Summary
Lineaire amplificatie-gemedieerde (LAM)-PCR is een methode ontwikkeld om de exacte positie van integratie virale vectoren in het genoom te identificeren. De techniek heeft zich ontwikkeld tot de superieure methode om klonale dynamiek in gentherapie patiënten, bioveiligheid van nieuwe vector technologieën, diversiteit T-cel, kanker stamcellen modellen, enz. te bestuderen
Introduction
Lineaire amplificatie-gemedieerde PCR (LAM-PCR) kan identificeren en karakteriseren onbekende flankerende DNA grenzend aan bekende DNA van elke oorsprong. Meer specifiek heeft LAM-PCR ontwikkeld om virale vector integratielocaties lokaliseren (IS) binnen het gastheergenoom 1,2. Genetische elementen zoals retrovirussen of transposons integreren hun genoom in het genoom van de gastheer in een (semi-) willekeurige wijze 3-6. In veel gevallen is beslissend precies de positie waar deze vectoren geïntegreerd kennen. LAM-PCR is bewezen superieur aan andere technieken zoals ligatie-gemedieerde PCR 7 en varianten of inverse PCR 8 zijn. De gevoeligheid en robuustheid van deze werkwijze ontstaat omdat de eerste voorversterking van het vector-genoom kruispunten en magnetische selectie van geamplificeerde PCR producten. Zoals de alternatieve methoden vermeld, LAM-PCR is gebaseerd op het gebruik van restrictie-enzymen, een voorspanning introduceren in het ophalen aantal IS 9-11. Aldusslechts een subset van de IS repertoire (de integrome) kan worden gedetecteerd in een reactie. Deze voorspanning wordt geminimaliseerd door de parallelle analyse van een monster met behulp van optimale combinaties van restrictie-enzymen 9. Onlangs, een variant van de technologie genoemd niet-beperkende LAM-PCR (nrLAM-PCR) ontwikkeld dat het gebruik van restrictie-enzymen omzeilt en maakt onpartijdige genoom-brede analyse van een monster in een enkele reactie 9,12.
In het verleden, is LAM-PCR gebruikt om identificatie van de veroorzakende retrovirale geeft aanleiding tot leukemie bij enkele patiënten in klinische proeven voor gentherapie 13-15. Sindsdien is LAM-PCR aangepast identificeren IS van andere integrerende vectoren (lentivirale vectoren, transposons) en ook integratiepatronen passief integrerende vectoren zoals adeno-geassocieerde vectoren (AAV) of integrase-defecte lentivirale vectoren (IDLV) identificeren 16 -21. Toepassingen van LAM-PCR zijn wijd verspreid: traditionelely, de techniek wordt veel gebruikt om de klonale samenstelling van genetisch gemodificeerde cellen te bestuderen bij patiënten die gentherapie hebben ondergaan of om de bioveiligheid van nieuwe vector systemen te beoordelen door het ontrafelen van hun integratie gedrag 15,16,22-24. Onlangs, LAM-PCR ingeschakeld bepalen specificiteit en off-target activiteit van designer nucleases door een IDLV vangen test 25.
Bovendien LAM-PCR laat toe om gemakkelijk volgen het lot van een getransduceerde cel na verloop van tijd in een organisme. Dit maakt proto-oncogenen en tumorsuppressor genen en om hematopoiese of kanker stamcel biologie 26-28 bestuderen. Tenslotte, LAM-PCR aangepast aan T-cel receptor diversiteit studie in mensen 29 (en ongepubliceerde gegevens).
De intrinsieke kracht van de technologie wordt nog versterkt door het koppelen van de methode om diepe sequencing technologieën die het mogelijk maken het karakteriseren miljoenen onbekende flankerende DNA met single nucleotide rRESOLUTIE geheel genomen. In het volgende protocol beschrijven we stap voor stap de versterking en de identificatie van flankerende onbekende DNA voorbeeldig te identificeren lentivirale vector IS. Oligonucleotiden die in het protocol zijn opgesomd in tabel 1. Geëxtraheerde DNA of cDNA van elke bron kan worden gebruikt als DNA-matrijs voor LAM-PCR en nrLAM-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van Linker Cassettes (LC)
- Meng 40 pl LC1 oligonucleotide (tabel 1), 40 pl LC2 oligonucleotide (tabel 1, met de juiste restrictie-enzym overhang), 110 pl Tris-HCl (100 mM, pH 7,5) en 10 pi 250 mM MgCl2.
- Incubeer bij 95 ° C gedurende 5 minuten en laat het reactiemengsel langzaam afkoelen tot kamertemperatuur. Voeg 300 ul H2O en concentreer dsLinker-DNA op een centrifugatie filter. Voeg 80 ui H2O het eluaat en 10 pi aliquot van bereide linker cassette 0,2 PCR buizen.
2. Preamplification van Vector Genome Knooppunten
- Voor elke te analyseren monster bereid een 50 ul PCR reactie.
- Bepaal de concentratie van de DNA-monsters. Pipet x pi (1-1,000 ng voor LAM/100-1, 000 ng voor nrLAM) van DNA in een 0,2 ml PCR-buis. Volume van DNA moet gelijk zijn in elk monster en in de liep zijnge van 0,5 tot 25 ul.
- Bereid PCR master mix zoals beschreven in Tabel 2 Mix (50 - x). Ul van de master mix met elk DNA-monster in 0,2 ml PCR-buisjes.
- Preamplify vector genoom juncties middels PCR-omstandigheden toegelicht in Tabel 2. Na voltooiing van PCR wordt 0,5 ul Taq Polymerase aan elke PCR buis en herhaling PCR-programma. PCR producten kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 4 dagen of lange termijn bij -20 ° C.
3. Magnetische scheiding van PCR Product
- Bereiding van Magnetic Beads
- Pipetteer 20 ul (200 ug) van streptavidine beklede magnetische kralen in een 1,5 ml buis en blootgesteld gedurende 1 minuut op de magnetische deeltjesscheider (MPS) bij kamertemperatuur. Gooi supernatant.
- Verwijder buis MPS en resuspendeer magnetische kralen in 40 ul PSB / 0,1% BSA (pH 7,5). Blootstellen aan MPS gedurende 1 minuut en gooi supernatant. Herhaal eenmaal deze stap.
- Wassen kralen wie 20 pl 3 M LiCl oplossing (3 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) bloot aan MPS gedurende 1 min en gooi supernatant. Resuspendeer kralen in 50 gl 6 M LiCl oplossing (6 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA).
- Meng gehele PCR-reactie van stap 2.2 met 50 ul van vervaardigde magnetische kralen. Incubeer op een horizontaal schudapparaat (300 rpm) ten minste 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. Deze stap maakt binding van gebiotinyleerd PCR-product beklede parels (DNA-Bead complex) streptavidine. DNA parelcomplex kan worden overnacht geïncubeerd op het schudapparaat of opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 4 dagen.
- Expose DNA-Bead complex MPS gedurende 1 min bij kamertemperatuur verwijderd supernatant en resuspendeer DNA-Bead complex in 100 pi H2O Onmiddellijk verder met stap 4 voor LAM of stap 5 voor nrLAM.
4. LAM-Procedure
- Dubbele streng DNA (dsDNA) Synthese (LAM alleen)
- Expose DNA-Bead complex van stap 3.3 tot MPS gedurende 1 minuut en diskaart supernatant. Voeg 8,25 ui H2O, 1 pl 10x hexa-buffer, 0,25 pl dNTPs (10 mM) en 0,5 pl (2 U) Klenow polymerase. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Voeg 90 ui H2O en blootstellen aan MPS gedurende 1 minuut. Gooi supernatant en resuspendeer DNA-Bead complex in 100 ul H 2 O.
- Beperking Digest
- Expose DNA-Bead complex om MPS gedurende 1 minuut en gooi supernatant. Voeg 8,5 ul H2O, 1 pi 10x restrictie-enzym buffer en 0,5 ul van restrictie-enzym en incubeer reactie gedurende 1 uur. Herhaal stap 4.1.2.
OPMERKING: Incubeer reactie bij de temperatuur door de fabrikant van het restrictie-enzym. Zorg ervoor dat er geen beperking plaats aanwezig binnen of stroomafwaarts van de primer bindingsplaats voor voorversterking in het DNA van belang. Voor de keuze van geschikte restrictie-enzymen / restrictie-enzym combinaties verwijzen naar 9.
- Expose DNA-Bead complex om MPS gedurende 1 minuut en gooi supernatant. Voeg 8,5 ul H2O, 1 pi 10x restrictie-enzym buffer en 0,5 ul van restrictie-enzym en incubeer reactie gedurende 1 uur. Herhaal stap 4.1.2.
- Ligatie van ds Linker (LK)
- Expose DNA-Bead complex om MPS gedurende 1 minuut en gooi supernatant. Voeg 5 ul H 2 O, 1 ui 10x FastLink buffer, 1 ui ATP (10 mM), 2 pi Linker cassette uit stap 1.2, en 1 ui Fast-Link DNA ligase (2 U / pl). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Herhaal stap 4.1.2.
- Denaturatie van Gesynthetiseerde dsDNA
- Expose DNA-Bead complex om MPS gedurende 1 minuut en gooi supernatant. Resuspendeer DNA-Bead complex in 5 pi 0,1 N NaOH. Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur op een horizontale schudinrichting.
- Expose DNA-Bead complex om MPS gedurende 1 minuut en verzamel voorversterkte vector-genoom knooppunt bevattende supernatant in nieuwe 1,5 ml buis. Onmiddellijk verder met stap 6 of winkel supernatant bij -20 ° C.
5. NrLAM-Procedure
- Ligatie van enkelstrengs linker (SSLC) (nrLAM alleen)
- Expose DNA-Bead complex van stap 3.3 tot MPSgedurende 1 minuut en gooi supernatant. Voeg 6,5 ul H2O, 1 pi 10x CircLigase Reaction Buffer, 0,5 pl MnCl2 (50 mM), 0,5 ui ATP (1 mM), 1 ui ssLinker oligonucleotide en 0,5 pl CircLigase (100 U / pl). Incubeer bij 60 ° C gedurende 1 uur.
- Voeg 90 ui H2O en blootstellen aan MPS gedurende 1 minuut. Verwijder supernatant en was DNA-Bead complex in 100 pi H2O Opnieuw blootstellen aan MPS 1 min, gooi supernatant en resuspendeer DNA-Bead complex in 10 ui H2O
6. Exponentiële Amplification I
- Voor elke te analyseren monster bereid een 50 ul PCR reactie.
- Pipetteer 2 pi template DNA (uit stap 4.4.2 (LAM) of 5.1.2 (nrLAM)) in een 0,2 ml PCR-buis.
- Bereid PCR master mix zoals beschreven in Tabel 3. Voeg 48 ul van master mix aan elk monster uit stap 6.1.1 en versterken vector genoom kruispunten door PCR conditions geïllustreerd in Tabel 3. PCR producten kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 4 dagen of lange termijn bij -20 ° C.
7. Magnetische scheiding van PCR Product
- Bereid magnetische korrels zoals toegelicht in stap 3.1.1 - 3.1.3. Resuspendeer kralen in 20 pl (voor LAM) en 50 pl (voor nrLAM) van 6 M LiCl oplossing (6 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). Meng 20 pl (LAM) en 50 pl (nrLAM) PCR-reactie uit stap 6.1.2 met vervaardigde magnetische beads (stap 7.1) en incubeer op een horizontaal schudapparaat (300 rpm) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. DNA parelcomplex kan worden overnacht geïncubeerd op het schudapparaat of opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 4 dagen.
- Expose DNA-Bead complex MPS gedurende 1 min, verwijder supernatant en resuspendeer DNA-Bead complex in 100 pi H2O Expose DNA-Bead complex om MPS gedurende 1 minuut en gooi supernatant.
- Resuspendeer DNA-Bead complex in 20 pi (LAM) of 5 pl (nrLAM) 0,1 N NaOH. Incuverminder gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een horizontaal schudapparaat, blootstellen aan MPS gedurende 1 minuut en laat geamplificeerd DNA supernatant nieuwe 1,5 ml buisje. Onmiddellijk verder met stap 8.1 of winkel supernatant bij -20 ° C.
8. Exponentiële Amplification II
- Voor elke te analyseren monster bereid een 50 ul PCR reactie.
- Pipetteer 2 pl matrijs-DNA (uit stap 7.3) in een 0,2 ml PCR buis.
- Bereid PCR master mix zoals beschreven in Tabel 4. Voeg 48 ul van master mix aan elk monster uit stap 8.1.1 en versterken vector genoom splitsingen PCR-omstandigheden toegelicht in Tabel 4. PCR producten kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 4 dagen of lange termijn bij -20 ° C.
- Visualiseren (nr) LAM-PCR-producten, belasting 10 ul van het PCR-product uit stap 8.1.2 op een 2% agarosegel. Als banden zijn zichtbaar, analyseren 10 ul van de LAM-PCR-product op hoge-resolutie gel. LET OP: Ethidium bromide is mutageen. Werken zeer zorgvuldig en altijd de juiste handschoenen te dragen.
9. Voorbereiding voor high-throughput sequencing
- Zuivering van (nr) LAM-PCR-producten
- Meng 40 pi PCR-product van stap 8.1.2 met 44 ul van kamertemperatuur AMPure XP Magnetic Beads. Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur en bloot MPS extra 2 minuten.
- Het supernatans en tweemaal wassen met 200 ul 70% EtOH het MPS.
- Gooi supernatant en resuspendeer DNA-Bead complex in 30 pi H 2 O. Incubeer 1 min en overdracht supernatant in de frisse 0,2 ml buis. Bepaal de concentratie van gezuiverd DNA.
- Fusionprimer PCR om sequencing specifieke adapters toevoegen.
- Voor elke te analyseren monster bereid een 50 ul PCR reactie.
- Pipet x pi (40 ng) van DNA in een 0,2 ml PCR-buis. Omvang van DNA moet gelijk in elk monster en in het traject van 0,5 tot 25 pi zijn.
- Bereid PCR master mix zoals beschreven in tabel 5 plaatsen (50 - x). Gl master mix aan elk monster uit stap 9.2.2 sequentiebepaling adapters introduceren (nr) LAM-PCR producten van PCR-omstandigheden toegelicht in tabel 5 PCR producten. kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 4 dagen of lange termijn bij -20 ° C.
- Om Fusionprimer-PCR producten load visualiseren 10 ul van het PCR-product uit stap 9.2.3 op een 2% agarosegel. Zuiver resterende PCR-product zoals beschreven in stap 9.1.1 - 9.1.3. Analyseer 1 ui gezuiverd PCR product uit stap 9.4 op een geautomatiseerde high-resolution elektroforeseapparaat exact te kwantificeren concentratie en fragment grootte van Fusionprimer-PCR-producten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LAM-PCR resulteert in amplificatie van vector genoom kruispunten met een bepaald fragment grootte voor elke kruising. De afzonderlijke PCR-fragmenten afhankelijk van de afstand tussen de locatie van de bekende DNA in het genoom en de dichtstbijzijnde restrictie-enzym herkenningsplaats. Dit maakt het visualiseren van de diversiteit van geamplificeerde verbindingen in monsters geanalyseerd door gelelektroforese zoals. Als eenmalig (monoklonale), verscheidene (oligoclonale), of meervoudige (polyklonale) groepen aanwezig zijn op de gel. De resultaten van LAM-PCR geoptimaliseerd door hoge resolutie elektroforese gels (figuur 2A), maar kan ook worden gevisualiseerd op 2% agarose gels (figuur 2B). nrLAM-PCR resulteert in PCR fragmenten van verschillende lengte voor elke kruising. Aldus monoklonaal, polyklonaal of oligoklonaal monsters verschijnen als een uitstrijkje door elektroforese en kunnen niet visueel worden onderscheiden. Visualiseren nrLAM-PCR product 2% agarosegel voldoende om succes bepalences van het protocol (figuur 2C). Na sequencing de herstelde genomisch DNA kan worden gebracht met de respectieve gastheergenoom exacte posities van de locatie van de vector (figuur 3A) te identificeren. Annotatie van het genoom maakt het mogelijk om de IS repertoire analyseren voor verschillende vector specifieke functies, zoals de voorkeur voor integratie in gen coderende gebieden (Figuur 3B) of dicht bij transcriptiestartplaatsen (Figuur 3C).
Figuur 1. Schematisch overzicht van LAM-PCR en nrLAM-PCR. A) Beide methoden starten met een initiële voorversterking vector genoom verbindingen met gebiotinyleerde primers hybridiseren dicht bij het einde van de bekende DNA-sequentie (even lange terminale herhaling (LTR) van een retrovirale vector). Preamplificatie leidt gebiotinyleerdessDNA van verschillende grootte voor identieke of verschillende vector genoom knooppunten. Gebiotinyleerd ssDNA is vastgelegd op magnetische deeltjes. B) Voor LAM PCR, enzymatische reactiestappen uit dsDNA synthese, restrictie digestie en ligatie van een bekende linker DNA genereren van producten van verschillende grootte met bekende sequenties aan beide uiteinden van het product. Door restrictie polymorfisme elk geamplificeerd junctie heeft een karakteristieke lengte. Na denaturatie LAM-PCR product geamplificeerd door geneste PCR met linker en vector specifieke primers. C) Voor nrLAM een ssDNA linkersequentie wordt rechtstreeks geligeerd aan het onbekende einde van de voorversterkte ssDNA van A) waardoor exponentiële amplificatie met geneste PCR met linker en vector specifieke primers. Dit cijfer is aangepast 2,12. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. >
Figuur 2. Representatieve resultaten van LAM-PCR en nrLAM-PCR. A, B) LAM-PCR-analyse van DNA geïsoleerd uit perifeer bloed van gentherapie behandelde patiënten. Het aantal banden op de gel komt overeen met het aantal aanwezig in het monster. Hoge resolutie gels (B) zijn beter geschikt voor klonaliteit geanalyseerde monsters visualiseren dan 2% agarosegels (A). C) nrLAM-PCR analyse van lentivirale vector getransduceerde cel klonen of bulk cellen. Ongeacht het aantal geamplificeerde insteekopeningen uitstrijk wordt gezien op de gel na elektroforese. M, 100 bp ladder; MC, monoklonaal; OC, oligoclonale; PC, polyklonale. Dit cijfer is gewijzigd van 2,9.
es/ftp_upload/51543/51543fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 3. Representatieve voorbeelden voor IS analyse door LAM-PCR en de daaropvolgende high-throughput sequencing. IS verdeling bij twee patiënten uit gammaretroviral (blauw) of lentivirale (groen) klinische proeven voor gentherapie. Na sequencing en in kaart brengen van de LAM-PCR-producten aan de respectieve genoom kan worden geëvalueerd bv:.. A) Genoom-brede verdeling van de IS-B) Verschil volgens de voorkeur voor het inbrengen in gen coderende gebieden tussen gammaretroviral en lentivirale vectoren en C) voorkeur voor plaatsing dicht bij transcriptie startplaatsen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Doel | Naam | Sequentie (5'-3 ') |
| LK-universele | LC1 | GACCCGGGAGATCTGAATTCAGTGGCACAG CAGTTAGG |
| LK-AATT | LC2 (AATT) | AATTCCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCA GATC |
| LK-CG | LC2 (CG) | CGCCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCAGATC |
| LK-TA | LC2 (TA) | TACCTAACTGCTGTGCCACTGAAATCAGATC |
| LK-nrLAM-PCR | SSLC | (P) CCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCAGATC TCCCGGGTddC |
| Preamplificatie | LTR-I (3'-richting) | (B) AGTAGTGTGTGCCCGTCTGT |
| LTR-I (5'-richting) | (B) TTAGCCAGAGAGCTCCCAGG | |
| Exponentiële amplificatie I | LTR-II (3'-richting) | (B) GTGTGACTCTGGTAACTAGAG |
| LTR-II (5'-richting) | (B) GATCTGGTCTAACCAGAGAG | |
| LC-I | GACCCGGGAGATCTGAATTC | |
| Exponentiële amplificatie II | LTR-III (3'-richting) | GATCCCTCAGACCCTTTTAGTC |
| LTR-III (5'-richting) | CCCAGTACAAGCAAAAAGCAG | |
| LC-II | GATCTGAATTCAGTGGCACAG |
Tabel 1. Oligonucleotiden voor LAM-en nrLAM-PCR te amplificeren lentivirale IS. SSLC gefosforyleerd aan het 5'-uiteinde (P) en ten 3'didesoxycytidin (ddC) te voorkomen multimerisatie van de SSLC tijdens ligatie. In het algemeen (nr) LAM-PCR primers bestaan uit 18-25 nucleotiden en niet passen aan het gastheergenoom. Primers voor preamplificatie moet zo dicht mogelijk geplaatst (≤ 120 bp) aan de 5 'of 3' uiteinde van de vector. Twee extra primers voor PCR Exponentiële I en II moet worden geplaatst tussen de primervoor voorversterking en vector einde. Primers voor preamplificatie en exponentiële PCR ik moet 5'-gefosforyleerd (P) zijn.
| Reagens | Volume (pl) | Concentratie | PCR Parameters | Temperatuur | Tijd | |
| H2O | 43 - x | Initiële denaturatie | 95 ° C | 5 min | ||
| Buffer | 5 | 10 x | Denaturatie | 95 ° C | 45 sec | |
| dNTP | 1 | 10 mM (LAM); 0,5 uM (nrLAM) | Gloeien | 60 ° C | 45 sec | 2 x 50 cycli |
| LTR-I | 0.5 | 0.17 uM | Verlenging | 72 ° C | 60 sec (LAM); 10 sec (nrLAM) | |
| TaqPolymerase | 0.5 | 2,5 U / pl | Final Rek | 72 ° C | 5 min (alleen LAM) |
Tabel 2. PCR-condities voor preamplificatie vector genoom knooppunten (stap 2). Kolommen 1-3 tonen de PCR reagentia voor amplificatie van een DNA-monster. Kolommen 4-6 illustreren de PCR-programma om vector genoom kruispunten preamplify.
| Reagens | Volume (pl) | Concentratie | PCR Parameters | Temperatuur | Tijd | |
| H2O | 40.5 | Initiële denaturatie | 95 ° C | 5 min | ||
| Buffer | 5 | 10 x | Denaturatie | 95 ° C | 45 sec | |
| dNTP | 1 </ Td> | 10 mM | Gloeien | 60 ° C | 45 sec | 35 Cycles |
| LTR-II | 0.5 | 16,7 uM | Verlenging | 72 ° C | 60 sec (LAM); 5 sec (nrLAM) | |
| LC-I | 0.5 | 16,7 uM | Final Rek | 72 ° C | 5 min (alleen LAM) | |
| Taq Polymerase | 0.5 | 2,5 U / pl |
Tabel 3. PCR-condities voor exponentiële amplificatie I (stap 6). Kolommen 1-3 tonen de PCR reagentia voor exponentiële amplificatie van een DNA-monster. Kolommen 4-6 illustreren de PCR-programma gebruikt om een monster na Ligatie van bindersequentie exponentieel versterken.
| Reagens | Volume (pl) | Concentratie | PCR Parameters | Temperatuur | Tijd | |
| H2O | 40.5 | Initiële denaturatie | 95 ° C | 5 min | ||
| Buffer | 5 | 10 x | Denaturatie | 95 ° C | 45 sec | |
| dNTP | 1 | 10 mM | Gloeien | 60 ° C | 45 sec | 35 Cycles |
| LTR-III | 0.5 | 16,7 uM | Verlenging | 72 ° C | 60 sec (LAM); 5 sec (nrLAM) | |
| LC-II | 0.5 | 16,7 uM | Final Rek | 72 ° C | 5 min | |
| Taq Polymerase | 0.5 | 2,5 U / pl |
Tabel 4. PCR-condities voor exponentiële Amplification I (stap 8). Kolommen 1-3 tonen de PCR-reagentia gebruikt voor geneste exponentiële amplificatie van een enkel monster. Kolommen 4-6 illustreren de PCR-programma gebruikt voor geneste exponentiële amplificatie van vector genoom kruispunten van een monster.
| Reagens | Volume (pl) | Concentratie | PCR Parameters | Temperatuur | Tijd | |
| H2O | 42.5 - x | Initiële denaturatie | 95 ° C | 2 min | ||
| Buffer | 5 | 10 x | Denaturatie | 95 ° C | 45 sec | |
| dNTP | 1 | 10 mM | Gloeien | 58 ° C | 45 sec | 12 Cycles |
| Fusionprimer A | 0.5 | 10 uM | Verlenging | 72 ° C | 60 sec | |
| Fusionprimer B | 0.5 | 10 uM | Final Rek | 72 ° C | 5 min | |
| Taq Polymerase | 0.5 | 2,5 U / pl |
Tabel 5. PCR-condities voor Fusionprimer-PCR (stap 9.2). Kolommen 1-3 tonen de PCR reagentia voor introductie van sequencing adapters (nr) LAM-PCR-producten. Kolommen 4-6 illustreren de PCR-programma voor Fusionprimer-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het LAM-PCR-techniek maakt het identificeren van onbekende DNA-sequenties die een bekende DNA regio flankeren. Vanwege de hoge gevoeligheid gevolg van voorversterking van de verbindingen met specifieke primers hybridiseren bij de bekende DNA-sequentie, is het mogelijk amplificeren en detecteren zelfs zeldzame verbindingen naar de enkele cel. Integendeel, een polyklonaal situatie LAM-PCR kan duizenden verschillende knooppunten amplificeren in een enkele reactie.
Echter, door het gebruik van restrictie-enzymen slechts een subfractie van het integrome kan worden geanalyseerd met LAM-PCR op de aanwezigheid van verbindingen met elk bepaald restrictie-enzym. Zo wordt herhaalde analyse van hetzelfde monster met verschillende enzymen waard 9. Als geen LAM-PCR amplicons aanwezig op de gel zijn, waarschijnlijk de afstand tussen de locatie van de bekende DNA-fragment en het dichtst herkenningsplaats van het gekozen restrictie-enzym te groot resulteren in LAM-PCR producten9. In dit geval andere enzymen worden gebruikt om de verbinding te versterken.
nrLAM is onafhankelijk van het gebruik van restrictie-enzymen en daarom is een zeer waardevolle methode om volledig karakteriseren sequenties die een bekende DNA-sequentie. Weglaten restrictiedigestie van het protocol resulteert in het verlies van specifieke restrictie fragment lengte polymorfisme kenmerkend zijn voor elk geamplificeerd knooppunt. In plaats elke geamplificeerde overgang wordt weergegeven door PCR producten van verschillende afmetingen waardoor een uitstrijk op de gel na elektroforese, onafhankelijk van de diversiteit van geamplificeerde kruispunten.
Zowel de LAM-en nrLAM-PCR-producten zijn perfect geschikt voor downstream high-throughput sequencing. High-throughput sequencing van (nr) LAM-PCR-producten en in kaart brengen van het opgehaalde rauwe sequenties naar de overeenkomstige genoom laat karakteriseren onbekend flankerende DNA of het identificeren van de exacte lokalisatie van vector-genoom knooppunten 30.Door de introductie van de streepjescode van sequenties in de fusionprimers enkele honderden LAM-en nrLAM-PCR-producten kunnen worden gesequenced in een sequencing run 30.
Vanwege de hoge gevoeligheid, LAM-PCR is gevoelig voor vervuiling of onoplettend uitgevoerd. Zo kan een PCR-grade milieu en bijzondere aandacht te reinigen afhandeling van het protocol is van het grootste belang voor de onbekende flankerende DNA met succes versterken zonder vervuilende monsters. Daarom waaronder getransduceerde genomische DNA en een water-controle voor elke PCR-reactie als negatieve controles in het LAM-PCR-protocol wordt sterk aanbevolen. Als controlemonsters geven aan dat kruisbesmetting is opgetreden tijdens het protocol, kan de producten van elke pauze punt worden gebruikt om delen van het protocol te herhalen. Als banden zijn nog aanwezig, wordt aanbevolen alle reagentia (bijv.. Primers, dNTP's, polymerasen, enz.) en gooi herhalen (nr) LAM-PCR protocol met nieuwe monsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq DNA Polymerase | Genaxxon Bioscience GmbH | M3001.5000 | Alternative Taq Polymerases may be used |
| PCR Buffer | Qiagen | 201203 | Use of this buffer is recommended |
| dNTP-Mixture | Genaxxon Bioscience GmbH | M3015.4020 | or any other dNTPs |
| Oligonucleotides (Primers) | MWG Biotech | HPLC purified | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11206D | |
| PBS | Gibco | 14190-086 | 0.1% wt/vol BSA |
| 6 M LiCl | Roth | 3739.1 | 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA |
| Tris-HCl, pH 7.5 | USB Corporation | 22637 | or any other supplier |
| EDTA | Applichem | A1103,0250 | or any other supplier |
| Klenow Polymerase | Roche Diagnostics | 10104523001 | |
| Hexanucleotide mixture | Roche Diagnostics | 11277081001 | |
| Restriction endonuclease | NEB | or any other supplier | |
| Fast-Link DNA ligation kit | Epicentre Biotechnologies | LK11025 | |
| CircLigase ssDNA Ligase Kit | Epicentre Biotechnologies | CL4111K | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | or any other supplier |
| Agarose LE | Roche Diagnostics | 11685660001 | or any other supplier |
| TBE buffer | Amresco | 0658 | or any other supplier |
| Ethidium bromide | Applichem | A2273,0005 | Ethidium bromide is mutagenic |
| 100 bp DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | or any other DNA ladder |
| 20 mM NaCl | Sigma-Aldrich | 71393-1L | or any other supplier |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158501 | for use with 1.5 ml Tubes |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158696 | for use with 96-well plates |
| Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membrane | Millipore | UFC503096 | |
| PerfectBlue Gelsystem Midi S | PeqLab | 40-1515 | or other electrophoresis system |
| TProfessional 96 | Biometra | 050-551 | or other Thermocycler for 96-well plates |
| Orbital shaker KS 260 basic | IKA | 2980200 | or other horizontal shaker |
| PCR softtubes 0.2 ml | Biozym Scientific GmbH | 711082 | or other 0.2 ml PCR tubes |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 12682 | or other 1.5 ml tubes |
| Gel documentation system | PeqLab | or any other gel documentation system | |
| Nanodrop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Spreadex EL1200 precast gel | Elchrom Scientific | 3497 | |
| Submerged gel electrophoresis apparatus SEA 2000 | Elchrom Scientific | 2001E | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA |
References
- Schmidt, M., et al. Detection and direct genomic sequencing of multiple rare unknown flanking DNA in highly complex samples. Hum Gene Ther. 12, 743-749 (2001).
- Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat Methods. 4, 1051-1057 (2007).
- Schroeder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
- Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M. Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration. Science. 300, 1749-1751 (2003).
- Vigdal, T. J., Kaufman, C. D., Izsvak, Z., Voytas, D. F., Ivics, Z. Common physical properties of DNA affecting target site selection of sleeping beauty and other Tc1/mariner transposable elements. J Mol Biol. 323, 441-452 (2002).
- Lewinski, M. K., et al. Retroviral DNA integration: viral and cellular determinants of target-site selection. PLoS Pathog. 2, (2006).
- Mueller, P. R., Wold, B. In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR. Science. 246, 780-786 (1989).
- Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. Journal of virology. 63, 1924-1928 (1989).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nature medicine. 15, 1431-1436 (2009).
- Harkey, M. A., et al. Multiarm high-throughput integration site detection: limitations of LAM-PCR technology and optimization for clonal analysis. Stem Cells Dev. 16, 381-392 (2007).
- Wang, G. P., et al. DNA bar coding and pyrosequencing to analyze adverse events in therapeutic gene transfer. Nucleic acids research. 36, (2008).
- Paruzynski, A., et al. Genome-wide high-throughput integrome analyses by nrLAM-PCR and next-generation sequencing. Nat. Protocols. 5, 1379-1395 (2010).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest. , 3132-3142 (2008).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1. Science. 302, 415-419 (2003).
- Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. J Clin Invest. 118, 3143-3150 (2008).
- Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326, 818-823 (2009).
- Matrai, J., et al. Hepatocyte-targeted expression by integrase-defective lentiviral vectors induces antigen-specific tolerance in mice with low genotoxic risk. Hepatology. 53, 1696-1707 (2011).
- Penaud-Budloo, M., et al. Adeno-associated virus vector genomes persist as episomal chromatin in primate muscle. Journal of virology. 82, 7875-7885 (2008).
- Kaeppel, C., et al. A largely random AAV integration profile after LPLD gene therapy. Nature medicine. 19, 889-891 (2013).
- Voigt, K., et al. Retargeting sleeping beauty transposon insertions by engineered zinc finger DNA-binding domains. Mol Ther. 20, 1852-1862 (2012).
- Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nature medicine. 12, 348-353 (2006).
- Boztug, K., et al. Stem-Cell Gene Therapy for the Wiskott-Aldrich Syndrome. N Engl J Med. 363, 1918-1927 (2010).
- Deichmann, A., et al. Vector integration is nonrandom and clustered and influences the fate of lymphopoiesis in SCID-X1 gene therapy. J Clin Invest. 117, 2225-2232 (2007).
- Schwarzwaelder, K., et al. Gammaretrovirus-mediated correction of SCID-X1 is associated with skewed vector integration site distribution in vivo. J Clin Invest. 117, 2241-2249 (2007).
- Gabriel, R., et al. An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity. Nat Biotechnol. 29, 816-823 (2011).
- Dieter, S. M., et al. Distinct types of tumor-initiating cells form human colon cancer tumors and metastases. Cell Stem Cell. 9, 357-365 (2011).
- Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nature biotechnology. 24, 687-696 (2006).
- Zavidij, O., et al. Stable long-term blood formation by stem cells in murine steady-state hematopoiesis. Stem Cells. 30, 1961-1970 (2012).
- Martins, V. C., et al. Thymus-autonomous T cell development in the absence of progenitor import. J Exp Med. 209, 1409-1417 (2012).
- Arens, A., et al. Bioinformatic clonality analysis of next-generation sequencing-derived viral vector integration sites. Hum Gene Ther Methods. 23, 111-118 (2012).
