Summary
Este artigo descreve um método para gerar embriões quiméricos que são projetados para testar as contribuições específicas de espécies de crista neural e / ou outros tecidos para o desenvolvimento craniofacial.
Abstract
A geração de embriões quiméricos é uma abordagem ampla e poderosa para estudar os destinos celulares, interações tecido e espécie-específicos contribuições para a análise histológica e desenvolvimento morfológico dos embriões vertebrados. Em particular, a utilização de embriões quiméricos estabeleceu a importância da crista neural em dirigir a morfologia específica da espécie do complexo craniofacial. O método aqui descrito utiliza duas espécies de aves, pato e codorniz, com notavelmente diferente morfologia craniofacial. Este método facilita muito a investigação da regulação molecular e celular de padrão específico da espécie no complexo craniofacial. Experimentos em codorna e pato embriões quiméricos já revelaram interações mediadas tecido da crista neural e comportamentos de células-autônoma que regulam padrão espécie-específicos no esqueleto craniofacial, musculatura e tegumento. A grande diversidade de derivados da crista neural sugere um potencial significativopara futuras aplicações do sistema quimérico codorna-pato para a compreensão do desenvolvimento dos vertebrados, doenças e evolução.
Introduction
O esqueleto facial desenvolve com o crescimento e fusão de vários processos faciais que são compostos de crista neural e mesodermal mesenchyme cercado por ectodérmica e camadas epiteliais endoderme 1-11. Eventos morfogenéticos dentro de cada processo são regidos por interações de sinalização distintas entre o mesênquima e epitélio em torno de 12-16. Alterações a estas interações de sinalização e / ou seus efetores downstream contribuir para fenótipos da doença e também pode ser relevante para a evolução do esqueleto craniofacial 17, 18. Portanto, elucidando o momento ea natureza das interações de tecido tem um grande potencial para aumentar a nossa compreensão da biologia do desenvolvimento e da evolução do esqueleto facial.
A utilização de embriões quiméricos para investigar as interações de tecido tem uma longa história em biologia do desenvolvimento. Esta abordagem foi iniciada por Hans Spemann e seu laboratórioque descobriu embrionárias "organizadores" através do transplante de tecidos entre os embriões de diferentes espécies de anfíbios. Spemann era um mestre de técnicas de micro-cirúrgicos, cuja mão-habilidades foram complementadas com o seu desenvolvimento de ferramentas especializadas, nomeadamente a pipeta Spemann. Viktor Hamburger era um estudante de pós-graduação no laboratório de Hans Spemann em Freiburg durante a década de 1920, que é quando os experimentos de transplante de originais que levaram ao Prêmio Nobel da Spemann foram realizados. Quando Hamburger mudou-se para Washington University, em St. Louis, em 1935, ele detalhou o processo de fazer uma micropipeta Spemann em seu Manual de Embriologia Experimental 19. Desenhou Noden era um estudante de pós-graduação no laboratório de Hamburger na Universidade de Washington até 1972. Depois de se mudar para a Universidade de Massachusetts, Amherst e depois para a Universidade de Cornell, Noden continuou fabricando e usando micropipetas Spemann por seus transplantes cirúrgicos envolvendo quimeras codorna-galinha. &# 160;. Enquanto um estudante de pós-graduação, um dos autores (Rich Schneider) treinados, com Drew Noden em Cornell 1995-1998 O protocolo a seguir para fazer uma micropipeta Spemann é baseado em descrições escritas por Hamburger e Noden e inclui modificações subseqüentes feitas por Schneider.
O uso de quimeras codorna-de bico para o estudo do desenvolvimento craniofacial e, especialmente, para a compreensão das contribuições de células da crista neural foi iniciada por Noden e por Le Douarin no início de 1970, revisto em Le Douarin et al 20. Esta abordagem tem sido amplamente adotado em muitos estudos e por inúmeros outros pesquisadores 1, 4, 5, 21-38. As taxas equivalentes de crescimento e morfologia de codorna e galinha fazer transplantes dentro deles ideal para o estudo do destino celular e rastreamento de linhagem. No entanto, por causa das semelhanças entre codorna e galinha, alterações morfológicas induced por células do doador são difíceis de decifrar. Em contraste, outros sistemas quiméricos aviária incluíram pato doméstico como uma forma de estudar os mecanismos que fazem embriões anatomicamente distinto 39-50. Mais especificamente, o sistema quimérico codorna-pato oferece vários benefícios para discernir os efeitos do doador sobre o hospedeiro, e vice-versa. Primeiro, os embriões de codorna e pato são distintas no tamanho do corpo e forma, que fornece uma maneira direta para explorar ou doador-mecanismos específicos do hospedeiro de formação de padrões através da análise para domínios diferenciais de expressão gênica (Figuras 1 A e B). Em segundo lugar, os embriões de codorna e pato têm consideravelmente diferentes taxas de maturação, com codorna incubação em 17 dias e pato eclosão em 28 dias. Crista neural transplantados mantém a sua taxa de maturação intrínseca dentro do ambiente de acolhimento e, assim, a identificação de mudanças temporais na expressão gênica, interações tecido, histogênese e morfogênese é possível51-57. Finalmente, o anticorpo anti-nuclear de codorniz (Q ¢ PN) permite que os dadores e albergar as contribuições celulares para ser permanentemente distinguidos um do outro através do reconhecimento de uma proteína que é expressa ubiquamente em células de codorniz, mas ausente de células de pato.
Protocol
1. Prepare tungstênio Agulhas
- Corte uma haste de tungstênio ao meio usando cortadores de fio, de modo que a vara não dobrar.
- Colocar a haste através da extremidade cónica de uma 5 3/4 em vidro de borosilicato pipeta Pasteur.
- Deixando cerca de 3/4 em da degola rebento do vidro, aderem a vara para a ponta da pipeta com uma pequena pérola de "adesivo hot melt" (HMA), que é o bastão de cola usada para uma pistola de cola. O HMA deve ser rapidamente derretido em uma chama de álcool, tomando cuidado para não queimar a cola e gerar fumaça preta.
- Utilizando um par de pinças, dobrar a ponta da haste de tungsténio (cerca de 1/4 a partir do topo final) até um ângulo de 45 ° é atingido.
- Segurando a pipeta de Pasteur, colocar cerca de 1/8 da da ponta da haste de tungsténio na chama de uma lâmpada de propano. Segure a ponta firme e exatamente perpendicular à chama.
- Retire a agulha da chama do momento que uma pequena mancha laranja de TUNGSdez moscas fora da agulha.
2. Prepare Spemann Pipettes
- Utilizando um bico de Bunsen, o calor da extremidade mais estreita de uma pipeta de Pasteur de vidro, até a pouco para além do afunilamento começa a derreter. Retire do fogo e puxe a ponta até a pipeta fica selado. Assegure-se que continua a haver uma porção da parte afunilada que tem um diâmetro externo de cerca de 0,7-1,0 mm. Quebre o final selada cerca de 4 cm do cone.
- Anexar cerca de 2 pés (60 cm) de tubo de borracha para a largura (aberto) final da pipeta. Soprar sobre a outra extremidade do tubo de borracha para assegurar que nenhum ar pode passar através da parte cónica da pipeta Pasteur.
- Usando um cilindro de gás propano com um maçarico de chama ligado lápis, aquecer uma área oval, de um lado da pipeta logo abaixo do início da conicidade. Soprar ar muito suavemente e constantemente, através do tubo de borracha, com uma pequena quantidade de pressão (aproximadamente a quantidade de pressão necessária para dizer que o início do letter "P" em nível de conversação). Quando o vidro se torna suave de um lado e começa a fivela para fora, remover rapidamente a pipeta da chama e golpe duro e constante através do tubo de borracha. Isso fará com que a parte aquecida do vidro para formar uma bolha em forma de salsicha que pode aparecer, que é bom. Se a bolha é muito pequeno, tente derretendo e soprando o vidro novamente. A última janela aberta no vaso deve ser de cerca de 0,25 in (6,35 mm) de largura por 0,5 cm (12,7 mm) de comprimento.
- Apontando a extremidade cónica para cima, raspe a bolha em um recipiente de resíduos de vidro, enquanto soprando suavemente através do tubo para evitar que fragmentos de vidro de entrar na pipeta.
- Usando a chama de propano, queimar as bordas restantes da bolha e fogo-polonês nas laterais da janela aberta. Tome cuidado para não derreter o eixo da pipeta.
- Com um lápis ponto diamante, marcar a extremidade cónica da pipeta aproximadamente 1,25 em (30 mm) a partir da janela e quebrar a pontacom uma pinça, de modo que a abertura da pipeta é cortado de forma limpa (pipetas de descarte com pontas quebradas ou irregulares).
- Usando fórceps e da borda de uma chama de um queimador de álcool, dobrar a porção estreita da pipeta em 0,375 (9,5 mm) a partir da ponta com um ângulo de aproximadamente 60 °, de modo que a parte dobrada está situado num plano vertical, quando da abertura da janela está na posição de 01:00 para o uso com a mão direita e as 11:00 h para o uso do canhoto. Este passo é melhor realizado em um free-projecto de gabinete.
- -Polonês fogo a ponta usando a chama de álcool sob um microscópio de dissecação. Não se esqueça de fechar a ponta, mas sim manter a rodada de abertura e suave sem qualquer constrição.
- Cortar um pedaço de 1 (25 mm) de um tubo de borracha, pulverizar o pedaço de tubo com 70% de etanol, e o tubo de deslize ao longo do eixo da pipeta até a abertura da janela está completamente coberto. Isso funciona como o "diafragma" da pipeta Spemann.
- Coloque uma lâmpada ml látex de borracha 2sobre a parte inferior aberta da pipeta. A lâmpada mantém a pressão negativa na pipeta Spemann.
- Para praticar o uso de uma pipeta de Spemann, transferir os grânulos de cromatografia de cerca de 100-200 um de diâmetro a partir de um ponto marcado em uma placa de Petri com um ponto marcado na outra sob um microscópio.
- Para limpar a pipeta Spemann, retire o bulbo de borracha e local pipeta, ponta para baixo, em um copo alto forrado com algodão ou gaze na parte inferior e preenchido com água destilada e detergente copos.
3. Esterilizar e incubar ovos
- Wipe ovos com etanol a 70% e colocar os ovos em tabuleiros de plástico de ovo.
- Definir os ovos numa incubadora aquecida a 37,5 ° C e 85-87%.
- Incubar os ovos até que eles atinjam HH9.5, cerca de 26 horas, para a codorna e 48 horas para pato.
4. Janela Eggs
- Retirar uma pequena peça de concha exterior da parte superior do ovo com uma pinça, tendo o cuidado de não perfurar o invólucro interior membrane.
- Usando uma seringa com uma agulha de 18 G por 1 polegada, fazer um buraco na ponta mais estreita do ovo e retirar aproximadamente 1-2 ml de albumina.
- Coloque fita adesiva transparente sobre o buraco e marca punção no shell.
- Cortar uma "janela" ao longo da superfície superior do ovo (através da fita transparente) usando uma tesoura curva.
5. Visualize Embriões e preparar para a cirurgia
- Usando uma vareta de vidro, escova suavemente uma pequena quantidade de vermelho neutro (0,02 g / mL em BSS de Hank) sobre o embrião.
- Corte a membrana vitelina e puxe-o sobre o embrião usando uma agulha de tungstênio afiadas-chama.
- Re-selar o ovo, colocando fita adesiva transparente sobre a janela.
6. Separe o tecido do doador a partir do embrião de Doadores
- Retire a fita da janela sobre o ovo do embrião doador.
- Para cortar a dobra neural da ectoderme adjacente do embrião dador, fazer fendas em ambos sides do tubo neural, utilizando uma agulha afiada tungsténio-chamas (fabricado como descrito acima).
- Em seguida, cortam o tubo neural aos níveis anteriores e posteriores desejadas do enxerto e o enxerto de separar do resto do tubo neural.
- Remover a dobra neural do embrião dador utilizando uma pipeta de Spemann ou outro tipo de micropipeta.
- Em seguida, retirar a fita adesiva a partir da janela sobre o ovo do hospedeiro e usar a pipeta Spemann para colocar a dobra neural doador ao lado do embrião hospedeiro adjacente à região do tubo neural, que vai receber o transplante.
7. Separe o tecido hospedeiro e Transplante do tecido do doador
- Separa-se a dobra neural do tubo neural do embrião hospedeiro, como feito com o doador. Tome cuidado para remover um enxerto de igual tamanho que o tecido do doador.
- Suavemente empurrar este tecido hospedeiro longe do embrião.
- Então, com uma agulha de tungstênio sem corte ou a ponta arredondada de um micropipette, mova suavemente o doador neural dobra no tubo neural de acolhimento, mantendo as orientações ântero-posterior e dorso-ventral adequadas. Certifique-se que o enxerto é dobrado ao longo dos lados, mas não se esqueça de picar ou danos aos tecidos subjacentes. Para ajudar a manter o controle da nota orientação original as assimetrias no tecido do doador ou coloração diferencial do vermelho neutro. Nós também foto-documento o embrião dador com o tecido que acompanha excisada, bem como a quimera imediatamente após a cirurgia.
- Salina estéril deve ser adicionado ao ovo se o embrião hospedeiro mostra sinais de dessecação.
- Agora, cuidadosamente re-vedação e rotular o ovo, e devolvê-lo suavemente para uma incubadora de humidade elevada (70-80%), onde o embrião quimérico pode desenvolver para a fase desejada para análise.
8. Recolha de Quimeras
- Certifique-se de coletar embriões quiméricos em acabado de fazer fixador frio da Serra e colocá-los imediatamente em uma rocker a 4 ° C durante uma fixação S / N. Isto irá permitir a detecção mais sensível de células de codorniz com o anticorpo anti-codorniz.
- Para as análises de expressão gênica por meio de RT-qPCR, congelar embriões diretamente em nitrogênio líquido antes da extração de RNA.
Representative Results
Antes de posterior análise, a eficiência do transplante tem de ser ensaiada. Para análise histológica, análises de expressão morfológica, ou gene em amostras de tecido, células de codorniz deve ser detectado por imuno-histoquímica utilizando anticorpos Q ¢ PN tal como descrito 36. Para as análises de RNA, espécie-específicos contribuições para os tecidos de interesse pode ser calculada usando uma estratégia baseada em PCR 58. Após a eficácia do transplante foi validado, outras medidas de resultados morfológicas ou moleculares pode ser avaliada em quimeras. As interações entre as células da crista neural doadores e tecidos circundantes derivados do hospedeiro que fundamentam histogênese adequada e morfogênese do complexo craniofacial já sido extensivamente estudada. Em particular, mesênquima da crista neural dirige morfologia específica da espécie da face 7, 13, 51, 59, teste padrão da pena 52, padrão muscular 56 up> e cartilagem 53, 57 através da regulação da expressão gênica host. Por exemplo, mesênquima da crista neural dita quando formas de osso na mandíbula por temporalmente regulação da expressão Bmp4 55.
Recentemente, investigações têm-se centrado nas interações tecido que ocorrem muito cedo no desenvolvimento craniofacial. Neste sentido, experiências utilizando quimeras codorna-pato mostraram embriões hospedeiros influenciar a migração da crista neural, determinando limites morfológicos. Ou seja, em embriões quck quiméricos, células da crista neural doador de codorna migrar para o anfitrião pato mandibular arco em um padrão de pato-like (Figura 1D). Apesar de esta contribuição hospedeiro ao tamanho da população da crista neural, da crista neural doador continua a gerar um esqueleto mandibular que é codorniz semelhante em tamanho e forma (Figura 1E).
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Figura 1. Quail-Duck Chimeric sistema. (A) Quail e (B) crânios pato apresentam diferenças consideráveis em tamanho e forma, e, portanto, são ideais para o uso de um sistema quimérico para estudar o desenvolvimento craniofacial (modificado de Tokia et al. 56). (C) O delineamento experimental para a geração de embriões quiméricos quck unilaterais de correspondência de fase HH9.5 codorna e embriões de pato. A dobra neural é removido de um lado de embriões de codorniz e transplantadas em embriões de pato após uma peça equivalente da dobra neural foi removido. (D) As células doadoras de codorniz (verde) pode ser seguido em quimeras utilizando um anticorpo anti-codorniz (Q ¢ PN) como mostrado na vista ventral de H12 embrião quimérico. (F) em mandíbulas quck em HH38, a codorna doador-derivadas Meckel7; s cartilagem é mais curto e mais reto do que a observada para a cartilagem contralateral derivados do hospedeiro pato de Meckel, que é maior e curvado. Reproduzido Tokita et al., Dev. Bio. 306, 377 (2007) com permissão da Elsevier.
Discussion
A crista neural é uma população de células embrionárias transiente que migra muito em todo o embrião e diferencia-se em diversos tipos celulares, incluindo osteoblastos, condrócitos e que contribuem para o esqueleto craniofacial. Transplante crista neural no sistema quimérico codorna-pato tem contribuído grandemente para a nossa compreensão das interações de tecido e vias de sinalização que regulam o desenvolvimento do esqueleto craniofacial. No entanto, dado o vasto potencial da crista neural também gerar células musculares lisas, adipócitos, melanócitos, células de Schwann, neurônios, o sistema quimera codorna-pato tem um tremendo potencial para futuras aplicações, particularmente em conjunto com o rápido avanço da biologia de células-tronco e medicina regenerativa. Desde codorna e pato são as duas espécies criadas comercialmente, um pronto fornecimento de ovos fertilizados relativamente barata está disponível a partir de uma variedade de fazendas. Assim, esta técnica deve ser acessível a researcdela operando dentro de uma ampla gama de orçamentos e espaço facilidade.
Embora esta técnica é muito poderosa, ainda há várias limitações. Como outras técnicas cirúrgicas, a qualidade ea viabilidade de quimeras codorna-pato confiar nas habilidades cirúrgicas do pesquisador e, portanto, não haverá mais variação inter e intra-individual entre os experimentos, em comparação com outros modelos, como aqueles que utilizam o mouse genética. Além disso, há também a variação nas taxas de desenvolvimento e as fases de embriões individuais que contribuem para a reprodutibilidade e sucesso de cada transplante. Embriões de aves também são muito suscetíveis à desidratação e, portanto, as etapas críticas durante a cirurgia incluem manter os níveis de luz baixa, o tempo sob o microscópio a um mínimo, os ovos seladas com fita adesiva, tanto quanto possível, e alta umidade na incubadora de pós-operatório de evitar a dessecação.
Em termos de viabilidade das quimeras, usually entre 50-75% sobrevivem, embora estas percentagens podem diminuir o mais velho a etapa de coleta. Em uma típica sessão de 4-6 horas de cirurgia, um cirurgião experiente pode gerar 10-15 quimeras. O sucesso dos transplantes também depende muito da qualidade das ferramentas. Boas ferramentas de levar a resultados reprodutíveis, mais consistentes. Usando um maçarico para fazer agulhas de tungstênio permite agulhas extremamente afiadas para ser feita. O tipo de tocha usado faz uma grande diferença, pois controla o tamanho da chama. Nitidez eletrolítica também pode ser usado, mas esta abordagem não chega nem perto de produzir agulhas tão acentuada. Utilize hastes de tungstênio em vez de fios acondicionados em bobinas de modo que as agulhas podem ser feitas em linha reta.
A micropipeta de Spemann, enquanto que consome tempo e é difícil de fazer, é um instrumento ideal para a transferência do tecido. A pipeta pode ser personalizado com diferentes tamanhos de aberturas, e pode ser utilizado repetidamente. Um fator crítico para usinga Spemann micropipeta é ter algum líquido no pipeta antes de tocar a ponta para a superfície do embrião. Algum do fluido irá fluir sempre para fora quando o contacto é feito com o menisco sobre o embrião. Pressionando sobre o diafragma permite que o tecido fluido e enxerto a ser ejetado de forma muito precisa, ao passo que um pouco desistir no diafragma suavemente suga o tecido doador do enxerto para a pipeta. A manutenção de um pouco de pressão positiva no diafragma mantém o tecido do enxerto doador na ponta da pipeta durante a transferência, e um pouco de pressão adicional sobre o diafragma permite que o tecido do enxerto doador para ser deliberadamente colocado no hospedeiro.
Para a proteção da pipeta Spemann durante o armazenamento e esterilização, retire a lâmpada a partir do final de largura e insira cuidadosamente a ponta cônica para o bulbo. Coloque a pipeta Spemann em um tubo de ensaio de vidro, cubra a parte superior com uma folha de alumínio, e autoclave antes da cirurgia. Após várias pipetas são reAdy para ser esterilizado novamente para a cirurgia, inverter as pipetas, aquecê-los quase a ferver na mesma solução de água destilada e de detergente de vidro, e em seguida enxaguar repetidamente com água destilada. Pipetas Autoclave em seus tubos individuais. O tubo de borracha que se forma o diafragma eo bulbo de borracha deve ser substituído depois de várias esterilizações ou quando se tornam escurecido e duro.
Muitos dos componentes do presente protocolo envolve equipamento perigoso. Por exemplo, o procedimento para a realização de um Spemann Micropipeta envolve três tipos de chamas, bem como aquecimento, puxar, sopro, dobra, corte e polimento de vidro. Portanto, uso de equipamento de proteção individual adequado (PPE), que aumenta a segurança, como óculos de proteção e um jaleco é crítica. Além disso, porque muitas pessoas sofrem, ou têm potencial para se desenvolver, alergias ao ovo, use sempre luvas ao manusear ovos. Com estas precauções em mente, o sistema quimérico codorna-pato isa método seguro, eficiente e relativamente acessível, que tem muitas aplicações futuras.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Pesquisa Dental e Craniofacial (NIDCR) concessão F32 (DE021929) para JLF e uma bolsa DE016402 NIDCR R01 para RAS
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | TEK | TEKZR114 | |
| Hank’s BSS w/o phenol red | Invitrogen | 14025-092 | |
| Neutral Red | Sigma Aldrich | N4638-5G | 0.22 µm filter-sterilized |
| 18 G Needles | BD | 305195 | |
| 5 ml syringe | BD | 309646 | |
| No. 5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Straight Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Curved Scissors | Fine Science Tools | 14029-10 | |
| Spemann Pipette | Hand-made in lab | ||
| Egg Holder | Glass ashtray and modeling clay | ||
| Alcohol Burner | Fisher | 04-245-1 | |
| Transparent Tape | 3M Scotch | 600 | |
| Glass Stirring Rod | Fisher | 11-380C | Tip is narrowed and rounded using a flame |
| Tungston wire (0.004 x 3 inches) | A-M Systems | 7190 | Tip is flame-sharpened in a propane torch |
| Bunsun Burner | Fisher Scientific | S49117 | |
| Pasteur Pipette | Fisherbrand | 22-183-632 | 9-inch (229 mm) |
| Rubber Tubing | Fisher Scientific | 14-178C | amber, thin wall natural rubber; wall thickness: 0.0625 in/1.6 mm; O.D.: 0.375 in/9.5 mm; I.D.: 0.25 in/6.4 mm |
| Propane Fuel Cylinder | BernzOmatic | UL2317 | TX-9 with torch style "A" with a screw-on brass "pencil flame" torch |
| Diamond Point Pencil | Fisher Scientific | 22-268912 | |
| Rubber Bulbs | Fisherbrand | S32325 |
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