Summary
रैखिक प्रवर्धन की मध्यस्थता (लैम) पीसीआर जीनोम में वायरल वैक्टर को एकीकृत करने की सटीक पदों की पहचान करने के लिए विकसित की एक विधि है. तकनीक जीन थेरेपी रोगियों, आदि उपन्यास वेक्टर प्रौद्योगिकियों, टी सेल विविधता, कैंसर स्टेम सेल मॉडल, की जैव सुरक्षा में प्रतिरूप गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए बेहतर तरीका हो विकसित किया गया है
Introduction
रैखिक प्रवर्धन पीसीआर (लैम पीसीआर) की मध्यस्थता में किसी भी मूल के ज्ञात डीएनए से सटे अज्ञात flanking डीएनए की पहचान करने और निस्र्पक की अनुमति देता है. अधिक विशेष रूप से, लैम पीसीआर मेजबान जीनोम 1,2 भीतर (है) वायरल वेक्टर एकीकरण साइटों स्थानीय बनाना करने के लिए विकसित किया गया है. रेट्रोवायरस या transposons जैसे आनुवंशिक तत्व एक (अर्द्ध) बेतरतीब ढंग से 3-6 में मेजबान जीनोम में उनके जीनोम एकीकृत. कई मामलों में यह इन वैक्टर एकीकृत वास्तव में, जहां स्थिति पता करने के लिए निर्णायक है. लैम पीसीआर बंधाव की मध्यस्थता पीसीआर 7 और इसके वेरिएंट या उलटा पीसीआर 8 जैसे वैकल्पिक तकनीकों को बेहतर साबित किया गया है. इस विधि की संवेदनशीलता और मजबूती वेक्टर जीनोम जंक्शनों और प्रवर्धित पीसीआर उत्पादों की चुंबकीय चयन की प्रारंभिक preamplification से उत्पन्न होती है. उल्लेख वैकल्पिक तरीकों की तरह, लैम पीसीआर IS 9-11 की पुनर्प्राप्ति क्षमता में एक पूर्वाग्रह शुरू करने, प्रतिबंध एंजाइमों के उपयोग पर निर्भर करता है. इस प्रकार,IS प्रदर्शनों की सूची (integrome) का केवल एक उप एक प्रतिक्रिया में पता लगाया जा सकता है. यह पूर्वाग्रह प्रतिबंध एंजाइमों 9 के इष्टतम संयोजन का उपयोग कर किसी नमूने की समानांतर विश्लेषण से कम से कम है. हाल ही में, प्रौद्योगिकी का एक प्रकार प्रतिबंध एंजाइमों के उपयोग में गतिरोध उत्पन्न और एक भी प्रतिक्रिया 9,12 में एक नमूना की निष्पक्ष जीनोम चौड़ा विश्लेषण की अनुमति देता है कि लैम पीसीआर (nrLAM पीसीआर) विकसित किया गया है गैर प्रतिबंधात्मक करार दिया.
अतीत में, लैम पीसीआर प्रेरणा का रेट्रोवायरल नैदानिक जीन थेरेपी परीक्षण 13-15 में कुछ रोगियों में ल्यूकेमिया को जन्म दे रहा है की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. तब से, लैम पीसीआर की पहचान करने के लिए अनुकूलित किया गया है अन्य को एकीकृत वैक्टर (lentiviral वैक्टर, transposons) और भी निष्क्रिय एडिनो से जुड़े वैक्टर (AAV) या integrase-दोषपूर्ण lentiviral वैक्टर (IDLV) की तरह वैक्टर एकीकृत करने के एकीकरण पैटर्न की पहचान करने से 16 -21. लैम पीसीआर के आवेदन व्यापक प्रसार कर रहे हैं: पारंपरिकly, तकनीक का व्यापक रूप से जीन थेरेपी आया है कि रोगियों में जीन संशोधित कोशिकाओं का प्रतिरूप संरचना का अध्ययन करने के लिए या उनके एकीकरण व्यवहार 15,16,22-24 unraveling द्वारा उपन्यास वेक्टर प्रणालियों की जैव सुरक्षा का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. हाल ही में, लैम पीसीआर एक IDLV फँसाने परख 25 से विशिष्टता और डिजाइनर न्युक्लिअसिज़ के बंद लक्ष्य गतिविधि का निर्धारण करने में सक्षम बनाया.
इसके अलावा, लैम पीसीआर आसानी से एक जीव में समय के साथ एक transduced सेल के भाग्य का पालन करने के लिए अनुमति देता है. इस आद्य ओंकोजीन के रूप में अच्छी तरह से ट्यूमर शमन जीनों की पहचान करने के लिए और भी hematopoiesis या कैंसर स्टेम कोशिका जीव विज्ञान 26-28 अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है. लेकिन पिछले कम से कम नहीं, लैम पीसीआर मनुष्यों 29 (और अप्रकाशित डेटा) में टी सेल रिसेप्टर विविधता का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया गया था.
प्रौद्योगिकी की आंतरिक शक्ति एकल nucleotide आर के साथ अज्ञात flanking डीएनए के लाखों निस्र्पक की अनुमति है कि गहरी अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के लिए विधि जोड़ने से मजबूत बनाया हैपूरे जीनोम में esolution. निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम कदम कदम प्रवर्धन और lentiviral वेक्टर है की पहचान करने के लिए exemplarily अज्ञात डीएनए flanking की पहचान का वर्णन. प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया oligonucleotides. किसी भी स्रोत से निकाले डीएनए या सीडीएनए लैम पीसीआर और nrLAM पीसीआर के लिए डीएनए टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है 1 टेबल में सूचीबद्ध हैं.
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Protocol
Linker कैसेट्स की 1. तैयारी (नियंत्रण रेखा)
- LC1 oligonucleotide (तालिका 1), (उचित प्रतिबंध एंजाइम की अधिकता के साथ तालिका 1) LC2 oligonucleotide, 110 μl Tris-एचसीएल (100 मिमी, 7.5 पीएच), और 10 μl 250 मिमी 2 MgCl के 40 μl के 40 μl मिलाएं.
- 5min के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और प्रतिक्रिया कमरे के तापमान को धीरे - धीरे शांत हो जाओ. 300 μl एच 2 हे जोड़ें और एक centrifugation फिल्टर पर dsLinker डीएनए ध्यान केंद्रित. 0.2 पीसीआर ट्यूब में तैयार लिंकर कैसेट की eluate और विभाज्य 10 μl 80 μl एच 2 हे जोड़ें.
वेक्टर जीनोम जंक्शनों 2. Preamplification
- विश्लेषण किया जा करने के लिए हर नमूना एक 50 μl पीसीआर प्रतिक्रिया तैयार करने के लिए.
- डीएनए नमूनों की एकाग्रता का निर्धारण. पिपेट एक्स μl (1-1,000 nrLAM के लिए एनजी LAM/100-1, 000 के लिए एनजी) एक 0.2 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब में डीएनए की. डीएनए की मात्रा प्रत्येक नमूने में और भाग गया में बराबर होना चाहिए0.5-25 μl के जीई.
- तालिका 2 में वर्णित के रूप में पीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार मिक्स (50 - एक्स). 0.2 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब में प्रत्येक डीएनए नमूने के साथ मास्टर मिश्रण के μl.
- पीसीआर के पूरा होने के बाद. तालिका 2 में उदाहरण पीसीआर शर्तों का उपयोग Preamplify वेक्टर जीनोम जंक्शनों प्रत्येक पीसीआर ट्यूब और फिर से दौड़ना पीसीआर कार्यक्रम को Taq पोलीमरेज़ μl 0.5 जोड़ें. पीसीआर उत्पादों -20 डिग्री सेल्सियस पर अप करने के लिए 4 दिन या लंबी अवधि के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है
पीसीआर उत्पाद के 3. चुंबकीय जुदाई
- चुंबकीय मोतियों की तैयारी
- पिपेट 20 एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में streptavidin लेपित चुंबकीय मोतियों की μl (200 ग्राम) और कमरे के तापमान पर चुंबकीय कण विभाजक (एमपीएस) पर 1 मिनट के लिए बेनकाब. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
- सांसदों से ट्यूब निकालें और 40 μl पीएसबी / 0.1% BSA (7.5 पीएच) में चुंबकीय मोती resuspend. 1 मिनट के लिए सांसदों को बेनकाब और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. एक बार इस चरण को दोहराएँ.
- धो वाई मोती3 एम LiCl समाधान के 20 μl वें (3 एम LiCl, 10 मिमी Tris-एचसीएल, 1 मिमी EDTA) 1 मिनट के लिए सांसदों को बेनकाब और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. 6 एम LiCl समाधान (6 एम LiCl, 10 मिमी Tris-एचसीएल, 1 मिमी EDTA) का 50 μl में Resuspend मोती.
- तैयार चुंबकीय मोतियों की 50 μl के साथ 2.2 कदम से पूरे पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण. कम से कम कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए एक क्षैतिज प्रकार के बरतन (300 आरपीएम) पर सेते हैं. यह कदम लिपटे मोतियों (डीएनए मनका जटिल) streptavidin को biotinylated पीसीआर उत्पाद के बंधन की अनुमति देता है. डीएनए मनका जटिल रातोंरात प्रकार के बरतन पर incubated या अप करने के लिए 4 दिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
- कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए सांसदों को डीएनए मनका जटिल पर्दाफाश, सतह पर तैरनेवाला हटाने, और 100 μl एच 2 ओ में डीएनए मनका जटिल resuspend इसके तत्काल बाद लैम या nrLAM के लिए 5 कदम के लिए कदम 4 के साथ आगे बढ़ना.
4. लैम प्रक्रिया
- डबल कतरा डीएनए (dsDNA) संश्लेषण (लैम केवल)
- 1 मिनट और जिले के लिए सांसदों को 3.3 कदम से डीएनए मनका जटिल बेनकाबकार्ड पर तैरनेवाला. 8.25 एच 2 ओ के μl, 1 μl 10x hexanucleotide बफर, 0.25 μl dNTPs (10 मिमी) और 0.5 μl (2 यू) Klenow पोलीमरेज़ जोड़ें. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- एच 2 ओ के 90 μl जोड़ें और 1 मिनट के लिए सांसदों को बेनकाब. 100 μl एच 2 ओ में सतह पर तैरनेवाला और resuspend डीएनए मनका जटिल त्यागें
- प्रतिबंध डाइजेस्ट
- 1 मिनट के लिए सांसदों को डीएनए मनका जटिल बेनकाब और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. 8.5 μl एच 2 ओ, 1 μl 10x प्रतिबंध एंजाइम बफर और प्रतिबंध एंजाइम के 0.5 μl जोड़ें और 1 घंटे के लिए प्रतिक्रिया सेते हैं. कदम 4.1.2 दोहराएँ.
नोट: प्रतिबंध एंजाइम के निर्माता से सिफारिश के तापमान पर प्रतिक्रिया सेते हैं. कोई प्रतिबंध साइट के भीतर मौजूद या ब्याज के डीएनए में preamplification के लिए इस्तेमाल किया प्राइमर बाध्यकारी साइट के बहाव है कि सुनिश्चित करें. उपयुक्त प्रतिबंध एंजाइमों / प्रतिबंध एंजाइम संयोजन के चुनाव के लिए 9 को देखें.
- 1 मिनट के लिए सांसदों को डीएनए मनका जटिल बेनकाब और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. 8.5 μl एच 2 ओ, 1 μl 10x प्रतिबंध एंजाइम बफर और प्रतिबंध एंजाइम के 0.5 μl जोड़ें और 1 घंटे के लिए प्रतिक्रिया सेते हैं. कदम 4.1.2 दोहराएँ.
- Ligation डी एस के Linker (लालकृष्ण)
- 1 मिनट के लिए सांसदों को डीएनए मनका जटिल बेनकाब और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. 5 μl एच 2 ओ, 1 μl 10x FastLink बफर, 1 μl एटीपी (10 मिमी), कदम 1.2 से 2 μl Linker कैसेट, और 1 μl फास्ट लिंक डीएनए ligase (2 यू / μl) जोड़ें. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. कदम 4.1.2 दोहराएँ.
- संश्लेषित dsDNA का विकृतीकरण
- 1 मिनट के लिए सांसदों को डीएनए मनका जटिल बेनकाब और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. 5 μl 0.1 एन NaOH में Resuspend डीएनए मनका जटिल. एक क्षैतिज प्रकार के बरतन पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट सेते हैं.
- 1 मिनट के लिए सांसदों को डीएनए मनका जटिल बेनकाब और नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला युक्त preamplified वेक्टर जीनोम जंक्शन इकट्ठा. तुरंत -20 डिग्री सेल्सियस पर कदम 6 या दुकान पर तैरनेवाला के साथ आगे बढ़ना
5. NrLAM प्रक्रिया
- एकल असहाय linker के ligation (एसएसएलसी) (nrLAM केवल)
- सांसदों को 3.3 कदम से डीएनए मनका जटिल बेनकाब1 मिनट और सतह पर तैरनेवाला त्यागें के लिए. 6.5 μl एच 2 ओ जोड़ें, 1 μl 10x प्रतिक्रिया बफर, CircLigase 0.5 μl 2 MnCl (50 मिमी), 0.5 एटीपी (1 मिमी) μl, 1 μl ssLinker oligonucleotide और 0.5 μl CircLigase (100 यू / μl). 1 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- एच 2 ओ के 90 μl जोड़ें और 1 मिनट के लिए सांसदों को बेनकाब. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 100 μl एच 2 ओ में डीएनए मनका जटिल धोने फिर 10 μl एच 2 ओ में 1 मिनट, सतह पर तैरनेवाला त्यागें और resuspend डीएनए मनका जटिल के लिए सांसदों को बेनकाब
6. घातीय प्रवर्धन मैं
- विश्लेषण किया जा करने के लिए हर नमूना एक 50 μl पीसीआर प्रतिक्रिया तैयार करने के लिए.
- पिपेट 2 μl टेम्पलेट (कदम 4.4.2 (लैम से) या 5.1.2 (nrLAM)) डीएनए एक 0.2 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब में.
- तालिका 3 में वर्णित के रूप में पीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार करें. कदम 6.1.1 से प्रत्येक नमूने के लिए मास्टर मिश्रण के 48 μl जोड़ें और पीसीआर conditio द्वारा वेक्टर जीनोम जंक्शनों बढ़ाना3 तालिका में उदाहरण एनएस. पीसीआर उत्पादों -20 डिग्री सेल्सियस पर अप करने के लिए 4 दिन या लंबी अवधि के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है
पीसीआर उत्पाद का 7. चुंबकीय जुदाई
- 3.1.3 - कदम 3.1.1 में उदाहरण के रूप में चुंबकीय मोती तैयार. (लैम के लिए) 20 μl या 6 एम LiCl समाधान (6 एम LiCl, 10 मिमी Tris-एचसीएल, 1 मिमी EDTA) का (nrLAM के लिए) 50 μl में Resuspend मोती. 20 μl (लैम) या तैयार चुंबकीय मोतियों के साथ कदम 6.1.2 से पीसीआर प्रतिक्रिया (कदम 7.1) का 50 μl (nrLAM) मिक्स और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए एक क्षैतिज प्रकार के बरतन (300 आरपीएम) पर सेते हैं. डीएनए मनका जटिल रातोंरात प्रकार के बरतन पर incubated या अप करने के लिए 4 दिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
- 1 मिनट के लिए सांसदों को डीएनए मनका जटिल पर्दाफाश, सतह पर तैरनेवाला हटाने और 100 μl एच 2 ओ में डीएनए मनका जटिल resuspend 1 मिनट के लिए सांसदों को डीएनए मनका जटिल बेनकाब और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
- 20 μl (लैम) या 5 μl (nrLAM) 0.1 एन NaOH में Resuspend डीएनए मनका जटिल. Incuएक क्षैतिज प्रकार के बरतन पर कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पीटा, 1 मिनट के लिए सांसदों को बेनकाब करने और नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में परिलक्षित डीएनए युक्त सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा. तुरंत -20 डिग्री सेल्सियस पर कदम 8.1 या दुकान पर तैरनेवाला के साथ आगे बढ़ना
8. घातीय प्रवर्धन द्वितीय
- विश्लेषण किया जा करने के लिए हर नमूना एक 50 μl पीसीआर प्रतिक्रिया तैयार करने के लिए.
- एक 0.2 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब में (कदम 7.3 से) पिपेट 2 μl टेम्पलेट डीएनए.
- तालिका 4 में वर्णित के रूप में पीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार करें. कदम 8.1.1 से प्रत्येक नमूने के लिए मास्टर मिश्रण के 48 μl जोड़ें और 4 तालिका में उदाहरण पीसीआर स्थितियों से वेक्टर जीनोम जंक्शनों बढ़ाना. पीसीआर उत्पादों के लिए 4 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है -20 डिग्री सेल्सियस पर दिन या दीर्घकालिक
- कल्पना करने के लिए (एनआर) लैम पीसीआर उत्पादों, एक 2% agarose जेल पर कदम 8.1.2 से पीसीआर उत्पाद का भार 10 μl. बैंड दिखाई दे रहे हैं, उच्च संकल्प जेल पर लैम पीसीआर उत्पाद के 10 μl का विश्लेषण. चेतावनी: EThidium ब्रोमाइड mutagenic है. बहुत सावधानी से काम करते हैं और हमेशा उचित दस्ताने पहनते हैं.
उच्च throughput अनुक्रमण के लिए 9. तैयारी
- (एनआर) लैम पीसीआर उत्पादों का शोधन
- कमरे के तापमान AMPure XP चुंबकीय मोतियों की 44 μl के साथ कदम 8.1.2 से 40 μl पीसीआर उत्पाद मिश्रण. कमरे के तापमान पर 5 मिनट सेते हैं और अतिरिक्त 2 मिनट के लिए सांसदों को बेनकाब.
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और सांसदों पर 200 μl 70% EtOH के साथ दो बार धोने.
- 30 μl एच 2 ओ में सतह पर तैरनेवाला और resuspend डीएनए मनका जटिल त्यागें ताजा 0.2 मिलीलीटर ट्यूब 1 मिनट और स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला सेते हैं. शुद्ध डीएनए की एकाग्रता का निर्धारण.
- Fusionprimer पीसीआर विशिष्ट एडेप्टर अनुक्रमण जोड़ने के लिए.
- विश्लेषण किया जा करने के लिए हर नमूना एक 50 μl पीसीआर प्रतिक्रिया तैयार करने के लिए.
- एक 0.2 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब में डीएनए की पिपेट एक्स μl (40 एनजी). डीएनए की मात्रा प्रत्येक नमूने में और 0.5-25 μl की रेंज में बराबर होना चाहिए.
- 5 तालिका में वर्णित के रूप में पीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार जोड़ना (50 - एक्स). कदम 9.2.2 से प्रत्येक नमूने के लिए मास्टर मिश्रण के μl और टेबल 5 पीसीआर उत्पादों में उदाहरण पीसीआर की स्थिति से (एनआर) लैम पीसीआर उत्पादों को अनुक्रमण एडेप्टर परिचय. -20 डिग्री सेल्सियस पर अप करने के लिए 4 दिन या लंबी अवधि के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है
- Fusionprimer पीसीआर उत्पादों लोड एक 2% agarose जेल पर कदम 9.2.3 से पीसीआर उत्पाद के 10 μl कल्पना करने के लिए. 9.1.3 - कदम 9.1.1 में वर्णित के रूप में शेष पीसीआर उत्पाद शुद्ध. सही Fusionprimer पीसीआर उत्पादों की एकाग्रता और टुकड़ा आकार यों के लिए एक स्वचालित उच्च संकल्प वैद्युतकणसंचलन डिवाइस पर कदम 9.4 से 1 μl शुद्ध किया पीसीआर उत्पाद का विश्लेषण करें.
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Representative Results
लैम पीसीआर प्रत्येक जंक्शन के लिए एक परिभाषित टुकड़ा आकार के साथ वेक्टर जीनोम जंक्शनों के प्रवर्धन में यह परिणाम है. व्यक्तिगत पीसीआर टुकड़े का आकार जीनोम में जाना जाता डीएनए के स्थान और निकटतम प्रतिबंध एंजाइम मान्यता साइट के बीच की दूरी पर निर्भर करता है. इस जेल वैद्युतकणसंचलन, जैसे द्वारा विश्लेषण के नमूनों में परिलक्षित जंक्शनों की विविधता दृश्यमान करने की अनुमति देता है., केवल एकल (मोनोक्लोनल) कई (oligoclonal), या एकाधिक (पॉलीक्लोनल) बैंड जेल पर मौजूद हैं. लैम पीसीआर का परिणाम सबसे अच्छा उच्च संकल्प वैद्युतकणसंचलन जैल (2A चित्रा) से देखा जाता है, लेकिन यह भी 2% agarose जैल (चित्रा 2 बी) पर देखे जा सकते हैं. nrLAM पीसीआर प्रत्येक व्यक्ति जंक्शन के लिए विभिन्न लंबाई की पीसीआर टुकड़े में यह परिणाम है. इस प्रकार, मोनोक्लोनल oligoclonal या पॉलीक्लोनल नमूने वैद्युतकणसंचलन द्वारा एक धब्बा के रूप में दिखाई देते हैं और नेत्रहीन प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है. 2% agarose जेल पर nrLAM पीसीआर उत्पाद Visualizing सफलता का निर्धारण करने के लिए पर्याप्त हैप्रोटोकॉल (चित्रा -2) का उपकर. अनुक्रमण के बाद बरामद जीनोमिक डीएनए वेक्टर (चित्रा 3) के स्थान की सटीक पदों की पहचान करने के लिए संबंधित मेजबान जीनोम के लिए गठबंधन किया जा सकता है. जीनोम की व्याख्या जीन कोडिंग क्षेत्रों (3B चित्रा) या प्रतिलेखन शुरू साइटों के करीब (चित्रा -3 सी) में एकीकरण के लिए पसंद की तरह अलग वेक्टर विशिष्ट सुविधाओं के लिए है प्रदर्शनों की सूची का विश्लेषण करने की अनुमति देता है.
चित्रा 1. लैम पीसीआर और nrLAM पीसीआर के योजनाबद्ध रूपरेखा. ए) दोनों तरीकों से जाना जाता डीएनए अनुक्रम एक रेट्रोवायरल वेक्टर के (यहाँ लंबे टर्मिनल दोहराने (लीटर)) के अंत के करीब hybridizing biotinylated प्राइमरों का उपयोग वेक्टर जीनोम जंक्शनों की एक शुरुआती preamplification के साथ शुरू करते हैं. Biotinylated में preamplification परिणामसमान या अलग वेक्टर जीनोम जंक्शनों के लिए विभिन्न आकार के ssDNA. Biotinylated ssDNA चुंबकीय कणों पर कब्जा कर लिया है. बी) लैम पीसीआर, dsDNA संश्लेषण से बना enzymatic प्रतिक्रिया कदम, प्रतिबंध डाइजेस्ट और एक ज्ञात लिंकर डीएनए उत्पाद के दोनों सिरों पर ज्ञात दृश्यों के साथ विभिन्न आकार के उत्पादों उत्पन्न की बंधाव के लिए. कारण प्रतिबंध लंबाई बहुरूपता के लिए प्रत्येक परिलक्षित जंक्शन एक विशेषता लंबाई है. विकृतीकरण के बाद लैम पीसीआर उत्पाद linker और वेक्टर विशिष्ट प्राइमरों के साथ नेस्टेड पीसीआर से परिलक्षित होता है. सी) nrLAM के लिए एक ssDNA लिंकर अनुक्रम सीधे linker के साथ नेस्टेड पीसीआर द्वारा घातीय प्रवर्धन) की अनुमति एक से preamplified ssDNA की अज्ञात अंत तक ligated और है विशिष्ट प्राइमरों सदिश. यह आंकड़ा से संशोधित किया गया है 2,12. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें. >
चित्रा 2. लैम पीसीआर और nrLAM पीसीआर के प्रतिनिधि परिणाम. जीन थेरेपी इलाज के रोगियों के परिधीय रक्त से अलग डीएनए की ए, बी) लैम पीसीआर विश्लेषण. जेल पर बैंड की संख्या नमूने में मौजूद की संख्या से मेल खाती है. उच्च संकल्प जैल (बी) (ए). सी) lentiviral वेक्टर transduced एकल कक्ष क्लोन या थोक कोशिकाओं की nrLAM पीसीआर विश्लेषण 2% agarose जैल से विश्लेषण किया नमूनों की clonality कल्पना करने के लिए अधिक उपयोगी हैं. प्रवर्धित प्रविष्टि साइटों की संख्या की स्वतंत्र एक धब्बा वैद्युतकणसंचलन के बाद जेल पर देखा जाता है. एम, 100 बीपी सीढ़ी; एम सी, मोनोक्लोनल; मैडोना, oligoclonal; पीसी, पॉलीक्लोनल. यह आंकड़ा 2,9 से संशोधित किया गया है.
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चित्रा 3. के लिए प्रतिनिधि उदाहरण लैम पीसीआर और बाद में उच्च throughput अनुक्रमण द्वारा विश्लेषण है. Gammaretroviral (नीला) या lentiviral (हरा) चिकित्सीय जीन थेरेपी परीक्षण से दो रोगियों में वितरण है. संबंधित जीनोम को अनुक्रमण और लैम पीसीआर उत्पादों की मैपिंग मूल्यांकन किया जा सकता है, के बाद जैसे:.. Gammaretroviral और lentiviral वैक्टर और सी के बीच जीन कोडिंग क्षेत्रों में सम्मिलन के लिए वरीयता के अनुसार बी) अंतर का एक) जीनोम चौड़ा वितरण) प्रतिलेखन शुरू साइटों के लिए करीब प्रविष्टि के लिए वरीयता. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
| उद्देश्य | नाम | अनुक्रम (5'-3 ') |
| लालकृष्ण सार्वभौमिक | LC1 | GACCCGGGAGATCTGAATTCAGTGGCACAG CAGTTAGG |
| लालकृष्ण-AATT | LC2 (AATT) | AATTCCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCA GATC |
| लालकृष्ण तटरक्षक | LC2 (सीजी) | CGCCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCAGATC |
| लालकृष्ण टीए | LC2 (टीए) | TACCTAACTGCTGTGCCACTGAAATCAGATC |
| लालकृष्ण-nrLAM पीसीआर | एसएसएलसी | (पी) CCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCAGATC TCCCGGGTddC |
| Preamplification | लीटर मैं (3'-दिशा) | (बी) AGTAGTGTGTGCCCGTCTGT |
| लीटर मैं (5'-दिशा) | (बी) TTAGCCAGAGAGCTCCCAGG | |
| घातीय प्रवर्धन मैं | लीटर द्वितीय (3'-दिशा) | (बी) GTGTGACTCTGGTAACTAGAG |
| लीटर द्वितीय (5'-दिशा) | (बी) GATCTGGTCTAACCAGAGAG | |
| नियंत्रण रेखा मैं | GACCCGGGAGATCTGAATTC | |
| घातीय प्रवर्धन द्वितीय | लीटर-III (3'-दिशा) | GATCCCTCAGACCCTTTTAGTC |
| लीटर-III (5'-दिशा) | CCCAGTACAAGCAAAAAGCAG | |
| नियंत्रण रेखा द्वितीय | GATCTGAATTCAGTGGCACAG |
तालिका 1. Oligonucleotides के लिए लैम और nrLAM पीसीआर lentiviral बढ़ाना एसएसएलसी 5'-अंत (पी) पर phosphorylated है. है और बंधाव दौरान एसएसएलसी की multimerization से बचने के लिए (डीडीसी) didesoxycytidin '3 पर है. सामान्य में, (एनआर) लैम पीसीआर प्राइमरों 18-25 nucleotides से मिलकर चाहिए और मेजबान जीनोम के लिए पंक्ति में नहीं होना चाहिए. Preamplification के लिए प्राइमर वेक्टर के 5 'या 3' अंत करने के लिए (120 बी पी ≤) संभव के रूप में बंद के रूप में रखा जाना चाहिए. घातीय पीसीआर मैं और द्वितीय के लिए दो अतिरिक्त प्राइमरों प्राइमर के बीच रखा जाना चाहिएpreamplification और वेक्टर अंत के लिए इस्तेमाल किया. प्राइमर preamplification और घातीय पीसीआर के लिए मैं 5'-phosphorylated (पी) की जरूरत है.
| अभिकर्मक | वॉल्यूम (μl) | एकाग्रता | पीसीआर पैरामीटर्स | तापमान | समय | |
| H2O | 43 - एक्स | प्रारंभिक विकृतीकरण | 95 डिग्री सेल्सियस | 5 मिनट | ||
| बफर | 5 | 10 X | विकृतीकरण | 95 डिग्री सेल्सियस | 45 सेकंड | |
| dNTP | 1 | 10 मिमी (लैम); 0.5 माइक्रोन (nrLAM) | एनीलिंग | 60 डिग्री सेल्सियस | 45 सेकंड | 2 एक्स 50 चक्रों |
| लीटर मैं | 0.5 | 0.17 माइक्रोन | बढ़ाव | 72 डिग्री सेल्सियस | 60 सेकंड (लैम); 10 सेकंड (nrLAM) | |
| Taqपोलीमर्स | 0.5 | 2.5 यू / μl | अंतिम बढ़ाव | 72 डिग्री सेल्सियस | 5 मिनट (लैम केवल) |
तालिका 2. वेक्टर जीनोम जंक्शनों (चरण 2) के preamplification के लिए पीसीआर शर्तों. कॉलम 1-3 एक डीएनए नमूने के प्रवर्धन के लिए इस्तेमाल पीसीआर अभिकर्मकों दिखा. कॉलम 4-6 वेक्टर जीनोम जंक्शनों preamplify को पीसीआर कार्यक्रम उदाहरण देना.
| अभिकर्मक | वॉल्यूम (μl) | एकाग्रता | पीसीआर पैरामीटर्स | तापमान | समय | |
| एच 2 हे | 40.5 | प्रारंभिक विकृतीकरण | 95 डिग्री सेल्सियस | 5 मिनट | ||
| बफर | 5 | 10 X | विकृतीकरण | 95 डिग्री सेल्सियस | 45 सेकंड | |
| dNTP | 1 </ P> | 10 मिमी | एनीलिंग | 60 डिग्री सेल्सियस | 45 सेकंड | 35 साइकिल |
| लीटर द्वितीय | 0.5 | 16.7 माइक्रोन | बढ़ाव | 72 डिग्री सेल्सियस | 60 सेकंड (लैम); 5 सेकंड (nrLAM) | |
| नियंत्रण रेखा मैं | 0.5 | 16.7 माइक्रोन | अंतिम बढ़ाव | 72 डिग्री सेल्सियस | 5 मिनट (लैम केवल) | |
| Taq पोलीमरेज़ | 0.5 | 2.5 यू / μl |
तालिका 3. पीसीआर स्थितियां घातीय प्रवर्धन के लिए मैं (चरण 6). कॉलम 1-3 एक डीएनए नमूने की घातीय प्रवर्धन के लिए इस्तेमाल पीसीआर अभिकर्मकों दिखा. कॉलम 4-6 तेजी लिंकर अनुक्रम के ligation के बाद एक नमूना बढ़ाना इस्तेमाल पीसीआर कार्यक्रम उदाहरण देना.
| अभिकर्मक | Volume (μl) | एकाग्रता | पीसीआर पैरामीटर्स | तापमान | समय | |
| एच 2 हे | 40.5 | प्रारंभिक विकृतीकरण | 95 डिग्री सेल्सियस | 5 मिनट | ||
| बफर | 5 | 10 X | विकृतीकरण | 95 डिग्री सेल्सियस | 45 सेकंड | |
| dNTP | 1 | 10 मिमी | एनीलिंग | 60 डिग्री सेल्सियस | 45 सेकंड | 35 साइकिल |
| लीटर III | 0.5 | 16.7 माइक्रोन | बढ़ाव | 72 डिग्री सेल्सियस | 60 सेकंड (लैम); 5 सेकंड (nrLAM) | |
| नियंत्रण रेखा द्वितीय | 0.5 | 16.7 माइक्रोन | अंतिम बढ़ाव | 72 डिग्री सेल्सियस | 5 मिनट | |
| Taq पोलीमरेज़ | 0.5 | 2.5 यू / μl |
तालिका 4. पीसीआर स्थितियां घातीय प्रवर्धन के लिए मैं (चरण 8). कॉलम 1-3 एक भी नमूना के नेस्टेड घातीय प्रवर्धन के लिए इस्तेमाल पीसीआर अभिकर्मकों दिखा. कॉलम 4-6 एक नमूना से वेक्टर जीनोम जंक्शनों के नेस्टेड घातीय प्रवर्धन के लिए इस्तेमाल पीसीआर कार्यक्रम उदाहरण देना.
| अभिकर्मक | वॉल्यूम (μl) | एकाग्रता | पीसीआर पैरामीटर्स | तापमान | समय | |
| एच 2 हे | 42.5 - एक्स | प्रारंभिक विकृतीकरण | 95 डिग्री सेल्सियस | 2 मिनट | ||
| बफर | 5 | 10 X | विकृतीकरण | 95 डिग्री सेल्सियस | 45 सेकंड | |
| dNTP | 1 | 10 मिमी | एनीलिंग | 58 डिग्री सेल्सियस | 45 सेकंड | 12 चक्रों |
| Fusionprimer एक | 0.5 | 10 माइक्रोन | बढ़ाव | 72 डिग्री सेल्सियस | 60 सेकंड | |
| Fusionprimer बी | 0.5 | 10 माइक्रोन | अंतिम बढ़ाव | 72 डिग्री सेल्सियस | 5 मिनट | |
| Taq पोलीमरेज़ | 0.5 | 2.5 यू / μl |
Fusionprimer पीसीआर के लिए सारणी 5. पीसीआर स्थितियां (कदम 9.2). कॉलम 1-3 (एनआर) लैम पीसीआर उत्पादों को अनुक्रमण एडेप्टर की शुरूआत के लिए इस्तेमाल पीसीआर अभिकर्मकों दिखा. कॉलम 4-6 Fusionprimer पीसीआर के लिए इस्तेमाल पीसीआर कार्यक्रम उदाहरण देना.
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Discussion
लैम पीसीआर तकनीक एक ज्ञात डीएनए क्षेत्र पार्श्व कि अज्ञात डीएनए अनुक्रम की पहचान करने की अनुमति देता है. क्योंकि ज्ञात डीएनए अनुक्रम में विशिष्ट प्राइमरों hybridizing साथ जंक्शनों की preamplification से उत्पन्न उच्च संवेदनशीलता की, यह एकल कोशिका स्तर से नीचे भी दुर्लभ जंक्शनों बढ़ाना और पता लगाने के लिए संभव है. इसके विपरीत, एक पॉलीक्लोनल स्थिति में लैम पीसीआर एक ही प्रतिक्रिया में विभिन्न जंक्शनों के हजारों बढ़ाना करने में सक्षम है.
हालांकि, प्रतिबंध के उपयोग के कारण integrome की केवल एक subfraction हर विशेष प्रतिबंध एंजाइम के साथ जंक्शनों की उपस्थिति के लिए लैम पीसीआर से विश्लेषण किया जा सकता एंजाइमों. इस प्रकार, विभिन्न एंजाइमों के साथ ही नमूने के दोहराया विश्लेषण 9 की सिफारिश की है. कोई लैम पीसीआर amplicons जेल पर मौजूद हैं, तो सबसे अधिक संभावना जाना जाता डीएनए टुकड़ा के स्थान और चुने हुए प्रतिबंध एंजाइम के निकटतम मान्यता साइट के बीच की दूरी लैम पीसीआर उत्पादों में परिणाम के लिए बहुत बड़ी है9. इस मामले में अन्य एंजाइमों जंक्शन बढ़ाना इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
nrLAM प्रतिबंध एंजाइमों के उपयोग से स्वतंत्र है और इसलिए व्यापक एक ज्ञात डीएनए अनुक्रम flanking दृश्यों को चिह्नित करने के लिए एक अत्यधिक मूल्यवान विधि का प्रतिनिधित्व करता है. प्रतिबंध प्रत्येक परिलक्षित जंक्शन निस्र्पक विशिष्ट प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई बहुरूपता के नुकसान में प्रोटोकॉल के परिणाम से पचाने को छोड़ना. इसके बजाय हर परिलक्षित जंक्शन परिलक्षित जंक्शनों की विविधता का स्वतंत्र वैद्युतकणसंचलन, के बाद जेल पर एक धब्बा में जिसके परिणामस्वरूप विभिन्न आकारों की पीसीआर उत्पादों का प्रतिनिधित्व करती है.
लैम और nrLAM पीसीआर दोनों उत्पादों को पूरी तरह से नीचे की ओर उच्च throughput अनुक्रमण के लिए अनुकूल हैं. इसी जीनोम के लिए (एनआर) लैम पीसीआर उत्पादों और पुनः प्राप्त कच्चे दृश्यों के मानचित्रण के उच्च throughput अनुक्रमण अज्ञात डीएनए flanking या वेक्टर जीनोम जंक्शनों 30 की सटीक स्थानीयकरण की पहचान निस्र्पक की अनुमति देता है.Fusionprimers में बारकोड दृश्यों को शुरू करके लैम और nrLAM पीसीआर उत्पादों के कई सैकड़ों एक अनुक्रमण संख्या 30 में अनुक्रम किया जा सकता.
असावधानी से निष्पादित अगर कारण उच्च संवेदनशीलता को, लैम पीसीआर संदूषण की संभावना है. इस प्रकार, प्रोटोकॉल की हैंडलिंग साफ करने के लिए एक पीसीआर ग्रेड वातावरण और विशेष ध्यान सफलतापूर्वक नमूने संदूषित बिना डीएनए flanking अज्ञात बढ़ाना अत्यंत महत्व का है. इसलिए, untransduced जीनोमिक डीएनए और लैम पीसीआर प्रोटोकॉल में नकारात्मक नियंत्रण के रूप में हर पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए एक पानी नियंत्रण सहित पुरजोर सिफारिश की है. नियंत्रण के नमूने पार संदूषण प्रोटोकॉल के दौरान मिले संकेत मिलता है, तो हर ठहराव बिंदु से उत्पादों प्रोटोकॉल के कुछ हिस्सों को दोहराने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. बैंड अभी भी मौजूद हैं, यह सभी अभिकर्मकों (जैसे., प्राइमरों, dNTPs, पीसीआर, आदि) को त्यागें और नए aliquots के साथ (एनआर) लैम पीसीआर प्रोटोकॉल को दोहरा करने के लिए सिफारिश की है.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq DNA Polymerase | Genaxxon Bioscience GmbH | M3001.5000 | Alternative Taq Polymerases may be used |
| PCR Buffer | Qiagen | 201203 | Use of this buffer is recommended |
| dNTP-Mixture | Genaxxon Bioscience GmbH | M3015.4020 | or any other dNTPs |
| Oligonucleotides (Primers) | MWG Biotech | HPLC purified | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11206D | |
| PBS | Gibco | 14190-086 | 0.1% wt/vol BSA |
| 6 M LiCl | Roth | 3739.1 | 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA |
| Tris-HCl, pH 7.5 | USB Corporation | 22637 | or any other supplier |
| EDTA | Applichem | A1103,0250 | or any other supplier |
| Klenow Polymerase | Roche Diagnostics | 10104523001 | |
| Hexanucleotide mixture | Roche Diagnostics | 11277081001 | |
| Restriction endonuclease | NEB | or any other supplier | |
| Fast-Link DNA ligation kit | Epicentre Biotechnologies | LK11025 | |
| CircLigase ssDNA Ligase Kit | Epicentre Biotechnologies | CL4111K | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | or any other supplier |
| Agarose LE | Roche Diagnostics | 11685660001 | or any other supplier |
| TBE buffer | Amresco | 0658 | or any other supplier |
| Ethidium bromide | Applichem | A2273,0005 | Ethidium bromide is mutagenic |
| 100 bp DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | or any other DNA ladder |
| 20 mM NaCl | Sigma-Aldrich | 71393-1L | or any other supplier |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158501 | for use with 1.5 ml Tubes |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158696 | for use with 96-well plates |
| Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membrane | Millipore | UFC503096 | |
| PerfectBlue Gelsystem Midi S | PeqLab | 40-1515 | or other electrophoresis system |
| TProfessional 96 | Biometra | 050-551 | or other Thermocycler for 96-well plates |
| Orbital shaker KS 260 basic | IKA | 2980200 | or other horizontal shaker |
| PCR softtubes 0.2 ml | Biozym Scientific GmbH | 711082 | or other 0.2 ml PCR tubes |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 12682 | or other 1.5 ml tubes |
| Gel documentation system | PeqLab | or any other gel documentation system | |
| Nanodrop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Spreadex EL1200 precast gel | Elchrom Scientific | 3497 | |
| Submerged gel electrophoresis apparatus SEA 2000 | Elchrom Scientific | 2001E | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA |
References
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