Biology

ウズラ·アヒルキメラを使用して顔面発展に種特異的な貢献を評価する

Published: May 31, 2014 doi: 10.3791/51534

Jennifer L. Fish¹, Richard A. Schneider¹

¹Department of Orthopaedic Surgery, University of California at San Francisco

Summary

この記事では、頭蓋顔面の開発に神経堤および/または他の組織の種特異的な貢献をテストするために設計されたキメラ胚を生成する方法を説明します。

Abstract

キメラ胚の生成は細胞の運命、組織の相互作用、および組織学的および脊椎動物の胚の形態的発展に種特異的な貢献を研究する広範かつ強力なアプローチである。特に、キメラ胚を使用することは頭蓋顔面複合体の種特異的な形態を向けるのを神経堤の重要性を確立しています。ここに記載される方法は大きく異なる顎顔面形態と、2鳥類、アヒルやウズラを利用しています。この方法は、大幅に頭蓋顔面複合体における種特異的なパターンの分子と細胞制御の調査を容易にします。ウズラやアヒルキメラ胚での実験は、すでに神経堤媒介組織相互作用および頭蓋顔面の骨格、筋肉、そして外皮における種特異的なパターンを制御する細胞自律的な行動を明らかにした。神経堤誘導体の偉大な多様性は、大きな可能性を示唆している脊椎動物の発生、病気、そして進化を理解するためのウズラ、アヒルキメラシステムの将来のアプリケーションに最適です。

Introduction

顔の骨格は、神経堤と外胚葉と内胚葉上皮層^1月11日に囲まれた中胚葉間葉で構成された複数の顔のプロセスの成長と融合から開発しています。各プロセス内の形態形成のイベントは、間葉と周囲の上皮^12月16日の間に明確なシグナル伝達相互作用によって支配される。これらのシグナル伝達の相互作用および/ またはその下流のエフェクターへの変化は、疾患の表現型に寄与し、また、頭蓋顔面の骨格^17、18の進化に関連する可能性がある。そのため、組織の相互作用のタイミングと性質を解明することは、顔の骨格の発達および進化生物学の我々の理解を高めるために大きな可能性を秘めている。

組織の相互作用を調査するキメラ胚の使用は発生生物学において長い歴史を持っています。このアプローチは、ハンス·シュペーマンと彼の研究室で開拓された誰が別の両生類の種の胚の間に組織を移植することによって、胚「主催者」を発見しました。シュペーマンは、手のスキル、特殊なツール、特にシュペーマンピペットの彼の開発によって補完されたマイクロ外科的技術のマスターだった。ヴィクトルハンバーガーはシュペーマンのノーベル賞につながったオリジナルの移植実験を行ったときである、1920年代フライブルクハンス·シュペーマンの実験室の大学院生だった。ハンバーガーは、1935年にセントルイスのワシントン大学に移動したとき、彼は実験発生学 ¹⁹ の彼マニュアルシュペーマンのマイクロピペットを作製するプロセスを詳しく説明。ドリューNodenはマサチューセッツ州アマースト大学にして、コーネル大学に移動した後、Nodenが製造し、ウズラ、ニワトリキメラを含む彼の外科移植のためシュペーマンマイクロピペットを使用し続けた。1972年までワシントン大学ハンバーガーの研究室の大学院生だった。＆＃160;大学院生、著者の一人（リッチシュナイダー）は1995年から1998年コーネル大学ドリューNodenで訓練しながらシュペーマンマイクロピペットを作るための、以下のプロトコルはハンバーガーやNodenによって書かれた記述に基づいて作られ、その後の修正を含む。シュナイダーによる。

頭蓋顔面の開発の研究のため、特に神経堤細胞の貢献を理解するためのウズラ-ニワトリキメラの使用は、ル·Douarin ら ²⁰に見直し、1970年代初頭にNodenにより、ルDouarinによって開拓された。このアプローチは、広く多くの研究で、多数の他の研究者^{1、4、5、21-38}に採用されている。ウズラやヒヨコの成長と形態の同等のレートは、細胞の運命と系統追跡の研究のために、その中の移植に最適です。しかし、ウズラとニワトリの間の類似性、形態学的変化は、indはドナー細胞によってuced解読することは困難である。対照的に、他の鳥類キメラのシステムは^{、39から50}胚は解剖学的に明確な確認メカニズムを研究するための方法として、国内アヒルが含まれている。具体的には、ウズラ、アヒルキメラシステムは、ホスト、およびその逆に、ドナーの影響を見分けるための複数の利点を提供します。まず、ウズラやアヒル胚の遺伝子発現（ 図1 AとB）の差動ドメインについてアッセイすることにより、パターン形成のドナーまたはホスト固有のメカニズムを探求するための直接的な方法を提供し、ボディサイズと形状で区別される。第二に、ウズラやアヒル胚はウズラが17日で孵化し、アヒルが28日で孵化して、成熟の大きく異なる速度を有する。移植された神経堤は、宿主環境内でその固有の成熟速度を維持し、従って、一時的な遺伝子発現の変化、組織の相互作用、組織形成および形態形成の同定が可能である51-57。最後に、抗核抗体ウズラ（PN¢Q）は、ドナーを可能にし、遍在ウズラ細胞において発現されるがアヒル細胞には存在しているタンパク質を認識することによって、互いに恒久的に区別する細胞の寄与をホストする。

Protocol

1。タングステン針を準備

ロッドが曲がらないようにワイヤーカッターを使用して半分にタングステン棒をカット。
ホウケイ酸ガラスパスツールピペットで5 3/4のテーパ端部を通って棒を通します。
グルーガンに使用スティックのりである、「ホットメルト接着剤」（HMA）の小さなビーズをピペットチップに棒を接着し、ガラスから突き出ロッドの約3/4が残る。 HMAはすぐに接着剤を燃やすと黒煙を発生しないように注意しながら、アルコールの炎で溶融されるべきである。
ピンセットを用いて、45°の角度に到達するまで（約1/4の上端から内）タングステン棒の先端を曲げる。
パスツールピペットを保持して、プロパントーチの炎にタングステン棒の先端の約1/8を配置します。安定した炎に正確に垂直先端を保持します。
炎の外に針を引く瞬間tungsの小さなオレンジ色の斑点針のオフ10ハエ。

2。シュペーマンピペットを準備

まもなくテーパーを超えて、ガラスが溶け始めるまでブンゼンバーナーを使用して、パスツールピペットの狭い方の端を加熱する。炎から取り外し、ピペットがシールになるまで先端を引っ張る。約0.7〜1.0ミリメートルのODを持つテーパ部の一部が残っていることを確認してください。密封端先細りから約4cmを破る。
ピペットの広い（開放）最後にゴム管の周囲に2フィート（60センチメートル）を取り付けます。空気がパスツールピペットのテーパ部を通過しないことを保証するためにゴム管のもう一方の端に吹く。
付属の鉛筆火炎トーチとプロパン燃料ボンベを使用して、単にテーパーの開始以下のピペットの片側に楕円形の領域を加熱。圧力のわずかな量（レットの始まりと言うのに必要な圧力の約量のゴム管を通じて非常に優しく、常に空気を吹き込むR会話レベルでの「P」）。ガラスが一面に柔らかくなり、外側にバックルを開始すると、すぐに炎からピペットを取り外し、ゴム管を通じてハードと着実に吹く。これは、ガラスの加熱部分がうまくなる、ポップもソーセージ形の泡を形成するようになります。気泡が小さすぎると、再びガラスを溶融し、発泡試みる。ガラスの最後の開いているウィンドウは、長い（12.7ミリメートル）での0.5により、広い周囲の0.25（6.35ミリメートル）である必要があります。
穏やかにピペットに入るのガラス破片を防ぐためにチューブを通して吹き込みつつ上方にテーパ状端部を指し、ガラス廃棄物容器内に泡を掻き取る。
プロパン炎を使用して、バブルと火 - ポーランド開いているウィンドウの辺の残りのエッジを燃焼。ピペットのシャフトを溶融しないように注意してください。
ダイヤモンドポイントの鉛筆を使用して、ウィンドウから約1.25（30ミリメートル）でのピペットのテーパー端をスコアチップを解消鉗子でピペット開口部はきれいにカットされているように（破線や凹凸ヒントを廃棄ピペット）。
ときに窓開口屈曲部が垂直面内にあるように、鉗子およびアルコールバーナーからの火炎の縁部を用いて、約60°の角度に先端から（9.5 mm）の中にピペット0.375の狭い部分を曲げる左利きの使用のために右利きの使用状況と午前11時のため一時位置にある。このステップは、最高のドラフトのない筐体で行われる。
解剖顕微鏡下でのアルコールの炎を使って火ポリッシュ先端。先端を閉鎖するのではなく円形の開口を維持し、任意のくびれのない滑らかなしないようにしてください。
、ゴム管の中の1（25ミリメートル）の部分をカットし、70％エタノールでチューブの一部をスプレーして、窓の開口部が完全に覆われるまで、ピペットのシャフトの上にチューブをスライドさせます。これはシュペーマンピペットの「ダイアフラム」として機能する。
ラテックスゴム2ミリリットルの電球を配置ピペットの開放底部の上。電球はシュペーマンピペット内の負圧を維持している。
、シュペーマンピペットを使用して練習し、顕微鏡下で、別の著しい場所に1シャーレの著しい箇所から、直径で約100〜200ミクロンのクロマトグラフィービーズを転送します。
シュペーマンピペットを洗浄するために、底に綿やガーゼを敷いた、蒸留水やガラス製品の洗浄剤で満たされた背の高いビーカーに、先端を下に、ゴム球と場所ピペットを削除します。

3。卵を殺菌しインキュベート

70％エタノールで卵を拭くとプラスチックの卵トレイに卵を置きます。
37.5℃、85から87までパーセントで加熱されたインキュベーター内で卵を設定します。
彼らはHH9.5、ウズラやアヒルのために48時間、約26時間後に到達するまで卵をインキュベートする。

4。ウィンドウ卵

内殻Mを穿刺しないように注意しながら、ピンセットで卵の上から外殻の小片を取り除くembrane。
1インチの針で18 gの注射器を用いて、卵の狭い先端の穴を突くと卵白の約1〜2ミリリットル撤回。
殻に穴穿刺マークの上に透明のテープを配置。
湾曲したハサミを使って（透明テープを介して）卵の上面に沿って「窓」を切った。

5。胚を視覚化し、手術のための準備

ガラス棒を用いて、胚の上に静かにニュートラルレッドを少量（ハンクスBSS 0.02グラム/ ml）を磨く。
卵黄膜を切断して、火炎シャープタングステン針を使用して、胚の上に引き出します。
ウィンドウの上に透明テープを配置することにより、卵を再密封する。

6。ドナー胚からドナー組織を分離

ドナー胚の卵の窓からテープを外します。
ドナー胚の隣接する外胚葉から神経倍をカットするには、両方のSIDにスリットを作る（上記のように製造された）難鋭利なタングステン針を使用して、神経管のエス。
その後、移植片の所望の前方および後方のレベルで神経管を横断し、神経管の他の部分から移植片を分離する。
シュペーマンピペットまたはマイクロピペットの他のタイプのいずれかを使用して、ドナー胚から神経倍に削除します。
そして、ホスト卵に窓に貼ったテープをはがし、移植を受ける神経管の領域に隣接する宿主胚と一緒にドナー神経フォールドを配置するシュペーマンピペットを使用しています。

7。ホスト組織を分離し、ドナー組織を移植

ドナーで行ったように、宿主胚の神経管から神経倍に分離する。ドナー組織として同じサイズの移植片を除去するように注意してください。
そっと遠く胚からこの宿主組織を押してください。
その後、鈍いタングステン針またはMIの丸いチップでcropipetteは、静かに、適切な前後方向と背腹方向を維持し、ホストの神経管に折りたたまドナー神経を移動します。移植片が側面に沿って中に隠れていることを確認してくださいますが、突くまたは下層組織に損傷しないようにしてください。元の位置のノートの中性赤からドナー組織または差動染色における任意の非対称性を追跡するのに役立ちます。我々はまた、フォトドキュメント伴う切除した組織とドナー胚と同様に、キメラはすぐに手術後。
宿主胚は、乾燥の兆候を示している場合に滅菌生理食塩水、卵を追加する必要があります。
今、慎重に再シールと卵にラベルを付け、ゆっくりキメラ胚を分析のために必要な段階に開発することができ、高湿インキュベーター（百分の70から80）に戻します。

キメラの8。コレクション

作りたての寒セラの固定液にキメラ胚を収集し、すぐにROにそれらを配置することを確認してくださいO / N固定のため4℃でcker。これは、抗ウズラ抗体とウズラ細胞のより高感度な検出を可能にする。
遺伝子発現は、RT-qPCRを介して分析のために、RNA抽出前に液体窒素で直接胚を凍結する。

Representative Results

更なる分析の前に、移植の効率をアッセイする必要がある。組織については、形態学的、又は遺伝子発現は組織試料で解析し、ウズラ細胞が³⁶記載のようにQ¢PN抗体を用いた免疫組織化学によって検出されるべきである。 RNA分析のため、関心のある組織に種特異的な寄与は、PCRベースの戦略^58を用いて計算することができる。移植の有効性が検証された後、さらなる形態学的または分子アウトカム指標は、キメラで評価することができる。ドナー神経堤細胞および頭蓋顔面複合体の適切な組織発生と形態形成の基礎となる周囲の宿主由来の組織との間の相互作用は、以前に広く研究されている。具体的には、神経堤間充織は、顔の種特異的な形態^{7、13、51、59、}フェザーパターン^52、筋肉のパターン^56に指示 >アップ、および軟骨^53、宿主遺伝子発現の調節を介して^57。例えば、神経堤間充織は、時間的にBMP4の発現が^55を調節することにより、下顎にあるとき、骨の形が決まる。

最近では、調査は非常に初期の頭蓋顔面の開発で発生する組織の相互作用を中心としています。この点に関して、ウズラ、アヒルキメラを利用する実験は、宿主胚は形態学的境界を決定することによって、神経堤遊走に影響を図示している。つまり、キメラquck胚では、ドナーウズラ神経堤細胞は、アヒルのようなパターン（ 図1D）のホストアヒル下顎アーチの中に移動、である。神経堤の人口の大きさに、このホストの貢献にもかかわらず、ドナー神経堤は、ウズラのような大きさと形状（ 図1E）にある下顎スケルトンを生成し続けています。

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図1。ウズラ-ダックキメラシステム。生成するための（A）、ウズラおよび（B）のアヒル頭蓋骨の大きさや形状にかなりの違いが表示され、したがって、理想的には（TOKIA ら ⁵⁶から変更）、頭蓋顔面の開発を研究するキメラシステムを使用するのに適している。（C）実験計画舞台をマッチさせたHH9.5ウズラとアヒル胚からの一方的なキメラ胚quck。神経フォールドはウズラ胚の片側から取り出し、神経倍の等価部分が除去された後のアヒル胚に移植される。（D）ウズラドナー細胞（緑色）、抗ウズラ抗体（Qを用いてキメラで追跡することができるHH12キメラ胚の腹側図に示されている。（F）HH38、ウズラのドナー由来メッケルでquck下顎のように）、PN¢7、S軟骨が大きく、湾曲している対側アヒル宿主由来メッケル軟骨のために観察されたものよりも短く、まっすぐです。復刻時田ら、開発。エルゼビアからの許可を得て、バイオ。306、377（2007）。

Discussion

神経堤は、胚全体で広範囲に移動し、頭蓋顔面の骨格に貢献軟骨細胞および骨芽細胞を含む多様な細胞型、に分化する過渡胚細胞集団である。ウズラ、アヒルキメラ系における神経堤を移植すると、頭蓋顔面骨格の発達を制御する組織相互作用およびシグナル伝達経路の理解に大きく貢献しています。しかしながら、平滑筋細胞、脂肪細胞、メラニン細胞、シュワン細胞、および神経細胞を生成するための神経堤の大きな可能性を考えると、ウズラ、アヒルキメラ系は、特に、幹細胞生物学の急速な発展に関連して、将来の用途のための多大な可能性を有する再生医療。ウズラやアヒルが両方の商業的に飼育種であるため、比較的安価な受精卵の準備供給は農場の様々な利用可能です。このように、この技術はresearcにアクセス可能でなければなりません彼女は、予算や設備スペースの広い範囲で動作する。

この技術は非常に強力ですが、いくつかの制限が残っている。その他の外科技術と同様に、ウズラ、アヒルキメラの質と生存率は、研究者の外科的なスキルに依存しているため、このようなマウスを利用したものなど、他のモデルと比較して実験間のより多くの間および個人内変動があるだろう遺伝学。また、各移植の再現性と成功に貢献し、開発し、個々の胚の段階の速度のばらつきもあります。鳥類の胚はまた、脱水症状に大変影響を受けやすいと手術中、したがって重要なステップは最小限に、顕微鏡下で、低い時間を光のレベルを維持含まれ、可能な限りテープで密封卵、術後のインキュベーター内で高湿度に乾燥を避ける。

キメラの生存能力の点で、uはこれらの割合は、古いコレクションのステージを減少させることができますがsually百分の50から75までの間、存続する。手術の典型的な4-6時間のセッションでは、経験豊富な外科医は、10月15日キメラを生成することができます。移植の成功はまた、ツールの品質に大きく依存する。良いツールは、より一貫性のある、再現性のある結果をもたらす。タングステン針を作るためにプロパントーチを使用すると、非常に鋭い針が行われることを可能にする。それは炎の大きさを制御しますので、使用のトーチのタイプは大きな違いになります。電解鮮鋭化を使用することもできるが、この方法も、シャープな針の製造に接近しない。針がまっすぐに作ることができるように、代わりにスプールされたワイヤーのタングステン棒を使用してください。

シュペーマンマイクロピペット、時間がかかり、製造が困難で、組織の転送のための理想的な手段である間。ピペットは、異なる寸法の開口を使用してカスタマイズすることができ、繰り返し使用することができる。資料を使のための重要な要因GAシュペーマンのマイクロピペットは、胚の表面に先端に触れる前に、ピペットでいくつかの流体を持つことである。連絡先が胚の上、メニスカスで行われたとき、流体の中には、常に流出する。少しゆっくりと、振動板上にさせるがピペットにドナー移植組織を吸うのに対し、ダイヤフラム上に押すと、流体および移植組織が非常に正確に吐出することができるようになります。ダイヤフラムに正の圧力のビットを維持することは、転送中にピペットの先端にドナー移植組織を維持し、ダイアフラムにはほとんど追加の圧力は、ドナー移植片組織が意図的にホストに配置することを可能にする。

ストレージおよび滅菌中シュペーマンピペットの保護のため、ワイド端から電球を外し、慎重に球に先細りの先端を挿入します。アルミホイルで上部をカバーし、手術前にオートクレーブ、ガラス試験管にシュペーマンピペットを置きます。複数のピペットが再された後その後ADY手術のために再度滅菌する、ピペットを反転、蒸留水やガラス製品、洗剤の同じ溶液中でほぼ沸騰にそれらを加熱し、蒸留水で繰り返し洗浄してください。彼らの個々のチューブ内のオートクレーブピペット。彼らは暗く堅いなったときに、振動板とゴム球を形成しているゴム管は、いくつかの不妊手術後に交換またはする必要があります。

このプロトコルのコンポーネントの多くは、危険な装置を含む。たとえば、シュペーマンマイクロピペットを作るための手順は、3炎の種類だけでなく、暖房、引っ張って、切断、ガラスの研磨、曲げ、発泡を伴う。したがって、このようなゴーグルと白衣などの安全性を高める適切な個人用保護具（PPE）を着用してすることは非常に重要です。さらに、多くの人が卵を取り扱う際は、必ず手袋を使用し、苦しんで、または、卵アレルギーを開発する可能性を持っているので。これらの注意事項を念頭に置いて、ウズラ、アヒルキメラシステムISA、多くの将来のアプリケーションを持って、安全で効率的、かつ比較的アクセス可能なメソッド。

Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Acknowledgments

この作品は、RASに歯科研究所とJLFの頭蓋顔面研究所（NIDCR）F32の助成金（DE021929）とNIDCR R01グラントDE016402によって賄われていた

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	TEK	TEKZR114
Hank’s BSS w/o phenol red	Invitrogen	14025-092
Neutral Red	Sigma Aldrich	N4638-5G	0.22 µm filter-sterilized
18 G Needles	BD	305195
5 ml syringe	BD	309646
No. 5 Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-20
Straight Scissors	Fine Science Tools	14028-10
Curved Scissors	Fine Science Tools	14029-10
Spemann Pipette			Hand-made in lab
Egg Holder			Glass ashtray and modeling clay
Alcohol Burner	Fisher	04-245-1
Transparent Tape	3M Scotch	600
Glass Stirring Rod	Fisher	11-380C	Tip is narrowed and rounded using a flame
Tungston wire (0.004 x 3 inches)	A-M Systems	7190	Tip is flame-sharpened in a propane torch
Bunsun Burner	Fisher Scientific	S49117
Pasteur Pipette	Fisherbrand	22-183-632	9-inch (229 mm)
Rubber Tubing	Fisher Scientific	14-178C	amber, thin wall natural rubber; wall thickness: 0.0625 in/1.6 mm; O.D.: 0.375 in/9.5 mm; I.D.: 0.25 in/6.4 mm
Propane Fuel Cylinder	BernzOmatic	UL2317	TX-9 with torch style "A" with a screw-on brass "pencil flame" torch
Diamond Point Pencil	Fisher Scientific	22-268912
Rubber Bulbs	Fisherbrand	S32325