Summary
Linéaire amplification médiée (LAM)-PCR est une méthode mise au point pour identifier la position exacte de l'intégration des vecteurs viraux dans le génome. La technique a évolué pour devenir la meilleure méthode pour étudier la dynamique clonale chez les patients de thérapie génique, de la biosécurité de nouvelles technologies de vecteur, la diversité des lymphocytes T, des modèles de cellules souches du cancer, etc
Introduction
Linéaire d'amplification médiée par PCR (LAM-PCR) permet d'identifier et de caractériser inconnu ADN flanquant adjacente à ADN connu de toute origine. Plus précisément, LAM-PCR a été développée pour localiser les sites d'intégration de vecteurs viraux (IS) dans le génome hôte 1,2. Les éléments génétiques comme les rétrovirus ou transposons intégrer leur génome dans le génome de l'hôte dans un (semi-) de manière aléatoire 3-6. Dans de nombreux cas, il est décisif de savoir exactement l'endroit où ces vecteurs intégrés. LAM-PCR a été prouvé pour être supérieur à d'autres techniques comme la ligature et d'une PCR 7 et ses variantes ou PCR inverse 8. La sensibilité et la robustesse de cette méthode résultent d'une pré-amplification initiale des jonctions vecteur du génome et la sélection magnétique de produits de PCR amplifiés. Comme les autres méthodes mentionnées, LAM-PCR repose sur l'utilisation d'enzymes de restriction, l'introduction d'un biais dans la capacité de récupération de l'IS 9-11. Ainsi,seulement un sous-ensemble du répertoire IS (la integrome) peut être détecté dans une réaction. Ce biais est minimisé par l'analyse en parallèle d'un échantillon donné en utilisant des combinaisons optimales des enzymes de restriction 9. Récemment, une variante de la technologie dite non restrictive LAM-PCR (nrLAM-PCR) a été développé qui contourne l'utilisation d'enzymes de restriction et permet impartiale analyse du génome d'un échantillon dans une seule réaction 9,12.
Dans le passé, LAM-PCR a été utilisée pour identifier le responsable rétrovirale donne lieu à la leucémie chez quelques patients dans les essais cliniques de thérapie génique 13-15. Depuis lors, LAM-PCR a été conçu pour identifier IS d'autres vecteurs d'intégration (vecteurs lentiviraux, transposons) et aussi d'identifier des modèles d'intégration d'intégration passivement vecteurs comme vecteurs adéno-associés (AAV) ou vecteurs lentiviraux intégrase défectueux (IDLV) 16 -21. Applications de LAM-PCR sont largement répandus: traditionnellement, la technique est largement utilisée pour étudier la composition clonale de cellules de gènes modifiés chez les patients qui ont subi la thérapie génique ou pour évaluer la biosécurité des nouveaux systèmes de vecteurs par démêler leur comportement d'intégration 15,16,22-24. Récemment, LAM-PCR a permis de déterminer la spécificité et de l'activité hors cible des nucléases de luxe par un essai de piégeage IDLV 25.
En outre, LAM-PCR permet de suivre facilement le sort d'une cellule transduction au fil du temps dans un organisme. Ceci permet d'identifier les proto-oncogènes ainsi que des gènes suppresseurs de tumeurs et également pour étudier l'hématopoïèse ou de la tige de biologie des cellules cancéreuses 26-28. Last but not least, LAM-PCR a été adapté pour étudier la diversité de récepteur des cellules T chez l'homme (29 et données non publiées).
La puissance intrinsèque de la technologie est renforcée par le procédé de liaison à des technologies de séquençage profondes qui permettent la caractérisation des millions d'ADN flanquant inconnu avec un seul nucléotide résolution dans les génomes entiers. Dans le protocole suivant, nous décrivons étape par étape l'amplification et l'identification de l'ADN flanquant inconnu exemplairement pour identifier vecteur lentiviral EST. Les oligonucleotides utilisés dans le protocole sont répertoriés dans le tableau 1. Extrait d'ADN ou d'ADNc de n'importe quelle source peuvent être utilisés en tant que matrice d'ADN pour LAM-PCR et PCR-nrLAM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Préparation de l'éditeur de liens Cassettes (LC)
- Mélanger 40 ul de LC1 oligonucléotide (Tableau 1), 40 pl de LC2 oligonucléotide (Tableau 1, avec l'enzyme appropriée de restriction saillie), 110 ul de Tris-HCl (100 mM, pH 7,5), et 10 ul de 250 mM de MgCl 2.
- Incuber à 95 ° C pendant 5 minutes et laisser la réaction refroidir lentement à température ambiante. Ajouter 300 ul de H 2 O et on concentre dsLinker-ADN sur un filtre de centrifugation. Ajouter 80 ul H 2 O à l'éluat et aliquote de 10 ul de la cassette de liaison préparés dans des tubes PCR de 0,2.
2. Préamplification de génome vecteur jonctions
- Pour chaque échantillon à analyser préparer une réaction de PCR de 50 ul.
- Déterminer la concentration des échantillons d'ADN. Pipette x pi (1-1,000 ng pour LAM/100-1, 000 ng pour nrLAM) de l'ADN dans un tube PCR de 0,2 ml. Volume de l'ADN devrait être égale dans chaque échantillon et en l'range de 0,5 à 25 pl.
- Préparer PCR master mix comme décrit dans le tableau 2 Mix (50 - x). Pl du mélange maître avec chaque échantillon d'ADN dans 0,2 ml tubes PCR.
- Préamplifier vecteur jonctions du génome en utilisant des conditions de PCR illustrés dans le tableau 2. Après l'achèvement de la PCR ajouter 0,5 ul de Taq polymérase dans chaque tube PCR et PCR programme de réexécution. Les produits de PCR peuvent être conservés à 4 ° C pendant jusqu'à 4 jours ou à long terme à -20 ° C.
3. Séparation magnétique de produit PCR
- Préparation des billes magnétiques
- Introduire à la pipette 20 ul (200 pg) de billes magnétiques revêtues de streptavidine dans un tube de 1,5 ml et exposer pendant 1 min sur le séparateur de particules magnétiques (MPS) à la température ambiante. Rejeter le surnageant.
- Retirer le tube du MPS et remettre en suspension des billes magnétiques dans 40 ul PSB / BSA à 0,1% (pH 7,5). Exposer à MPS pendant 1 min et éliminer le surnageant. Répétez cette étape une fois.
- Lavez perles wie 20 ul de solution 3 M de LiCl (3 M de LiCl, 10 mM de Tris-HCl, 1 mM EDTA) à exposer MPS pendant 1 min et éliminer le surnageant. Resuspendre les billes dans 50 pl de solution 6 M de LiCl (6 M de LiCl, 10 mM de Tris-HCl, 1 mM EDTA).
- Mélanger ensemble de la réaction de PCR provenant de l'étape 2.2 avec 50 ul de billes magnétiques préparées. Incuber sur un agitateur horizontal (300 rpm), au moins pendant 2 h à température ambiante. Cette étape permet de lier de produit PCR biotinylé à la streptavidine billes revêtues (complexe ADN-Bead). complexe de bourrelet d'ADN peut être incubée pendant une nuit dans un agitateur ou stocké à 4 ° C pendant jusqu'à 4 jours.
- Exposer complexe ADN-Talon à MPS pendant 1 min à température ambiante, enlever le surnageant et remettre en suspension complexe ADN-Bead 100 pi H 2 O. Procéder immédiatement à l'étape 4 pour LAM ou l'étape 5 pour nrLAM.
4. LAM-procédure
- Strand ADN double (ADN double brin) Synthèse (LAM seulement)
- Exposer complexe ADN-perle de l'étape 3.3 de MPS pendant 1 min et discarte surnageant. Ajouter 8,25 pi de H 2 O, 1 pl 10x tampon hexanucléotidique, 0,25 dNTP pi (10 mm) et 0,5 pi (2 U) polymérase de Klenow. Incuber à 37 ° C pendant 1 heure.
- Ajouter 90 ul de H 2 O et exposer à MPS pour 1 min. Rejeter le surnageant et remettre en suspension complexe ADN-Bead dans 100 pi de H 2 O.
- Restriction Digest
- Exposer complexe ADN-Talon à MPS pendant 1 min et éliminer le surnageant. Ajouter 8,5 pi de H 2 O, 1 ul de 10 x tampon d'enzyme de restriction et 0,5 ul d'enzyme de restriction de réaction et incuber pendant 1 heure. Répétez l'étape 4.1.2.
NOTE: Incuber la réaction à la température recommandée par le fabricant de l'enzyme de restriction. Assurez-vous qu'il n'ya pas de site de restriction présents dans ou en aval du site de liaison de l'amorce utilisée pour pré-amplification de l'ADN d'intérêt. Pour le choix des combinaisons appropriées des enzymes de restriction / enzyme de restriction reportez-vous à 9.
- Exposer complexe ADN-Talon à MPS pendant 1 min et éliminer le surnageant. Ajouter 8,5 pi de H 2 O, 1 ul de 10 x tampon d'enzyme de restriction et 0,5 ul d'enzyme de restriction de réaction et incuber pendant 1 heure. Répétez l'étape 4.1.2.
- La ligature des DS Linker (LK)
- Exposer complexe ADN-Talon à MPS pendant 1 min et éliminer le surnageant. Ajouter 5 ul de H 2 O, 1 pi de tampon 10x FastLink, 1 ul d'ATP (10 mM), 2 ul de lieur de cassette de l'étape 1.2, et de 1 ul de production rapide-Link ADN ligase (2 U / pl). Incuber à température ambiante pendant 5 min. Répétez l'étape 4.1.2.
- Dénaturation des ADN double brin synthétisé
- Exposer complexe ADN-Talon à MPS pendant 1 min et éliminer le surnageant. Remettre en suspension complexe ADN-Bead dans 5 pi de NaOH 0,1. Incuber 5 minutes à température ambiante sur un agitateur horizontal.
- Exposer complexe ADN-Talon à MPS pendant 1 min et collecter préamplifié jonction vecteur du génome contenant surnageant dans nouveau tube de 1,5 ml. Procéder immédiatement à l'étape 6 ou magasin surnageant à -20 ° C.
5. NrLAM-procédure
- La ligature de liaison unique brin (sslc) (nrLAM seulement)
- Exposer complexe ADN-perle de l'étape 3.3 de MPSpendant 1 min et éliminer le surnageant. Ajouter 6,5 pi de H 2 O, 1 ul de tampon de réaction CircLigase 10x, 0,5 pi de MnCl2 (50 mM), 0,5 ul d'ATP (1 mM), 1 pl ssLinker oligonucléotide et 0,5 ul CircLigase (100 U / pl). Incuber à 60 ° C pendant 1 heure.
- Ajouter 90 ul de H 2 O et exposer à MPS pour 1 min. Jeter le surnageant et laver complexe ADN-Bead 100 pi H 2 O. Encore une fois exposer à MPS pendant 1 min, le surnageant et remettre en suspension des rejets complexe ADN-Bead dans 10 pl H 2 O.
6. Amplification exponentielle je
- Pour chaque échantillon à analyser préparer une réaction de PCR de 50 ul.
- Pipette ADN matrice 2 yl (de l'étape 4.4.2 (LAM) ou 5.1.2 (nrLAM)) dans un tube PCR de 0,2 ml.
- Préparer PCR master mix comme décrit dans le tableau 3. Ajouter 48 pi de mélange maître à chaque échantillon de l'étape 6.1.1 et amplifier vecteur génome jonctions par conditio PCRns illustrés dans le tableau 3. produits de PCR peuvent être conservés à 4 ° C pendant jusqu'à 4 jours ou à long terme à -20 ° C.
7. Séparation magnétique de produit PCR
- Préparer des billes magnétiques comme illustré dans les étapes 3.1.1 - 3.1.3. Resuspendre les billes dans 20 pl (par LAM) ou 50 pi (par nrLAM) de solution 6 M de LiCl (6 M de LiCl, 10 mM de Tris-HCl, 1 mM EDTA). Mélanger 20 ul (LAM) ou 50 pi (nrLAM) de réaction de PCR à partir de l'étape 6.1.2 préparés avec des billes magnétiques (étape 7.1) et incuber sur un agitateur horizontal (300 rpm) pendant 2 h à température ambiante. complexe de bourrelet d'ADN peut être incubée pendant une nuit dans un agitateur ou stocké à 4 ° C pendant jusqu'à 4 jours.
- Exposer complexe ADN-Talon à MPS pendant 1 min, enlever le surnageant et remettre en suspension complexe ADN-Bead 100 pi H 2 O. Exposer complexe ADN-Talon à MPS pendant 1 min et éliminer le surnageant.
- Remettre en suspension complexe ADN-Bead dans 20 pi (LAM) ou 5 pi (nrLAM) NaOH 0,1 N. Incudébat pendant 10 min à température ambiante sur un agitateur horizontal, exposer à MPS pour 1 minute et recueillir l'ADN amplifié contenant surnageant dans nouveau tube de 1,5 ml. Procéder immédiatement à l'étape 8.1 ou magasin surnageant à -20 ° C.
8. Amplification exponentielle II
- Pour chaque échantillon à analyser préparer une réaction de PCR de 50 ul.
- Pipette ADN matrice 2 yl (de l'étape 7.3) dans un tube PCR de 0,2 ml.
- Préparer PCR Master Mix, comme décrit dans le tableau 4. Ajouter 48 pi de mélange maître pour chaque échantillon à partir de l'étape 8.1.1 et amplifier le génome vecteur jonctions par des conditions de PCR illustrés dans le tableau 4. Produits de PCR peuvent être conservés à 4 ° C pendant jusqu'à 4 jours ou à long terme à -20 ° C.
- Pour visualiser (nr) les produits LAM-PCR, charge 10 pi du produit de PCR provenant de l'étape 8.1.2 sur un gel d'agarose à 2%. Si les bandes sont visibles, 10 ul d'analyser le produit LAM-PCR sur gel à haute résolution. ATTENTION: Etbromure de hidium est mutagène. Travailler très soigneusement et toujours porter des gants appropriés.
9. Préparation de séquençage à haut débit
- Purification de (nr) produits LAM-PCR
- Mélanger 40 pi PCR-produit de l'étape 8.1.2 avec 44 pi de température ambiante AMPure XP billes magnétiques. Incuber 5 minutes à température ambiante et à exposer MPS pendant encore 2 min.
- Rejeter le surnageant et laver deux fois avec 200 ul EtOH à 70% sur les MPS.
- Rejeter le surnageant et remettre en suspension complexe ADN-Bead dans 30 pl H 2 O. Incuber 1 min surnageant et les frais tube de 0,2 ml. Déterminer la concentration de l'ADN purifié.
- Fusionprimer PCR pour ajouter séquençage adaptateurs spécifiques.
- Pour chaque échantillon à analyser préparer une réaction de PCR de 50 ul.
- Pipette x pi (40 ng) d'ADN dans un tube PCR de 0,2 ml. Volume de l'ADN devrait être égale dans chaque échantillon et dans la gamme de 0,5 à 25 pl.
- Préparer PCR master mix comme décrit dans le tableau 5 Ajouter (50 - x). Pi de mélange maître à chaque échantillon de l'étape 9.2.2 et introduire des adaptateurs de séquençage à (nr) produits LAM-PCR en conditions de PCR illustrés dans le tableau 5 produits de PCR. peuvent être stockées à 4 ° C pendant jusqu'à 4 jours ou à long terme à -20 ° C.
- Pour visualiser Fusionprimer-PCR de produits de charge 10 ul du produit de PCR provenant de l'étape 9.2.3 sur un gel d'agarose à 2%. Purifier le produit PCR reste comme décrit dans les étapes 9.1.1 - 9.1.3. Analyser une pl de produit PCR purifié de l'étape 9.4 sur un dispositif d'électrophorèse à haute résolution automatisées pour quantifier avec précision la concentration et la taille des fragments produits Fusionprimer-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Résultats de LAM-PCR dans l'amplification de génome vecteur jonctions avec une taille de fragment défini pour chaque jonction. La taille des fragments de PCR individuels dépend de la distance entre l'emplacement de l'ADN connues dans le génome et le site de reconnaissance de l'enzyme de restriction le plus proche. Ceci permet la visualisation de la diversité des jonctions amplifiées dans les échantillons analysés par électrophorèse sur gel, par exemple., Si ce n'est que seule (monoclonaux), plusieurs (oligoclonales), ou plusieurs bandes (polyclonaux) sont présentes sur le gel. Les résultats de LAM-PCR sont les mieux vu par les gels d'électrophorèse à haute résolution (Figure 2A), mais peuvent également être visualisées sur 2% de gels d'agarose (figure 2B). Résultats nrLAM-PCR en fragments PCR de différentes longueurs pour chaque jonction individuel. Échantillons ainsi monoclonaux, oligoclonales ou polyclonaux apparaissent comme un test par électrophorèse et ne peuvent être distingués visuellement. Visualiser le produit nrLAM-PCR sur un gel d'agarose à 2% est suffisant pour déterminer succèsprocessus du protocole (figure 2C). Après séquençage de l'ADN génomique récupérée peut être aligné sur le génome de l'hôte respectif pour identifier les positions exactes de l'emplacement du vecteur (figure 3A). Annotation du génome permet d'analyser le répertoire IS pour différentes caractéristiques du vecteur comme préférence pour une intégration dans le gène codant pour les régions (figure 3B) ou à proximité de sites d'initiation de la transcription (figure 3C).
Figure 1. Représentation schématique de LAM-PCR et nrLAM-PCR. A) Les deux méthodes commencent par une pré-amplification initiale des jonctions de génomes de vecteur en utilisant des amorces biotinylées s'hybrider à proximité de la fin de la séquence d'ADN connue (ici de répétition terminale longue (LTR) d'un vecteur rétroviral). Résultats de préamplification à biotinyléssDNA de taille différente pour jonctions vecteur génome identiques ou différents. Biotinylé ADNsb est capturée sur des particules magnétiques. B) Pour les LAM PCR, les étapes de réaction enzymatique des composés de synthèse ADN double brin, de digestion par restriction et ligation d'un ADN de liaison connu de générer des produits de tailles différentes avec des séquences connues sur les deux extrémités du produit. En raison de la longueur restriction polymorphisme chaque jonction amplifié a une longueur caractéristique. Après dénaturation du produit LAM-PCR est amplifié par PCR imbriquée avec lieurs vecteur et des amorces spécifiques. C) Pour nrLAM une séquence de liaison ADN sb est directement ligaturé à l'extrémité inconnue de l'ADN à un brin pré-amplifié à partir de A), permettant l'amplification exponentielle par PCR nichée avec lieur et des amorces spécifiques de vecteur. Ce chiffre a été modifié depuis 2,12. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. >
Figure 2. Des résultats représentatifs de LAM-PCR et nrLAM-PCR. A B) analyse, LAM-PCR de l'ADN isolé à partir de sang périphérique de patients traités par thérapie génique. Le nombre de bandes sur le gel correspond au nombre de IS présents dans l'échantillon. Gels à haute résolution (B) sont mieux adaptés à visualiser clonalité des échantillons analysés de 2% des gels d'agarose (A). C) d'analyse nrLAM-PCR de vecteur lentiviral des clones de cellules individuelles ou de cellules transduites en vrac. Indépendamment du nombre de sites d'insertion amplifiés un frottis est visible sur le gel après électrophorèse. M, échelle 100 pb; MC, monoclonal; OC, oligoclonale; PC, polyclonal. Ce chiffre a été modifié depuis 2,9.
es/ftp_upload/51543/51543fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figure 3. Des exemples représentatifs de ce que l'analyse par LAM-PCR et après séquençage à haut débit. EST distribution de deux patients de gammaretroviral (bleu) ou lentiviral (vert) des essais de thérapie génique clinique. Après séquençage et de cartographie des produits LAM-PCR du génome respectif est peuvent être évaluées, par exemple:.. A) L'échelle du génome distribution de IS B) Différence en fonction de la préférence pour une insertion dans les régions codantes de gènes entre gammaretroviral et des vecteurs lentiviraux et C) préférence pour l'insertion à proximité des sites de début de transcription. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| But | Nom | Séquence (5'-3 ') |
| LK-universel | LC1 | GACCCGGGAGATCTGAATTCAGTGGCACAG CAGTTAGG |
| LK-AATT | LC2 (AATT) | AATTCCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCA GATC |
| LK-CG | LC2 (CG) | CGCCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCAGATC |
| LK-TA | LC2 (TA) | TACCTAACTGCTGTGCCACTGAAATCAGATC |
| LK-nrLAM-PCR | sslc | (P) CCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCAGATC TCCCGGGTddC |
| Préamplification | LTR-I (direction 3 ') | (B) AGTAGTGTGTGCCCGTCTGT |
| LTR-I (5'-direction) | (B) TTAGCCAGAGAGCTCCCAGG | |
| Amplification exponentielle je | LTR-II (direction 3 ') | (B) GTGTGACTCTGGTAACTAGAG |
| LTR-II (5'-direction) | (B) GATCTGGTCTAACCAGAGAG | |
| LC-I | GACCCGGGAGATCTGAATTC | |
| L'amplification exponentielle II | LTR-III (direction 3 ') | GATCCCTCAGACCCTTTTAGTC |
| LTR-III (5'-direction) | CCCAGTACAAGCAAAAAGCAG | |
| LC-II | GATCTGAATTCAGTGGCACAG |
Tableau 1. Oligonucleotides pour LAM-et nrLAM-PCR pour amplifier lentiviral IS. SSLC est phosphorylée au niveau de l'extrémité 5 '(P) et en 3' didesoxycytidin (ddC) pour éviter la multimérisation de la SSLC pendant la ligature. En général, (nr) des amorces LAM-PCR devrait être composé de 18 à 25 nucléotides et ne doivent pas aligner dans le génome de l'hôte. Les amorces pour la préamplification doivent être placés aussi près que possible (≤ 120 pb) à l'extrémité 5 'ou 3' du vecteur. Deux amorces supplémentaires pour I et II exponentielle PCR doivent être placées entre la couche de fondutilisé pour la pré-amplification et l'extrémité du vecteur. Amorces pour la préamplification et exponentielle PCR j'ai besoin d'être 5'-phosphorylée (P).
| Réactif | Volume (ul) | Concentration | Les paramètres de PCR | Température | Temps | |
| H2O | 43 - x | Dénaturation initiale | 95 ° C | 5 min | ||
| Tampon | 5 | 10 x | Dénaturation | 95 ° C | 45 sec | |
| dNTP | 1 | 10 mM (LAM); 0,5 uM (nrLAM) | Recuit | 60 ° C | 45 sec | 2 x 50 Cycles |
| LTR-je | 0,5 | 0,17 pm | Allongement | 72 ° C | 60 sec (LAM); 10 sec (nrLAM) | |
| TaqPolymérase | 0,5 | 2,5 U / pl | Allongement final | 72 ° C | 5 min (seulement LAM) |
Tableau 2. PCR Conditions de pré-amplification de jonctions de génome vecteur (étape 2). Colonnes 1-3 montrent les réactifs de PCR utilisées pour l'amplification d'un échantillon d'ADN unique. Colonnes 4-6 illustrent le programme PCR à préamplifier vecteur génome jonctions.
| Réactif | Volume (ul) | Concentration | Les paramètres de PCR | Température | Temps | |
| H 2 O | 40,5 | Dénaturation initiale | 95 ° C | 5 min | ||
| Tampon | 5 | 10 x | Dénaturation | 95 ° C | 45 sec | |
| dNTP | 1 </ Td> | 10 mM | Recuit | 60 ° C | 45 sec | 35 Cycles |
| LTR-II | 0,5 | 16,7 uM | Allongement | 72 ° C | 60 sec (LAM); 5 sec (nrLAM) | |
| LC-I | 0,5 | 16,7 uM | Allongement final | 72 ° C | 5 min (seulement LAM) | |
| Taq polymérase | 0,5 | 2,5 U / pl |
Tableau 3. Conditions PCR pour l'amplification exponentielle I (étape 6). Colonnes 1-3 montrent les réactifs de PCR utilisées pour l'amplification exponentielle d'un seul échantillon d'ADN. Colonnes 4-6 illustrent le programme PCR utilisé pour amplifier de manière exponentielle un échantillon après ligature de la séquence de liaison.
| Réactif | Volume (pl) | Concentration | Les paramètres de PCR | Température | Temps | |
| H 2 O | 40,5 | Dénaturation initiale | 95 ° C | 5 min | ||
| Tampon | 5 | 10 x | Dénaturation | 95 ° C | 45 sec | |
| dNTP | 1 | 10 mM | Recuit | 60 ° C | 45 sec | 35 Cycles |
| LTR-III | 0,5 | 16,7 uM | Allongement | 72 ° C | 60 sec (LAM); 5 sec (nrLAM) | |
| LC-II | 0,5 | 16,7 uM | Allongement final | 72 ° C | 5 min | |
| Taq polymérase | 0,5 | 2,5 U / pl |
Tableau 4. Conditions PCR pour l'amplification exponentielle I (étape 8). Colonnes 1-3 montrent les réactifs de PCR utilisées pour l'amplification exponentielle imbriquée d'un seul échantillon. Colonnes 4-6 illustrent le programme PCR utilisé pour l'amplification exponentielle imbriquée de vecteur génome jonctions d'un échantillon.
| Réactif | Volume (ul) | Concentration | Les paramètres de PCR | Température | Temps | |
| H 2 O | 42,5 - x | Dénaturation initiale | 95 ° C | 2 min | ||
| Tampon | 5 | 10 x | Dénaturation | 95 ° C | 45 sec | |
| dNTP | 1 | 10 mM | Recuit | 58 ° C | 45 sec | 12 Cycles |
| Un Fusionprimer | 0,5 | 10 uM | Allongement | 72 ° C | 60 sec | |
| Fusionprimer B | 0,5 | 10 uM | Allongement final | 72 ° C | 5 min | |
| Taq polymérase | 0,5 | 2,5 U / pl |
Tableau 5. PCR Conditions d'Fusionprimer-PCR (étape 9.2). Colonnes 1-3 montrent les réactifs de PCR utilisées pour l'introduction d'adaptateurs de séquençage à (nr) produits LAM-PCR. Colonnes 4-6 illustrent le programme PCR utilisé pour Fusionprimer-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La technique LAM-PCR permet d'identifier des séquences d'ADN inconnues qui flanquent une région d'ADN connue. En raison de la sensibilité élevée résultant de pré-amplification de la jonction avec l'hybridation des amorces spécifiques de la séquence d'ADN connue, il est possible d'amplifier et de détecter même des jonctions rares jusqu'au niveau de la cellule unique. A l'inverse, dans une situation polyclonal LAM-PCR est capable d'amplifier les milliers de différentes jonctions dans une seule réaction.
Toutefois, en raison de l'utilisation d'enzymes de restriction seulement une sous-fraction de la integrome peut être analysée par LAM-PCR pour la présence de jonctions avec chaque enzyme de restriction particulière. Ainsi, les analyses répétées du même échantillon avec des enzymes différentes est recommandé 9. Si aucun amplicons LAM-PCR sont présentes sur le gel, le plus probable de la distance entre l'emplacement du fragment d'ADN connue et le site de reconnaissance le plus proche de l'enzyme de restriction choisie est trop grande pour conduire à des produits LAM-PCR9. Dans ce cas, d'autres enzymes doivent être utilisées pour amplifier la jonction.
nrLAM est indépendant de l'utilisation d'enzymes de restriction et représente un procédé très utile pour caractériser complètement les séquences flanquantes une séquence d'ADN connue donc. L'omission de digestion de restriction à partir des résultats de protocole dans la perte de la longueur spécifique du polymorphisme des fragments de restriction amplifiés caractérisant chaque jonction. Au lieu chaque jonction amplifié est représenté par des produits de PCR de tailles différentes aboutissant à un frottis sur le gel après électrophorèse, indépendant de la diversité des jonctions amplifiés.
Les deux produits de la MAMA et nrLAM-PCR sont parfaitement adaptés pour aval séquençage à haut débit. Séquençage à haut débit de (nr) produits LAM-PCR et la cartographie de séquences brutes extraites du génome correspondant permet de caractériser inconnue flanquant l'ADN ou l'identification de la localisation exacte du vecteur du génome jonctions 30.En introduisant des séquences de codes à barres dans les fusionprimers plusieurs centaines de produits de la MAMA et nrLAM-PCR peuvent être séquencés dans un séquençage terme 30.
En raison de la sensibilité élevée, LAM-PCR est sujette à la contamination si elle est exécutée distraitement. Ainsi, un environnement de grade PCR et une attention particulière pour nettoyer la manipulation du protocole est d'une importance capitale pour amplifier avec succès l'inconnu ADN flanquant sans contaminer les échantillons. Par conséquent, y compris l'ADN génomique untransduced et un contrôle de l'eau pour chaque réaction de PCR comme témoins négatifs dans le protocole LAM-PCR est fortement recommandée. Si les échantillons de contrôle indiquent que la contamination croisée s'est produite pendant le protocole, les produits de chaque point de pause peuvent être utilisés pour répéter parties du protocole. Quand les bandes sont encore présentes, il est recommandé de jeter tous les réactifs (p. ex., Les amorces, dNTP, polymérases, etc) et en répétant le protocole (n °) LAM-PCR avec de nouvelles aliquotes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq DNA Polymerase | Genaxxon Bioscience GmbH | M3001.5000 | Alternative Taq Polymerases may be used |
| PCR Buffer | Qiagen | 201203 | Use of this buffer is recommended |
| dNTP-Mixture | Genaxxon Bioscience GmbH | M3015.4020 | or any other dNTPs |
| Oligonucleotides (Primers) | MWG Biotech | HPLC purified | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11206D | |
| PBS | Gibco | 14190-086 | 0.1% wt/vol BSA |
| 6 M LiCl | Roth | 3739.1 | 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA |
| Tris-HCl, pH 7.5 | USB Corporation | 22637 | or any other supplier |
| EDTA | Applichem | A1103,0250 | or any other supplier |
| Klenow Polymerase | Roche Diagnostics | 10104523001 | |
| Hexanucleotide mixture | Roche Diagnostics | 11277081001 | |
| Restriction endonuclease | NEB | or any other supplier | |
| Fast-Link DNA ligation kit | Epicentre Biotechnologies | LK11025 | |
| CircLigase ssDNA Ligase Kit | Epicentre Biotechnologies | CL4111K | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | or any other supplier |
| Agarose LE | Roche Diagnostics | 11685660001 | or any other supplier |
| TBE buffer | Amresco | 0658 | or any other supplier |
| Ethidium bromide | Applichem | A2273,0005 | Ethidium bromide is mutagenic |
| 100 bp DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | or any other DNA ladder |
| 20 mM NaCl | Sigma-Aldrich | 71393-1L | or any other supplier |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158501 | for use with 1.5 ml Tubes |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158696 | for use with 96-well plates |
| Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membrane | Millipore | UFC503096 | |
| PerfectBlue Gelsystem Midi S | PeqLab | 40-1515 | or other electrophoresis system |
| TProfessional 96 | Biometra | 050-551 | or other Thermocycler for 96-well plates |
| Orbital shaker KS 260 basic | IKA | 2980200 | or other horizontal shaker |
| PCR softtubes 0.2 ml | Biozym Scientific GmbH | 711082 | or other 0.2 ml PCR tubes |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 12682 | or other 1.5 ml tubes |
| Gel documentation system | PeqLab | or any other gel documentation system | |
| Nanodrop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Spreadex EL1200 precast gel | Elchrom Scientific | 3497 | |
| Submerged gel electrophoresis apparatus SEA 2000 | Elchrom Scientific | 2001E | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA |
References
- Schmidt, M., et al. Detection and direct genomic sequencing of multiple rare unknown flanking DNA in highly complex samples. Hum Gene Ther. 12, 743-749 (2001).
- Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat Methods. 4, 1051-1057 (2007).
- Schroeder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
- Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M. Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration. Science. 300, 1749-1751 (2003).
- Vigdal, T. J., Kaufman, C. D., Izsvak, Z., Voytas, D. F., Ivics, Z. Common physical properties of DNA affecting target site selection of sleeping beauty and other Tc1/mariner transposable elements. J Mol Biol. 323, 441-452 (2002).
- Lewinski, M. K., et al. Retroviral DNA integration: viral and cellular determinants of target-site selection. PLoS Pathog. 2, (2006).
- Mueller, P. R., Wold, B. In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR. Science. 246, 780-786 (1989).
- Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. Journal of virology. 63, 1924-1928 (1989).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nature medicine. 15, 1431-1436 (2009).
- Harkey, M. A., et al. Multiarm high-throughput integration site detection: limitations of LAM-PCR technology and optimization for clonal analysis. Stem Cells Dev. 16, 381-392 (2007).
- Wang, G. P., et al. DNA bar coding and pyrosequencing to analyze adverse events in therapeutic gene transfer. Nucleic acids research. 36, (2008).
- Paruzynski, A., et al. Genome-wide high-throughput integrome analyses by nrLAM-PCR and next-generation sequencing. Nat. Protocols. 5, 1379-1395 (2010).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest. , 3132-3142 (2008).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1. Science. 302, 415-419 (2003).
- Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. J Clin Invest. 118, 3143-3150 (2008).
- Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326, 818-823 (2009).
- Matrai, J., et al. Hepatocyte-targeted expression by integrase-defective lentiviral vectors induces antigen-specific tolerance in mice with low genotoxic risk. Hepatology. 53, 1696-1707 (2011).
- Penaud-Budloo, M., et al. Adeno-associated virus vector genomes persist as episomal chromatin in primate muscle. Journal of virology. 82, 7875-7885 (2008).
- Kaeppel, C., et al. A largely random AAV integration profile after LPLD gene therapy. Nature medicine. 19, 889-891 (2013).
- Voigt, K., et al. Retargeting sleeping beauty transposon insertions by engineered zinc finger DNA-binding domains. Mol Ther. 20, 1852-1862 (2012).
- Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nature medicine. 12, 348-353 (2006).
- Boztug, K., et al. Stem-Cell Gene Therapy for the Wiskott-Aldrich Syndrome. N Engl J Med. 363, 1918-1927 (2010).
- Deichmann, A., et al. Vector integration is nonrandom and clustered and influences the fate of lymphopoiesis in SCID-X1 gene therapy. J Clin Invest. 117, 2225-2232 (2007).
- Schwarzwaelder, K., et al. Gammaretrovirus-mediated correction of SCID-X1 is associated with skewed vector integration site distribution in vivo. J Clin Invest. 117, 2241-2249 (2007).
- Gabriel, R., et al. An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity. Nat Biotechnol. 29, 816-823 (2011).
- Dieter, S. M., et al. Distinct types of tumor-initiating cells form human colon cancer tumors and metastases. Cell Stem Cell. 9, 357-365 (2011).
- Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nature biotechnology. 24, 687-696 (2006).
- Zavidij, O., et al. Stable long-term blood formation by stem cells in murine steady-state hematopoiesis. Stem Cells. 30, 1961-1970 (2012).
- Martins, V. C., et al. Thymus-autonomous T cell development in the absence of progenitor import. J Exp Med. 209, 1409-1417 (2012).
- Arens, A., et al. Bioinformatic clonality analysis of next-generation sequencing-derived viral vector integration sites. Hum Gene Ther Methods. 23, 111-118 (2012).
