Summary
Un metodo è descritto per la purificazione efficiente di proteine di fusione twin-Strep-tag e dei loro complessi specifiche in materia di streptavidina modificato (Strep-Tactin) resina covalentemente reticolato con Bis (Sulfosuccinimidil) suberato (BS3). Il metodo ha i vantaggi di velocità veloce, buon recupero proteina bersaglio ed elevata purezza, ed è compatibile con la successiva analisi mediante spettrometria di massa.
Abstract
Purificazione per affinità di proteine di fusione Strep-targhetta di resine che trasportano una streptavidina allestita (Strep-Tactin) è diventato un metodo ampiamente utilizzato per l'isolamento di complessi proteici in condizioni fisiologiche. Proteine di fusione contenenti due copie di Strep-tag II, designate twin-Strep-tag o SIII-tag, hanno il vantaggio di una maggiore affinità per Strep-Tactin rispetto a quelli che contengono un solo Strep-tag, permettendo così più efficiente purificazione di proteine. Tuttavia, questo vantaggio è compensato dal fatto che eluizione delle proteine twin-Strep-taggate con biotina può essere incompleta, portando a basso recupero di proteine. Il recupero può essere notevolmente migliorata utilizzando denaturazione eluizione con sodio dodecil solfato (SDS), ma questo porta a campionare contaminazione con Strep-Tactin rilasciato dalla resina, rendendo il saggio incompatibile con analisi proteomica valle. Per superare questa limitazione, abbiamo sviluppato un metodo in base al quale tetramero resina accoppiata di Strep-Tactinè prima stabilizzato da covalente reticolazione con Bis (Sulfosuccinimidil) suberato (BS3) e la resina reticolata risultante viene poi utilizzato per purificare bersaglio complessi proteici in un singolo passaggio di purificazione batch. Eluizione efficiente con SDS assicura buon recupero proteina, mentre l'assenza di contaminazione Strep-Tactin permette valle proteina analisi mediante spettrometria di massa. Come un proof of concept, descriviamo qui un protocollo per la purificazione della proteina virale SIII-tagged VPG-Pro da nuclei di N. infettato da virus piante benthamiana utilizzando la resina di polimetacrilato Strep-Tactin reticolato con BS3. Lo stesso protocollo può essere utilizzato per purificare qualsiasi proteina twin-Strep-tag di interesse e caratterizzare suoi partner di legame fisiologiche.
Introduction
Negli ultimi anni, la tecnologia Strep-tag è stato ampiamente utilizzato in molti settori della ricerca biomedica, tra cui la proteomica e la biologia strutturale. Questa tecnologia purificazione della proteina, che si basa sulla fusione di proteine ricombinanti ad una breve Strep-tag peptide, è maturata con l'avvento di matrici di affinità che trasportano Strep-Tactin, una variante geneticamente di streptavidina con una migliore capacità di legame peptidico. 1, 2 proteine di fusione contenenti due copie di Strep-tag II, designate twin-Strep-tag o SIII-tag, mostrano una maggiore affinità per le matrici Strep-Tactin di quelli contenenti un solo Strep-tag, garantendo la depurazione più efficiente delle proteine ricombinanti e i loro partner di legame associate. Tuttavia, la maggiore affinità delle proteine twin-Strep-tagged per Strep-Tactin ha anche il suo rovescio della medaglia. Eluizione concorrenziale di tali proteine con eccesso di biotina può essere incompleta, con conseguente riduzione della resa di proteine bersaglio. A mminerale efficiente alternativa è eluizione con SDS, ma porta alla contaminazione del campione indesiderato con Strep-Tactin rilasciato dalla resina, rendendo il test incompatibile con l'analisi proteomica. Questo articolo presenta una tecnica per superare questa limitazione prima stabilizzazione del tetramero resina accoppiata di Strep-Tactin dal chimico cross-linking e quindi utilizzando SDS per eluire le proteine twin-Strep-taggate e dei loro complessi associati dalla risultante resina reticolata. Così, sufficiente resa di proteine può essere realizzata senza contaminazione del campione con Strep-Tactin, consentendo così un'ulteriore analisi mediante spettrometria di massa.
Il metodo è adatto per la purificazione di una proteina di fusione ricombinante con un SIII-tag-superficie esposta 3 o twin-Strep-tag (WSHPQFEK sequenza aminoacidica (GGGS) 3 WSHPQFEK e SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK, rispettivamente). La proteina può essere di origine animale, vegetale o batterica e può essere isolato da entrambi cellulare totalelisato o frazione organello arricchito. Come esempio, si descrive qui la purificazione di una proteina SIII-tag VPG-Pro di Potato virus A (PVA) 4 dalla frazione nucleare di PVA-infettati Nicotiana benthamiana. La frazione nucleare è stato isolato come descritto in precedenza 5, con le seguenti modifiche: cellule non sono state trattate con formaldeide, butirrato di sodio è stato sostituito in tutti i buffer con fluoruro di sodio 5 mM, inibitore della proteasi completo è stato sostituito con PMSF, Triton X-100 in concentrazione estrazione tampone # 2 è stato ridotto al 0,3% (v / v) e il pellet nucleare ottenuto mediante centrifugazione attraverso cuscino di saccarosio (tampone di estrazione # 3) è stato risospeso in 1,45 ml di tampone di legame pre-raffreddata e ruotata per 1,5 ore a 4 ° C. L'estratto nucleare risultante contiene la proteina esca SIII-tag e complessi associati (campione proteina esca) è stato elaborato secondo il protocollo descritto di seguito (vedere paragrafo 2).
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Protocol
1. Cross-linking di Strep-Tactin Polimetacrilato resina con Bis (Sulfosuccinimidil) suberato (BS3)
- Equilibrare una provetta sigillata contenente 2 mg di BS3 reticolante a temperatura ambiente. ATTENZIONE: BS3 è una sostanza pericolosa. Indossare guanti e occhiali protettivi.
- Risospendere Strep-Tactin resina di polimetacrilato (sospensione al 50% in 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl) di breve vigorosa agitazione e trasferire immediatamente 600 ml di sospensione ad una colonna di spin con un puntale con l' end tagliata.
- Centrifugare a 1500 xg per 30 secondi a temperatura ambiente. Scartare il flow-through e aggiungere 450 ml di tampone fosfato salino (PBS) alla colonna.
- Ripetere il passaggio precedente 2 più volte per sostituire completamente tampone Tris con PBS e lasciare la resina in 430 ml di PBS a pH 8,0 dopo l'ultima centrifugazione.
- Forare il foglio della provetta con BS3 con un puntale contenente 1001; l di acqua ultrapura. Sciogliere la polvere BS3 in acqua pipettando gentilmente su e giù e immediatamente aggiungere 20 ml di soluzione alla colonna di spin. La concentrazione finale di BS3 nella reazione di reticolazione è ~ 1,2 mM.
- Ruotare la colonna per 30 minuti a temperatura ambiente. Verificare che la resina viene miscelata correttamente con la soluzione BS3.
- Per spegnere la reazione, aggiungere 6 ml di 3M Tris-HCl, pH 7.5 e ruotare la colonna per altri 15 minuti a temperatura ambiente.
- Centrifugare a 1500 xg per 30 secondi a temperatura ambiente. Gettare il flow-through e risospendere la resina reticolata in 450 ml di soluzione salina tamponata Tris con Tween 20 (TBST). Ripetere la centrifugazione e lavare i passaggi altre due volte. Nell'ultima fase, risospendere la resina in 450 ml di TBS.
- Trasferire la sospensione di resina in una nuova provetta utilizzando una punta di pipetta con l'estremità tagliata. Risospendere la resina nella colonna a sinistra con altri 450 ml di TBS e trasferimento al tubo stesso. Ripetere the ultimo passo nuovamente al massimo il trasferimento della resina dalla colonna al tubo.
- Lasciare riposare la provetta per 10 minuti a temperatura ambiente e regolare il volume a 600 ml rimuovendo l'eccesso di TBS. La resina è pronta per l'uso immediato (raccomandato) o può essere conservato a 4 ° C, senza congelare.
2. Legame della proteina Bait Twin-Strep-tag e associate Complessi al Cross-linked Strep-Tactin Polimetacrilato Resina
- Centrifugare 1 ml del campione proteina esca in tampone di legame a 17.000 xg per 10 min a 4 ° C e trasferire il surnatante in una nuova provetta.
- Per minimizzare legame di proteine endogene biotinilati alla resina Strep-Tactin, aggiungere avidina ad una concentrazione finale di 100 pg / ml e ruotare per 15 min a 4 ° C.
- Se la resina reticolata dal punto 1.10 è stato conservato per un periodo di tempo prolungato a 4 ° C, raccogliere la resina mediante centrifugazione a 400 xg for 1 min a 4 ° C, scartare il surnatante e lavare la resina con 1 ml di TBST. Ripetere la centrifugazione e lavaggio passaggi altre due volte, prima con TBST e poi con TBS. Centrifugare la provetta a 400 xg per 1 min a 4 ° C e regolare al volume originale rimuovendo l'eccesso di TBS.
- Risospendere il reticolato resina Strep-Tactin nel vortex. Immediatamente aggiungere 50 microlitri della sospensione resina per il tubo contenente il campione di proteina esca con una punta di pipetta taglio e ruotare per altri 30 min a 4 ° C.
- Durante l'attesa, impostare thermomixer a 55 ° C e preriscaldare 500 microlitri di tampone di eluizione per uso nel passaggio 3.1.
- Centrifugare a 400 xg per 1 min a 4 ° C. Eliminare il supernatante e lavare la resina su un rotatore per 5 minuti a 4 ° C con 1 ml di pre-raffreddata tampone di lavaggio # 1. Ripetere la centrifugazione e lavare passi tre volte. Nell'ultima fase, risospendere la resina in 250 ml di tampone di lavaggio # 2.
- Tr ansfer la sospensione resina per una colonna di spin fresco. Risospendere la resina rimanente nel tubo in altri 250 ml di tampone di lavaggio # 2 e trasferire alla stessa colonna.
- Centrifugare a 400 xg per 3 min a 4 ° C, scartare il flow-through e trasferire la colonna di una fiala delfini naso 2 ml. Procedere immediatamente alla fase di eluizione sotto.
3. Eluizione di specifici complessi proteici
- Aggiungere 150 ml di tampone di eluizione preriscaldato dal punto 2.4 alla colonna di spin.
- Incubare in thermomixer per 5 minuti a 55 ° C, agitando a 1.400 rpm.
- Centrifugare a 1500 xg per 1 minuto a temperatura ambiente.
- Eliminare la colonna e memorizzare le proteine bersaglio purificate a ≤ -20 ° C.
| Tampone fosfato salino (PBS) | Na 2 HPO 4 | 10 mM |
| KH 2 PO 4 | 2mM |
| NaCl | 137 mm |
| KCl | 2.7 mM |
| pH regolato a 7,4 se non diversamente specificato (pH 8.0 nella sezione 1.4) | |
| Tris soluzione salina tamponata (TBS) | |
| Tris-HCl, pH 7.4 | 50 mM |
| ght = stile "20" = "height: 20px; width: 299px;"> NaCl | 150 mm |
| Tris tamponata salina con Tween 20 (TBST) | |
| Tris-HCl, pH 7.4 | 50 mM |
| NaCl | 150 mm |
| Tween 20 | 0,1% (v / v) |
| Tampone di legame | |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 25 mm |
| NaCl | x "> 550 mm|
| NaF | 5 mM |
| EDTA | 0,5 mm |
| Glicerina | 10% (v / v) |
| PMSF | 0,1 mm |
| Lavare tampone # 1 | |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 25 mm |
| NaCl | 500 mm |
| NaF td> | 5 mM |
| EDTA | 0,4 mm |
| Igepal CA-630 | 0,2% (v / v) |
| Glicerina | 5% (v / v) |
| PMSF | 0,1 mm |
| Lavare tampone # 2 | |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 25 mm |
| NaCl | 150 mm |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 25 mm |
| SDS | 1% (w / v) |
Tabella 1. Buffer utilizzati nel presente studio.
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Representative Results
La procedura di purificazione è schematicamente illustrato in Figura 1, con una rappresentazione di problemi associati con altri metodi di purificazione esistenti.
Figura 1. Rappresentazione schematica della procedura di purificazione. Il flusso di lavoro comprende stabilizzazione della Strep-Tactin tetramero resina accoppiati tramite reticolazione covalente con BS3, legame della proteina esca twin-Strep-tag e complessi legati alla resina reticolata , lavando via di proteine non legate, eluizione dei complessi proteici specificamente legati con 1% SDS e la loro analisi mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) denaturazione. Due sfere rosse nella proteina esca indicano il twin-Strep-tag. Limitazioni di altri metodi di purificazione sono mostrati in insertocaselle a destra. Essi comprendono eluizione incompleta delle proteine bersaglio con biotina e la contaminazione del campione con Strep-Tactin seguente denaturazione eluizione con 1% SDS.
Risultati tipici della purificazione di proteine SIII-marcato mediante il BS3-reticolato resina di polimetacrilato Strep-Tactin e eluizione denaturazione con 1% SDS sono illustrati nella Figura 2. 10% (15 ml) della colonna eluato centrifuga contenente purificato SIII-tag proteine PVA VPG-Pro e collegate sono stati analizzati mediante SDS-PAGE seguita da colorazione argento. L'assenza della banda di 52 kDa corrispondente al PVA VPG-Pro nella corsia controllo negativo confermato la specificità del pull-down. 40 microlitri della restante centrifuga colonna eluato sono stati applicati ad un gel SDS-free cheratina e la corsia corrispondente è stato tagliato fuori e le proteine contenute stati digeriti con tripsina e analizzati mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS). L'analisi di spettrometria di massa ha identificato virale RNA-dependent RNA polimerasi (replicasi) Pennino come partner interagente di VPG-Pro. Più peptidi triptici corrispondenti a pennino sono stati rilevati in tutti e quattro repliche biologiche della purificazione per affinità e nessuno dei quattro controlli esprimono VPG-Pro senza l'SIII-tag, confermando la specificità di interazione. Poiché il peso molecolare del NIB (59 kDa) è vicina a quella di SIII-tagged VPG-Pro (52 kDa), le due proteine è apparso come un doppio band durante SDS analisi PAGE (Figura 2, punta di freccia). Nel loro insieme, i risultati sopra descritti forniscono la prova sperimentale che purificazione per affinità di resine Strep-Tactin covalentemente reticolato con BS3 può essere impiegato con successo per isolare le proteine twin-Strep-tag e identificare i loro partner di legame fisiologico mediante spettrometria di massa.
Figura 3. Biotina eluizione di SIII-tagged PVA VPG-Pro da Strep-Tactin resina di polimetacrilato èincompleto rispetto a eluizione con 1% SDS. La figura mostra un immunoblot anti-VPG di eluati da Strep-Tactin perline. Le perle sono state eluite con biotina o 15 mM o con 1% SDS. La differenza di intensità di segnale riflette rese diverse proteici ottenuti con le due tecniche di eluizione. I controlli negativi corrispondono alle purificazioni da cellule infettate con il virus esprime VPG-Pro senza l'SIII-tag.
Figura 4. Covalente reticolazione con BS3 impedisce il rilascio di Strep-Tactin dalla resina durante SDS eluizione. La figura mostra un gel-argento macchiato di SDS eluati da non reticolato (corsia sinistra) e BS3-reticolato (corsia di destra) Strep-Tactin resina polimetacrilato. Si noti la presenza di rilasciato Strep-Tactin sulla corsia di sinistra, ma la sua assenza sulla corsia di destra.
Figura 5. Struttura chimica di Bis (Sulfosuccinimidil) suberato (BS3) e la sua reazione di reticolazione con gruppi amminici epsilon di residui di lisina in Strep-Tactin.
Figura 6. Purificazione di proteine twin-Strep-tag fluorescente verde (GFP) sulla non-cross-linked e BS3-cross-linked Strep-Tactin resina di polimetacrilato. Due quantità uguali di embrionali renali 293 cellule umane che esprimono GFP twin-Strep-tag state lisate e analogamente trasformati utilizzando il protocollo di cui sopra, tranne che in un caso la resina è stata reticolata con BS3 e nell'altro BS3 ha essereen sostituito con acqua nella reazione di reticolazione. La figura mostra un gel SDS-poliacrilammide-argento macchiato e immunoblot anti-GFP di proteine purificate. Si noti che alcuni diminuzione della resa di proteine è inerente ai metodi di purificazione coinvolgono reticolazione chimica, ma questo è compensato dal maggiore purezza del campione per l'assenza di rilasciato Strep-Tactin.
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Discussion
Il protocollo di cui sopra può essere usato per purificare qualsiasi proteina esca twin-Strep-tag di interesse e suoi complessi associati in qualsiasi tampone adatto che non contiene biotina o denaturanti forti. Nella versione attuale del protocollo, vincolante e lavaggio vengono eseguiti in condizioni relativamente restrittive in presenza di elevata sale e detergente non ionico. Anche se questo si traduce in meno sfondo, complessi proteici fragili possono dissociare in queste condizioni. Per conservare tali complessi minore affinità, concentrazione salina può essere abbassata e detergente non ionico può essere ridotto o omesso dai buffer di legame e lavaggio.
Il vantaggio principale del sistema twin-Strep-tag è l'alta affinità della piccola (3kDa) tag tandem a streptavidina allestita (Strep-Tactin) 1, 2, consenta un'efficace purificazione di uno stadio di proteine bersaglio e loro complessi anche in lotti modalità. A causa del forte legame di twin-Strep-tagStreptococco-Tactin, la resina può essere lavato in condizioni moderatamente stringenti, come l'elevata detersivo e / o concentrazioni saline, che si traduce in una maggiore purezza proteina bersaglio. Tuttavia, tale forte legame ha anche i suoi svantaggi. Anche nel caso di proteine con un singolo Strep-tag II (sequenza aminoacidica WSHPQFEK), eluizione competitivo dalla resina può essere a volte difficile. Ad esempio, eluizione di Strep (II)-tagged proteine chinasi, NtCDPK2, dalla resina di polimetacrilato Strep-Tactin con 10 mM desthiobiotin dimostrato di essere soccombente, richiedendo eluizione denaturazione con tampone campione SDS 6. Il problema è stato risolto solo dopo desthiobiotin stato sostituito con forte biotina concorrenti (10 mM) e l'eluizione è stata condotta per 5 minuti con agitazione vigorosa 7. Nel caso del doppio Strep-tag, che ha una maggiore affinità per Strep-Tactin, proteina bersaglio eluizione può essere incompleta anche a concentrazioni di biotina alto come 15 mM. Come mostrato in figura 3,solo una piccola frazione di SIII-tag PVA VPG-Pro potrebbe essere eluito dalla resina Strep-Tactin con biotina 15 mM rispetto alla quantità eluito con 1% SDS. È importante notare che l'efficienza di eluizione competitivo probabilmente dipende anche dalla natura della proteina eluita o complesso proteico. Proteine più grandi e più idrofobo può stericamente ostacolare l'accessibilità della tasca di legame biotina in Strep-Tactin, rendendo così eluizione competitivo meno efficiente. Gli inconvenienti di cui sopra sono evitati mediante eluizione con SDS, ma ad eluizione ha i suoi problemi, soprattutto che ruota intorno al fatto che l'esposizione a detergenti porta alla dissociazione dei tetrameri Strep-Tactin resina accoppiati e la contaminazione del campione con rilasciato Strep-Tactin 8. Questo è dimostrato in figura 4 (corsia sinistra), che mostra una notevole quantità di Strep-Tactin rilasciato dopo incubazione della resina Strep-Tactin in tampone di eluizione contenente 1% SDS. Tale contaminazione è inaccettabile seil campione deve essere ulteriormente analizzato da LC-MS/MS.
Una soluzione efficace al problema di contaminazione superiore è la stabilizzazione della resina accoppiato Strep-Tactin tetramero 9 da covalente reticolazione. A questo scopo, abbiamo impiegato un idrosolubile, non scindibile, omobifunzionali ammina-reattiva cross-linker BS3 con una storia di utilizzo efficace nello stabilizzare strutture proteiche 10-13. Figura 5 mostra la formula chimica di BS3 e la sua reticolazione reazione con libere gruppi epsilon amino di lisina nel Strep-Tactin. Quando il Strep-Tactin tetramero resina accoppiata stata stabilizzata mediante reticolazione con BS3, il problema della contaminazione del campione con rilasciato Strep-Tactin stata praticamente eliminata (Figura 4, corsia di destra). Poiché la reticolazione con BS3 non provoca vasta aggregazione della proteina 14, non riduce l'accessibilità della tasca di legame in streptavidina biotina, rendendo l'resina reticolata adatto per la purificazione di proteine di fusione Strep-tag. Va notato, tuttavia, che la reticolazione chimica delle proteine con attività biologica (anticorpi, ecc) stabilizza entrambi conformazioni proteiche attive e inattive, portando ad una perdita di attività. Ad esempio, il metodo immunoprecipitazione consolidata utilizzando anticorpi BS3-reticolato produce una resa proteina bersaglio inferiore rispetto a quello ottenuto con anticorpi non reticolato 15. Tuttavia, una certa perdita di attività biologica è considerato un compromesso accettabile per il miglioramento della purezza del campione. Abbiamo osservato risultati simili con la resina Strep-Tactin BS3-reticolato. La resa di proteine leggermente inferiore ottenuto con la resina reticolata è stata più che compensata dal notevolmente migliorata purezza del campione (Figura 6).
Un'altra possibile applicazione del metodo proposto è nella purificazione di proteine di membrana Strep-contrassegnati solubilizED con detergenti. Detergenti sono essenziali per mantenere tali proteine idrofobiche e loro complessi associati in soluzione, ma la loro presenza può portare a contaminazione del campione con Strep-Tactin rilasciato dalla resina di affinità. Un buon esempio di questo è la purificazione di una proteina di membrana Strep (II)-tag presso NTT1 su Strep-Tactin perline ai fini della proteina cristallizzazione 8. La presenza del laurylamidodimethylpropylaminoxide detergente (Lapao) nel tampone di eluizione portato alla liberazione di Strep-Tactin dalle perline e successiva crescita di cristalli indesiderati Strep-Tactin 8. Stabilizzazione della resina accoppiato Strep-Tactin tetramer da covalente cross-linking può fornire un mezzo efficace per superare questo problema.
In sintesi, reticolazione chimica è stata impiegata con successo per superare le limitazioni associate denaturazione eluizione dalla resina Strep-Tactin. Questo approccio ha aiutato a raggiungere una buona proteina bersaglio recupero senza introdurre contaminazioni del campione. Il metodo proposto può quindi essere utilizzato per identificare specifici partner di legame di proteine esca twin-Strep-contrassegnate mediante spettrometria di massa. Inoltre, il metodo può essere applicato per isolare e caratterizzare complessi nucleoproteici, compresi quelli reversibilmente reticolato con formaldeide, così come le proteine di membrana solubilizzate con detergenti. Infine, reticolazione chimica non modifica significativamente le proprietà fisiche della resina Strep-Tactin, rendendo la resina reticolata potenzialmente adatti per applicazioni ad alta produttività.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Noi riconosciamo con gratitudine il supporto tecnico di Sini Miettinen, Minna Pollanen e Taru Rautavesi. Ringraziamo Helka Nurkkala per la fornitura di cellule HEK 293 esprimenti twin-Strep-tag GFP e Pekka Evijärvi per la fornitura di apparecchi registrazione suono. Questo lavoro è stato finanziato dall'Accademia di Finlandia, concedere numeri 138.329, 134.684 e 258.978.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2 mg | Pierce/Thermo Scientific | 21585 | www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection. |
| Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension) | IBA | 2-1505 | www.iba-lifesciences.com |
| Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile | Costar (Corning) | 8163 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Dolphin-nose tubes | Costar (Corning) | 3213 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Avidin | IBA | 2-0204 | www.iba-lifesciences.com |
References
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