Summary
この方法は、ツインのStrepタグ融合タンパク質と共有結合的にビス（スルホスクシンイミジル）（BS3）で架橋された修正されたストレプトアビジン（ストレプト-Tactinの）樹脂上での具体的な複合体の効率的な精製方法が記載されている。この方法は、速い速度の利点は、良好な標的タンパク質の回収および高純度を有し、質量分析によるその後の分析に対応している。
Abstract
操作されたストレプトアビジン（のStrep-Tactinの）を有する樹脂上Strepタグ融合タンパク質のアフィニティー精製は、生理学的条件下でタンパク質複合体の単離のために広く用いられる方法となった。ツインStrepタグまたはSIIIタグを指定StrepタグIIの2つのコピーを含有する融合タンパク質は、より効率的なタンパク質精製を可能にする、単一のStrepタグを含有するものと比較してのStrep-Tactinのための高い親和性の利点を有する。しかし、この利点は、ビオチンとのツインStrepタグタンパク質の溶出は低タンパク質の回収につながる、不完全になる可能性があるという事実によって相殺される。回収率は劇的にドデシル硫酸ナトリウム（SDS）で変性溶出を使用することによって改善することができるが、これは下流のプロテオーム解析を用いたアッセイ互換性がなくなり、樹脂から遊離のStrep-Tactinの混入をサンプリングするために導く。この制限を克服するために、我々は、ストレプト-Tactinの方法により、樹脂結合型四量体を開発した第ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）で処理し、得られた架橋樹脂との架橋は、単一のバッチ精製段階における標的タンパク質複合体を精製するために使用される共有結合によって安定化される。ストレプト-Tactinのを汚染の不在は、質量分析による下流のタンパク質分析を可能にしながら、SDSによる効率的な溶出は、優れたタンパク質回収を確実にします。概念実証として、我々はここではウイルスに感染したNの核からSIIIタグ付きウイルスタンパク質のVPg-Proを精製するためのプロトコルを記述BS3と架橋したストレプト-Tactinのポリメタクリレート樹脂を用いてベンサミアナタバコ植物 。同じプロトコルは、目的の任意の二Strepタグタンパク質を精製し、その生理学的結合パートナーを特徴付けるために使用することができる。
Introduction
近年では、Strepタグ技術は、プロテオミクスと構造生物学などの生物医学研究の多くの分野で広く使用されるようになった。ショートStrepタグペプチドに組換えタンパク質の融合に依存するこのタンパク質精製技術は、ストレプト-Tactinの、改良されたペプチド結合能を有するストレプトアビジンの遺伝子操作された変異体を担持するアフィニティーマトリックスの出現により成熟した図1、図2ツインStrepタグまたはSIIIタグを指定StrepタグIIの2つのコピーを含有する融合タンパク質は、組換えタンパク質のより効率的な浄化を保証する、単一のStrepタグを含有するものよりストレプ-Tactinのマトリックスに対して高い親和性を示し、そしてそれに関連付けられた結合パートナー。しかし、連鎖球菌-TactinのにツインStrepタグタンパク質の高い親和性はまた、その欠点を持っています。過剰のビオチンを有するこのようなタンパク質の競合的溶出は、標的タンパク質の収率の低下につながる、不完全であってもよい。 M鉱石効率的な代替は、SDSで溶出されていますが、プロテオーム解析を用いたアッセイ互換性がなくなり、樹脂から遊離のStrep-Tactinのとの望ましくないサンプル汚染につながる。本論文では、最初に化学架橋した後、得られる架橋樹脂からツインStrep-tag IIタグタンパク質およびそれに関連する複合体を溶出させるために、SDSを使用してのStrep-Tactinの樹脂結合型四量体を安定化させることにより、この制限を克服するための技術を提供します。したがって、十分なタンパク質収量、それによって、質量分析によるさらなる分析を可能にする、ストレプト-Tactinの試料汚染することなく達成することができる。
この方法は、表面に露出SIIIタグ3又は二Strepタグ（アミノ酸配列WSHPQFEK（GGGS）3 WSHPQFEKそれぞれSAWSHPQFEK（GGGS）2 GGSAWSHPQFEK）を有する任意の組換え融合タンパク質の精製に適している。タンパク質は、動物、植物または細菌起源のものとすることができ、全細胞のいずれかから単離することができる溶解物または濃縮された細胞小器官画。例として、ここでは、PVAに感染したベンサミアナタバコ植物の核画分からのジャガイモウイルスA（PVA）4のSIIIタグ化タンパク質のVPg -プロの精製を説明します。以前に以下の改変を、5に記載のように、核画分を単離した細胞をホルムアルデヒドで処理しなかった、酪酸ナトリウム、5 mMのフッ化ナトリウムとのすべてのバッファに置換し、完全プロテアーゼ阻害剤は、PMSFで置換し、抽出におけるトリトンX-100濃度バッファ＃2は0.3％に低下した（v / v）で（抽出緩衝液＃3）ショ糖クッションを通した遠心分離により得られた核ペレットを、予め冷却した結合緩衝液1.45中に再懸濁し、4℃で1.5時間回転SIIIタグ化ベイトタンパク質と会合した複合体（ベイトタンパク質試料）を含有する得られた核抽出物（セクション2を参照）、以下に記載されるプロトコルに従って処理した。
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Protocol
ビスのStrep-Tactinのポリメタクリレート樹脂の1。架橋（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）
- 室温にBS3架橋剤の2ミリグラムを含む1密封されたマイクロチューブを平衡化させます。注意：BS3は、危険な物質である。保護手袋、ゴーグルを着用してください。
- 再懸濁のStrep-Tactinのメタクリル樹脂（100 mMトリス - 塩酸、pH8.0の50％懸濁液、1mMのEDTA、150mMのNaCl）による簡単な激しく振盪し、すぐにピペットチップを用いてスピンカラムに懸濁液600μLを転送最後に切り落とした。
- 室温で30秒間1500×gで遠心分離する。フロースルーを捨て、カラムにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）450μlのを追加します。
- 完全にPBSでトリス緩衝液を交換し、最後の遠心分離後のpHを8.0に調整のPBS 430μlに樹脂を残すように、前のステップ2を複数回繰り返します。
- 100を含むピペットチップでBS3とマイクロチューブの箔を穿刺1、超純水のL。優しく上下にピペッティングし、水中でBS3の粉末を溶解し、すぐにスピンカラムに溶液20μlを加える。架橋反応におけるBS3の最終濃度は〜1.2 mMである。
- 室温で30分の列を回転させます。樹脂はBS3溶液と適切に混合されていることを確認してください。
- 反応をクエンチし、3Mのトリス-HCl、pH7.5中の6μlを添加し、室温でさらに15分間、カラムを回転させる。
- 室温で30秒間1500×gで遠心分離する。フロースルーを捨て、トリス450μlの中で架橋した樹脂を再懸濁トゥイーン20（TBST）で緩衝生理食塩水。遠心分離を繰り返して、手順をさらに2回洗う。最後のステップでは、TBSを450μlの樹脂を再懸濁。
- カットオフ末にピペットチップを使用して、新しいチューブに樹脂懸濁液を転送します。 TBS系の別の450μLでカラムに残った樹脂を再懸濁し、同じチューブに移す。繰り返し目もう一度チューブにカラムからの樹脂の最大転送を確保するための電子最後のステップ。
- チューブを室温で10分間放置し、過剰のTBSを除去して600μlの体積を調整してみましょう。樹脂は、そのまま使用することができます（推奨）または凍結することなく、4℃で保存することができます。
2。架橋のStrep-Tactinのポリメタクリレート樹脂にツイン·Strepタグbaitタンパク質と会合した複合体の結合
- 4℃で10分間、17,000×gで、結合緩衝液中のベイトタンパク質サンプルの遠心分離機1 mlの上清を新しいチューブに移す。
- 、連鎖球菌-Tactinの樹脂に対する内因性ビオチン化タンパク質の結合を最小限に100μg/ mlのの最終濃度にアビジンを追加し、4℃で15分間回転させるには
- ステップ1.10から架橋された樹脂は4℃で長期間保管した場合、400×gでのfoでの遠心分離によって樹脂を回収4℃でR 1分、上清を廃棄し、TBST 1mlで樹脂を洗浄。遠心分離を繰り返し、洗浄は、まずTBSTで、その後TBSで2回、繰り返します。 4℃で1分間400×gでチューブを遠心分離し、過剰のTBSを削除して元のボリュームに調節してください。
- ボルテックスにより架橋された連鎖球菌-Tactinの樹脂を再懸濁します。すぐに切断されたピペットチップを用いてベイトタンパク質試料を含むチューブに樹脂懸濁液50μlを添加し、4℃でさらに30分間回転させる
- 待っている間、55℃にサーモを設定し、ステップ3.1で使用するために、溶出緩衝液500μlを予熱。
- 4℃で1分間400×gで遠心分離上澄み液を捨て、あらかじめ冷却洗浄バッファー＃1の1ミリリットルで4℃で5分間ローテーター上樹脂を洗浄。遠心分離を繰り返して、手順3回洗浄する。最後のステップでは、洗浄バッファー＃2の250μlの樹脂を再懸濁。
- TR新鮮なスピンカラムに樹脂懸濁液をansfer。洗浄バッファー＃2の別の250μlのチューブ内に残った樹脂を再懸濁し、同じ列に移す。
- 4℃で3分間400×gで遠心し、フロースルーを捨て、新鮮なイルカ鼻2ミリリットルチューブにカラムを移す。以下の溶出ステップにすぐに進んでください。
特定のタンパク質複合体の3。溶出
- ステップ2.4からのスピンカラムに予熱した溶出バッファー150μLを加える。
- 1,400 rpmで振とうし、55℃で5分間サーモミキサー中でインキュベートする。
- 室温で1分間1500×gで遠心分離する。
- 列を捨て、≤-20℃で精製された標的タンパク質を保存する
| リン酸緩衝生理食塩水（PBS） | のNa 2 HPO 4 | 10 mMの |
| KH 2 PO 4 | 2mMの |
| NaClを | 137 mMの |
| 塩化カリウム | 2.7 mMの |
| （セクション1.4のpH 8.0）、特に明記しない限り、pHを7.4に調整した | |
| トリス生理食塩水（TBS）にバッファリングされた | |
| トリス-HCl、pH7.4の | 50 mMの |
| GHT = "20"スタイル= "高さ：ULは幅：299px;">のNaCl | 150 mMの |
| トリスはトゥイーン20（TBST）で緩衝化生理食塩水 | |
| トリス-HCl、pH7.4の | 50 mMの |
| NaClを | 150 mMの |
| トゥイーン20 | 0.1％（v / v）の |
| 結合バッファー | |
| トリス-HCl、pH8.0の | 25 mMの |
| NaClを | X; "> 550 mMの|
| NaFを | 5 mMの |
| EDTA | 0.5 mMの |
| グリセロール | 10％（v / v）の |
| PMSF | 0.1 mMの |
| 洗浄バッファー＃1 | |
| トリス-HCl、pH8.0の | 25 mMの |
| NaClを | 500 mMの |
| NaFを TD> | 5 mMの |
| EDTA | 0.4 mMの |
| IGEPAL CA-630 | 0.2％（v / v）の |
| グリセロール | 5％（v / v）の |
| PMSF | 0.1 mMの |
| 洗浄バッファー＃2 | |
| トリス-HCl、pH8.0の | 25 mMの |
| NaClを | 150 mMの |
| トリス-HCl、pH8.0の | 25 mMの |
| SDS | 1％（w / v）の |
表1本研究で用いたバッファ。
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Representative Results
精製手順を模式的に一緒に他の既存の精製方法に伴う問題の表現と、 図1に示されている。
図1精製手順の概略図。ワークフローは、共有結合架橋樹脂に二Strepタグベイトタンパク質と会合した複合体の結合を、BS3との架橋を介して樹脂結合されたストレプト-Tactinのテトラマーの安定化を含む、1％SDS、液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析（LC-MS/MS）によるそれらの分析と特異的に結合したタンパク質複合体の溶出を、変性、非結合タンパク質を洗浄した。ベイトタンパク質の二つの赤い球はツインStrepタグを示している。他の精製方法の限界は、挿入図に示されている右側のボックス。彼らは、ストレプト-Tactinの1％SDSで変性溶出を以下のビオチンとサンプル汚染に標的タンパク質の不完全な溶出が含まれています。
BS3架橋のStrep-Tactinのポリメタクリレート樹脂を用い、1％SDSで溶出変性SIIIタグ化タンパク質の精製の 代表的な結果を図2に示す。含有するスピンカラム溶出液の10％（15μl）の精製SIII-タグPVAのVPg、Proおよび関連タンパク質は、銀染色、続いてSDS-PAGEにより分析した。陰性対照レーンにPVAのVPg-Proアカウントに対応する52 kDaのバンドが存在しない場合は、プルダウンの特異性が確認された。残りのスピンカラム溶出液の40μlをケラチンフリーSDSゲルに適用し、対応するレーンを切り出し、含まれるタンパク質をトリプシンで消化し、液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析（LC-MS/MS）により分析した。質量分析は、ウイルスRNA-DEPEを同定しndent RNAポリメラーゼ（レプリカーゼ）はVPg - プロの相互作用パートナーとしてNIB。 NIBに対応する複数のトリプシンペプチドは、相互作用の特異性が確認され、SIII-タグなしたVPg-Proのを表現する4つのコントロールでのアフィニティ精製およびなしの4つのすべての生物学的複製が検出された。 NIB（59 kDa）の分子量は、SIIIタグ付きにVPg -プロ（52 kDa）ののそれに近いため、2つのタンパク質は、SDS PAGE分析（ 図2、矢印）の間に二重のバンドとして登場しました。まとめると、以上の結果は、共有BS3と架橋したストレプト-Tactinの樹脂上のアフィニティー精製に成功二Strepタグ·タンパク質を単離および質量分析によってそれらの生理学的結合パートナーを同定するために用いることができる実験的証拠を提供する。
図3。ビオチン溶出のStrep-Tactinのポリメタクリレート樹脂からのPVAはVPg-ProであるSIIIタグ化不完全な1％SDSで溶出と比較して図は、連鎖球菌-Tactinのビーズからの溶出物の抗のVPgイムノブロットを示しています。ビーズを15 mMのビオチンまたは1％SDSのいずれかで溶出した。シグナル強度の差は、2つの溶出技術を用いて得られた異なるタンパク質収量を反映する。ネガティブコントロールは、SIII-タグなしたVPg-Proは発現するウイルスに感染した細胞から精製に対応しています。
図4。BS3による架橋共有結合は、図は、非架橋（左車線）から、SDS溶出液の銀染色ゲルを示す。SDS溶出時の樹脂からのStrep-Tactinの放出を防ぎ 、BS3架橋（右車線）のStrep-Tactinのポリメタクリレート樹脂。左車線にリリースのStrep-Tactinのの存在が、右車線での不在に注意してください。
図5：ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）およびストレプト-Tactinの中のリジン残基のεアミノ基との架橋反応の化学構造。
図6非架橋に二Strepタグ、緑色蛍光タンパク質（GFP）の精製およびBS3架橋のStrep-Tactinのポリメタクリレート樹脂。二StrepタグGFPを発現するヒト胚腎臓293細胞の2つの等量溶解し、上記と同様のプロトコルを用いて処理したこと以外は一つのケース内に樹脂がBS3や他のBS3がいても、クロスリンクされている架橋反応において水と置換されたエン。図は、銀染色したSDS-ポリアクリルアミドゲルで精製したタンパク質の抗GFP免疫ブロットを示す。タンパク質収率に多少の減少は、化学的架橋を含む精製方法に固有であるが、これが原因で解放のStrep-Tactinの非存在下に高いサンプル純度によって補償されることに留意されたい。
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Discussion
上記のプロトコルは、ビオチンまたは強力な変性剤を含まない任意の適切な緩衝液中の目的とそれに関連する複合体のいずれかの二Strepタグベイトタンパク質を精製するために使用することができる。プロトコルの現在のバージョンでは、結合および洗浄は、高い塩および非イオン性界面活性剤の存在下で比較的ストリンジェントな条件下で行われる。これはより少ないバックグラウンドをもたらすが、壊れやすいタンパク質複合体は、これらの条件下で解離してもよい。このような低い親和性複合体を維持するために、塩濃度を低下させることができ、非イオン性界面活性剤は、緩衝剤を結合および洗浄から減少又は省略することができる。
ツインStrepタグシステムの主な利点はあっても、バッチ中の標的タンパク質およびその複合体の効率的な一段階精製を可能にする、操作されたストレプトアビジン（ストレプト-Tactinの）1〜2小（3kDa）タンデムタグの高親和性であるモード。なぜならツインStrepタグの強い結合のストレプト-Tactinのために、樹脂は、より高い標的タンパク質純度をもたらす高い界面活性剤および/または塩濃度のような中程度にストリンジェントな条件下で洗浄することができる。しかしながら、このような強い結合は、その欠点を有する。単一のStrepタグII（アミノ酸配列WSHPQFEK）を有するタンパク質の場合には、樹脂からの競合的溶出が困難な場合があり得る。例えば、ストレプトマイシン（II）の溶出タグ化タンパク質キナーゼ、10mMの有するストレプト-Tactinのポリメタクリレート樹脂からNtCDPK2は、SDSサンプルバッファーで変性6溶出を必要とする、不成功であることが判明したデスチオビオチン。この問題は、デスチオビオチンが強く競合するビオチン（10mM）および溶出を激しく振とうしながら07 5分間行ったと交換した後にのみ解決された。ストレプト-Tactinのに対してより高い親和性を有する二Strepタグの場合には、標的タンパク質の溶出は、さらに15mMのビオチンと高い濃度で不完全であってもよい。 図3に示すように、SIIIタグ付きのPVAたVPg-Proは、1％SDSで溶出量と比較して15 mMのビオチンでのStrep-Tactinの樹脂から溶出することができた。のごく一部これは、競合溶出の効率はそうも溶出されたタンパク質またはタンパク質複合体の性質に依存することに留意することが重要である。より大きく、より疎水性のタンパク質は、立体的に、それによって競合溶出が少なく効率的に、連鎖球菌-Tactinの中のビオチン結合ポケットの接近を妨げることがあります。上記の欠点は、SDSで溶出を使用することによって回避されるが、このような溶出は、主に界面活性剤への曝露を解除のStrep-Tactinの8と樹脂結合のStrep-Tactinのテトラマーおよび試料汚染の解離をもたらすという事実を巡る、独自の問題を抱えている。これは、1％のSDSを含有する溶出緩衝液中のStrep-Tactinの樹脂のインキュベーション後に放出のStrep-Tactinのかなりの量を示しており、 図4（左レーン）に示されている。このような汚染は許容できない場合は試料はさらに、LC-MS/MSにより分析される必要がある。
上記の汚染問題への効果的な解決策は、共有架橋による樹脂結合ストレプト-Tactinの四量体9の安定化である。この目的のために、我々は、タンパク質構造の10-13の安定化に成功した使用の歴史を持つ水溶性の、非切断、ホモ二官能性アミン-反応性クロスリンカーBS3を用いた。5は BS3の化学式を示し、その架橋図ストレプト-Tactinの中のリジンのフリーのεアミノ基との反応。樹脂結合ストレプト-Tactinの四量体は、BS3で架橋することによって安定したところで、リリースさストレプト-Tactinの持つ試料汚染の問題は、事実上（ 図4、右レーン）を除去した。 BS3と架橋が豊富なタンパク質凝集14を引き起こさないので、製造、ストレプトアビジンでビオチン結合ポケットのアクセス可能性を低下させないStrepタグ融合タンパク質の精製に適した架橋樹脂。これは、生物学的活性（抗体など）を有するタンパク質の化学的架橋は、いくつかの活性喪失につながる、両方の活性および不活性タンパク質コンフォメーションを安定化させることに留意されたい。例えば、BS3架橋抗体を用いて十分に確立された免疫沈降法は、非架橋抗体15で得られたものと比較して低い標的タンパク質の収率を生じる。それにもかかわらず、生物学的活性のいくつかの損失が改善されたサンプルの純度の許容のトレードオフであると考えられている。我々は、BS3架橋のStrep-Tactinの樹脂と同様の結果を観察した。架橋樹脂を用いて得られたやや低いタンパク質収率を大幅に向上させる試料の純度（ 図6）によって補償以上であった。
提案手法のもう一つの潜在的な用途は、ストレプトタグ付き膜タンパク質の精製にあるsolubiliz界面活性剤とエド。界面活性剤は、溶液中で疎水性タンパク質およびそれらに関連する複合体を維持するために必須であるが、ストレプト-Tactinのアフィニティー樹脂から遊離して、それらの存在は、試料汚染につながる可能性がある。この良い例が、タンパク質結晶8を目的としたストレプト-Tactinのビーズ上NTT1 で連鎖球菌（II） -タグ付きの膜タンパク質の精製である。溶出緩衝液中の洗剤laurylamidodimethylpropylaminoxide（LAPAO）の存在は、ビーズからのStrep-Tactinのの放出および望ましくないのStrep-Tactinの結晶8のその後の成長につながった。共有結合架橋による樹脂結合ストレプト-Tactinの四量体の安定化は、この問題を克服する効果的な手段を提供することができる。
要約すると、化学的架橋は、正常のStrep-Tactinの樹脂からの溶出の変性に関連する制限を克服するために採用されている。このアプローチは、良好な標的タンパク質の再を達成する助けサンプル汚染を導入することなくcovery。提案された方法は、このように質量分析法により二Strepタグベイトタンパク質の特異的結合パートナーを同定するために使用することができる。さらに、この方法は、核タンパク質可逆ホルムアルデヒドで架橋されたものを含む複合体、ならびに界面活性剤で可溶化した膜タンパク質を単離および特徴付けるために適用することができる。最後に、化学架橋は、非常に高いスループットアプリケーションに潜在的に適した架橋樹脂を作るのStrep-Tactinの樹脂の物性を変化させない。
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Disclosures
利害の対立が宣言されていません。
Acknowledgments
我々は感謝SiniがMiettinen、みんなPöllänenとたるRautavesiの技術サポートを認める。私たちは、HEKに録音機器を提供するためのツインStrepタグ、GFPとペッカEvijärviを発現する293細胞を提供するためのヘルカNurkkalaに感謝します。この作品は、フィンランド·アカデミーによって資金を供給された、数字138329、134684と258978を付与します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2 mg | Pierce/Thermo Scientific | 21585 | www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection. |
| Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension) | IBA | 2-1505 | www.iba-lifesciences.com |
| Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile | Costar (Corning) | 8163 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Dolphin-nose tubes | Costar (Corning) | 3213 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Avidin | IBA | 2-0204 | www.iba-lifesciences.com |
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