Summary
Linear-amplificação mediada (LAM)-PCR é um método desenvolvido para identificar as posições exactas dos vectores de integração no genoma viral. A técnica evoluiu para ser o método superior para estudar a dinâmica clonais em pacientes de terapia genética, biossegurança de tecnologias inovadoras de vetores, a diversidade de células T, modelos de células-tronco do câncer, etc
Introduction
Linear-amplificação mediada por PCR (LAM-PCR) permite a identificação e caracterização de DNA flanqueando desconhecida adjacente ao ADN conhecida de qualquer origem. Mais especificamente, a LAM-PCR foi desenvolvido para localizar locais de integração de vectores virais (IS) dentro do genoma do hospedeiro de 1,2. Os elementos genéticos como retrovírus ou transposons integrar o seu genoma no genoma do hospedeiro em uma (semi-) forma aleatória 3-6. Em muitos casos, é decisivo saber exactamente a posição em que esses vectores integrados. LAM-PCR tem sido provado ser superior a técnicas alternativas, como mediada por ligadura PCR 7 e suas variantes ou PCR inversa 8. A sensibilidade e robustez deste método surge a partir da pré-amplificação inicial das junções vector de genoma e selecção magnética de produtos de PCR amplificados. Como os métodos alternativos mencionados, LAM-PCR baseia-se na utilização de enzimas de restrição, a introdução de um preconceito na capacidade de recuperação dos SI 9-11. Assim,apenas um subconjunto do repertório é (a integrome) pode ser detectada numa reacção. Esta distorção é minimizada por meio da análise paralela de uma determinada amostra, utilizando as melhores combinações de enzimas de restrição de 9. Recentemente, uma variante da tecnologia denominada não-restritivo LAM-PCR (PCR-nrLAM) tem sido desenvolvida que contorna o uso de enzimas de restrição e permite a análise de todo o genoma imparcial de uma amostra numa única reacção de 9,12.
No passado, a LAM-PCR foi utilizada para identificar o retrovírus causador é o que dá origem a leucemia em alguns pacientes, em ensaios clínicos de terapia génica 13-15. Desde então, a LAM-PCR foi adaptado para identificar é de outros vetores de integração (vetores lentivirais, transposons) e também para identificar padrões de integração de integrar passivamente vetores como vetores adeno-associados (AAV) ou lentivirais integrase-defeituoso (IDLV) 16 -21. Aplicações da LAM-PCR são ampla: tradicionally, a técnica é utilizada para estudar a composição clonal de células de genes modificados em pacientes que foram submetidos a terapia de gene, ou para avaliar a segurança biológica de sistemas de vectores novos por desvendar o seu comportamento integração 15,16,22-24. Recentemente, a LAM-PCR permitiu determinar especificidade e atividade fora do alvo de nucleases de grife por um ensaio prendendo IDLV 25.
Além disso, a LAM-PCR permite seguir facilmente o destino de uma célula transduzida ao longo do tempo em um organismo. Isso permite identificar proto-oncogenes, bem como genes supressores de tumores e também para estudar hematopoiese ou caule câncer biologia celular 26-28. Por último, mas não menos importante, a LAM-PCR foi adaptado para estudar a diversidade de receptores de células T em humanos (29 e dados não publicados).
O poder intrínseca da tecnologia é reforçada pela ligação entre o método de tecnologias de seqüenciamento de profundidade que permitem caracterizar milhões de desconhecido flanqueando DNA com um único nucleotídeo reSolution em genomas inteiros. No seguinte protocolo, descrevemos passo a passo a amplificação e identificação de DNA flanqueando desconhecido exemplarmente para identificar lentiviral vetor IS. Os oligonucleótidos utilizados no protocolo estão listadas na Tabela 1. Extraído DNA ou cDNA de qualquer fonte pode ser utilizado como modelo de ADN para a LAM-PCR e nrLAM-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparação de Linker Cassetes (LC)
- Misturar 40 ul de oligonucleótido LC1 (Tabela 1), 40 ul de oligonucleótido LC2 (Tabela 1, com a enzima de restrição adequada saliência), 110 ul de Tris-HCl (100 mM, pH 7,5), e 10 ul de 250 mM MgCl2.
- Incubar a 95 ° C durante 5 minutos e deixar a reacção arrefecer lentamente até à temperatura ambiente. Adicionar 300 ul de H2O e concentrar dsLinker-ADN num filtro de centrifugação. Adicionar 80 ul de H 2 O para o produto de eluição e uma alíquota de 10 ul de cassete de ligação preparados em tubos de 0,2 PCR.
2. Pré-amplificação do genoma do vetor Junções
- Para cada amostra a ser analisada preparar uma reacção de PCR de 50 uL.
- Determinar a concentração de amostras de DNA. Pipeta x ul (1-1,000 ng para LAM/100-1, 000 ng para nrLAM) de DNA para um tubo de PCR de 0,2 ml. Volume de ADN deve ser igual em cada uma das amostras e no range de 0,5 a 25 ul.
- Prepare PCR master mix como descrito na Tabela 2 Mistura (50 - x). Ul da mistura principal em cada amostra de DNA em 0,2 ml de tubos de PCR.
- Preamplify vector junções do genoma utilizando condições de PCR exemplificados na Tabela 2. Após conclusão da PCR adicionar 0,5 ul de Taq polimerase a cada tubo de PCR e PCR reprise programa. Os produtos da PCR pode ser armazenada a 4 ° C durante até 4 dias, ou a longo prazo a -20 ° C.
3. Separação Magnética de PCR Produto
- Preparação de esferas magnéticas
- Pipetar 20 ul (200 ug) de pérolas magnéticas revestidas com estreptavidina em um tubo de 1,5 ml e expor durante 1 min sobre o separador de partículas magnético (MPS), à temperatura ambiente. Elimine o sobrenadante.
- Retire os tubos de MPS e ressuspender as esferas magnéticas em 40 ul PSB / 0,1% de BSA (pH 7,5). Expor a MPS por 1 min e descartar o sobrenadante. Repita este passo uma vez.
- Lavar contas wiº 20 ul de uma solução M de LiCl três (3 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM) para expor MPS durante 1 min e rejeitar o sobrenadante. Grânulos Ressuspender em 50 ul de solução 6 M de LiCl (6 M de LiCl, 10 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM).
- Misturar toda a reacção de PCR, a partir do passo 2.2 com 50 uL de pérolas magnéticas preparadas. Incubar num agitador horizontal (300 rpm), pelo menos durante 2 horas à temperatura ambiente. Este passo permite a ligação do produto de PCR biotinilado com estreptavidina (esferas revestidas com complexos de ADN-grânulo). Complexo de cordão de ADN pode ser incubado num agitador durante a noite ou armazenado a 4 ° C durante até 4 dias.
- Expor complexo ADN-Bead a MPS durante 1 min, à temperatura ambiente, remover o sobrenadante e ressuspender complexo ADN-grânulo em 100 mL de H 2 O. Proceder imediatamente com a etapa 4 para LAM ou o passo 5 para nrLAM.
4. LAM-Processo
- Duplo Strand DNA (dsDNA) Síntese (apenas LAM)
- Expor complexo ADN-grânulo a partir do passo 3.3 a MPS durante 1 min e dissobrenadante cartão. Adicionar 8,25 mL de H2O, 1 ml de 10x tampão hexanucleotide, 0,25 ul de dNTPs (10 mM) e 0,5 mL (2 L), a polimerase de Klenow. Incubar a 37 ° C durante 1 hora.
- Adicionar 90 mL de H 2 O e expor a MPS para 1 min. Elimine o sobrenadante e ressuspender complexo DNA-Bead em 100 mL de H 2 O.
- Restrição Digest
- Expor complexo ADN-Bead a MPS durante 1 min e descartar o sobrenadante. Adicionar 8,5 mL de H2O, 1 ml de 10x tampão de enzima de restrição e 0,5 ul de enzima de restrição e reacção incubar durante 1 hora. Repita o passo 4.1.2.
NOTA: Incubar reacção à temperatura recomendada pelo fabricante da enzima de restrição. Certifique-se de que não há nenhum local de restrição presente dentro ou a jusante do local de ligação do iniciador utilizado para a pré-amplificação do ADN de interesse. Para escolha de combinações de enzimas enzimas de restrição / restrição adequados referem-se a 9.
- Expor complexo ADN-Bead a MPS durante 1 min e descartar o sobrenadante. Adicionar 8,5 mL de H2O, 1 ml de 10x tampão de enzima de restrição e 0,5 ul de enzima de restrição e reacção incubar durante 1 hora. Repita o passo 4.1.2.
- Ligadura de ds Linker (LK)
- Expor complexo ADN-Bead a MPS durante 1 min e descartar o sobrenadante. Adicionar 5 mL de H2O, 1 ml de 10x tampão FastLink, 1 ul de ATP (10 mM), 2 uL cassete Linker do passo 1.2, e 1 ul Fast-ligação do ADN ligase (2 U / mL). Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Repita o passo 4.1.2.
- A desnaturação de Sintetizado dsDNA
- Expor complexo ADN-Bead a MPS durante 1 min e descartar o sobrenadante. Ressuspender o complexo de ADN-grânulo em 5 mL de NaOH 0,1 N. Incubar 5 minutos à temperatura ambiente num agitador horizontal.
- Expor complexo DNA-Talão a MPS por 1 min e recolher junção vetor do genoma pré-amplificado contendo sobrenadante em novo tubo de 1,5 ml. Proceder imediatamente com a etapa 6 ou loja sobrenadante a -20 ° C.
5. NrLAM-Procedimento
- Ligadura de único vinculador encalhado (SSLC) (nrLAM apenas)
- Expor complexo DNA-Bead a partir do passo 3.3 para MPSpor 1 min e elimine o sobrenadante. Adicionar 6,5 mL de H 2 O, 1 ul CircLigase 10x tampão de reacção, 0,5 mL de MnCl2 (50 mM), 0,5 ul de ATP (1 mM), 1 ul ssLinker oligonucleótido e 0,5 ul CircLigase (100 U / ul). Incubar a 60 ° C durante 1 hora.
- Adicionar 90 mL de H 2 O e expor a MPS para 1 min. Elimine o sobrenadante e lava-se complexo de ADN-grânulo em 100 mL de H 2 O. Novamente expor a MPS para 1 min, o sobrenadante e ressuspender o descarte complexo ADN-grânulo em 10 mL de H 2 O.
6. Exponencial de amplificação I
- Para cada amostra a ser analisada preparar uma reacção de PCR de 50 uL.
- Pipeta 2 ul de DNA molde (a partir do passo 4.4.2 (LAM) ou 5.1.2 (nrLAM)) dentro de um tubo de PCR de 0,2 ml.
- Prepare PCR master mix como descrito na Tabela 3. Adicionar 48 ul de mistura principal para cada amostra a partir do passo 6.1.1 e amplificar vectores junções do genoma por PCR condins exemplificados na Tabela 3. produtos de PCR pode ser armazenada a 4 ° C durante até 4 dias, ou a longo prazo a -20 ° C.
7. Separação Magnética de PCR Produto
- Prepare a esferas magnéticas como exemplificado nos passos 3.1.1 - 3.1.3. Grânulos Ressuspender em 20 ul (para LAM) ou 50 ul (para nrLAM) de solução 6 M de LiCl (6 M de LiCl, 10 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM). Misturar 20 ul (LAM) ou 50 ul (nrLAM) de reacção de PCR a partir do passo 6.1.2 com esferas magnéticas preparadas (passo 7.1) e incuba-se num agitador horizontal (300 rpm) durante 2 horas à temperatura ambiente. Complexo de cordão de ADN pode ser incubado num agitador durante a noite ou armazenado a 4 ° C durante até 4 dias.
- Expor complexo ADN-grânulo de MPS para 1 min, remover o sobrenadante e ressuspender complexo ADN-grânulo em 100 mL de H 2 O. Expor complexo ADN-Bead a MPS durante 1 min e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender o complexo de ADN-grânulo em 20 ul (LAM) ou 5 mL (nrLAM) NaOH 0,1 N. INCUbate por 10 minutos à temperatura ambiente num agitador horizontal, expor a MPS para 1 min e coletar DNA contendo sobrenadante amplificado em novo tubo de 1,5 ml. Proceder de imediato com o passo 8.1 ou loja sobrenadante a -20 ° C.
8. Exponencial de amplificação II
- Para cada amostra a ser analisada preparar uma reacção de PCR de 50 uL.
- Pipeta 2 ul de DNA molde (a partir do passo 7.3) a um tubo de PCR de 0,2 ml.
- Prepare PCR master mix como descrito na Tabela 4. Adicionar 48 ul de mistura principal para cada amostra a partir do passo 8.1.1 e amplificar vectores junções do genoma por condições de PCR exemplificados na Tabela 4. Produtos de PCR pode ser armazenada a 4 ° C durante até 4 dias ou a longo prazo a -20 ° C.
- Para visualizar (nr) produtos LAM-PCR, carga de 10 ul do produto de PCR a partir do passo 8.1.2 em um gel de agarose a 2%. Se as bandas são visíveis, analisar 10 ul do produto a LAM-PCR em gel de alta resolução. CUIDADO: Etbrometo hidium é mutagênico. Trabalhe com muito cuidado e sempre usar luvas apropriadas.
9. Preparação de alta capacidade Seqüenciamento
- Purificação de (nr) produtos LAM-PCR
- Misture 40 mL PCR-produto da etapa 8.1.2 com 44 l de temperatura ambiente AMPure XP esferas magnéticas. Incubar 5 minutos à temperatura ambiente e expor a MPS durante mais 2 min.
- Elimine o sobrenadante e lava-se duas vezes com 200 ul de EtOH a 70% sobre as MPS.
- Descartar o sobrenadante e ressuspender o complexo de ADN-grânulo em 30 mL de H 2 O. Incubar 1 min e transferência de sobrenadante para novo tubo de 0,2 ml. Determinar a concentração de ADN purificado.
- Fusionprimer PCR para adicionar sequenciação adaptadores específicos.
- Para cada amostra a ser analisada preparar uma reacção de PCR de 50 uL.
- Pipeta x pi (40 ng) de ADN dentro de um tubo de PCR de 0,2 ml. Volume de ADN deve ser igual em cada uma das amostras e na gama de 0,5 a 25 ul.
- Prepare PCR master mix, conforme descrito na tabela 5 Adicionar (50 - x). ML de mistura de mestre para cada amostra a partir do passo 9.2.2 e introduzir adaptadores para Seqüenciamento (nr) produtos LAM-PCR por condições de PCR exemplificado na Tabela 5 produtos de PCR. pode ser armazenado a 4 ° C durante até 4 dias, ou a longo prazo a -20 ° C.
- Para visualizar os produtos de PCR Fusionprimer-carga de 10 ul do produto de PCR a partir do passo 9.2.3 em um gel de agarose a 2%. Purificar restante produto de PCR como descrito nos passos 9.1.1 - 9.1.3. Analise 1 ul do produto de PCR purificado a partir do passo 9.4 em um dispositivo de electroforese automatizada de alta resolução de quantificar com precisão a concentração eo fragmento de tamanho de produtos Fusionprimer-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LAM-PCR resulta na amplificação do genoma do vetor cruzamentos com um tamanho de fragmento definido para cada junção. O tamanho dos fragmentos de PCR individuais depende da distância entre o local do ADN conhecido no genoma e o local de reconhecimento da enzima de restrição mais próximo. Isto permite visualizar a diversidade das junções amplificados em amostras analisadas por electroforese em gel, por exemplo. Se apenas simples (monoclonais), vários (oligoclonais), ou múltiplos (policlonais) as bandas estão presentes no gel. Os resultados da LAM-PCR são melhor vistos por géis de electroforese de alta resolução (Figura 2A), mas também pode ser visualizada no gel de agarose a 2% (Figura 2B). nrLAM-PCR resultou em fragmentos de PCR de vários comprimentos para cada junção individualmente. Assim, amostras de monoclonais, oligoclonais ou policlonais aparecem como uma mancha por electroforese e não pode ser distinguido visualmente. A visualização do produto nrLAM-PCR em gel de agarose a 2% é suficiente para determinar successo do protocolo (Figura 2C). Após a sequenciação do ADN genómico recuperado pode ser alinhado com o respectivo genoma do hospedeiro para identificar as posições exactas da localização do vector (Figura 3A). Anotação do genoma permite analisar o repertório é para diferentes características específicas de vetores como preferência para integração em regiões do gene de codificação (Figura 3B) ou perto de sítios de início de transcrição (Figura 3C).
Figura 1. Esboço esquemático da LAM-PCR e nrLAM-PCR. A) Ambos os métodos começam com uma pré-amplificação inicial do vector junções do genoma utilizando iniciadores biotinilados hibridizar próximo da extremidade da sequência de ADN conhecida (repetir aqui longo do terminal (LTR) de um vector retroviral). Resultados Pré-amplificação em biotiniladoADNcs de tamanho diferente para junções do genoma vector, idênticos ou diferentes. Biotinilado ADNcs é capturada sobre as partículas magnéticas. B) Para LAM PCR, os passos de reacção enzimática compostos de síntese de dsDNA, digestão de restrição e ligação de um ligante de ADN conhecida gerar produtos de diferentes dimensões, com sequências conhecidas em ambas as extremidades do produto. Devido ao polimorfismo de comprimento de restrição cada junção amplificado tem um comprimento característico. Após a desnaturação do produto da LAM-PCR é amplificado por PCR com ligantes e iniciadores específicos de vector. C) Para nrLAM uma sequência de ligação de ADNcs é directamente ligado à extremidade desconhecido do ADNcs pré-amplificado a partir de A) que permite a amplificação exponencial por PCR com ligante e vetor primers específicos. Este valor foi modificado a partir do 2,12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. >
Figura 2. Resultados representativos de LAM-PCR e nrLAM-PCR. A, B) Análise LAM-PCR do ADN isolado a partir do sangue periférico de doentes tratados com terapia de genes. O número de bandas do gel correspondem ao número do estiver presente na amostra. Gel de alta resolução (B) são mais adequados para visualizar clonalidade de amostras analisadas do que 2% de gel de agarose (A). C) análise nrLAM-PCR do vector lentiviral clones de uma única célula ou células transduzidas granel. Independente do número de locais de inserção amplificados um esfregaço é visto no gel após a electroforese. M, 100 bp ladder; MC, anticorpo monoclonal; OC, oligoclonal; PC, policlonal. Este valor foi modificado de 2,9.
"width =" 500 es/ftp_upload/51543/51543fig3highres.jpg "/>
Figura 3. Exemplos representativos para análise É por LAM-PCR e posterior seqüenciamento de alto rendimento. É a distribuição em dois pacientes de gammaretroviral (azul) ou lentiviral (verde) ensaios de terapia genética clínica. Após o seqüenciamento e mapeamento dos produtos LAM-PCR para o respectivo genoma é pode ser avaliada, por exemplo:.. A) Genome-wide distribuição de IS B) Diferença de acordo com a preferência para a inserção de genes que codificam regiões entre gammaretroviral e lentivirais e C) preferência para a inserção perto dos locais de início de transcrição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Propósito | Nome | Sequência (5'-3 ') |
| LK-universal | LC1 | GACCCGGGAGATCTGAATTCAGTGGCACAG CAGTTAGG |
| LK-AATT | LC2 (AATT) | AATTCCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCA GATC |
| LK-CG | LC2 (CG) | CGCCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCAGATC |
| LK-TA | LC2 (TA) | TACCTAACTGCTGTGCCACTGAAATCAGATC |
| LK-nrLAM-PCR | SSLC | (P) CCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCAGATC TCCCGGGTddC |
| Preamplification | LTR-I (3'-direção) | (B) AGTAGTGTGTGCCCGTCTGT |
| LTR-I (5'-direção) | (B) TTAGCCAGAGAGCTCCCAGG | |
| Amplificação exponencial I | LTR-II (3'-direção) | (B) GTGTGACTCTGGTAACTAGAG |
| LTR-II (5'-direção) | (B) GATCTGGTCTAACCAGAGAG | |
| LC-I | GACCCGGGAGATCTGAATTC | |
| Amplificação exponencial II | LTR-III (3'-direção) | GATCCCTCAGACCCTTTTAGTC |
| LTR-III (5'-direção) | CCCAGTACAAGCAAAAAGCAG | |
| LC-II | GATCTGAATTCAGTGGCACAG |
Tabela 1. Oligonucleótidos para a LAM-e nrLAM-PCR para amplificar lentiviral IS. SSLC é fosforilado na extremidade 5 '(P) e tem a 3' didesoxycytidin (ddC), para evitar a multimerização da SSLC durante ligadura. Em geral, (nr) iniciadores LAM-PCR deve consistir de 18-25 nucleótidos e não deverá alinhar com o genoma do hospedeiro. Os iniciadores para a pré-amplificação devem ser colocados o mais próximo possível (≤ 120 pb) às extremidades 5 'ou 3' do vector. Dois iniciadores de PCR adicionais para exponencial I e II necessitam de ser colocado entre o iniciadorusado para a pré-amplificação e a extremidade do vetor. Primers para pré-amplificação e Exponencial PCR Eu preciso ser 5'-fosforilada (P).
| Reagente | Volume (uL) | Concentração | Parâmetros de PCR | Temperatura | Tempo | |
| H2O | 43 - x | A desnaturação inicial | 95 ° C | 5 min | ||
| Amortecedor | 5 | 10 x | A desnaturação | 95 ° C | 45 seg | |
| dNTP | 1 | 10 mm (LAM); 0,5 uM (nrLAM) | Recozimento | 60 ° C | 45 seg | 2 x 50 Ciclos |
| LTR-I | 0,5 | 0,17 mM | Alongamento | 72 ° C | 60 seg (LAM); 10 seg (nrLAM) | |
| TaqPolymerase | 0,5 | 2,5 U / ul | Alongamento final | 72 ° C | 5 min (somente LAM) |
Tabela 2. PCR Condições de pré-amplificação das junções do genoma do vetor (passo 2). Colunas 1-3 mostram os reagentes de PCR utilizados para a amplificação de uma única amostra de ADN. Colunas 4-6 exemplificam o programa de PCR para preamplify vector junções do genoma.
| Reagente | Volume (uL) | Concentração | Parâmetros de PCR | Temperatura | Tempo | |
| H2O | 40,5 | A desnaturação inicial | 95 ° C | 5 min | ||
| Amortecedor | 5 | 10 x | A desnaturação | 95 ° C | 45 seg | |
| dNTP | 1 </ Td> | 10 mM | Recozimento | 60 ° C | 45 seg | 35 Ciclos |
| LTR-II | 0,5 | 16,7 fiM | Alongamento | 72 ° C | 60 seg (LAM); 5 seg (nrLAM) | |
| LC-I | 0,5 | 16,7 fiM | Alongamento final | 72 ° C | 5 min (somente LAM) | |
| Taq Polimerase | 0,5 | 2,5 U / ul |
Tabela 3. PCR condições para amplificação exponencial I (passo 6). Colunas 1-3 mostram os reagentes de PCR utilizados para a amplificação exponencial de uma única amostra de ADN. Colunas 4-6 exemplificam o programa de PCR utilizado para amplificar exponencialmente uma amostra após a ligadura da sequência do ligante.
| Reagente | Volume (ul) | Concentração | Parâmetros de PCR | Temperatura | Tempo | |
| H2O | 40,5 | A desnaturação inicial | 95 ° C | 5 min | ||
| Amortecedor | 5 | 10 x | A desnaturação | 95 ° C | 45 seg | |
| dNTP | 1 | 10 mM | Recozimento | 60 ° C | 45 seg | 35 Ciclos |
| LTR-III | 0,5 | 16,7 fiM | Alongamento | 72 ° C | 60 seg (LAM); 5 seg (nrLAM) | |
| LC-II | 0,5 | 16,7 fiM | Alongamento final | 72 ° C | 5 min | |
| Taq Polimerase | 0,5 | 2,5 U / ul |
Tabela 4. PCR condições para amplificação exponencial I (passo 8). Colunas 1-3 mostram os reagentes de PCR utilizados para a amplificação exponencial aninhada de uma única amostra. Colunas 4-6 exemplificam o programa de PCR utilizado para a amplificação exponencial aninhada de vetor junções do genoma de uma amostra.
| Reagente | Volume (uL) | Concentração | Parâmetros de PCR | Temperatura | Tempo | |
| H2O | 42.5 - x | A desnaturação inicial | 95 ° C | 2 min | ||
| Amortecedor | 5 | 10 x | A desnaturação | 95 ° C | 45 seg | |
| dNTP | 1 | 10 mM | Recozimento | 58 ° C | 45 seg | 12 ciclos |
| A Fusionprimer | 0,5 | 10 uM | Alongamento | 72 ° C | 60 seg | |
| Fusionprimer B | 0,5 | 10 uM | Alongamento final | 72 ° C | 5 min | |
| Taq Polimerase | 0,5 | 2,5 U / ul |
Tabela 5. PCR Condições para Fusionprimer-PCR (passo 9.2). Colunas 1-3 mostram os reagentes de PCR utilizados para a introdução de adaptadores para sequenciação (nr) produtos LAM-PCR. Colunas 4-6 exemplificam o programa de PCR utilizado para Fusionprimer-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A técnica da LAM-PCR permite a identificação de sequências de ADN desconhecidas que flanqueiam uma região conhecida de ADN. Devido à elevada sensibilidade resultante do pré-amplificação dos cruzamentos com os iniciadores específicos de hibridação na sequência de ADN conhecida, que é possível amplificar e detectar até mesmo junções raras para baixo para o nível de uma única célula. Ao contrário, em uma situação policlonal LAM-PCR é capaz de amplificar milhares de junções diferentes numa única reacção.
No entanto, devido à utilização de enzimas de restrição apenas uma subfracção da integrome pode ser analisada por LAM-PCR para detectar a presença de junções com cada enzima de restrição particular. Assim, análises repetidas da mesma amostra com diferentes enzimas é recomendado 9. Se não há amplicões LAM-PCR estão presentes no gel, mais provavelmente a distância entre o local do fragmento de DNA conhecida e o sítio de reconhecimento mais próximo da enzima de restrição escolhido é muito grande para resultar em produtos da LAM-PCR9. Neste caso outras enzimas devem ser utilizados para amplificar a junção.
nrLAM é independente da utilização de enzimas de restrição e, por conseguinte, representa um método altamente valiosa para caracterizar exaustivamente sequências que flanqueiam uma sequência de ADN conhecida. Omitindo digestão de restrição a partir dos resultados do protocolo na perda de polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição específico caracterizar cada junção amplificado. Em vez disso, cada junção amplificado é representada pelos produtos de PCR de diferentes tamanhos, resultando em uma mancha no gel após a electroforese, independente da diversidade das junções amplificados.
Ambos produtos da LAM e nrLAM-PCR são perfeitamente adequados para a jusante sequenciamento de alto rendimento. De alta capacidade de seqüenciamento (nr) produtos LAM-PCR e mapeamento de seqüências de matérias recuperados ao genoma correspondente permite caracterizar desconhecido flanqueando DNA ou identificar a localização exata de junções vetor do genoma 30.Com a introdução de sequências de código de barras nos fusionprimers várias centenas de produtos da LAM e nrLAM-PCR pode ser seqüenciado em um seqüenciamento de corrida de 30.
Devido à alta sensibilidade, a LAM-PCR é propenso a contaminação se executado distraidamente. Assim, um meio de PCR e de grau especial atenção para limpar a manipulação do protocolo é de extrema importância para amplificar o êxito desconhecida que flanqueia o ADN, sem contaminar as amostras. Portanto, incluindo DNA genômico não transduzidas e um controle de água para cada reação de PCR como controles negativos no protocolo LAM-PCR é altamente recomendável. Se as amostras de controlo indicam que a contaminação cruzada ocorreu durante o protocolo, os produtos a partir de cada ponto de pausa pode ser utilizado para repetir partes do protocolo. Quando as bandas estão ainda presentes, recomenda-se a descartar os reagentes (por exemplo., Iniciadores, dNTP, polimerases, etc) e repetir o (nr) protocolo LAM-PCR com novas aliquotas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq DNA Polymerase | Genaxxon Bioscience GmbH | M3001.5000 | Alternative Taq Polymerases may be used |
| PCR Buffer | Qiagen | 201203 | Use of this buffer is recommended |
| dNTP-Mixture | Genaxxon Bioscience GmbH | M3015.4020 | or any other dNTPs |
| Oligonucleotides (Primers) | MWG Biotech | HPLC purified | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11206D | |
| PBS | Gibco | 14190-086 | 0.1% wt/vol BSA |
| 6 M LiCl | Roth | 3739.1 | 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA |
| Tris-HCl, pH 7.5 | USB Corporation | 22637 | or any other supplier |
| EDTA | Applichem | A1103,0250 | or any other supplier |
| Klenow Polymerase | Roche Diagnostics | 10104523001 | |
| Hexanucleotide mixture | Roche Diagnostics | 11277081001 | |
| Restriction endonuclease | NEB | or any other supplier | |
| Fast-Link DNA ligation kit | Epicentre Biotechnologies | LK11025 | |
| CircLigase ssDNA Ligase Kit | Epicentre Biotechnologies | CL4111K | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | or any other supplier |
| Agarose LE | Roche Diagnostics | 11685660001 | or any other supplier |
| TBE buffer | Amresco | 0658 | or any other supplier |
| Ethidium bromide | Applichem | A2273,0005 | Ethidium bromide is mutagenic |
| 100 bp DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | or any other DNA ladder |
| 20 mM NaCl | Sigma-Aldrich | 71393-1L | or any other supplier |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158501 | for use with 1.5 ml Tubes |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158696 | for use with 96-well plates |
| Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membrane | Millipore | UFC503096 | |
| PerfectBlue Gelsystem Midi S | PeqLab | 40-1515 | or other electrophoresis system |
| TProfessional 96 | Biometra | 050-551 | or other Thermocycler for 96-well plates |
| Orbital shaker KS 260 basic | IKA | 2980200 | or other horizontal shaker |
| PCR softtubes 0.2 ml | Biozym Scientific GmbH | 711082 | or other 0.2 ml PCR tubes |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 12682 | or other 1.5 ml tubes |
| Gel documentation system | PeqLab | or any other gel documentation system | |
| Nanodrop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Spreadex EL1200 precast gel | Elchrom Scientific | 3497 | |
| Submerged gel electrophoresis apparatus SEA 2000 | Elchrom Scientific | 2001E | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA |
References
- Schmidt, M., et al. Detection and direct genomic sequencing of multiple rare unknown flanking DNA in highly complex samples. Hum Gene Ther. 12, 743-749 (2001).
- Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat Methods. 4, 1051-1057 (2007).
- Schroeder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
- Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M. Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration. Science. 300, 1749-1751 (2003).
- Vigdal, T. J., Kaufman, C. D., Izsvak, Z., Voytas, D. F., Ivics, Z. Common physical properties of DNA affecting target site selection of sleeping beauty and other Tc1/mariner transposable elements. J Mol Biol. 323, 441-452 (2002).
- Lewinski, M. K., et al. Retroviral DNA integration: viral and cellular determinants of target-site selection. PLoS Pathog. 2, (2006).
- Mueller, P. R., Wold, B. In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR. Science. 246, 780-786 (1989).
- Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. Journal of virology. 63, 1924-1928 (1989).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nature medicine. 15, 1431-1436 (2009).
- Harkey, M. A., et al. Multiarm high-throughput integration site detection: limitations of LAM-PCR technology and optimization for clonal analysis. Stem Cells Dev. 16, 381-392 (2007).
- Wang, G. P., et al. DNA bar coding and pyrosequencing to analyze adverse events in therapeutic gene transfer. Nucleic acids research. 36, (2008).
- Paruzynski, A., et al. Genome-wide high-throughput integrome analyses by nrLAM-PCR and next-generation sequencing. Nat. Protocols. 5, 1379-1395 (2010).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest. , 3132-3142 (2008).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1. Science. 302, 415-419 (2003).
- Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. J Clin Invest. 118, 3143-3150 (2008).
- Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326, 818-823 (2009).
- Matrai, J., et al. Hepatocyte-targeted expression by integrase-defective lentiviral vectors induces antigen-specific tolerance in mice with low genotoxic risk. Hepatology. 53, 1696-1707 (2011).
- Penaud-Budloo, M., et al. Adeno-associated virus vector genomes persist as episomal chromatin in primate muscle. Journal of virology. 82, 7875-7885 (2008).
- Kaeppel, C., et al. A largely random AAV integration profile after LPLD gene therapy. Nature medicine. 19, 889-891 (2013).
- Voigt, K., et al. Retargeting sleeping beauty transposon insertions by engineered zinc finger DNA-binding domains. Mol Ther. 20, 1852-1862 (2012).
- Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nature medicine. 12, 348-353 (2006).
- Boztug, K., et al. Stem-Cell Gene Therapy for the Wiskott-Aldrich Syndrome. N Engl J Med. 363, 1918-1927 (2010).
- Deichmann, A., et al. Vector integration is nonrandom and clustered and influences the fate of lymphopoiesis in SCID-X1 gene therapy. J Clin Invest. 117, 2225-2232 (2007).
- Schwarzwaelder, K., et al. Gammaretrovirus-mediated correction of SCID-X1 is associated with skewed vector integration site distribution in vivo. J Clin Invest. 117, 2241-2249 (2007).
- Gabriel, R., et al. An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity. Nat Biotechnol. 29, 816-823 (2011).
- Dieter, S. M., et al. Distinct types of tumor-initiating cells form human colon cancer tumors and metastases. Cell Stem Cell. 9, 357-365 (2011).
- Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nature biotechnology. 24, 687-696 (2006).
- Zavidij, O., et al. Stable long-term blood formation by stem cells in murine steady-state hematopoiesis. Stem Cells. 30, 1961-1970 (2012).
- Martins, V. C., et al. Thymus-autonomous T cell development in the absence of progenitor import. J Exp Med. 209, 1409-1417 (2012).
- Arens, A., et al. Bioinformatic clonality analysis of next-generation sequencing-derived viral vector integration sites. Hum Gene Ther Methods. 23, 111-118 (2012).
