Summary
В данной работе представлены методы, используемые для исследования пространственно коррелированную химические, структурные и механические свойства многослойной шкале Atractosteus шпателем (А. шпателем) с помощью наноиндентирования, преобразование Фурье ИК (ИК) спектроскопии, сканирующей электронной микроскопии (SEM) и Х- рентгеновской компьютерной томографии (РКТ). Экспериментальные результаты были использованы для исследования принципов построения защитных биологических материалов.
Abstract
Иерархическая архитектура защитных биологических материалов, таких как минерализованных рыбьей чешуи, раковин брюхоногих, рога барана, рогов, и морские черепахи предоставляет уникальные принципы проектирования с потенциалами для направления дизайн защитных материалов и систем в будущем. Понимание взаимоотношений структура-свойство для этих материальных систем на микроуровне и наноуровне, где инициирует отказ имеет важное значение. В настоящее время экспериментальные методы, такие как наноиндентирования, рентгеновской КТ, и SEM обеспечить исследователей с пути, чтобы коррелировать механическое поведение с иерархическими микроструктур этих материальных систем 1-6. Тем не менее, четко определенный стандартная процедура для подготовки образцов минерализованных биоматериалов в данный момент недоступна. В этом исследовании, методы зондирования пространственно коррелированную химические, структурные и механические свойства многослойной шкале А. шпатель с помощью наноиндентирования, ИК-Фурье, SEM, с ваннойэнергия-рентгеновский (EDX) микроанализа и рентгеновской КТ представлены.
Introduction
Исследователи изучают структурные биоматериалов и пытаются выяснить принципы проектирования, которые обеспечивают структурные биоматериалов с улучшенными механическими свойствами, такими как гораздо более высокой вязкости и прочности, когда по сравнению с их отдельных компонентов. Исследования по принципы проектирования бронированных рыбьей чешуи для Pagrus основным 7, Polypterus senagalus 2,6, Arapaima гигабайтами 3, Cyprinus карпов 4, и Atractosteus шпатель 1 продемонстрировали необходимость расширения применения существующих экспериментальных методов для изучения структурных ответов и микроструктуры характеристики, так как подробные стандартные процедуры не доступны для этих типов материалов и экспериментов.
Среди различных бронированных рыбьей чешуи обсуждали, А. шпатель является исторически хищник вершины из центральной части США 8 и является одним из видов с высокимLY минерализованные весы. Биржи видов мышечной массы для массы кожи для получения улучшенной системы хищник обороны по сравнению с рыбами сопоставимого размера, упомянутого ранее 9. По Пейдж и Burr 10 А. шпатель является третьим по величине пресноводная рыба в Северной Америке с белуги (Acipenser transmontanus) и Атлантического осетра (Acipenser Oxyrhynchus), являющейся более крупные виды. Высоко-минерализованные рыбья чешуя из А. шпатель только недавно изучается. Томпсон и McCune 11 предположили, что морфология GAR масштабах имеют трехслойную композицию, состоящую из внешнего слоя ganoine, диффузного слоя кости и пластинчатой слой кости. Современные исследования на А. шпатель весы не отличается костный слой в диффузных или пластинчатых регионах костей, но только изучали регион кости как единый внутренний слой 1,12.
В этом исследовании, процедуры висследования ^ микроструктуру, наноструктуры, химический состав, и пространственное распределение механических свойств шкал А. шпатель по результатам ИК-Фурье спектроскопии, SEM, РКТ и методы наноиндентирование представлены.
Protocol
1. Рыбья чешуя Подготовка образцов
Для этого исследования, весы были получены из армии США инженером научно-исследовательского центра (ERDC) Экологическая лаборатория на середине длины (29-й хвостовой колонка) от долгого около 600 мм гр (А. шпателем). В рыбья чешуя были получены в соответствии с ERDC и Национального института здоровья (NIH) руководящие принципы по уходу за животными.
- Материалы
Запишите пространственное положение на рыбу весов, полученных для исследования. Убедитесь придерживаться соответствующей организации или государственных принципов для получения биологических образцов, таких как руководящие принципы по уходу за животными NIH. Хранить весов в адекватной среде, такой как фосфатно-буферном солевом растворе, чтобы сохранить гидратации и поддерживать содержание минеральных веществ, как только они будут удалены из рыбы. Избегайте длительного хранения, которые могут привести к потере минеральной, которые могут повлиять данные Наноиндентирование. Используйте кисть со средним ворсом и т.weezers для удаления мягких тканей с жестких масштабах. - Образец Монтажные и секционирования
Рассматривая поперечный разрез короткого оси рыбьей чешуи (рисунок 1), используя Фурье-ИК и наноиндентирования требуется сначала монтажа весов в жесткой среде, такой как из двух частей эпоксидной смолы, состоящей из смолы и отвердителя. Используйте общего назначения RT отверждения эпоксидных смол с низкими температурами пик таких как коммерческой эпоксидной смолы общего назначения, используемых в данном исследовании, у которого была пиковую температуру меньше 55 ° С
Рисунок 1. Рентгеновская КТ образы А. шпатель масштаб изображением поперечного сечения короткой оси, рассмотренный в данном исследовании А. шпатель с помощью наноиндентирования и FTIR [A (передний), P (задний), D (спинной), V (брюшной)]. </ Р>
- Держите чешую в 32 мм образца диаметр плесени помощью имеющегося в продаже держатель пластиковой образца. Это держит образец правильной ориентации при монтаже в эпоксидной смолой.
- После того, как образец проводится в форме, залить неотвержденный эпоксидную смолу на образце, а затем позволить эпоксидной вылечить в соответствии с инструкциями изготовителя.
- После того, как эпоксидная вылечена, раздел монтируется образец с помощью алмазный диск высокоточной отсечку видели в средней линии образца.
- Разрушать ультразвуком в дистиллированной воде в течение 15 мин, чтобы удалить весь мусор из образца.
- Полироли для Наноиндентирование и ИК-Фурье
Для получения гладкой ровной поверхности для наноиндентирования, как показано на рисунке 2, следующая процедура полировки и параметры предложил на основе обсуждений с производства шлифовальной и образцов. Однако эти параметры могут должны быть скорректированы для различных биоматериалов на основе ответовтаких как съема материала. Ультразвуком образцов в ванну с дистиллированной водой между полировки шагов важно обеспечить частиц из грубых шаг полировки не вводят в последующей тонкой полировки шагом.
Рисунок 2. Изображение полированной короткой оси поперечного сечения А. шпатель масштаб установлен в эпоксидной смолой.
- Грубый для ногтей с подушкой 15 мкм SiC и воды в качестве смазки, пока образец не является плоской с помощью автоматического полирующей головки силу 7 фунт-сила и скорости 200 оборотов в минуту (RPM).
- Обрабатывают ультразвуком образца в ванну с дистиллированной водой в течение 15 мин.
- Промежуточный ногтей с подушкой 6 мкм SiC с использованием воды смазку при скорости валика 130 оборотах в минуту и сила 7 фунт-сила на5 мин.
- Разрушать ультразвуком образец в ванну с дистиллированной водой в течение 15 мин.
- Польский с 1 мкм SiC площадки с использованием воды смазку со скоростью валика 130 оборотов в минуту и силу 7 фунт-сила в течение 5 мин.
- Обрабатывают ультразвуком образца в ванну с дистиллированной водой в течение 15 мин.
- Итоговый польский с нм коллоидной суспензии диоксида кремния 50 с использованием соответствующего полировальник например, высокой плотности, нетканого, низким ворсом пористого полиуретана, что производитель предлагает в течение 50 нм суспензий. Польский со скоростью 130 оборотов в минуту с усилием 7 фунт-сила в течение 5 мин.
- Обрабатывают ультразвуком образца в ванну с дистиллированной водой в течение 15 мин.
2. Наноиндентирование Тестирование
- Калибровка системы наноиндентирования перед каждой серией испытаний на производит руководящие принципы. Калибровка должна включать в себя определение функции в зону действия системы для кончика Беркович и рамы жесткости. Кроме того, выполнить калибровку микроскоп-на-индентора на этом этапечтобы гарантировать, что отступы коррелируют с выбранными местах микроскопа.
- Загрузите образец в наноиндентор и использовать элементы управления оптического микроскопа на наноиндентор принести образец в центре внимания.
- С помощью элементов управления программного обеспечения для перемещения образца в месте для первого абзаца. В идеале это составляет примерно 10 мкм в эпоксидной смолы с краю ganoine слое вдоль центральной линии поперечного сечения в масштабе.
- Выполните 4 параллельных ряда зубцов расстоянии 15 мкм друг от друга, чтобы получить статистически значимые данные установить, начиная с этого места. Установите наноиндентор до максимальной нагрузке 5 мН, погрузки и разгрузки темпов 0,1 мН / сек, время удержания 30 сек, а минимальное расстояние отступа 5 мкм для каждой строки. Ряд зубцов должен быть настроен для запуска ортогональный к поверхности ganoine, и достаточное число зубцов должны быть указаны путешествовать по поперечному сечению шкале, в то время прохождения примерно 10 мкм в EPoXу мимо костлявой слоя.
- Когда партия завершена, есть наноиндентор создать фидуциальных отступы с максимальной нагрузкой 100 млн в первом и последнем абзаце, который должен быть в эпоксидной перед ganoine слоя и после костного слоя, соответственно. Они соотносятся с начальной и конечной точек для каждой строки отступов.
- После наноиндентировании, поместите образец обратно в растворе PBS, чтобы избежать дальнейшего обезвоживания.
- С помощью программного обеспечения наноиндентирования определить модуль и твердости, основанный на методе Оливер-Pharr 13, если наблюдается материал зависит от времени отклика. В противном случае удержания времени, возможно, придется быть продлен преодолеть сползание наблюдается от разгрузки слишком быстро.
3. Пространственным разрешением ATR-ИК спектроскопия
Использование слайд-на ATR аксессуар прилагается к микроскопом ИК-Фурье является одним предложил метод сбора с пространственным разрешением преобразование Фурье инфракрасного (FTIR) спектры Лос-АнджелесеYers в рыбьей чешуи образца. ATR аксессуар позволяет для сбора спектров высокого качества с очень малой (~ 10 мкм) 2 пространственным разрешением, которое не достижимо с любой другой метод FTIR. То же самое полированный образец (рис. 2), полученного на наноиндентирования экспериментов был использован в этих экспериментах.
- Выбор образца с поверхности и размеров, подходящей для микроскопом FTIR используемого для анализа, чтобы обеспечить высокое качество спектры получают из ATR-FTIR spectromicroscopy.
- Подготовьте микроскоп FTIR для сбора данных. ИК микроспектроскопия требует калибровки сигнала FTIR при тех же условиях отбора проб как будет использоваться для измерения образца. Как правило, это включает охлаждение детектора и позволяет времени для того, чтобы стабилизировать а также сбора весь фоновый спектров и спектров образца при тех же условиях окружающей среды. Это может быть особенно важно, потому что пара СО 2 и воды в воздухе может гramatically повлиять ИК спектры. Важно также, чтобы убедиться, что оптика прибора, выровнены.
- Сбор соответствующий спектр фона вычесть образец против. Для этих экспериментов, полированный, с золотым покрытием стекло микроскопа был использован в качестве фона для ИК-Фурье spectromicroscopy.
- С помощью соответствующего цели, сосредоточиться на образце и выберите область интереса для анализа.
- После того, как сфера интересов находится прикрепите аксессуар ATR для объектива микроскопа ИК-Фурье, поднять образец, пока он не входит в тесный контакт с внутренним элементом отражения ATR, и собрать спектр образца.
- После сбора спектры FTIR, выполните требуется необходимым стандартным обработки данных.
4. Рентгеновская компьютерная томография (КТ)
- Получить и подготовить шкалу, как описано в разделе 1.1
- Установка сканера
- Разминка источник рентгеновского излучения в соответствии со спецификациями завода-изготовителя.
- Набор рентгеновская напряжение и ток до 50 кВ и 160 мкА, соответственно.
- Установите время экспозиции, чтобы 1450 мс.
- Выберите 1,0 мм алюминиевый фильтр.
- До загрузки образца, сделать поправку плоским поля при рентгеновский источник выключен (в темном поле) и на (ярко-поле).
- Mount и нагрузки образца
Весы должны быть установлены таким образом, чтобы они не смещаются или перемещать по всей длине сканирования. Эти образцы также должны быть установлены с использованием материалов, которые практически прозрачны для рентгеновских лучей. Сочетание пенопласта и парафильмом могут быть использованы, чтобы обеспечить шкалу на стадии CT.- Жестко закреплен образец таким образом, чтобы наибольший размер параллелен детектора.
- Закрепите установленный образец на сцену сканера.
- Поместите образец так, что она будет в центре вращения по всей проверки.
- Выберите самое высокое разрешение, что позволяет весь масштаб, чтобы быть в поле зрения (FOV), в данном случае7,5 мкм.
- Настройки Приобретение
Выполнять сканирование в этом исследовании с вращательным шаге 0,25 ° и значением кадр усреднения 15. При более низких разрешениях являются приемлемыми, увеличить размер шага и / или уменьшить кадр в среднем сократить общее время сканирования. - Параметры реконструкции
После того, как набор данных получен, восстановить проекционные рентгеновские изображения, чтобы создать набор данных, содержащий изображения поперечного сечения. Выберите настройки по умолчанию NRecon программных SkyScan в за исключением следующего.- Измените Изменить Кольцо Артефакт до 20.
- Измените Изменить Луч Hardening до 25%.
- Отрегулируйте CS Static Rotation сделать поперечного сечения уровень изображения.
- Обработка изображений
Использование программного обеспечения SkyScan в CTAN для получения конечного 3D, черно-белое изображение. Настройте диапазон серой шкалы на соответствующем уровне, чтобы удалить артефакты из пенополистирола и парафильмом.
Образцы, подготовленные полировки для наноиндентирования и micro-/nano-structure характеристики были изучены с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM). Режим низкого вакуума была использована, чтобы минимизировать обезвоживание образцов и необходимость применения проводящих покрытий. Часовой химический анализ проводили на полированных образцов в сочетании с SEM визуализации с использованием энергии-дисперсионные рентгеновской спектроскопии (EDX). EDX анализ проводили на той же линии / сетки, анализировали с помощью наноиндентирования для обеспечения корреляции между химическими и механическими свойствами. Недавно перелом поверхности были также рассмотрены SEM для обеспечения более полной информации о морфологии и ориентации biomineralized структур, присутствующих в рыбьей чешуи. Чтобы улучшить качество изображения для наблюдения за нано-структуры на поверхности излома, образцы напылением золота (Au) и отображается в режиме высокого вакуума. Следующийпредоставляет дополнительную информацию о процедурах, применяемых.
- SEM Визуализация полированных поверхностей
- Наведите полированного образца в SEM камеры и насос камеру в режим пониженного вакуума с камеры давления от 0,1 до 0,5 мбар.
- Отрегулируйте рабочее расстояние примерно 5,0 мм.
- Активируйте высокого напряжения (HV) и перейдите к интересующей области на образце, который включает переходную зону между ganoine и костных подслоях или других областях, представляющих интерес.
- Получение изображений в HV 15 кВ и током пучка около 3,9 нА.
- Фокус изображение и выполнять все необходимые выравнивания и корректировки stigmation.
- Захват изображения с не менее трех регионах, представляющих интерес на соответствующих увеличениях (обычно 250X до 10000 X) с помощью низкого вакуума обратного рассеяния электрон (БФБ) детектора, чтобы помочь в идентификации изменений в биоминеральной содержания и плотности (то есть, плотные кости против пористые кости ).
- SEM Визуализация поверхности излома
- Прикрепите недавно перелом образца к заглушке 90 ° SEM помощью двусторонней углерода ленту с поверхности разрушения вверх.
- Sputter слой с Au с получением густого проводящий слой суб-нм на поверхности излома.
- Поместите образец в SEM камеры и насос камеру в режим высокого вакуума.
- Отрегулируйте рабочее расстояние до от 3,0 до 5,0 мм.
- Активируйте HV и перейдите к регионах, представляющих интерес на образец. Основные области, представляющие интерес в этом случае были структура присутствует в ganoine и костных слоев.
- Получение изображений в пределах от 5 кВ и 15 HV кВ и более низкой током пучка 0,24 нА чтобы улучшить качество изображения.
- Первоначально сосредоточиться образец и выполнять предварительные выравнивания.
- Увеличение увеличение до более чем 5000 X и переход от нормального объектива эмиссии поля в погружной / сверхвысоким разрешением (UHR) линзы.
- Выполните UHR выравнивания и корректировки stigmation.
- Захват изображения с не менее трех регионах Oе интерес у соответствующих увеличениях (обычно 5000 X до 250000 X) с помощью через детектор объектива (TLD), работающие в вторичных электронов режиме (SE).
- EDX анализ полированных поверхностей (выполняется совместно с изображениями SEM). Эти параметры материала зависит и должны быть скорректированы таким образом, объем взаимодействия EDX похожа по размеру с объемом наноиндентирование взаимодействия как обсуждалось Мозером 14.
- Перейдите к области интереса на полированного образца, которая включает наноиндентирования сетку, указанный точек отсчета в конце каждой строки отступов.
- Убедитесь, HV составляет не менее 15 кВ, ток пучка составляет не менее 3,9 нА, а рабочее расстояние больше, чем 5,0 мм.
- Захват BSE образ региона, которые будут проанализированы с помощью EDX.
- Использование ПО EDX анализа, захватить и то же изображение, чтобы помочь в поиске областей провести химический анализ по линии отступов.
- Использование «Анализ линия" технику, POsition линию для выполнения химического анализа по линии интересах отступов, начиная с первого абзаца и заканчивающийся в последнем абзаце.
- Укажите количество точек анализа, который будет помещен вдоль линии. Лучше всего использовать такое же количество пунктов анализа и углублений, которые присутствуют для обеспечения прямого пространственную корреляцию между химическим составом и механическими свойствами.
- Когда линия находится и указано точки правильно, инициировать анализ строки с помощью программного обеспечения EDX.
- Когда анализ линия завершена, идентифицировать элементы, представляющие интерес для быть количественно из спектров, полученных точке вдоль указанной линии на полированной поверхности образца.
- После того, как элементы, представляющие интерес определены, выполнить калибровку фона для учета тормозного излучения и других эффектов.
- Выберите опцию анализа деконволюция программного обеспечения, которые, чтобы получить количественный анализ на каждой точке вдоль указанной линии к Quanтифы химический состав в каждой точке.
- Сохранение результатов количественного химического анализа наряду с изображением заданной линии, что было проанализировано, чтобы помочь в пространственной корреляции с механическими свойствами, измеренных с помощью наноиндентирования.
Representative Results
На рисунке 3 приведены средние результаты пространственно-коррелированных nanoinidentation / SEM / EDX анализа, проведенного через примерно 800 мкм длительного короткой оси поперечного сечения. В примерно 60 мкм толщиной ganoine слоя, наноиндентор рассчитали среднюю модуль 69,0 ГПа и твердостью 3,3 ГПа. Наноиндентор определяется средний модуль 14,3 ГПа и твердостью 0,5 ГПа для примерно 740 мкм толщиной кости слоя.
EDX определяется углерод, кислород, кальций и фосфор, которые обычно встречаются в минерализованных масштабах. Тем не менее, ganoine и костные слои содержали различий в количественной оценке химического состава. Наблюдаемое углерода шип в костном слое может быть связано с том, что область не столь же высокой минерализацией, что приводит к незначительному увеличению углерода, что также вызвало наблюдаемое снижение общей яркости BSE изображения. В частности, ganoine слой "; С означает соотношение атомной концентрации Са: Р 1,71 появились похожие на гидроксиапатита с теоретическим отношением 1,67. Средняя Са кости слоя: Р снизилась до 1,51 представляет собой сокращение в размере минерализации от ganoine слоя.
ИК спектры на рисунке 4 для слоя костной ткани и ganoine слой определили основные функциональные группы, как амид, карбоксильной, фосфата и карбонила. В частности, ИК подтвердили визуальное наблюдение гидроксиапатита подписей в наружной (ganoine) слоя и коллагеновых подписей во внутреннем слое (кость). Пики при 3,500-3,000 см -1 из-за NH растяжения и NH изгиб между 1550 и 1500 см -1 представляют амидные группы в костном слое. Пики в области волновое число 1,470-1,365 см -1 представляют амидные алкильные группы. Кроме того, отличительной C = O растяжения при 1641 см -1 наблюдали на костном слое. Горохкс от 3,000-2,500 см -1 представляют карбоксильные группы. Спектры Оба кости и ganoine слоев производится отличительный пик вблизи 1,079.33 см -1, указывающих на растяжение фосфат.
Рентгеновского изображения КТ на фиг.5 захватывает, что ganoine слой не покрывает слой кости, где масштабы перекрываются друг с другом. Более яркие серые слои ganoine указывают более плотные, более твердые и жесткие фазы в то время как более темные серые слои кости указывают менее плотные и менее жесткие фазы. Кроме того, снимки РКТ оказана помощь в выявлении неравномерности в ganoine толщины слоя. В самом деле, ясно ямы наблюдаются близко к центру ganoine слоем, который не покрывают костный слой вообще.
СЭМ-изображение на рисунке 6А поверхности разрушения травления с H 3 PO 4 показал наноструктур организованные в слоистой шаблон для ganoine слоя. Это наностержней организованнаяСтруктура коррелирует с гидроксиапатита подписей, полученных из FTIR для области ganoine.
6А изображена типичная ниже увеличения СЭМ микрофотография поверхности разлома четко определяющий переход между ganoine и костных слоев с пунктирной линией. 6В изображает большем увеличении СЭМ изображения поверхности разрушения после травления с H 3 PO 4. После травления, ориентированных наностержней в наружной ganoine слоя четко определить в то время как волокна, как наноструктуры наблюдается в костном слое.
Рисунок 3. Модуль и твердости данные наноиндентировании пространственно коррелирует с SEM / EDX химического состава.
Рисунок 4. ИК спектры собраны от внешнего (ganoine) и внутренняя (костная) слои.
Рисунок 5. РКТ изображения, показывающие точечной коррозии на наружной (ganoine) слой, покрывающий внутреннюю (костное) слой.
Рисунок 6. (A) низкого увеличение СЭМ-изображение поверхности излома типичной, (B) большем увеличении изображения наностержни во внешней (ganoine) и волокна во внутреннем (Bоны) слои .. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
С экспериментальной точки зрения, исследователи должны помнить, что при работе с естественным биологические материалы, такие как минерализованных рыбьей чешуи, отчетности пространственное положение шкале на рыбу является критическим, поскольку до исследования показали, механические свойства минерализованных рыбьей чешуи зависят где масштабы были расположены на рыб 4.
Механические свойства минерализованных биологических материалов также было показано, что в зависимости от состояния гидратации образцов 4. Это ограничивает полезность этой техники при попытке сравнить свежие образцы, которые были правильно гидратированных опубликованным результатам в открытой литературе, которые используют сухие окаменелые образцы. Таким образом, длительные раз тестирования необходимо избегать, чтобы свести к минимуму последствия обезвоживания на механические свойства образца во время наноиндентирования. Материал конкретные пилотные исследования рекомендуется обеспечить эксперименния выполнения достаточно минимальна не менять механическое поведение материала. Мокрый наноиндентирование клеток будет предпочтительным методом для поддержания постоянного гидратации состояние материала, если испытательное оборудование позволяет.
Способ наноиндентирование используемый в данном исследовании, который рассчитывается модуль упругости по кривой разгрузки предполагает, что материал ведет себя как линейного упругого изотропного материала. Этот метод может быть использован с различными обжимными штампами. Тем не менее, трехсторонний Беркович наконечник с половиной угла 65,35 ° была использована в данном исследовании. Альтернативные советы, такие как куба углу (половина угол = 35.36 °) подходят для процедуры, представленной в этой рукописи, но так как куб углу наконечник острее, чем кончик трещин Беркович могут быть получены в образце при гораздо меньших нагрузок, чем с верхушка Беркович.
Полировка является важным шагом для получения гладкой и ровной поверхности с свернутом Surfacэ шероховатость, чтобы не повлиять на результаты Наноиндентирование. Шаги полировки, представленные в этой рукописи Предлагаемая процедура, что, возможно, потребуется внести изменения в зависимости от типа полировщика используется. Тем не менее, важным шагом для обеспечения точных данных наноиндентирования в том, что шероховатость поверхности сводится к минимуму, а для этого конкретного материала нм финал польский 50 требовалось, чтобы получить гладкую плоскую поверхность на глубинах отступа зондируемой.
Расстояние между абзацами также гарантирует точные данные наноиндентирования, что не зависит от деформации материала, происходящего от предыдущих абзацах. Руководство пользователя наноиндентор для оборудования в этом исследовании предложил абзац расстояние должно быть не менее 20-30x максимальная глубина проникновения Беркович инденторами 15. Для альтернативных материалов, требуемое расстояние отступ должен будет определяться на основе приложенной нагрузки и максимальной глубины отпечатка, как описано выше в открытомлитература 16,17. Кроме того, время удержания для этого материала был выбран, чтобы преодолеть любые ползучести наблюдается для различных материальных фаз исследуемых позволяет в наноиндентор программного обеспечения Оливер-Pharr метода анализа, который будет использоваться. Однако, как обсуждалось на Oyen 18 альтернативные методы анализа доступны для биологических материалов при материальные зависящие от времени ответы не могут быть преодолены с подходящими раз трюмных.
Для достижения результатов с высоким разрешением из РКТ, несколько параметров должны быть оптимизированы. В этом документе излагаются очень специфический набор параметров для использования на рыбьей чешуи с уникальным размером и слоистой толщины. С разных размеров выборки, эти параметры должны быть отрегулирован для получения набора данных самого высокого качества. Процесс выбора каждого параметра должны быть четко определены в инструкции, которая поставляется с машина используется. Параметры сканирования (напряжение, ток, экспозиция, выбор фильтра) и настройки реконструкции(кольцевые артефакты, закалка света), возможно, придется быть изменен, чтобы приспособить множество других размеров выборки и геометрии.
РКТ при условии, образ целого масштабного морфологии, идентифицирующий ganoine слой, покрывающий костлявый слой материала только там, где масштабы не перекрывают друг друга. Образы РКТ также определили, что ganoine слой состоял из неодинаковой толщины по всей шкале, и даже выставлены ямы, что в целом не хватило ganoine слой.
Интересно, что данные наноиндентирование пространственно коррелирует с химического анализа СЭМ / EDX определили резкое дискретный переход между 2 слоями вместо более постепенного перехода наблюдается для минерализованных рыбы масштабах P. senagalus (в Bruet др.. 2).
Сочетание наноиндентировании, ИК-Фурье, EDX, и SEM условии механические свойства, химический анализ и структурную информацию для подтверждениянаружный слой как ganoine с эмалью, как морфологии и химии. Кроме того, эти методы подтверждают внутренний слой в виде костной слоя материала.
В заключение, методы, описанные в данном исследовании определены порядок и соответствующие результаты для изучения минерализованной рыбы шкалу А. шпатель из объемной структуры вплоть до состава наноструктур и химической.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить признательность за финансовую поддержку этой работы, предоставленной 6.1 Базовая программа армии США ERDC Военная Engineering Research и ERDC Центра Программы исследований, направленных. Авторы также хотели бы поблагодарить персонал и материальные средства в ERDC геотехнических и бетона и материалов Отрасль Структурная лаборатории для поддержки экспериментальных работ. Разрешение на публикацию было выдано Лаборатории директор, геотехнической и сооружений.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Epoxy resin | Buehler | 701-501512 | |
| Epoxy hardener | Buehler | 703-501528 | |
| Samplkups | Buheler | 20-8180 | |
| SamplKlips I | Buehler | 20-4100-100S | |
| High precision cut-off saw | Buehler | Isomet | |
| UltraMet 2002 sonic cleaner | Buehler | B2510R-MT | |
| Polisher | Buehler | 49-1750-160 | |
| 1,200 grit (15 μm) SiC paper | Struers | 40400012 | |
| 4,000 grit (6 μm) SiC paper | Struers | 40400014 | |
| 50 nm colloidal silica | Buehler | 40-10075 | |
| Chemomet polishing pad for 50 nm suspension | Buehler | 40-7918 | |
| Nanoindenter | MTS | G200 | |
| FTIR continuum microscope | Thermo Nicollet | 6700 | |
| X-ray computed tomography | Skyscan | Skyscan 1173 | |
| SEM | FEI | NovaNanoSEM 630 | |
| EDX | Bruker | AXS Xflash detector 4010 | |
| Sputter coater | Denton | Desk II |
References
- Allison, P. G., et al. Mechanical properties and structure of the biological multilayered material system, Atractosteus spatula scales. Acta Biomater. 9, 5289-5296 (2013).
- Bruet, B. J. F., Song, J., Boyce, M. C., Ortiz, C. Materials design principles of ancient fish armour. Nat. Mater. 7, 748-756 (2008).
- Lin, Y. S., Wei, C. T., Olevsky, E. A., Meyers, M. A. Mechanical properties and the laminate structure of Arapaima gigas scales. J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 4, 1145-1156 (2011).
- Marino Cugno Garrano, A., et al. On the mechanical behavior of scales from Cyprinus carpio. J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 7, 17-29 (2012).
- Song, J., et al. Quantitative microstructural studies of the armor of the marine threespine stickleback (Gasterosteus aculeatus). J. Struct. Biol. 171, 318-331 (2010).
- Wang, L., Song, J., Ortiz, C., Boyce, M. C. Anisotropic design of a multilayered biological exoskeleton. J. Mater. Res. 24, 3477-3494 (2009).
- Ikoma, T., Kobayashi, H., Tanaka, J., Walsh, D., Mann, S. Microstructure, mechanical, and biomimeetic properties of fish scales from Pagrus major. 142, 327-333 (2003).
- O'Connell, M. T., Shepherd, T. D., O'Connell, A. M. U., Myers, R. A. Long-term declines in two apex predators, bull sharks (Carcharhinus leucas) and alligator gar (Atractosteus spatula), in Lake Pontchartrain, an Oligohaline estuary in southeastern Louisiana. Estuar. Coast. 30, 567-574 (2007).
- Long Jr, J. H., Hale, M. E., McHenry, M. J., Westneat, M. W. Functions of fish skin: flexural stiffness and steady swimming of longnose gar Lepisosteus osseus. J. Exp. Biol. 199, 2139-2151 (1996).
- Page, L. M., Burr, B. M. A field guide to freshwater fishes. The Peterson field guide series. , Houghton Mifflin Company. (1991).
- Thompson, K. S., McCune, A. R. Development of the scales in Lepisosteus as a model for scale formation in fossil fishes. J. Linn. Soc. Longdon, Zool. 82, 73-86 (1984).
- Yang, W., et al. Structure and fracture resistance of alligator gar (Atractosteus spatula) armored fish scales. Acta. Biomater. 9, 5876-5889 (2013).
- Moser, R. D., Allison, P. G., Chandler, M. Q. Characterization of Impact Damage in Ultra-High Performance Concrete Using Spatially Correlated Nanoindentation/SEM/EDX. J. Mater. Eng. Perf. 22, 1-7 (2013).
- Oliver, W. C., Pharr, G. M. An improved technique for determining hardness and elastic modulus using load and displacement sensing indentation experiments. J Mater Res. 7, 1564-1583 (1992).
- Agilent Technologies Nano Indenter G200 User's Guide. , Agilent Technologies Inc. Palo Alto. (2012).
- Ulm, F. J., et al. Statistical indentation techniques for hydrated nanocomposites: concrete, bone, and shale. J. Amer. Cer. Soc. 90, 2677-2692 (2007).
- Randall, N. X., Vandamme, M., Ulm, F. -J. Nanoindentation analysis as a two-dimensional tool for mapping the mechanical properties of complex surfaces. J. Mater. Res. 24, 679-690 (2009).
- Oyen, M. L. Nanoindentation of Biological and Biomimetic Materials. Exper. Tech. 37, 73-87 (2013).
