Summary
الخطي التضخيم بوساطة (LAM)-PCR هو طريقة تم تطويرها لتحديد مواقع الدقيق لدمج ناقلات فيروسية في الجينوم. وقد تطورت هذه التقنية لتكون طريقة متفوقة لدراسة ديناميات النسيلي في المرضى العلاج الجيني، والسلامة البيولوجية التكنولوجيات رواية ناقلات، والتنوع تي خلية، ونماذج الخلايا الجذعية السرطانية، الخ
Introduction
الخطي التضخيم بوساطة PCR (LAM-PCR) يسمح تحديد وتوصيف غير معروف الحمض النووي DNA المرافقة مجاورة ليعرف من أي منشأ. وبشكل أكثر تحديدا، تم تطوير LAM-PCR في توطين مواقع التكامل ناقلات فيروسية (IS) في الجينوم المضيف 1،2. العناصر الجينية مثل الفيروسات القهقرية أو ترانسبوزونات دمج الجينوم الخاصة بهم في جينوم المضيف في (شبه) بطريقة عشوائية 3-6. في كثير من الحالات هو حاسمة أن يعرف بالضبط الموقف حيث تتكامل هذه النواقل. وقد ثبت LAM-PCR لتكون متفوقة على التقنيات البديلة مثل بوساطة ربط PCR 7 ومشتقاته أو العكسية PCR 8. حساسية ومتانة هذه الطريقة ينشأ من preamplification الأولي للتقاطعات ناقلات الجينوم واختيار المغناطيسي من المنتجات PCR تضخيمها. مثل الطرق البديلة المذكورة، تعتمد LAM-PCR على استخدام إنزيمات التقييد، وإدخال التحيز في قدرة استرجاع IS 9-11. وبالتالي،ويمكن الكشف عن مجموعة فرعية فقط من مرجع هي (integrome) في رد فعل واحد. يتم التقليل من هذا التحيز من خلال تحليل مواز لعينة معينة باستخدام تركيبات الأمثل للأنزيمات تقييد 9. في الآونة الأخيرة، وهو البديل من التكنولوجيا يطلق عليه غير المقيدة وقد تم تطوير LAM-PCR (nrLAM-PCR) التي تلتف استخدام إنزيمات التقييد ويسمح تحليل الجينوم على نطاق غير منحازة لعينة في رد فعل واحد 9،12.
في الماضي، استخدمت LAM-PCR لتحديد فيروس المسبب للمرض هو مما أدى إلى سرطان الدم في عدد قليل من المرضى في التجارب السريرية العلاج الجيني 13-15. منذ ذلك الحين، تم تكييفها LAM-PCR لتحديد IS من ناقلات أخرى دمج (ناقلات lentiviral، ترانسبوزونات) وأيضا لتحديد أنماط التكامل دمج سلبي مثل ناقلات ناقلات الغدة المرتبطة (AAV) أو integrase معيبة ناقلات lentiviral (IDLV) 16 -21. واسعة تنتشر تطبيقات LAM-PCR: التقليديةلاي، ويستخدم على نطاق واسع هذه التقنية لدراسة تكوين نسيلي خلايا الجينات المعدلة في المرضى الذين خضعوا لعلاج الجينات أو لتقييم السلامة الأحيائية أنظمة النواقل رواية كشف السلوك اندماجهم 15،16،22-24. في الآونة الأخيرة، تمكين LAM-PCR تحديد خصوصية وبعيدا عن الهدف من النشاط nucleases مصمم من قبل IDLV محاصرة مقايسة 25.
علاوة على ذلك، LAM-PCR يسمح بسهولة لمتابعة مصير الخلايا transduced مع مرور الوقت في كائن حي. وهذا يسمح لتحديد بروتو الجينات المسرطنة وكذلك الورم الجينات القامع وأيضا لدراسة تكون الدم أو سرطان الخلايا الجذعية والبيولوجيا 26-28. أخيرا وليس آخرا، تم تكييفها LAM-PCR لدراسة التنوع مستقبلات خلايا T في الإنسان 29 (وبيانات غير منشورة).
ومما يعزز قوة لا يتجزأ من التكنولوجيا من خلال ربط الأسلوب لتقنيات التسلسل العميقة التي تسمح تميز الملايين من المجهول المرافقة الحمض النووي مع واحد النوكليوتيدات صesolution في الجينوم بأكمله. في بروتوكول التالية، ونحن تصف خطوة بخطوة التضخيم وتحديد المرافقة الحمض النووي غير معروف exemplarily لتحديد ناقلات lentiviral IS. يتم سرد أليغنوكليوتيد] المستخدمة في البروتوكول في الجدول 1. المستخلصة الحمض النووي أو كدنا] من أي مصدر يمكن استخدامها كقالب الحمض النووي لLAM-PCR وnrLAM-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد رابط كاسيت (LC)
- مزيج 40 ميكرولتر من LC1 قليل النوكليوتيد (الجدول 1)، و 40 ميكرولتر من LC2 قليل النوكليوتيد (الجدول 1، مع تقييد انزيم عبء السليم)، و 110 ميكرولتر تريس، حمض الهيدروكلوريك (100 ملم، ودرجة الحموضة 7.5)، و 10 ميكرولتر 250 ملم MgCl 2.
- احتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 5MIN والسماح للتفاعل يبرد ببطء إلى درجة حرارة الغرفة. إضافة 300 ميكرولتر H 2 O والتركيز dsLinker الحمض النووي على فلتر الطرد المركزي. إضافة 80 ميكرولتر H 2 O إلى شطافة وقسامة 10 ميكرولتر من استعداد رابط الكاسيت في 0.2 أنابيب PCR.
2. Preamplification من ناقلات الجينوم المفارق
- لكل عينة لتحليلها إعداد 50 ميكرولتر PCR التفاعل.
- تحديد تركيز عينات من الحمض النووي. ماصة ميكرولتر س (1-1،000 نانوغرام للLAM/100-1، 000 نانوغرام للnrLAM) من الحمض النووي إلى 0.2 مل أنبوب PCR. يجب أن يكون حجم الحمض النووي على قدم المساواة في كل عينة وركض فيجنرال الكتريك من 0،5 حتي 25 ميكرولتر.
- إعداد PCR مزيج الرئيسي كما هو موضح في الجدول رقم 2 ميكس (50 - س). ميكرولتر من مزيج الرئيسي مع كل عينة الحمض النووي في 0.2 مل أنابيب PCR.
- Preamplify ناقلات تقاطعات الجينوم باستخدام PCR الظروف المتمثلة في الجدول 2. بعد الانتهاء من PCR إضافة 0.5 ميكرولتر طق البلمرة إلى كل أنبوب PCR وبرنامج PCR باعادتها. ويمكن تخزين المنتجات PCR في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أيام أو على المدى الطويل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
3. الفصل المغناطيسي للPCR المنتج
- إعداد الخرز المغناطيسي
- ماصة 20 ميكرولتر (200 ميكروغرام) من streptavidin المغلفة الخرز المغناطيسي في أنبوب 1.5 مل وفضح لمدة 1 دقيقة على فاصل الجسيمات المغناطيسية (MPS) في درجة حرارة الغرفة. تجاهل طاف.
- إزالة أنبوب من MPS و resuspend حبات مغناطيسية في 40 ميكرولتر الحزب الاشتراكى البرازيلى / 0.1٪ BSA (الرقم الهيدروجيني 7.5). فضح لMPS لمدة 1 دقيقة وتجاهل طاف. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
- غسل حبات وايال 20 ميكرولتر من 3 M LiCl الحل (3 M LiCl، 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 1 ملم EDTA) لفضح MPS لمدة 1 دقيقة وتجاهل طاف. الخرز resuspend في 50 ميكرولتر من LiCl M 6 الحل (6 M LiCl، 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 1 ملم EDTA).
- مزيج تفاعل PCR بأكمله من الخطوة 2.2 مع 50 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المعدة. احتضان الأفقي على شاكر (300 دورة في الدقيقة) على الأقل لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. هذه الخطوة تسمح ملزمة من الناتج PCR البيروكسيديز إلى streptavidin المغلفة الخرز (مجمع الحمض النووي الخرزة). يمكن المحتضنة معقدة حبة الحمض النووي على شاكر بين عشية وضحاها أو تخزينها في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أيام.
- فضح معقدة الحمض النووي حبة لMPS لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وإزالة طاف، و resuspend معقدة الحمض النووي في 100 ميكرولتر حبة H 2 O. الشروع فورا في الخطوة 4 للام أو خطوة 5 لnrLAM.
4. LAM-الداخلي
- ضعف ستراند الحمض النووي (dsDNA و) التجميعي (LAM فقط)
- فضح معقدة الحمض النووي حبة من الخطوة 3.3 للنواب لمدة 1 دقيقة وديسبطاقة طاف. إضافة 8.25 ميكرولتر من H 2 O، 1 ميكرولتر العازلة 10X hexanucleotide، 0.25 ميكرولتر dNTPs (10 ملم) و 0.5 ميكرولتر (2 U) Klenow البلمرة. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- إضافة 90 ميكرولتر من H 2 O وفضح لMPS لمدة 1 دقيقة. تجاهل طاف و resuspend معقدة الحمض النووي في 100 ميكرولتر حبة H 2 O.
- تقييد دايجست
- فضح معقدة الحمض النووي حبة لMPS لمدة 1 دقيقة وتجاهل طاف. إضافة 8.5 ميكرولتر H 2 O، 1 ميكرولتر العازلة 10X تقييد انزيم و 0.5 ميكرولتر من انزيم التقييد واحتضان رد فعل لمدة 1 ساعة. كرر الخطوة 4.1.2.
ملاحظة: احتضان رد الفعل في درجة الحرارة الموصى بها من قبل الشركة المصنعة للانزيم التقييد. تأكد من أنه لا يوجد أي قيود موجودة في موقع أو المصب من موقع ملزم التمهيدي تستخدم لpreamplification في الحمض النووي من الفائدة. لاختيار مجموعات انزيم تقييد الانزيمات / تقييد مناسبة الرجوع إلى 9.
- فضح معقدة الحمض النووي حبة لMPS لمدة 1 دقيقة وتجاهل طاف. إضافة 8.5 ميكرولتر H 2 O، 1 ميكرولتر العازلة 10X تقييد انزيم و 0.5 ميكرولتر من انزيم التقييد واحتضان رد فعل لمدة 1 ساعة. كرر الخطوة 4.1.2.
- ربط س من رابط (LK)
- فضح معقدة الحمض النووي حبة لMPS لمدة 1 دقيقة وتجاهل طاف. إضافة 5 ميكرولتر H 2 O، 1 ميكرولتر 10X فاست لينك العازلة، 1 ميكرولتر ATP (10 ملم)، 2 ميكرولتر رابط الكاسيت من الخطوة 1.2، و 1 ميكرولتر سريعة لينك الحمض النووي يغاز (2 U / ميكرولتر). يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. كرر الخطوة 4.1.2.
- تمسخ من تجميعي dsDNA و
- فضح معقدة الحمض النووي حبة لMPS لمدة 1 دقيقة وتجاهل طاف. معقدة في resuspend الحمض النووي الخرزة في 5 ميكرولتر 0.1 N هيدروكسيد الصوديوم. احتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر الأفقي.
- فضح معقدة الحمض النووي حبة لMPS لمدة 1 دقيقة وجمع preamplified تقاطع ناقلات الجينوم تحتوي على طاف في أنبوب جديد 1.5 مل. الشروع فورا في الخطوة 6 أو مخزن طاف في -20 درجة مئوية.
5. nrLAM-الداخلي
- ربط واحد الذين تقطعت بهم السبل من رابط (SSLC) (nrLAM فقط)
- فضح معقدة الحمض النووي حبة من الخطوة 3.3 إلى MPSلمدة 1 دقيقة وتجاهل طاف. إضافة 6.5 ميكرولتر H 2 O، CircLigase 1 ميكرولتر العازلة 10X رد الفعل، 0.5 ميكرولتر MnCl 2 (50 ملم)، و 0.5 ميكرولتر ATP (1 ملم)، 1 ميكرولتر ssLinker نيوكليوتيدات دقيقة و 0.5 ميكرولتر CircLigase (100 U / ميكرولتر). احتضان عند 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- إضافة 90 ميكرولتر من H 2 O وفضح لMPS لمدة 1 دقيقة. تجاهل طاف ويغسل معقدة الحمض النووي في 100 ميكرولتر حبة H 2 O. تعرض مرة أخرى لMPS لمدة 1 دقيقة، طاف تجاهل و resuspend معقدة الحمض النووي الخرزة في 10 ميكرولتر H 2 O.
6. الأسي التضخيم أنا
- لكل عينة لتحليلها إعداد 50 ميكرولتر PCR التفاعل.
- ماصة 2 ميكرولتر قالب الحمض النووي (من الخطوة 4.4.2 (LAM) أو 5.1.2 (nrLAM)) إلى 0.2 مل أنبوب PCR.
- إعداد PCR مزيج الرئيسي كما هو موضح في الجدول رقم 3. إضافة 48 ميكرولتر من مزيج الرئيسي إلى كل عينة من الخطوة 6.1.1 وتضخيم ناقلات تقاطعات الجينوم بواسطة PCR CONDITIOنانوثانية يتضح في الجدول 3. يمكن تخزين المنتجات PCR في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أيام أو على المدى الطويل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
7. الفصل المغناطيسي للPCR المنتج
- إعداد حبات مغناطيسية كما حدث مثلا في خطوات 3.1.1 - 3.1.3. الخرز resuspend في 20 ميكرولتر (للام) أو 50 ميكرولتر (لnrLAM) من 6 م LiCl الحل (6 M LiCl، 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 1 ملم EDTA). مزيج 20 ميكرولتر (LAM) أو 50 ميكرولتر (nrLAM) من رد فعل PCR من الخطوة 6.1.2 مع حبات مغناطيسية استعداد (الخطوة 7.1)، واحتضان على شاكر الأفقي (300 دورة في الدقيقة) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. يمكن المحتضنة معقدة حبة الحمض النووي على شاكر بين عشية وضحاها أو تخزينها في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أيام.
- فضح معقدة الحمض النووي حبة لMPS لمدة 1 دقيقة، وإزالة طاف و resuspend معقدة الحمض النووي في 100 ميكرولتر حبة H 2 O. فضح معقدة الحمض النووي حبة لMPS لمدة 1 دقيقة وتجاهل طاف.
- في resuspend معقدة الحمض النووي الخرزة في 20 ميكرولتر (LAM) أو 5 ميكرولتر (nrLAM) 0.1 N هيدروكسيد الصوديوم. Incuباتي لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر الأفقي، فضح لMPS لمدة 1 دقيقة وجمع الحمض النووي التي تحتوي على تضخيم طاف في أنبوب جديد 1.5 مل. الشروع فورا في الخطوة 8.1 أو مخزن طاف في -20 درجة مئوية.
8. الأسي التضخيم الثاني
- لكل عينة لتحليلها إعداد 50 ميكرولتر PCR التفاعل.
- ماصة 2 ميكرولتر قالب الحمض النووي (من الخطوة 7.3) إلى 0.2 مل أنبوب PCR.
- إعداد PCR مزيج الرئيسي كما هو موضح في الجدول رقم 4. إضافة 48 ميكرولتر من مزيج الرئيسي إلى كل عينة من الخطوة 8.1.1 وتضخيم ناقلات تقاطعات الجينوم ظروف PCR يتضح في الجدول رقم 4. يمكن تخزين المنتجات PCR في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أيام أو على المدى الطويل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
- لتصور (NR) منتجات LAM-PCR، تحميل 10 ميكرولتر من المنتج PCR من الخطوة 8.1.2 على 2٪ agarose هلام. إذا نطاقات واضحة وتحليل 10 ميكرولتر من المنتج LAM-PCR على هلام عالية الدقة. تنبيه: إتبروميد hidium هو التشوهات الخلقية. العمل بعناية فائقة ودائما ارتداء القفازات المناسبة.
9. إعداد لارتفاع الإنتاجية تسلسل
- تنقية (NR) منتجات LAM-PCR
- مزيج 40 ميكرولتر PCR المنتج من الخطوة 8.1.2 مع 44 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة AMPure XP الخرز المغناطيسي. احتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وفضح لMPS ل2 دقيقة إضافية.
- تجاهل طاف ويغسل مرتين مع 200 ميكرولتر 70٪ ETOH على MPS.
- تجاهل طاف و resuspend معقدة الحمض النووي في 30 ميكرولتر حبة H 2 O. احتضان 1 دقيقة ونقل طاف لأنبوب 0.2 مل الطازجة. تحديد تركيز الحمض النووي تنقيته.
- Fusionprimer PCR لإضافة محولات تسلسل معين.
- لكل عينة لتحليلها إعداد 50 ميكرولتر PCR التفاعل.
- ماصة ميكرولتر س (40 نانوغرام) من الحمض النووي إلى 0.2 مل أنبوب PCR. يجب أن يكون حجم الحمض النووي على قدم المساواة في كل عينة وفي حدود 0،5 حتي 25 ميكرولتر.
- إعداد PCR مزيج الرئيسي كما هو موضح في الجدول 5 إضافة (50 - س). ميكرولتر من مزيج الرئيسي إلى كل عينة من الخطوة 9.2.2 وإدخال محولات تسلسل إلى (NR) منتجات LAM-PCR PCR الظروف المتمثلة في الجدول 5 منتجات PCR. يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أيام أو على المدى الطويل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
- لتصور Fusionprimer-PCR تحميل المنتجات 10 ميكرولتر من المنتج PCR من الخطوة 9.2.3 على 2٪ agarose هلام. تنقية المنتج PCR المتبقية كما هو موضح في الخطوات 9.1.1 - 9.1.3. تحليل 1 ميكرولتر منتج PCR تنقيته من الخطوة 9.4 على الآلية عالية الدقة الجهاز الكهربائي لقياس بدقة تركيز وجزء حجم المنتجات Fusionprimer-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
النتائج LAM-PCR في التضخيم من ناقلات تقاطعات مع حجم الجينوم جزء المحدد لكل تقاطع. حجم الفردية شظايا PCR يعتمد على المسافة بين موقع الحمض النووي المعروف في الجينوم وأقرب موقع تقييد الاعتراف الانزيم. وهذا يسمح تصور تنوع تقاطعات تضخيم في العينات التي تم تحليلها من قبل الكهربائي هلام، على سبيل المثال، إذا كانت موجودة على هلام واحد فقط (وحيدة النسيلة)، عدة (oligoclonal)، أو متعددة (بولكلونل) العصابات. نتائج LAM-PCR يتم عرضها بشكل أفضل من خلال المواد الهلامية الكهربائي عالية الدقة (الشكل 2A)، ولكن يمكن أيضا تصور على 2٪ الاغاروز المواد الهلامية (الشكل 2B). النتائج nrLAM-PCR في شظايا PCR من طول مختلفة لكل تقاطع على حدة. تظهر عينات وحيدة النسيلة بالتالي، oligoclonal أو بولكلونل كما مسحة من قبل الكهربائي والتي لا يمكن تمييزها بصريا. تصور المنتج nrLAM-PCR على 2٪ agarose هلام غير كافية لتحديد يمثسيس من البروتوكول (الشكل 2C). بعد تسلسل الحمض النووي الجيني تعافى يمكن محاذاة إلى الجينوم المضيفة المعنية لتحديد المواقع الدقيقة للموقع ناقلات (الشكل 3A). الشرح للجينوم يسمح لتحليل ذخيرة IS لمختلف ميزات محددة مثل ناقلات تفضيل الاندماج في الجين الترميز المناطق (الشكل 3B) أو على مقربة من مواقع بداية النسخ (الشكل 3C).
الشكل 1. مخطط تخطيطي LAM-PCR وnrLAM-PCR. أ) كلا الأسلوبين تبدأ مع preamplification الأولي من ناقلات تقاطعات الجينوم باستخدام بادئات البيروكسيديز التهجين على مقربة من نهاية تسلسل الحمض النووي المعروف (تكرار هنا محطة الطويلة (LTR) من ناقلات فيروسات). النتائج Preamplification في البيروكسيديزssDNA من حجم مختلفة لتقاطعات ناقلات الجينوم متطابقة أو مختلفة. يتم التقاط البيروكسيديز ssDNA على الجزيئات المغناطيسية. B) للLAM PCR، خطوات التفاعل الأنزيمي تتألف من dsDNA والتوليف، وتقييد هضم وربط من الحمض النووي المعروف رابط توليد المنتجات من مختلف الأحجام مع تسلسل المعروفة على طرفي المنتج. بسبب تقييد تعدد الأشكال طول كل مفترق تضخيم يبلغ طولها مميزة. بعد تمسخ يتم تضخيمه المنتج LAM-PCR PCR المتداخلة من قبل مع رابط وناقلات الاشعال محددة. C) للnrLAM هو ligated تسلسل رابط ssDNA مباشرة إلى نهاية غير معروفة من ssDNA preamplified من أ) السماح التضخيم الأسي بواسطة PCR المتداخلة مع رابط و المتجه الاشعال محددة. تم تعديل هذا الرقم من 2،12. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. نتائج ممثل LAM-PCR وnrLAM-PCR. A، B) تحليل LAM-PCR من الحمض النووي المعزولة من الدم المحيطي من العلاج الجيني معاملة المرضى. عدد العصابات على الجل يتوافق مع عدد موجود في العينة. المواد الهلامية عالية الدقة (B) هي أكثر ملاءمة لتصور قابلية التنسيل من العينات التي تم تحليلها من 2٪ الاغاروز المواد الهلامية (A). C) تحليل nrLAM-PCR من ناقلات lentiviral استنساخ خلية واحدة أو خلايا transduced السائبة. مستقلة من عدد من المواقع الإدراج تضخيم وينظر مسحة على هلام الكهربائي بعد. M، و 100 نقطة أساس سلم؛ MC، وحيدة النسيلة؛ OC، oligoclonal؛ PC، بولكلونل. تم تعديل هذا الرقم من 2،9.
es/ftp_upload/51543/51543fig3highres.jpg "العرض =" 500 "/>
الشكل 3. أمثلة الممثل لIS تحليل LAM-PCR واللاحقة الإنتاجية العالية التسلسل. IS التوزيع في اثنين من المرضى من gammaretroviral (الازرق) أو lentiviral (الأخضر) التجارب السريرية العلاج الجيني. بعد تسلسل ورسم الخرائط من المنتجات LAM-PCR لجينوم كل IS يمكن تقييمها على سبيل المثال:. أ) توزيع على نطاق الجينوم من IS B) الفرق وفقا لتفضيل الإدراج في المناطق الترميز الجينات بين gammaretroviral وناقلات lentiviral وC) تفضيل الإدراج على مقربة من مواقع بدء النسخ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
غرض | اسم | تسلسل (5'-3 ') |
LK-عالمية | LC1 | GACCCGGGAGATCTGAATTCAGTGGCACAG CAGTTAGG |
LK-AATT | LC2 (AATT) | AATTCCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCA GATC |
LK-CG | LC2 (CG) | CGCCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCAGATC |
LK-TA | LC2 (TA) | TACCTAACTGCTGTGCCACTGAAATCAGATC |
LK-nrLAM-PCR | SSLC | (P) CCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCAGATC TCCCGGGTddC |
Preamplification | LTR-I (3'-الاتجاه) | (B) AGTAGTGTGTGCCCGTCTGT |
LTR-I (5'-الاتجاه) | (B) TTAGCCAGAGAGCTCCCAGG | |
الأسي التضخيم أنا | LTR-II (3'-الاتجاه) | (B) GTGTGACTCTGGTAACTAGAG |
LTR-II (5'-الاتجاه) | (B) GATCTGGTCTAACCAGAGAG | |
LC-I | GACCCGGGAGATCTGAATTC | |
التضخيم الأسي الثاني | LTR-III (3'-الاتجاه) | GATCCCTCAGACCCTTTTAGTC |
LTR-III (5'-الاتجاه) | CCCAGTACAAGCAAAAAGCAG | |
LC-II | GATCTGAATTCAGTGGCACAG |
الجدول 1. أليغنوكليوتيد] لIS-LAM وnrLAM-PCR لتضخيم lentiviral. يتم فسفرته SSLC في نهاية 5'(P) ويحتوي على 3 'didesoxycytidin (DDC) لتجنب multimerization من خلال ربط SSLC. بشكل عام، (NR) يجب أن تتكون الاشعال LAM-PCR من 18-25 النيوكليوتيدات، وينبغي ألا محاذاة إلى جينوم المضيف. يجب وضع الاشعال لpreamplification في أقرب وقت ممكن (≤ 120 بي بي) إلى نهاية 5 'أو 3' من النواقل. تحتاج اثنين الاشعال إضافية لالأسي PCR الأول والثاني لتوضع بين التمهيديتستخدم لpreamplification ونهاية النواقل. الاشعال لpreamplification والأسي PCR ولست بحاجة إلى أن تكون فسفرته-5'(P).
كاشف | حجم (ميكرولتر) | تركيز | PCR معلمات | درجة الحرارة | وقت | |
H2O | 43 - س | تمسخ الأولي | 95 ° C | 5 دقائق | ||
العازلة | 5 | 10 × | تمسخ | 95 ° C | 45 ثانية | |
dNTP | 1 | 10 ملم (لام)؛ 0.5 ميكرومتر (nrLAM) | الصلب | 60 ° C | 45 ثانية | 2 × 50 دورات |
LTR-I | 0.5 | 0.17 ميكرومتر | استطالة | 72 ° C | 60 ثانية (LAM)؛ 10 ثانية (nrLAM) | |
طقالبلمرة | 0.5 | 2.5 U / ميكرولتر | الاستطالة النهائي | 72 ° C | 5 دقيقة (LAM فقط) |
الجدول 2. PCR-شروط preamplification تقاطعات الجينوم ناقلات (الخطوة 2). الأعمدة 1-3 تظهر الكواشف المستخدمة PCR لتضخيم الحمض النووي لعينة واحدة. الأعمدة 4-6 تجسيد برنامج PCR لpreamplify ناقلات تقاطعات الجينوم.
كاشف | حجم (ميكرولتر) | تركيز | PCR معلمات | درجة الحرارة | وقت | |
H 2 O | 40.5 | تمسخ الأولي | 95 ° C | 5 دقائق | ||
العازلة | 5 | 10 × | تمسخ | 95 ° C | 45 ثانية | |
dNTP | 1 </ الدفتيريا> | 10 ملي | الصلب | 60 ° C | 45 ثانية | 35 دورات |
LTR-II | 0.5 | 16.7 ميكرومتر | استطالة | 72 ° C | 60 ثانية (LAM)؛ 5 ثانية (nrLAM) | |
LC-I | 0.5 | 16.7 ميكرومتر | الاستطالة النهائي | 72 ° C | 5 دقيقة (LAM فقط) | |
طق البلمرة | 0.5 | 2.5 U / ميكرولتر |
الجدول 3. PCR-شروط التضخيم الأسي الأول (خطوة 6). الأعمدة 1-3 تظهر الكواشف PCR تستخدم لتضخيم الأسي من عينة الحمض النووي واحد. الأعمدة 4-6 تجسيد برنامج PCR تستخدم لتضخيم أضعافا مضاعفة عينة واحدة بعد ربط تسلسل رابط.
كاشف | فولوم (ميكرولتر) | تركيز | PCR معلمات | درجة الحرارة | وقت | |
H 2 O | 40.5 | تمسخ الأولي | 95 ° C | 5 دقائق | ||
العازلة | 5 | 10 × | تمسخ | 95 ° C | 45 ثانية | |
dNTP | 1 | 10 ملي | الصلب | 60 ° C | 45 ثانية | 35 دورات |
LTR-III | 0.5 | 16.7 ميكرومتر | استطالة | 72 ° C | 60 ثانية (LAM)؛ 5 ثانية (nrLAM) | |
LC-II | 0.5 | 16.7 ميكرومتر | الاستطالة النهائي | 72 ° C | 5 دقائق | |
طق البلمرة | 0.5 | 2.5 U / ميكرولتر |
الجدول 4. PCR-شروط التضخيم الأسي الأول (الخطوة 8). الأعمدة 1-3 تظهر الكواشف PCR تستخدم لتضخيم الأسي متداخلة من عينة واحدة. الأعمدة 4-6 تجسيد برنامج PCR تستخدم لتضخيم الأسي متداخلة من ناقلات تقاطعات الجينوم من عينة واحدة.
كاشف | حجم (ميكرولتر) | تركيز | PCR معلمات | درجة الحرارة | وقت | |
H 2 O | 42.5 - س | تمسخ الأولي | 95 ° C | 2 دقيقة | ||
العازلة | 5 | 10 × | تمسخ | 95 ° C | 45 ثانية | |
dNTP | 1 | 10 ملي | الصلب | 58 ° C | 45 ثانية | 12 دورات |
Fusionprimer A | 0.5 | 10 ميكرومتر | استطالة | 72 ° C | 60 ثانية | |
Fusionprimer B | 0.5 | 10 ميكرومتر | الاستطالة النهائي | 72 ° C | 5 دقائق | |
طق البلمرة | 0.5 | 2.5 U / ميكرولتر |
الجدول 5. PCR-شروط Fusionprimer-PCR (الخطوة 9.2). الأعمدة 1-3 تظهر الكواشف PCR تستخدم لإدخال محولات التسلسل إلى (NR) منتجات LAM-PCR. الأعمدة 4-6 تجسيد برنامج PCR تستخدم لFusionprimer-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقنية LAM-PCR يسمح تحديد تسلسل الحمض النووي المجهولة التي تكتنف المنطقة الحمض النووي المعروف. بسبب حساسية عالية الناجمة عن preamplification من تقاطعات مع الاشعال محددة التهجين في تسلسل الحمض النووي المعروف، فمن الممكن لتضخيم وكشف حتى تقاطعات نادرة وصولا الى مستوى خلية واحدة. العكس من ذلك، في حالة بولكلونل LAM-PCR قادرة على تضخيم الآلاف من تقاطعات مختلفة في رد فعل واحد.
ولكن نظرا لاستخدام تقييد الانزيمات فقط فخذ من integrome يمكن تحليلها بواسطة LAM-PCR لوجود تقاطعات مع كل انزيم التقييد معينة. وبالتالي، فمن المستحسن تحليل المتكررة لنفس العينة مع الانزيمات المختلفة 9. إذا لم يكن هناك amplicons LAM-PCR موجودة على هلام، وعلى الأرجح المسافة بين موقع جزء الحمض النووي المعروف وأقرب موقع الاعتراف انزيم التقييد التي تم اختيارها هي كبيرة جدا لتؤدي إلى منتجات LAM-PCR9. في هذه الحالة يجب أن تستخدم الإنزيمات الأخرى لتضخيم تقاطع.
nrLAM مستقلة عن استخدام الانزيمات التقييد، وبالتالي يمثل طريقة ذات قيمة عالية لتوصيف شامل متواليات المرافقة تسلسل الحمض النووي المعروف. حذف تقييد هضم من نتائج البروتوكول في فقدان محددة تقييد جزء طول تعدد الأشكال التي تميز كل مفترق تضخيمها. بدلا من ذلك يتم تضخيم كل مفترق ممثلة المنتجات PCR من مختلف الأحجام مما أدى إلى تشويه على هلام الكهربائي بعد، بغض النظر عن تنوع تقاطعات تضخيمها.
هي مناسبة المنتجات على حد سواء LAM وnrLAM-PCR تماما لالمصب الإنتاجية العالية التسلسل. عالية الإنتاجية تسلسل (NR) منتجات LAM-PCR ورسم خرائط تسلسل الخام إلى استرجاع الجينوم المقابلة يسمح تميز مجهولة المرافقة الحمض النووي أو تحديد التعريب الدقيق للناقلات الجينوم التقاطعات 30.من خلال إدخال تسلسل الباركود في fusionprimers عدة مئات من المنتجات LAM وnrLAM-PCR يمكن أن تكون متسلسلة في واحدة المدى تسلسل 30.
بسبب حساسية عالية، LAM-PCR هو عرضة للتلوث إذا أعدم inattentively. وهكذا، فإن البيئة PCR الصف وإيلاء اهتمام خاص لتنظيف التعامل مع البروتوكول هو من أهمية قصوى لتضخيم بنجاح المجهول المرافقة الحمض النووي دون تلويث العينات. لذلك، ينصح بشدة بما في ذلك الحمض النووي الجيني untransduced والتحكم في المياه لكل تفاعل PCR كما الضوابط السلبية في بروتوكول LAM-PCR. إذا تبين أن عينات مراقبة التلوث المتبادل وقعت خلال البروتوكول، والمنتجات من كل نقطة وقفة يمكن استخدامها لتكرار أجزاء من البروتوكول. عندما لا تزال العصابات الحاضر، فمن المستحسن أن تجاهل كافة الكواشف (على سبيل المثال، الاشعال، dNTPs، بلمرة، الخ) وتكرار (NR) بروتوكول LAM-PCR مع مأخوذة الجديدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Taq DNA Polymerase | Genaxxon Bioscience GmbH | M3001.5000 | Alternative Taq Polymerases may be used |
PCR Buffer | Qiagen | 201203 | Use of this buffer is recommended |
dNTP-Mixture | Genaxxon Bioscience GmbH | M3015.4020 | or any other dNTPs |
Oligonucleotides (Primers) | MWG Biotech | HPLC purified | |
Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11206D | |
PBS | Gibco | 14190-086 | 0.1% wt/vol BSA |
6 M LiCl | Roth | 3739.1 | 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA |
Tris-HCl, pH 7.5 | USB Corporation | 22637 | or any other supplier |
EDTA | Applichem | A1103,0250 | or any other supplier |
Klenow Polymerase | Roche Diagnostics | 10104523001 | |
Hexanucleotide mixture | Roche Diagnostics | 11277081001 | |
Restriction endonuclease | NEB | or any other supplier | |
Fast-Link DNA ligation kit | Epicentre Biotechnologies | LK11025 | |
CircLigase ssDNA Ligase Kit | Epicentre Biotechnologies | CL4111K | |
NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | or any other supplier |
Agarose LE | Roche Diagnostics | 11685660001 | or any other supplier |
TBE buffer | Amresco | 0658 | or any other supplier |
Ethidium bromide | Applichem | A2273,0005 | Ethidium bromide is mutagenic |
100 bp DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | or any other DNA ladder |
20 mM NaCl | Sigma-Aldrich | 71393-1L | or any other supplier |
Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158501 | for use with 1.5 ml Tubes |
Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158696 | for use with 96-well plates |
Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membrane | Millipore | UFC503096 | |
PerfectBlue Gelsystem Midi S | PeqLab | 40-1515 | or other electrophoresis system |
TProfessional 96 | Biometra | 050-551 | or other Thermocycler for 96-well plates |
Orbital shaker KS 260 basic | IKA | 2980200 | or other horizontal shaker |
PCR softtubes 0.2 ml | Biozym Scientific GmbH | 711082 | or other 0.2 ml PCR tubes |
1.5 ml tubes | Eppendorf | 12682 | or other 1.5 ml tubes |
Gel documentation system | PeqLab | or any other gel documentation system | |
Nanodrop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
Spreadex EL1200 precast gel | Elchrom Scientific | 3497 | |
Submerged gel electrophoresis apparatus SEA 2000 | Elchrom Scientific | 2001E | |
2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA |
References
- Schmidt, M., et al. Detection and direct genomic sequencing of multiple rare unknown flanking DNA in highly complex samples. Hum Gene Ther. 12, 743-749 (2001).
- Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat Methods. 4, 1051-1057 (2007).
- Schroeder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
- Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M. Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration. Science. 300, 1749-1751 (2003).
- Vigdal, T. J., Kaufman, C. D., Izsvak, Z., Voytas, D. F., Ivics, Z. Common physical properties of DNA affecting target site selection of sleeping beauty and other Tc1/mariner transposable elements. J Mol Biol. 323, 441-452 (2002).
- Lewinski, M. K., et al. Retroviral DNA integration: viral and cellular determinants of target-site selection. PLoS Pathog. 2, (2006).
- Mueller, P. R., Wold, B. In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR. Science. 246, 780-786 (1989).
- Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. Journal of virology. 63, 1924-1928 (1989).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nature medicine. 15, 1431-1436 (2009).
- Harkey, M. A., et al. Multiarm high-throughput integration site detection: limitations of LAM-PCR technology and optimization for clonal analysis. Stem Cells Dev. 16, 381-392 (2007).
- Wang, G. P., et al. DNA bar coding and pyrosequencing to analyze adverse events in therapeutic gene transfer. Nucleic acids research. 36, (2008).
- Paruzynski, A., et al. Genome-wide high-throughput integrome analyses by nrLAM-PCR and next-generation sequencing. Nat. Protocols. 5, 1379-1395 (2010).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest. , 3132-3142 (2008).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1. Science. 302, 415-419 (2003).
- Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. J Clin Invest. 118, 3143-3150 (2008).
- Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326, 818-823 (2009).
- Matrai, J., et al. Hepatocyte-targeted expression by integrase-defective lentiviral vectors induces antigen-specific tolerance in mice with low genotoxic risk. Hepatology. 53, 1696-1707 (2011).
- Penaud-Budloo, M., et al. Adeno-associated virus vector genomes persist as episomal chromatin in primate muscle. Journal of virology. 82, 7875-7885 (2008).
- Kaeppel, C., et al. A largely random AAV integration profile after LPLD gene therapy. Nature medicine. 19, 889-891 (2013).
- Voigt, K., et al. Retargeting sleeping beauty transposon insertions by engineered zinc finger DNA-binding domains. Mol Ther. 20, 1852-1862 (2012).
- Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nature medicine. 12, 348-353 (2006).
- Boztug, K., et al. Stem-Cell Gene Therapy for the Wiskott-Aldrich Syndrome. N Engl J Med. 363, 1918-1927 (2010).
- Deichmann, A., et al. Vector integration is nonrandom and clustered and influences the fate of lymphopoiesis in SCID-X1 gene therapy. J Clin Invest. 117, 2225-2232 (2007).
- Schwarzwaelder, K., et al. Gammaretrovirus-mediated correction of SCID-X1 is associated with skewed vector integration site distribution in vivo. J Clin Invest. 117, 2241-2249 (2007).
- Gabriel, R., et al. An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity. Nat Biotechnol. 29, 816-823 (2011).
- Dieter, S. M., et al. Distinct types of tumor-initiating cells form human colon cancer tumors and metastases. Cell Stem Cell. 9, 357-365 (2011).
- Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nature biotechnology. 24, 687-696 (2006).
- Zavidij, O., et al. Stable long-term blood formation by stem cells in murine steady-state hematopoiesis. Stem Cells. 30, 1961-1970 (2012).
- Martins, V. C., et al. Thymus-autonomous T cell development in the absence of progenitor import. J Exp Med. 209, 1409-1417 (2012).
- Arens, A., et al. Bioinformatic clonality analysis of next-generation sequencing-derived viral vector integration sites. Hum Gene Ther Methods. 23, 111-118 (2012).