Summary
Линейно-амплификации опосредованной (ЛАМ)-ПЦР является метод, разработанный для определения точных координат интеграции вирусных векторов в геноме. Техника развивались, чтобы быть лучшим методом для изучения клоновых динамику у пациентов генной терапии, биобезопасности новых векторных технологий, Т-клеточного разнообразия, моделей стволовых раковых клеток, и т.д.
Introduction
Линейно-амплификации опосредованной ПЦР (LAM-ПЦР) позволяет идентификации и характеристике неизвестный фланговый ДНК, прилегающей к известной ДНК любого происхождения. Более конкретно, LAM-ПЦР был разработан, чтобы локализовать вирусный вектор сайтов интеграции (IS) в геном хозяина 1,2. Генетические элементы, такие как ретровирусов или транспозонов интегрировать их геном в геном хозяина в (полу-) случайным образом 3-6. Во многих случаях это является решающим точно знать позицию, где интегрированную эти векторы. LAM-ПЦР было доказано, что превосходит альтернативных методов, таких как перевязки опосредованного ПЦР 7 и его вариантов или обратной ПЦР 8. Чувствительность и надежность этого метода возникает в результате первоначального предварительного усиления вектора-генома развязок и магнитного выбора усиленных продуктов ПЦР. Как и альтернативных методов, указанных, LAM-ПЦР основан на использовании ферментов рестрикции, введение ошибку в поисковой мощностью 9-11. Таким образом,только подмножество репертуара (integrome) могут быть обнаружены в одной реакции. Это смещение минимизируется параллельного анализа данного образца, используя оптимальные комбинации ферментов рестрикции 9. Недавно вариант технологии называют не ограничивающими LAM-ПЦР (nrLAM-PCR) была разработана, что обходит использование ферментов рестрикции и позволяет объективную генома анализ образца в одной реакции 9,12.
В прошлом LAM-ПЦР был использован для идентификации причинным ретровирусная порождает лейкемии у нескольких пациентов в клинических испытаниях генной терапии 13-15. С тех пор, LAM-ПЦР была адаптирована для выявления IS от других интегрирующих векторов (лентивирусные векторы, транспозонов), а также для выявления интеграционных моделей пассивно интеграции векторы, как аденоассоциированные векторов (AAV) или интегразы исправный лентивирусов (IDLV) 16 -21. Применение LAM-ПЦР широкое распространение: традиционнаялы, этот метод широко используется для изучения клональную состав генов изменение клеток у пациентов, которые подверглись генной терапии или для оценки биобезопасности новых векторных систем на распутывание их поведение интеграции 15,16,22-24. Недавно LAM-ПЦР позволили установить специфику и мимо ворот деятельность дизайнера нуклеаз путем IDLV захвата анализа 25.
Кроме того, LAM-ПЦР позволяет легко следить за судьбу трансдуцированной клетки с течением времени в организме. Это позволяет определить протоонкогенами а также гены-супрессоры опухолей, а также для изучения гемопоэза или раковых стволовых клеточной биологии 26-28. Не в последнюю очередь, LAM-ПЦР была адаптирована для изучения разнообразия Т-клеточный рецептор у человека 29 (и неопубликованные данные).
Внутренняя сила технологии подкрепляется связывая метод для глубоких технологий секвенирования, которые позволяют характеризующие миллионы неизвестного фланговые ДНК с одной нуклеотидной гesolution в целых геномов. В следующем протокола, мы опишем шаг за шагом усиление и определение сопутствующих неизвестный ДНК образцово определить лентивирусный вектор. Олигонуклеотиды, используемые в протоколе приведены в таблице 1. Экстрагированной ДНК или кДНК из любого источника может быть использован в качестве ДНК-матрицы для LAM-ПЦР и nrLAM-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Получение Linker кассет (LC)
- Смешать 40 мкл олигонуклеотида LC1 (табл. 1), 40 мкл олигонуклеотида LC2 (табл. 1, с надлежащей рестрикционного фермента свеса), 110 мкл Трис-HCl (100 мМ, рН 7,5) и 10 мкл 250 мМ MgCl 2.
- Инкубировать при 95 ° С в течение 5 мин, и пусть реакции медленно остыть до комнатной температуры. Добавьте 300 мкл H 2 O и сосредоточиться dsLinker-ДНК на центрифугирования фильтра. Добавить 80 мкл H 2 O в элюата и аликвотные 10 мкл подготовленной линкерным кассеты в 0,2 ПЦР пробирок.
2. Предусиление векторных Геном переходов
- Для каждого образца для анализа подготовить ПЦР 50 мкл.
- Определить концентрацию образцов ДНК. Внесите х мкл (1-1000 нг для LAM/100-1, 000 нг для nrLAM) из ДНК в 0,2 мл ПЦР-пробирку. Объем ДНК должна быть равна в каждой пробе и в RANGE от 0,5 до 25 мкл.
- Подготовка ПЦР основной смеси, как описано в таблице 2 Mix (50 - х). Мкл мастер-смеси с каждого образца ДНК в 0,2 мл ПЦР пробирок.
- Preamplify векторные генома переходов с использованием ПЦР условий, примеры которых приведены в таблице 2. После завершения ПЦР добавить 0,5 мкл Taq-полимеразы в каждую ПЦР-пробирку и запускать программу ПЦР. ПЦР-продукты могут храниться при температуре 4 ° С в течение до 4 дней или долгосрочной перспективе при температуре -20 ° С.
3. Магнитной сепарации продукта ПЦР
- Подготовка магнитных шариков
- Пипетка 20 мкл (200 мкг), покрытых стрептавидином магнитных шариков в 1,5 мл трубки и подвергать в течение 1 мин на магнитный сепаратор частиц (MPS) при комнатной температуре. Удалите супернатант.
- Удаление трубки из МПС и ресуспендируют магнитных шариков в 40 мкл PSB / 0,1% БСА (рН 7,5). Expose для MPS в течение 1 мин и отбросить супернатант. Повторите этот шаг один раз.
- Вымойте бисером Wiй 20 мкл 3 М раствора LiCl (3 M LiCl, 10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА) подвергать MPS в течение 1 мин и отбросить супернатант. Ресуспендируют бусины в 50 мкл 6 М раствора LiCl (6 М LiCl, 10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА).
- Смешать все ПЦР со стадии 2.2 с 50 мкл приготовленных магнитных шариков. Инкубировать в горизонтальном шейкере (300 оборотов в минуту) по крайней мере в течение 2 ч при комнатной температуре. Этот шаг позволяет связывания биотинилированного продукта ПЦР в стрептавидина шарики (ДНК-бисера сложные). ДНК шарик комплекс можно инкубировать на шейкере в течение ночи или хранили при 4 ° С в течение 4 суток.
- Expose ДНК-бисера комплекс для MPS в течение 1 мин при комнатной температуре, удалить супернатант, и ресуспендируют ДНК-бисера комплекс в 100 мкл H 2 O. Сразу переходите к шагу 4 для LAM или в шаге 5 для nrLAM.
4. LAM-процессуальный
- Двухместный нити ДНК (дц) Синтез (только ЛАМ)
- Expose ДНК-бисера комплекс с шага 3.3 в MPS в течение 1 мин и раскарта супернатант. Добавить 8,25 мкл H 2 O, 1 мкл 10x гексануклеотида буфер, 0,25 мкл дНТФ (10 мм) и 0,5 мкл (2 U) полимеразы Кленова. Инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа.
- Добавить 90 мкл H 2 O и подвергать MPS в течение 1 мин. Удалите супернатант и ресуспендируют комплекс ДНК-бисера в 100 мкл H 2 O.
- Ограничение Дайджест
- Expose ДНК-бисера комплекс для MPS в течение 1 мин и отбросить супернатант. Добавить 8,5 мкл H 2 O, 1 мкл 10х буфера рестрикционного фермента и 0,5 мкл рестриктазы и инкубировать реакцию в течение 1 часа. Повторите шаг 4.1.2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выдержите реакцию при температуре, рекомендованной производителем ферментом рестрикции. Убедитесь, что нет сайт рестрикции присутствует в или ниже по течению от сайта связывания праймера, используемого для предварительного усиления в ДНК интерес. Для выбора подходящих комбинаций ферментов рестрикции / рестриктаз см. 9.
- Expose ДНК-бисера комплекс для MPS в течение 1 мин и отбросить супернатант. Добавить 8,5 мкл H 2 O, 1 мкл 10х буфера рестрикционного фермента и 0,5 мкл рестриктазы и инкубировать реакцию в течение 1 часа. Повторите шаг 4.1.2.
- Лигирование DS компоновщика (ЛК)
- Expose ДНК-бисера комплекс для MPS в течение 1 мин и отбросить супернатант. Добавьте 5 мкл H 2 O, 1 мкл 10x FASTLINK буфер, 1 мкл АТФ (10 мм), 2 мкл Linker кассету со стадии 1.2, и 1 мкл Быстрый-Link ДНК лигазы (2 ед / мкл). Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. Повторите шаг 4.1.2.
- Денатурацию синтезированной двухцепочечной ДНК
- Expose ДНК-бисера комплекс для MPS в течение 1 мин и отбросить супернатант. Ресуспендируют ДНК-бисера комплекс в 5 мкл 0,1 N NaOH. Инкубировать 5 мин при комнатной температуре на горизонтальном шейкере.
- Expose ДНК-бисера комплекс для MPS в течение 1 мин и собирать предварительно усиленный вектор-генома переход, содержащий супернатант в новую пробирку 1,5 мл. Сразу переходите к шагу 6 или магазине супернатанта при температуре -20 ° С.
5. NrLAM-процессуальный
- Лигирование одноцепочечной линкера (SSLC) (nrLAM только)
- Expose ДНК-бисера комплекс с шага 3.3 в MPSв течение 1 мин и отбросить супернатант. Добавить 6,5 мкл H 2 O, 1 мкл CircLigase 10x реакционного буфера, 0,5 мкл MnCl 2 (50 ммоль), 0,5 мкл АТФ (1 мм), 1 мкл ssLinker олигонуклеотида и 0,5 мкл CircLigase (100 ед / мкл). Инкубировать при 60 ° С в течение 1 часа.
- Добавить 90 мкл H 2 O и подвергать MPS в течение 1 мин. Удалите супернатант и мыть ДНК-бисера комплекс в 100 мкл H 2 O. Опять подвергать MPS в течение 1 мин, отбросить супернатант и ресуспендируют ДНК-Bead комплекса в 10 мкл H 2 O.
6. Экспоненциальная Усиление Я
- Для каждого образца для анализа подготовить ПЦР 50 мкл.
- Внесите 2 шаблона мкл ДНК (со стадии 4.4.2 (LAM) или 5.1.2 (nrLAM)) в 0,2 мл ПЦР-пробирку.
- Подготовка ПЦР основной смеси, как описано в таблице 3. Добавить 48 мкл мастер-микс для каждого образца, начиная с шага 6.1.1 и усиливать вектор генома переходы с помощью ПЦР-кондинс качестве примеров в таблице 3. ПЦР-продукты могут храниться при температуре 4 ° С в течение до 4 дней или долгосрочной перспективе при температуре -20 ° С.
7. Магнитной сепарации продукта ПЦР
- Подготовка магнитных шариков на примере с шагом 3.1.1 - 3.1.3. Ресуспендируют бусины в 20 мкл (для LAM) или 50 мкл (для nrLAM) от 6 М раствора LiCl (6 М LiCl, 10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА). Смешать 20 мкл (LAM) или 50 мкл (nrLAM) реакции ПЦР со стадии 6.1.2 с подготовленных магнитных шариков (этап 7.1) и инкубировали на горизонтальном шейкере (300 оборотов в минуту) в течение 2 часов при комнатной температуре. ДНК шарик комплекс можно инкубировать на шейкере в течение ночи или хранили при 4 ° С в течение 4 суток.
- Expose ДНК-бисера комплекс для MPS в течение 1 мин, удалить супернатант и ресуспендируют ДНК-бисера комплекс в 100 мкл H 2 O. Expose ДНК-бисера комплекс для MPS в течение 1 мин и отбросить супернатант.
- Ресуспендируют ДНК-бисера комплекс в 20 мкл (LAM) или 5 мкл (nrLAM) 0.1 N NaOH. INCUБАТЭ течение 10 мин при комнатной температуре на горизонтальном шейкере, подвергать его воздействию MPS в течение 1 мин и собирают амплифицированной ДНК, содержащий супернатант в новую пробирку 1,5 мл. Сразу переходите к шагу 8.1 или магазина супернатанта при температуре -20 ° С.
8. Экспоненциальная Усиление II
- Для каждого образца для анализа подготовить ПЦР 50 мкл.
- Внесите 2 шаблона мкл ДНК (с шага 7.3) в 0,2 мл ПЦР-пробирку.
- Подготовка ПЦР основной смеси, как описано в таблице 4. Добавить 48 мкл мастер-микс для каждого образца, начиная с шага 8.1.1 и усиливать вектор генома переходы по ПЦР условиях, примеры которых приведены в таблице 4. Продукты ПЦР можно хранить при температуре 4 ° С в течение до 4 дней или долгосрочная при -20 ° С
- Для визуализации (NR) продукты LAM-ПЦР, нагрузка 10 мкл ПЦР-продукта из стадии 8.1.2 на 2% агарозном геле. Если видны полосы, анализа 10 мкл продукта ПЦР LAM-на высокого разрешения геле. ВНИМАНИЕ: Ethidium бромид является мутагенным. Работа очень тщательно и всегда носить защитные перчатки.
9. Подготовка к высокой пропускной последовательности
- Очистка (NR) продуктов LAM-ПЦР
- Смешайте 40 мкл ПЦР-продукта со стадии 8.1.2 с 44 мкл комнатной температуре AMPure XP магнитных шариков. Инкубировать 5 мин при комнатной температуре и не подвергайте воздействию MPS в течение еще 2 мин.
- Удалите супернатант и мыть два раза 200 мкл 70% этанола на MPS.
- Удалите супернатант и ресуспендируют комплекс ДНК-бисера в 30 мкл H 2 O. Выдержите 1 мин и передачи супернатант в новую пробирку 0,2 мл. Определить концентрацию очищенного ДНК.
- Fusionprimer ПЦР добавить секвенирования конкретных адаптеров.
- Для каждого образца для анализа подготовить ПЦР 50 мкл.
- Пипетка х мкл (40 нг) ДНК в 0,2 мл ПЦР-пробирку. Объем ДНК должна быть равна в каждой пробе, а в диапазоне от 0,5 до 25 мкл.
- Подготовка ПЦР основной смеси, как описано в таблице 5 (50 - х). Мкл мастер-микс на каждого образца со стадии 9.2.2 и ввести секвенирования адаптеры для (NR) продуктов LAM-ПЦР с помощью ПЦР условиях, примеры которых приведены в таблице 5 продуктов ПЦР. можно хранить при температуре 4 ° С в течение до 4 дней или долгосрочной перспективе при температуре -20 ° С.
- Для визуализации Fusionprimer-ПЦР-продукты нагрузка 10 мкл ПЦР-продукта с этапа 9.2.3 на 2% агарозном геле. Очищают оставшийся продукт ПЦР, как описано в шагах 9.1.1 - 9.1.3. Анализ 1 мкл очищенного продукта ПЦР с шага 9,4 на автоматизированной электрофореза устройства с высоким разрешением, чтобы точно определить количество концентрации и фрагмент размер продуктов Fusionprimer-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LAM-PCR приводит к амплификации генома векторных переходов с определенного размера фрагмента для каждого перехода. Размер отдельных ПЦР-фрагментов зависит от расстояния между местом известного ДНК в геноме и ближайшим сайта рестрикции фермента распознавания. Это позволяет визуализировать разнообразие амплифицированных переходов в анализируемых пробах помощью гель-электрофореза, например., Если только один (моноклональные), несколько (олигоклональные) или несколько (поликлональные) присутствуют полосы на геле. Результаты LAM-PCR лучше всего рассматривать высокими электрофореза гели разрешения (рис. 2а), но также могут быть визуализированы на 2% агарозном геле (фиг. 2b). nrLAM-PCR приводит в ПЦР-фрагментов различной длины для каждого отдельного соединения. Таким образом моноклональные, так и поликлональные олигоклональные выборки появляются в виде мазка с помощью электрофореза и не могут быть выделены визуально. Визуализация продукта nrLAM-ПЦР на 2% агарозном геле достаточно определить Sucналог протокола (рис. 2С). После секвенирования геномной ДНК восстановлены могут быть выровнены с соответствующим геном хозяина, чтобы определить точное положение местоположении вектора (фиг.3А). Аннотация генома позволяет проанализировать репертуар для различных конкретных векторных функций, таких как предпочтение интеграции в геном, кодирующим регионах (рис. 3В) или близких к транскрипции стартовых сайтов (рис. 3C).
Рисунок 1. Схематическое изображение LAM-PCR и nrLAM-PCR. A) Оба способа начинают с начального предварительного усиления векторных генома переходов с использованием биотинилированных праймеров гибридизоваться близко к концу известной последовательности ДНК (здесь длинный концевой повтор (LTR) из ретровирусного вектора). Результаты Предварительное усиление в БиотинилированныеоцДНК разного размера для одинаковых или различных вектор генома переходов. Биотинилированных оцДНК захватывается на магнитных частиц. B) Для LAM ПЦР, ферментативных стадий реакции, состоящих из синтеза двухцепочечной ДНК, ограничение дайджеста и лигирования известным линкерной ДНК генерировать продукты разных размеров с известными последовательностями на обоих концах продукта. Из-за длины ограничение полиморфизма друг усиливается перехода имеет характерную длину. После денатурации продукт LAM-ПЦР усиливается вложенной ПЦР с линкерных и векторных специфических праймеров. C) Для nrLAM линкерная онДНК напрямую сшит с неизвестной конце предварительным усилением одноцепочечной ДНК из А), что позволяет экспоненциальное усиление по вложенной ПЦР с линкера и вектор специфических праймеров. Эта цифра была изменена с 2,12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. >
Рисунок 2. Представитель результаты LAM-PCR и nrLAM-PCR. A, B) LAM-PCR анализ выделенной ДНК из периферической крови пациентов, получавших терапию гена. Число полос на геле соответствует количеству присутствует в образце. Гели с высоким разрешением (B) лучше подходят для визуализации клональности анализируемых образцов, чем 2% агарозном геле (А). C) nrLAM-ПЦР анализ лентивирусным вектором трансдуцированные клонов одноклеточные или сыпучих клеток. Независимо от количества амплифицированных участков вставки мазок видно на геле после электрофореза. М, на 100 базисных пунктов лестница; MC, моноклональное; OC олигоклональная; ПК, поликлональные. Эта цифра была изменена с 2,9.
es/ftp_upload/51543/51543fig3highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок 3. Типичные примеры для IS анализ LAM-ПЦР и последующего высокой пропускной последовательности. IS распределение у двух пациентов из gammaretroviral (синий) или лентивирусов (зеленый) испытаний клинической генной терапии. После секвенирования и картирования продуктов LAM-ПЦР с соответствующим геном может быть оценена, например:..) Геном-Широкое распространение ЕСТЬ В) разницу в зависимости от предпочтений для вставки в генных кодирующих областях между gammaretroviral и лентивирусов и С) предпочтение для вставки близко к транскрипции стартовых сайтов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Цель | Название | Последовательность (5'-3 ') |
| ЛК-универсальный | LC1 | GACCCGGGAGATCTGAATTCAGTGGCACAG CAGTTAGG |
| ЛК-AATT | LC2 (AATT) | AATTCCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCA GATC |
| ЛК-CG | LC2 (CG) | CGCCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCAGATC |
| ЛК-TA | LC2 (ТА) | TACCTAACTGCTGTGCCACTGAAATCAGATC |
| ЛК-nrLAM-ПЦР | SSLC | (Р) CCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCAGATC TCCCGGGTddC |
| Предварительное усиление | LTR-я (3-направление) | (B) AGTAGTGTGTGCCCGTCTGT |
| LTR-я (5'-направление) | (B) TTAGCCAGAGAGCTCCCAGG | |
| Экспоненциальная амплификация Я | LTR-II (3'-направлении) | (B) GTGTGACTCTGGTAACTAGAG |
| LTR-II (5'-направлении) | (B) GATCTGGTCTAACCAGAGAG | |
| LC-I | GACCCGGGAGATCTGAATTC | |
| Экспоненциальная амплификация II | LTR-III (3'-направлении) | GATCCCTCAGACCCTTTTAGTC |
| LTR-III (5'-направлении) | CCCAGTACAAGCAAAAAGCAG | |
| LC-II | GATCTGAATTCAGTGGCACAG |
Таблица 1 олигонуклеотидов. Для LAM-и nrLAM-PCR для амплификации лентивирусов IS. SSLC фосфорилируется в 5'-конец (P), и имеет на 3 'didesoxycytidin (DDC), чтобы избежать мультимеризацию в течение SSLC труб. В общем, (NR) LAM-ПЦР-праймеры должен состоять из 18-25 нуклеотидов и не должны привести в геном хозяина. Праймеры для предварительного усиления должен быть размещен как можно ближе (≤ 120 пар оснований) с 5 'или 3' конца вектора. Два дополнительных праймеры для экспоненциального ПЦР I и II должны быть размещены между праймеромиспользуется для предварительного усиления и вектором цели. Грунтовки для предварительного усиления и экспоненциального ПЦР мне нужно быть 5'-фосфорилируется (Р).
| Реагент | Объем (мкл) | Концентрация | ПЦР Параметры | Температура | Время | |
| H2O | 43 - х | Начальная денатурация | 95 ° C | 5 мин | ||
| Буфер | 5 | 10 х | Денатурация | 95 ° C | 45 сек | |
| дНТФ | 1 | 10 мм (ЛАМ); 0,5 мкм (nrLAM) | Отжиг | 60 ° C | 45 сек | 2 х 50 Циклы |
| LTR-я | 0.5 | 0,17 мкМ | Удлинение | 72 ° C | 60 с (ЛАМ); 10 сек (nrLAM) | |
| TaqПолимеразной | 0.5 | 2,5 ед / мкл | Финал Удлинение | 72 ° C | 5 мин (только ЛАМ) |
Таблица 2. ПЦР-условия для предварительного усиления векторных генома переходов (шаг 2). Столбцы 1-3 показывают реагенты ПЦР использовали для амплификации одном образце ДНК. Колонны 4-6 иллюстрируют программу ПЦР в preamplify векторные генома переходы.
| Реагент | Объем (мкл) | Концентрация | ПЦР Параметры | Температура | Время | |
| H 2 O | 40.5 | Начальная денатурация | 95 ° C | 5 мин | ||
| Буфер | 5 | 10 х | Денатурация | 95 ° C | 45 сек | |
| дНТФ | 1 </ TD> | 10 мМ | Отжиг | 60 ° C | 45 сек | 35 Циклы |
| LTR-II | 0.5 | 16.7 мкМ | Удлинение | 72 ° C | 60 с (ЛАМ); 5 сек (nrLAM) | |
| LC-I | 0.5 | 16.7 мкМ | Финал Удлинение | 72 ° C | 5 мин (только ЛАМ) | |
| Taq-полимеразы | 0.5 | 2,5 ед / мкл |
Таблица 3. ПЦР-условия экспоненциальной амплификации I (этап 6). Столбцы 1-3 показывают реагенты, используемые для ПЦР экспоненциальной амплификации одном образце ДНК. Колонны 4-6 иллюстрируют программу ПЦР используется для экспоненциально усиливать один образец после перевязки линкерной последовательности.
| Реагент | ВоЛуме (мкл) | Концентрация | ПЦР Параметры | Температура | Время | |
| H 2 O | 40.5 | Начальная денатурация | 95 ° C | 5 мин | ||
| Буфер | 5 | 10 х | Денатурация | 95 ° C | 45 сек | |
| дНТФ | 1 | 10 мМ | Отжиг | 60 ° C | 45 сек | 35 Циклы |
| LTR-III | 0.5 | 16.7 мкМ | Удлинение | 72 ° C | 60 с (ЛАМ); 5 сек (nrLAM) | |
| LC-II | 0.5 | 16.7 мкМ | Финал Удлинение | 72 ° C | 5 мин | |
| Taq-полимеразы | 0.5 | 2,5 ед / мкл |
Таблица 4. ПЦР-условия для экспоненциального Усиление I (этап 8). Столбцы 1-3 показать реагентов для ПЦР, используемые для вложенного экспоненциальной амплификации одного образца. Колонны 4-6 иллюстрируют программу ПЦР используется для вложенного экспоненциальной амплификации векторных генома переходов из одного образца.
| Реагент | Объем (мкл) | Концентрация | ПЦР Параметры | Температура | Время | |
| H 2 O | 42.5 - х | Начальная денатурация | 95 ° C | 2 мин | ||
| Буфер | 5 | 10 х | Денатурация | 95 ° C | 45 сек | |
| дНТФ | 1 | 10 мМ | Отжиг | 58 ° C | 45 сек | 12 Циклы |
| Fusionprimer | 0.5 | 10 мкм | Удлинение | 72 ° C | 60 сек | |
| Fusionprimer B | 0.5 | 10 мкм | Финал Удлинение | 72 ° C | 5 мин | |
| Taq-полимеразы | 0.5 | 2,5 ед / мкл |
Таблица 5. ПЦР-Условия Fusionprimer-ПЦР (шаг 9.2). Столбцы 1-3 показать реагентов для ПЦР, используемые для введения секвенирования адаптеров к (NR) продуктов LAM-ПЦР. Столбцы 4-6 иллюстрируют программу ПЦР, используемый для Fusionprimer-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Техника LAM-ПЦР позволяет выявить неизвестные последовательности ДНК, которые фланкируют известный участок ДНК. Из-за высокой чувствительности в результате предварительного усиления из переходов с использованием специфических праймеров гибридизации в известной последовательности ДНК, можно усилить и обнаруживать даже редкие переходы вплоть до уровне одной клетки. Напротив, в поликлональной ситуации LAM-PCR способен усиливать тысячи различных узлов в одной реакции.
Однако в связи с использованием рестриктаз только субфракции из integrome могут быть проанализированы LAM-PCR на присутствие переходов с каждого конкретного фермента рестрикции. Таким образом, повторный анализ одного и того же образца с различных ферментов рекомендуется 9. Если не LAM-ПЦР ампликонов не присутствуют на геле, скорее всего расстояние между расположения известного фрагмента ДНК и ближайшим сайта узнавания выбранного фермента рестрикции слишком велик, чтобы привести в продуктах LAM-ПЦР9. В этом случае другие ферменты должны быть использованы для усиления перехода.
nrLAM не зависит от использования рестрикционных ферментов и, следовательно, представляет собой чрезвычайно ценным методом всесторонне характеризуют последовательности, фланкирующие известную последовательность ДНК. Опуская ограничение переварить из результатов протокола к потере определенного полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, характеризующего каждый усиленный переход. Вместо каждый усиливается перехода представлена продуктов ПЦР различных размеров в результате в мазке на геле после электрофореза, независимо от разнообразия усиленных узлов.
Оба LAM-и nrLAM-ПЦР-продукты отлично подходят для последующей высокой пропускной последовательности. Высокая пропускная секвенирование (NR) продуктов LAM-ПЦР и отображения полученных сырьевых последовательностей с соответствующим геном позволяет характеризующие неизвестное фланговый ДНК или при определении точных локализацию вектор-генома переходов 30.Вводя последовательности штрих в fusionprimers несколько сотен ЛАМ-и nrLAM-продуктов ПЦР может быть упорядочены в одном секвенирования перспективе 30.
В связи с высокой чувствительностью, LAM-ПЦР является склонным к загрязнению, если выполняется невнимательно. Таким образом, среда ПЦР-класса и особое внимание для очистки обработку протокола имеет первостепенное значение для успешного усиления неизвестное фланговый ДНК без загрязнения образцов. Таким образом, в том числе untransduced геномной ДНК и контроля воды для каждого ПЦР-реакции, как отрицательных контролей в протокол LAM-ПЦР, настоятельно рекомендуется. Если контрольные образцы показывают, что перекрестное загрязнение произошло в протоколе, продукты из каждой точке паузы может быть использован, чтобы повторить части протокола. Когда полосы по-прежнему присутствуют, рекомендуется, чтобы отменить все реагенты (например,., Грунтовки, дНТФ, полимеразы, и т.д.) и повторяя (NR) протокол LAM-ПЦР с новыми порциями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq DNA Polymerase | Genaxxon Bioscience GmbH | M3001.5000 | Alternative Taq Polymerases may be used |
| PCR Buffer | Qiagen | 201203 | Use of this buffer is recommended |
| dNTP-Mixture | Genaxxon Bioscience GmbH | M3015.4020 | or any other dNTPs |
| Oligonucleotides (Primers) | MWG Biotech | HPLC purified | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11206D | |
| PBS | Gibco | 14190-086 | 0.1% wt/vol BSA |
| 6 M LiCl | Roth | 3739.1 | 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA |
| Tris-HCl, pH 7.5 | USB Corporation | 22637 | or any other supplier |
| EDTA | Applichem | A1103,0250 | or any other supplier |
| Klenow Polymerase | Roche Diagnostics | 10104523001 | |
| Hexanucleotide mixture | Roche Diagnostics | 11277081001 | |
| Restriction endonuclease | NEB | or any other supplier | |
| Fast-Link DNA ligation kit | Epicentre Biotechnologies | LK11025 | |
| CircLigase ssDNA Ligase Kit | Epicentre Biotechnologies | CL4111K | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | or any other supplier |
| Agarose LE | Roche Diagnostics | 11685660001 | or any other supplier |
| TBE buffer | Amresco | 0658 | or any other supplier |
| Ethidium bromide | Applichem | A2273,0005 | Ethidium bromide is mutagenic |
| 100 bp DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | or any other DNA ladder |
| 20 mM NaCl | Sigma-Aldrich | 71393-1L | or any other supplier |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158501 | for use with 1.5 ml Tubes |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158696 | for use with 96-well plates |
| Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membrane | Millipore | UFC503096 | |
| PerfectBlue Gelsystem Midi S | PeqLab | 40-1515 | or other electrophoresis system |
| TProfessional 96 | Biometra | 050-551 | or other Thermocycler for 96-well plates |
| Orbital shaker KS 260 basic | IKA | 2980200 | or other horizontal shaker |
| PCR softtubes 0.2 ml | Biozym Scientific GmbH | 711082 | or other 0.2 ml PCR tubes |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 12682 | or other 1.5 ml tubes |
| Gel documentation system | PeqLab | or any other gel documentation system | |
| Nanodrop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Spreadex EL1200 precast gel | Elchrom Scientific | 3497 | |
| Submerged gel electrophoresis apparatus SEA 2000 | Elchrom Scientific | 2001E | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA |
References
- Schmidt, M., et al. Detection and direct genomic sequencing of multiple rare unknown flanking DNA in highly complex samples. Hum Gene Ther. 12, 743-749 (2001).
- Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat Methods. 4, 1051-1057 (2007).
- Schroeder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
- Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M. Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration. Science. 300, 1749-1751 (2003).
- Vigdal, T. J., Kaufman, C. D., Izsvak, Z., Voytas, D. F., Ivics, Z. Common physical properties of DNA affecting target site selection of sleeping beauty and other Tc1/mariner transposable elements. J Mol Biol. 323, 441-452 (2002).
- Lewinski, M. K., et al. Retroviral DNA integration: viral and cellular determinants of target-site selection. PLoS Pathog. 2, (2006).
- Mueller, P. R., Wold, B. In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR. Science. 246, 780-786 (1989).
- Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. Journal of virology. 63, 1924-1928 (1989).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nature medicine. 15, 1431-1436 (2009).
- Harkey, M. A., et al. Multiarm high-throughput integration site detection: limitations of LAM-PCR technology and optimization for clonal analysis. Stem Cells Dev. 16, 381-392 (2007).
- Wang, G. P., et al. DNA bar coding and pyrosequencing to analyze adverse events in therapeutic gene transfer. Nucleic acids research. 36, (2008).
- Paruzynski, A., et al. Genome-wide high-throughput integrome analyses by nrLAM-PCR and next-generation sequencing. Nat. Protocols. 5, 1379-1395 (2010).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest. , 3132-3142 (2008).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1. Science. 302, 415-419 (2003).
- Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. J Clin Invest. 118, 3143-3150 (2008).
- Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326, 818-823 (2009).
- Matrai, J., et al. Hepatocyte-targeted expression by integrase-defective lentiviral vectors induces antigen-specific tolerance in mice with low genotoxic risk. Hepatology. 53, 1696-1707 (2011).
- Penaud-Budloo, M., et al. Adeno-associated virus vector genomes persist as episomal chromatin in primate muscle. Journal of virology. 82, 7875-7885 (2008).
- Kaeppel, C., et al. A largely random AAV integration profile after LPLD gene therapy. Nature medicine. 19, 889-891 (2013).
- Voigt, K., et al. Retargeting sleeping beauty transposon insertions by engineered zinc finger DNA-binding domains. Mol Ther. 20, 1852-1862 (2012).
- Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nature medicine. 12, 348-353 (2006).
- Boztug, K., et al. Stem-Cell Gene Therapy for the Wiskott-Aldrich Syndrome. N Engl J Med. 363, 1918-1927 (2010).
- Deichmann, A., et al. Vector integration is nonrandom and clustered and influences the fate of lymphopoiesis in SCID-X1 gene therapy. J Clin Invest. 117, 2225-2232 (2007).
- Schwarzwaelder, K., et al. Gammaretrovirus-mediated correction of SCID-X1 is associated with skewed vector integration site distribution in vivo. J Clin Invest. 117, 2241-2249 (2007).
- Gabriel, R., et al. An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity. Nat Biotechnol. 29, 816-823 (2011).
- Dieter, S. M., et al. Distinct types of tumor-initiating cells form human colon cancer tumors and metastases. Cell Stem Cell. 9, 357-365 (2011).
- Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nature biotechnology. 24, 687-696 (2006).
- Zavidij, O., et al. Stable long-term blood formation by stem cells in murine steady-state hematopoiesis. Stem Cells. 30, 1961-1970 (2012).
- Martins, V. C., et al. Thymus-autonomous T cell development in the absence of progenitor import. J Exp Med. 209, 1409-1417 (2012).
- Arens, A., et al. Bioinformatic clonality analysis of next-generation sequencing-derived viral vector integration sites. Hum Gene Ther Methods. 23, 111-118 (2012).
