، والتفاعلات الأنسجة، وتكون الأنسجة، والتشكل من الممكن51-57. وأخيرا، فإن الأجسام المضادة النووية المضادة للالسمان (س ¢ PN) يسمح المانحة والمضيفة المساهمات الخلوية لتكون متميزة عن بعضها البعض بشكل دائم من خلال الاعتراف البروتين الذي يتم التعبير بتواجد مطلق في خلايا السمان ولكن غاب عن خلايا بطة.

Protocol

1. إعداد الإبر التنغستن

  1. قطع قضيب التنغستن في نصف باستخدام قواطع للاسلاك بحيث قضيب لا ينحني.
  2. الموضوع قضيب حتى نهاية مدبب من 5 3/4 في الزجاج البورسليكات باستور ماصة.
  3. ترك حوالي 3/4 في قضيب الشائكة للخروج من الزجاج، والتمسك قضيب لغيض ماصة مع حبة صغيرة من "لاصقة تذوب الساخنة" (HMA)، وهو عصا الغراء يستخدم لمسدس الغراء. وHMA ينبغي ذاب سريعا في لهب الكحول، مع الحرص على عدم حرق الغراء وتوليد الدخان الاسود.
  4. باستخدام زوج من ملقط، ثني غيض من قضيب التنغستن (حوالي 1/4 في نهاية من أعلى) حتى يتم التوصل إلى زاوية 45 درجة.
  5. عقد ماصة باستور، ووضع حوالي 1/8 في لغيض من قضيب التنغستن في لهب الشعلة البروبان. عقد غيض ثابت ومتعامدة تماما مع اللهب.
  6. سحب الإبرة من اللهب لحظة بقعة صغيرة من البرتقال tungsعشرة الذباب الخروج من إبرة.

2. إعداد سبيمان الماصات

  1. باستخدام موقد بنسن، تسخين نهاية ضيقة من ماصة باستور الزجاج حتى ما بعد فترة وجيزة من تفتق يبدأ في الذوبان. إزالة من اللهب وسحب غيض حتى يصبح مختومة ماصة. تأكد أنه لا يزال هناك جزء من جزء مدبب يحتوي على ما يقرب من OD 0،7-1،0 مم. كسر نهاية أغلقت حوالي 4 سم من تفتق.
  2. نعلق حوالي 2 قدم (60 سم) من أنابيب مطاطية لواسعة (مفتوح) نهاية ماصة. ضربة على الطرف الآخر من الأنبوب المطاطي لضمان عدم وجود الهواء يمكن أن تمر من خلال جزء مدبب من ماصة باستور.
  3. باستخدام اسطوانة الوقود البروبان مع تعلق لهب الشعلة قلم رصاص، وتسخين مساحة البيضاوي على جانب واحد من ماصة أسفل بداية تفتق. ضربة الهواء بلطف شديد ومستمر من خلال أنابيب المطاط مع كمية ضئيلة من الضغط (حوالي كمية الضغط اللازم أن أقول بداية letteص "P" على مستوى محادثة). عندما يصبح الزجاج الناعمة على جانب واحد ويبدأ في مشبك الخارج، وإزالة بسرعة ماصة من اللهب وضربة الثابت والمطرد من خلال أنابيب المطاط. وسوف يسبب هذا الجزء ساخنة من الزجاج لتشكيل فقاعة على شكل النقانق التي قد البوب، التي على ما يرام. إذا كانت فقاعة صغيرة جدا، في محاولة ذوبان وتهب الزجاج مرة أخرى. ينبغي أن يكون نافذة مفتوحة النهائي في الزجاج نحو 0.25 في (6.35 ملم) واسعة بنسبة 0.5 في (12.7 ملم) لفترة طويلة.
  4. مشيرا نهاية مدبب صعودا، كشط فقاعة في حاوية النفايات الزجاجية في حين تهب بلطف من خلال أنابيب لمنع شظايا الزجاج من دخول ماصة.
  5. باستخدام لهب البروبان وحرق الحواف المتبقية من فقاعة والنار البولندية الجانبين من نافذة مفتوحة. والحرص على عدم إذابة رمح ماصة.
  6. باستخدام قلم رصاص نقطة الماس، والنتيجة نهاية مدبب من ماصة حوالي 1.25 في (30 ملم) من النافذة وكسر قبالة الطرفمع ملقط بحيث يتم خفض افتتاح ماصة نظيفة (ماصات مع نصائح تجاهل مكسورة أو غير متساو).
  7. باستخدام ملقط وحافة لهب الموقد من الكحول، وثني الجزء الضيق من ماصة 0.375 في (9.5 ملم) من طرف إلى زاوية من 60 درجة تقريبا بحيث الجزء عازمة هو في الطائرة العمودية عند فتح نافذة هو في موقف 1:00 للاستخدام اليد اليمنى والساعة 11:00 لاستخدام أعسر. تتم هذه الخطوة في أفضل خالية من مشروع ضميمة.
  8. النار تلميع غيض باستخدام لهب الكحول تحت المجهر تشريح. تأكد من عدم إغلاق قبالة الطرف بل تبقي افتتاح الجولة وسلس دون أي انقباض.
  9. قطع 1 في (25 ملم) قطعة من أنابيب المطاط، رش قطعة من الأنابيب مع الايثانول 70٪، وحرك الأنبوب على رمح من ماصة حتى يتم تغطية افتتاح نافذة تماما. هذا يعمل باسم "الحجاب الحاجز" من ماصة سبيمان.
  10. وضع لمبة مل اللاتكس المطاط 2على الجزء السفلي المفتوحة للماصة. يحافظ على لمبة الضغط السلبي في ماصة سبيمان.
  11. لممارسة باستخدام ماصة سبيمان، نقل حبات اللوني حوالي 100-200 ميكرون في القطر من بقعة ملحوظ في واحدة طبق بيتري إلى بقعة ملحوظ في آخر تحت المجهر.
  12. لتنظيف ماصة سبيمان، وإزالة لمبة المطاط ومكان ماصة، تلميح إلى أسفل، في كوب طويل القامة اصطف مع القطن أو الشاش على الجزء السفلي ومملوءة بالماء المقطر والمنظفات والأواني الزجاجية.

3. تعقيم واحتضان البيض

  1. مسح البيض مع الايثانول 70٪ ووضع البيض على أطباق البيض من البلاستيك.
  2. تعيين البيض في حاضنة ساخنة في 37.5 درجة مئوية و 85-87٪.
  3. احتضان البيض حتى تصل HH9.5، ما يقرب من 26 ساعة لالسمان والبط 48 ساعة ل.

4. نافذة بيض

  1. إزالة قطعة صغيرة من الغلاف الخارجي من الجزء العلوي من البيض مع ملقط، مع الحرص على عدم ثقب قذيفة الداخلية مembrane.
  2. باستخدام حقنة مع 18 G بمقدار 1 بوصة إبرة، كزة حفرة في أضيق غيض من البيض وسحب ما يقرب من 1-2 مل من الزلال.
  3. وضع الشريط الشفاف خلال ثقب وثقب علامة في وعاء.
  4. قطع "نافذة" على طول السطح العلوي للبويضة (من خلال الشريط الشفاف) باستخدام مقص المنحني.

5. تصور الأجنة والتحضير للجراحة

  1. باستخدام قضيب الزجاج، وفرشاة بلطف كمية صغيرة من الأحمر محايد (0.02 جم / مل في BSS هانك) على الجنين.
  2. قطع الغشاء المحي وتسحبه على الجنين باستخدام إبرة التنغستن شحذ-اللهب.
  3. إعادة ختم البيض عن طريق وضع شريط شفاف على النافذة.

6. فصل الأنسجة المانحة من الأجنة المانحة

  1. إزالة الشريط من نافذة على بيضة الجنين المانحة.
  2. لخفض أضعاف العصبية من الأديم الظاهر المتاخمة للجنين المانحة، وجعل الشقوق على حد سواء SIDوفاق في الأنبوب العصبي، وذلك باستخدام إبرة التنغستن شحذ-اللهب (المصنعة كما هو موضح أعلاه).
  3. ثم، وقطع عبر الأنبوب العصبي على المستويين الأمامي والخلفي المطلوب من الكسب غير المشروع وفصل الكسب غير المشروع عن بقية الأنبوب العصبي.
  4. إزالة أضعاف العصبية من الجنين المانحة باستخدام ماصة سبيمان أو أي نوع آخر من micropipette.
  5. ثم، قم بإزالة الشريط من نافذة على البيض المضيفة واستخدام ماصة سبيمان لوضع العصبية أضعاف المانحة إلى جانب الجنين المضيف المتاخمة لمنطقة الأنبوب العصبي الذي سيتلقى عملية الزرع.

7. فصل الأنسجة المضيف وزرع الأنسجة المانحة

  1. فصل أضعاف العصبية من الأنبوب العصبي للجنين المضيف، كما فعلت مع الجهة المانحة. الحرص على إزالة الكسب غير المشروع متساوية في الحجم مثل الأنسجة المانحة.
  2. دفع برفق هذا النسيج المضيف بعيدا عن الجنين.
  3. ثم، مع إبرة التنغستن حادة أو مدورة غيض من ميلcropipette، حرك بلطف العصبية المانحة أضعاف في الأنبوب العصبي المضيفة، والحفاظ على التوجهات انتيرو الخلفي وظهراني بطني المناسبة. تأكد من هو مدسوس الكسب غير المشروع في طول الجانبين ولكن تأكد من عدم لكزة أو الأضرار التي لحقت الأنسجة الكامنة. للمساعدة على ابقاء المسار من المذكرة التوجه الأصلي أي التفاوت في الأنسجة المانحة أو تلطيخ التفاضلية من الأحمر لاشئ. نحن أيضا الصور ثيقة الجنين المانحة مع الأنسجة رفعه المصاحبة لها، فضلا عن الوهم على الفور بعد الجراحة.
  4. وينبغي أن يضاف ملحي معقم إلى البويضة إذا تبين الجنين المضيف علامات الجفاف.
  5. الآن، بعناية إعادة الختم وتسمية البيض، وبلطف إعادته إلى حاضنة الرطوبة العالية (70-80٪) حيث يمكن للجنين خيالية تطوير إلى المرحلة المطلوبة للتحليل.

8. مجموعة من الوهم

  1. تأكد من جمع الأجنة خيالية في تقدم طازجة تثبيتي الباردة سيرا ووضعها فورا على ريال عمانيCKER في 4 درجات مئوية لO / N التثبيت. وهذا سوف يسمح لمزيد من الكشف عن الخلايا الحساسة السمان مع الأجسام المضادة لمكافحة السمان.
  2. ليحلل التعبير الجيني عن طريق RT-QPCR، وتجميد الأجنة مباشرة في النيتروجين السائل قبل استخراج الحمض النووي الريبي.

Representative Results

قبل إجراء مزيد من التحليل، وكفاءة عملية الزرع يحتاج إلى أن يعاير. لالنسيجي وتحليل الصرفي، أو التعبير الجيني على عينات الأنسجة، ويجب أن يتم الكشف عن الخلايا المناعية باستخدام السمان التي كتبها س ¢ PN الضد كما هو موضح 36. لتحليلات الحمض النووي الريبي، والمساهمات أنواع محددة لأنسجة الفائدة يمكن حسابها باستخدام إستراتيجية تعتمد PCR-58. بعد أن تم التحقق من صحة فعالية عملية الزرع، يمكن تقييم نتائج المزيد من التدابير الشكلية أو الجزيئية في الوهم. التفاعلات بين الخلايا العصبية قمة المانحة والأنسجة المحيطة المستمدة من المضيفة التي تكمن وراء تكون الأنسجة السليمة والتشكل من مجمع القحفي سبق دراستها على نطاق واسع. على وجه الخصوص، العصبية قمة اللحمة المتوسطة يوجه التشكل أنواع محددة من الوجه 7، 13، 51، 59، 52 نمط الريش، ونمط العضلات 56 تصل>، والغضاريف 53 و 57 من خلال تنظيم التعبير الجيني المضيف. على سبيل المثال، العصبية قمة اللحمة المتوسطة يملي عندما أشكال العظام في الفك السفلي من خلال تنظيم زمنيا BMP4 التعبير 55.

في الآونة الأخيرة، وتركزت التحقيقات على التفاعلات التي تحدث في الأنسجة تطوير القحفي في وقت مبكر جدا. في هذا الصدد، وقد أظهرت التجارب باستخدام الوهم السمان بطة الأجنة المضيفة تؤثر الهجرة قمة العصبية من خلال تحديد الحدود المورفولوجية. وهذا هو، في الأجنة quck خيالية السمان المانحة الخلايا العصبية قمة تهاجر إلى المضيف بطة قوس الفك السفلي في نمط مثل بطة (1D الشكل). على الرغم من هذه المساهمة المضيف لحجم السكان قمة العصبية، لا تزال قمة العصبية المانحة لإنشاء هيكل عظمي الفك السفلي الذي هو في حجم وشكل (الشكل 1E) مثل السمان.

ه 1 "لل: محتوى العرض =" 6in "FO: SRC =" / files/ftp_upload/51534/51534fig1highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/51534/51534fig1.jpg "/>
الشكل 1. السمن بطة نظام همي. (A) السمان و (B) عرض جماجم بطة اختلافات كبيرة في الحجم والشكل، وبالتالي، هي مناسبة بشكل مثالي لاستخدام نظام خيالية لدراسة تطوير القحفي (معدلة من تقية وآخرون 56). (C) تصميم التجريبية لتوليد من جانب واحد الأجنة quck خيالية من مطابقة المرحلة HH9.5 السمان والبط الأجنة. تتم إزالة حظيرة العصبية من جانب واحد من الأجنة السمان وزرعها في أجنة البط بعد قطعة يعادل أضعاف العصبية تمت إزالة (D) الخلايا المانحة السمان (الأخضر) يمكن اتباعها في الوهم باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة السمان (Q ¢ PN) كما هو مبين في عرض بطني من HH12 الجنين خيالية. (F) في الفك السفلي quck في HH38، والسمان المانحة المستمدة ميكل7، ق الغضروف هو أقصر وأكثر استقامة من تلك التي لوحظت لبطة المستمدة من المضيفة غضروف ميكل المقابل، الذي هو أكبر والمنحنية. طبع Tokita آخرون، ديف. الحيوي. 306، 377 (2007) بإذن من السيفير.

Discussion

قمة العصبية هي الخلايا الجنينية السكان عابرة أن يهاجر على نطاق واسع في جميع أنحاء الجنين ويفرق في أنواع الخلايا المتنوعة، بما في ذلك غضروفية وبانيات، التي تسهم في الهيكل العظمي القحفي. وقد ساهم زرع قمة العصبية في النظام خيالية السمان البطة إلى حد كبير في فهمنا للتفاعلات الأنسجة ومسارات الإشارات التي تنظم تطوير الهيكل العظمي القحفي. ومع ذلك، وبالنظر إلى الإمكانات الهائلة للقمة العصبية لتوليد خلايا العضلات الملساء أيضا، الخلايا الشحمية، الخلايا الصباغية، وخلايا شوان، والخلايا العصبية، ونظام الوهم السمان بطة لديها امكانات هائلة لتطبيقات المستقبل، لا سيما بالتزامن مع التقدم السريع في بيولوجيا الخلايا الجذعية والطب التجديدي. منذ السمان والبط وكلاهما الأنواع المرباة تجاريا، وإمدادات جاهزة من البويضات المخصبة غير مكلفة نسبيا هو متاح من مجموعة متنوعة من المزارع. وبالتالي، ينبغي أن تكون هذه التقنية في متناول الأبحاث وراتبها العاملة ضمن مجموعة واسعة من الميزانيات ومساحة المنشأة.

على الرغم من أن هذه التقنية هي قوية جدا، لا تزال هناك العديد من القيود. مثل تقنيات جراحية أخرى، ونوعية وجدوى الوهم السمان بطة الاعتماد على المهارات الجراحية للباحث، وبالتالي، لن يكون هناك اختلاف بين أكثر وداخل الفرد بين التجارب بالمقارنة مع نماذج أخرى، مثل تلك التي تستخدم الماوس علم الوراثة. وعلاوة على ذلك، هناك أيضا تباين في معدلات التنمية ومراحل الأجنة الفردية التي تسهم في استنساخ ونجاح كل زرع. أجنة الطيور هي أيضا عرضة للجفاف وبالتالي تشمل الخطوات الحاسمة أثناء الجراحة الحفاظ على مستويات الضوء المنخفضة، وهي المرة تحت المجهر إلى أدنى حد ممكن، والبيض مختومة بالشمع قدر الإمكان، وارتفاع نسبة الرطوبة في الحاضنة بعد الجراحة ل تجنب الجفاف.

من حيث الجدوى من الوهم، شيو sually بين 50-75٪ البقاء على قيد الحياة، على الرغم من هذه النسب يمكن أن تقلل من كبار السن في مرحلة جمع. في جلسة 4-6 ساعة نموذجية من الجراحة، يمكن للجراح من ذوي الخبرة تولد 10-15 الوهم. نجاح زرع يعتمد أيضا إلى حد كبير على نوعية الأدوات. أدوات جيدة تؤدي إلى أكثر اتساقا، والنتائج استنساخه. باستخدام الشعلة البروبان لجعل الإبر التنغستن يسمح الإبر الحادة للغاية في هذا الشأن. نوع الشعلة تستخدم لإحداث فرق كبير لأنه يتحكم في حجم اللهب. ويمكن أيضا أن تستخدم شحذ كهربائيا، ولكن هذا النهج لا يقترب حتى من إنتاج الإبر الحادة كما. استخدام قضبان التنغستن بدلا من الأسلاك المخزنة مؤقتا بحيث الإبر ويمكن إجراء على التوالي.

وmicropipette سبيمان، في حين تستغرق وقتا طويلا وصعبا لجعل، هو أداة مثالية لنقل الأنسجة. يمكن تخصيص ماصة مع فتحات مختلفة الحجم، ويمكن استخدامها مرارا وتكرارا. وثمة عامل حاسم لالنقيبالجا سبيمان micropipette هو أن يكون بعض السوائل في ماصة قبل لمس طرف على سطح الجنين. وبعض من السائل تتدفق دائما عندما يتم الاتصال مع الغضروف المفصلي على الجنين. الضغط على الحجاب الحاجز يسمح الأنسجة السوائل والكسب غير المشروع يمكن إخراجه بدقة متناهية، في حين أن السماح بارتفاع طفيف على الحجاب الحاجز تمتص بلطف الكسب غير المشروع الأنسجة المانحة في ماصة. الحفاظ على القليل من الضغط الايجابي على الحجاب الحاجز تحافظ على الأنسجة الكسب غير المشروع المانحة في غيض من ماصة أثناء النقل، وضغط إضافية قليلة على الحجاب الحاجز يسمح الأنسجة المانحة الكسب غير المشروع لتوضع عمدا في البلد المضيف.

لحماية ماصة سبيمان أثناء التخزين والتعقيم، وإزالة لمبة من نهاية واسعة وبعناية إدراج غيض مدبب إلى لمبة. وضع ماصة سبيمان في أنبوب اختبار زجاجي، وتغطي الجزء العلوي مع رقائق الألومنيوم، والأوتوكلاف قبل الجراحة. بعد ماصات متعددة هي إعادةعدي المراد تعقيمها مرة أخرى لإجراء عملية جراحية، عكس الماصات، تسخين منهم تقريبا ليغلي في نفس الحل من الماء المقطر والمنظفات والأواني الزجاجية، ثم شطف مرارا مع الماء المقطر. ماصات الأوتوكلاف في أنابيب الفردية. يجب أن يتم استبدال أنابيب المطاط الذي يشكل الحجاب الحاجز وبعد عدة لمبة المطاط التعقيم أو عندما تصبح مظلمة وقاسية.

العديد من مكونات هذا البروتوكول تنطوي المعدات الخطرة. على سبيل المثال، فإن الإجراء لصنع سبيمان Micropipette ينطوي على ثلاثة أنواع من النيران وكذلك التدفئة، وسحب، وتهب، والانحناء، وقطع، وتلميع الزجاج. وبالتالي، وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة (PPE) أن يزيد من السلامة مثل نظارات واقية ومعطف المختبر أمر بالغ الأهمية. بالإضافة إلى ذلك، لأن الكثير من الناس يعانون من، أو لديها القدرة على تطوير والحساسية البيض، ودائما استخدام قفازات عند التعامل مع البيض. مع هذه الاحتياطات في الاعتبار، ونظام خيالية السمان بطة طسا طريقة آمنة وفعالة، ويمكن الوصول إليها نسبيا والتي لديها العديد من التطبيقات المستقبلية.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني للأبحاث الأسنان والجمجمة (NIDCR) منحة F32 (DE021929) لJLF ومنحة DE016402 NIDCR R01 إلى RAS

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x PBS TEK TEKZR114
Hank’s BSS w/o phenol red Invitrogen 14025-092
Neutral Red Sigma Aldrich N4638-5G 0.22 µm filter-sterilized
18 G Needles BD 305195
5 ml syringe BD 309646
No. 5 Dumont forceps Fine Science Tools 11252-20
Straight Scissors Fine Science Tools 14028-10
Curved Scissors Fine Science Tools 14029-10
Spemann Pipette Hand-made in lab
Egg Holder Glass ashtray and modeling clay
Alcohol Burner Fisher 04-245-1
Transparent Tape 3M Scotch 600
Glass Stirring Rod Fisher 11-380C Tip is narrowed and rounded using a flame
Tungston wire (0.004 x 3 inches) A-M Systems 7190 Tip is flame-sharpened in a propane torch
Bunsun Burner Fisher Scientific S49117
Pasteur Pipette Fisherbrand 22-183-632 9-inch (229 mm)
Rubber Tubing Fisher Scientific 14-178C amber, thin wall natural rubber; wall thickness: 0.0625 in/1.6 mm; O.D.: 0.375 in/9.5 mm; I.D.: 0.25 in/6.4 mm
Propane Fuel Cylinder BernzOmatic UL2317 TX-9 with torch style "A" with a screw-on brass "pencil flame" torch
Diamond Point Pencil Fisher Scientific 22-268912
Rubber Bulbs Fisherbrand S32325

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Le Lièvre, C. S., Le Douarin, N. M. Mesenchymal derivatives of the neural crest: analysis of chimaeric quail and chick embryos. J Embryol Exp Morphol. 34, 125-154 (1975).
  2. Le Lièvre, C. S. Participation of neural crest-derived cells in the genesis of the skull in birds. J Embryol Exp Morphol. 47, 17-37 (1978).
  3. Noden, D. M. An analysis of the migratory behavior of avian cephalic neural crest cells. Dev Biol. 42, 106-130 (1975).
  4. Noden, D. M. The control of avian cephalic neural crest cytodifferentiation. I. Skeletal and connective tissues. Dev Biol. 67, 296-312 (1978).
  5. Couly, G. F., Coltey, P. M., Le Douarin, N. M. The triple origin of skull in higher vertebrates: a study in quail-chick chimeras. Development. 117, 409-429 (1993).
  6. Noden, D. M., Schneider, R. A. Neural crest cells and the community of plan for craniofacial development: historical debates and current perspectives. Adv Exp Med Biol. 589, 1-23 (2006).
  7. Schneider, R. A. Developmental mechanisms facilitating the evolution of bills and quills. J Anat. 207, 563-573 (2005).
  8. Sperber, G. H. Craniofacial embryology. , 4th edn, Wright. (1989).
  9. Chai, Y., Maxson, R. E. Recent advances in craniofacial morphogenesis. Dev Dyn. 235, 2353-2375 (2006).
  10. Gitton, Y., et al. Evolving maps in craniofacial development. Semin Cell Dev Biol. 21, 301-308 (2010).
  11. Szabo-Rogers, H. L., Smithers, L. E., Yakob, W., Liu, K. J. New directions in craniofacial morphogenesis. Dev Biol. 341, 84-94 (2010).
  12. Francis-West, P. H., Tatla, T., Brickell, P. M. Expression patterns of the bone morphogenetic protein genes Bmp-4 and Bmp-2 in the developing chick face suggest a role in outgrowth of the primordia. Dev Dyn. 201, 168-178 (1994).
  13. Schneider, R. A. How to tweak a beak: molecular techniques for studying the evolution of size and shape in Darwin's finches and other birds. Bioessays. 29, 1-6 (2007).
  14. Richman, J. M., Lee, S. H. About face: signals and genes controlling jaw patterning and identity in vertebrates. Bioessays. 25, 554-568 (2003).
  15. Graham, A., Okabe, M., Quinlan, R. The role of the endoderm in the development and evolution of the pharyngeal arches. J Anat. 207, 479-487 (2005).
  16. Neubüser, A., Peters, H., Balling, R., Martin, G. R. Antagonistic interactions between FGF and BMP signaling pathways: a mechanism for positioning the sites of tooth formation. Cell. 90, 247-255 (1997).
  17. Wilkie, A. O., Morriss-Kay, G. M. Genetics of craniofacial development and malformation. Nature reviews. Genetics. 2, 458-468 (2001).
  18. Fish, J. L., et al. modularity, and the evolvability of the vertebrate jaw. Evol Dev. 13, 549-564 (2011).
  19. Hamburger, V. A Manual of Experimental Embryology. , Chicago. (1942).
  20. Le Douarin, N. M., Creuzet, S., Couly, G., Dupin, E. Neural crest cell plasticity and its limits. Development. 131, 4637-4650 (2004).
  21. Baker, C. V., Bronner-Fraser, M., Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. Early- and late-migrating cranial neural crest cell populations have equivalent developmental potential in vivo. Development. 124, 3077-3087 (1997).
  22. Baker, C. V., Stark, M. R., Marcelle, C., Bronner-Fraser, M. Competence, specification and induction of Pax-3 in the trigeminal placode. Development. 126, 147-156 (1999).
  23. Borue, X., Noden, D. M. Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm. Development. 131, 3967-3980 (2004).
  24. Cobos, I., Shimamura, K., Rubenstein, J. L., Martinez, S., Puelles, L. Fate map of the avian anterior forebrain at the four-somite stage, based on the analysis of quail-chick chimeras. Dev Biol. 239, 46-67 (2001).
  25. Couly, G., Le Douarin, N. M. Head morphogenesis in embryonic avian chimeras: evidence for a segmental pattern in the ectoderm corresponding to the neuromeres. Development. 108, 543-558 (1990).
  26. Couly, G. F., Coltey, P. M., Le Douarin, N. M. The developmental fate of the cephalic mesoderm in quail-chick chimeras. Development. 114, 1-15 (1992).
  27. Köntges, G., Lumsden, A. Rhombencephalic neural crest segmentation is preserved throughout craniofacial ontogeny. Development. 122, 3229-3242 (1996).
  28. Noden, D. M., Francis-West, P. The differentiation and morphogenesis of craniofacial muscles. Dev Dyn. 235, 1194-1218 (2006).
  29. Le Douarin, N. M. A biological cell labelling technique and its use in experimental embryology. Dev Biol. 30, 217-222 (1973).
  30. Lwigale, P. Y. Embryonic origin of avian corneal sensory nerves. Dev Biol. 239, 323-337 (2001).
  31. Marcucio, R. S., Cordero, D. R., Hu, D., Helms, J. A. Molecular interactions coordinating the development of the forebrain and face. , (2005).
  32. Noden, D. M. The Role of the Neural Crest in Patterning of Avian Cranial Skeletal, Connective, and Muscle Tissues. Dev Biol. 96, 144-165 (1983).
  33. Noden, D. M. Patterning of Avian Craniofacial Muscles. Dev Biol. 116, 347-356 (1986).
  34. Olivera-Martinez, I., Coltey, M., Dhouailly, D., Pourquie, O. Mediolateral somitic origin of ribs and dermis determined by quail-chick chimeras. Development. 127, 4611-4617 (2000).
  35. Schienda, J., et al. Somitic origin of limb muscle satellite and side population cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 945-950 (2006).
  36. Schneider, R. A. Neural crest can form cartilages normally derived from mesoderm during development of the avian head skeleton. Dev Biol. 208, 441-455 (1999).
  37. Schneider, R. A., Hu, D., Rubenstein, J. L., Maden, M., Helms, J. A. Local retinoid signaling coordinates forebrain and facial morphogenesis by maintaining FGF8 and SHH. Development. 128, 2755-2767 (2001).
  38. Selleck, M. A. J., Bronner-Fraser, M. Origins of the avian neural crest: The role of neural plate-epidermal interactions. Development. 121, 525-538 (1995).
  39. Waddington, C. H. Developmental mechanics of chick and duck embryos. Nature. 125, 924-925 (1930).
  40. Waddington, C. H. Experiments on the Development of Chick and Duck Embryos, Cultivated in vitro. Philosophical transactions of the Royal Society of London. 221, 179-230 (1932).
  41. Hampe, A. Role of mesoderm and ectoderm of leg bud in exchanges between duck and chicken. C R Hebd Seances Acad Sci. 244, 3179-3181 (1957).
  42. Zwilling, E. Interaction between ectoderm and mesoderm in duck-chicken limb bud chimaeras. J Exp Zool. 142, 521-532 (1959).
  43. Pautou, M. P. Determining role of the mesoderm in the specific differentiation of the leg in birds. Arch Anat Microsc Morphol Exp. 57, 311-328 (1968).
  44. Sohal, G. S., et al. Development of the trochlear nucleus in quail and comparative study of the trochlear nucleus, nerve, and innervation of the superior oblique muscle in quail, chick, and duck. Journal of Comparative Neurology. 239, 227-236 (1985).
  45. Sohal, G. S. Effects of reciprocal forebrain transplantation on motility and hatching in chick and duck embryos. Brain Res. 113, 35-43 (1976).
  46. Sohal, G. S., et al. Synapse formation on quail trochlear neurons transplanted in duck embryos before naturally occurring motor neuron death. International Journal of Developmental Neuroscience. 8, 9-16 (1990).
  47. Yamashita, T., Sohal, G. S. Development of smooth and skeletal muscle cells in the iris of the domestic duck, chick and quail. Cell and Tissue Research. 244, 121-131 (1986).
  48. Yamashita, T., Sohal, G. S. Embryonic origin of skeletal muscle cells in the iris of the duck and quail. Cell and Tissue Research. 249, 31-37 (1987).
  49. Dhouailly, D. Analysis of the factors in the specific differenciation of the neoptile feathers in the duck and chicken. J Embryol Exp Morphol. 18, 389-400 (1967).
  50. Dhouailly, D. The determination of specific differentiation of neoptile and teleoptile feathers in the chick and the duck. J Embryol Exp Morphol. 24, 73-94 (1970).
  51. Schneider, R. A., Helms, J. A. The cellular and molecular origins of beak morphology. Science. 299, 565-568 (2003).
  52. Eames, B. F., Schneider, R. A. Quail-duck chimeras reveal spatiotemporal plasticity in molecular and histogenic programs of cranial feather development. Development. 132, 1499-1509 (2005).
  53. Eames, B. F., Schneider, R. A. The genesis of cartilage size and shape during development and evolution. Development. 135, 3947-3958 (2008).
  54. Lwigale, P. Y., Schneider, R. A. Other chimeras: quail-duck and mouse-chick. Methods Cell Biol. 87, 59-74 (2008).
  55. Merrill, A. E., Eames, B. F., Weston, S. J., Heath, T., Schneider, R. A. Mesenchyme-dependent BMP signaling directs the timing of mandibular osteogenesis. Development. 135, 1223-1234 (2008).
  56. Tokita, M., Schneider, R. A. Developmental origins of species-specific muscle pattern. Dev Biol. 331, 311-325 (2009).
  57. Solem, R. C., Eames, B. F., Tokita, M., Schneider, R. A. Mesenchymal and mechanical mechanisms of secondary cartilage induction. Dev Biol. 356, 28-39 (2011).
  58. Ealba, E. L., Schneider, R. A. A simple PCR-based strategy for estimating species-specific contributions in chimeras and xenografts. Development. 140, 3062-3068 (2013).
  59. Jheon, A. H., Schneider, R. A. The cells that fill the bill: neural crest and the evolution of craniofacial development. J Dent Res. 88, 12-21 (2009).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 87، قمة العصبية، الوهم السمان، البط، والتنمية القحفي، والتفاعلات الظهارية الوسيطة، وزرع الأنسجة والبيولوجيا التطورية التنموية
تقييم مساهمات أنواع محددة لتنمية الجمجمة عن طريق الوهم السمان بطة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fish, J. L., Schneider, R. A.… More

Fish, J. L., Schneider, R. A. Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras. J. Vis. Exp. (87), e51534, doi:10.3791/51534 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter