Summary
Lineal-amplificación mediada (LAM)-PCR es un método desarrollado para identificar las posiciones exactas de los vectores de integración viral en el genoma. La técnica ha evolucionado a ser el método superior para estudiar la dinámica clonales en los pacientes de terapia génica, la bioseguridad de las tecnologías de nuevo vector, la diversidad de células T, los modelos de células madre de cáncer, etc
Introduction
Lineal-amplificación mediada por PCR (LAM-PCR) permite la identificación y caracterización de ADN que flanquea desconocida adyacente a ADN conocido de cualquier origen. Más específicamente, LAM-PCR se ha desarrollado para localizar los sitios de integración de vectores virales (IS) dentro del genoma del huésped 1,2. Los elementos genéticos como retrovirus o transposones integrar su genoma en el genoma huésped en un (semi-) de forma aleatoria 3-6. En muchos casos es decisivo para saber exactamente la posición en que estos vectores integrados. LAM-PCR se ha demostrado ser superior a las técnicas alternativas como la ligadura mediada por PCR 7 y sus variantes o PCR inversa 8. La sensibilidad y la robustez de este método surge de la etapa previa de amplificación inicial de las uniones de vector y el genoma de la selección magnética de los productos de PCR amplificados. Al igual que los métodos alternativos mencionados, LAM-PCR se basa en el uso de enzimas de restricción, la introducción de un sesgo en la capacidad de recuperación de IS 9-11. Por lo tanto,sólo un subconjunto del repertorio ESTÁ (la integrome) se puede detectar en una reacción. Este sesgo se minimiza por el análisis paralelo de una muestra dada usando combinaciones óptimas de las enzimas de restricción 9. Recientemente, una variante de la tecnología denomina no restrictiva LAM-PCR (nrLAM-PCR) se ha desarrollado que evita el uso de enzimas de restricción y permite el análisis de todo el genoma imparcial de una muestra en una sola reacción 9,12.
En el pasado, LAM-PCR se ha utilizado para identificar el causante retroviral está dando lugar a la leucemia en algunos pacientes en los ensayos clínicos de terapia génica 13-15. Desde entonces, LAM-PCR ha sido adaptado para identificar es de otros vectores de integración (vectores lentivirales, transposones) y también para identificar patrones de integración de la integración de pasivamente vectores como vectores adeno-asociados (AAV) o vectores lentivirales-integrasa defectuosa (IDLV) 16 -21. Aplicaciones de la LAM-PCR son de amplia expansión: tradicionalLY, la técnica se usa ampliamente para estudiar la composición clonal de células de genes modificados en los pacientes que han sido sometidos a la terapia génica o para evaluar la seguridad de la biotecnología de sistemas de vectores novedosos por desentrañar su comportamiento integración 15,16,22-24. Recientemente, LAM-PCR permitió determinar la especificidad y la actividad fuera del objetivo de las nucleasas de diseño mediante un ensayo de captura de IDLV 25.
Por otra parte, LAM-PCR permite seguir fácilmente el destino de una célula transducida con el tiempo en un organismo. Esto permite identificar los proto-oncogenes, así como genes supresores de tumores y también para estudiar la hematopoyesis o madre de cáncer biología celular 26-28. Por último, pero no menos importante, LAM-PCR fue adaptado para estudiar la diversidad de receptores de células T en seres humanos (29 y datos no publicados).
La potencia intrínseca de la tecnología se ve reforzada por la vinculación el método a las tecnologías de secuenciación profundas que permiten la caracterización de millones de ADN desconocido que flanquea con solo nucleótido resolución de genomas enteros. En el siguiente protocolo, se describe paso a paso la amplificación e identificación de ADN flanqueante desconocido a modo de ejemplo para identificar vector lentiviral ES. Los oligonucleótidos utilizados en el protocolo se enumeran en la Tabla 1. Extrajeron el ADN o el ADNc de cualquier fuente se pueden utilizar como plantilla de ADN para LAM-PCR y nrLAM-PCR.
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Protocol
1. Preparación del vinculador Cassettes (LC)
- Mezclar 40 l de LC1 oligonucleótido (Tabla 1), 40 l de LC2 oligonucleótido (Tabla 1, con la enzima de restricción apropiada voladizo), 110 l de Tris-HCl (100 mM, pH 7,5), y 10 l 250 mM de MgCl 2.
- Incubar a 95 ° C durante 5 minutos y dejar que la reacción se enfríe lentamente a temperatura ambiente. Añadir 300 l de H 2 O y concentrarse dsLinker-ADN en un filtro de centrifugación. Añadir 80 l H 2 O al eluato y alícuotas de 10 l de casete de engarce dispuesto en 0.2 tubos de PCR.
2. Preamplificación del genoma del vector Uniones
- Para cada muestra a analizar preparar una reacción de PCR de 50 l.
- Determinar la concentración de las muestras de ADN. Pipeta x l (1-1.000 ng para LAM/100-1, 000 ng para nrLAM) de ADN en un tubo de PCR de 0,2 ml. Volumen de ADN debe ser igual en cada muestra y en la RANGE de 0,5 a 25 l.
- Preparar mezcla maestra de PCR como se describe en la Tabla 2 de la mezcla (50 - x). L de la mezcla maestra con cada muestra de ADN en 0,2 ml tubos de PCR.
- Preamplificar vector uniones genoma utilizando condiciones de PCR ejemplificados en la Tabla 2. Después de la terminación de la PCR añaden 0,5 l de Taq polimerasa a cada tubo de PCR y vuelva a ejecutar el programa de PCR. Los productos de PCR se pueden almacenar a 4 ° C durante un máximo de 4 días o largo plazo a -20 ° C.
3. Separación Magnética de la PCR Producto
- Preparación de perlas magnéticas
- Pipetear 20 l (200 g) de perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina en un tubo de 1,5 ml y se exponga durante 1 min en el separador de partículas magnéticas (MPS) a temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante.
- Saque el tubo del MPS y volver a suspender las perlas magnéticas en 40 l PSB / BSA al 0,1% (pH 7,5). La exposicion a MPS durante 1 min y desechar el sobrenadante. Repita este paso una vez.
- Lavar perlas wiº 20 l de solución de LiCl 3 M (3 M LiCl, 10 mM de Tris-HCl, 1 mM EDTA) exponer a MPS durante 1 minuto y desechar el sobrenadante. Resuspender las perlas en 50 l de solución 6 M de LiCl (6 M de LiCl, mM de Tris-HCl 10, EDTA 1 mM).
- Mezcla de reacción PCR entera de la etapa 2.2 con 50 l de perlas magnéticas preparadas. Incubar en un agitador horizontal (300 rpm) a menos de 2 horas a temperatura ambiente. Este paso permite la unión del producto de PCR biotinilado a estreptavidina perlas recubiertas (complejo ADN-Bead). Complejo de grano de ADN se puede incubar en un agitador durante la noche o se almacenó a 4 ° C durante hasta 4 días.
- La exposicion complejo ADN-Bead para MPS durante 1 minuto a temperatura ambiente, quite el sobrenadante y resuspender complejo ADN-bolas en 100 l de H 2 O. Proceder inmediatamente con el paso 4 para LAM o el paso 5 para nrLAM.
4. LAM-Procedimiento
- ADN de doble cadena (dsDNA) Síntesis (LAM solamente)
- La exposicion complejo ADN-Bead desde el paso 3.3 para MPS por 1 min y dissobrenadante tarjeta. Añadir 8,25 l de H 2 O, 1 l de tampón 10x hexanucleótido, 0,25 mu l dNTPs (10 mM) y 0,5 l (2 U) Klenow polimerasa. Incubar a 37 ° C durante 1 hora.
- Añadir 90 l de H 2 O y se exponga a MPS durante 1 min. Desechar el sobrenadante y complejo ADN-Bead resuspender en 100 l de H 2 O.
- Digestión de restricción
- La exposicion complejo ADN-Bead para MPS por 1 min y desechar el sobrenadante. Añadir 8,5 l de H 2 O, 1 l de 10x tampón de enzima de restricción y 0,5 l de enzima de restricción y se incuba la reacción durante 1 hora. Repita el paso 4.1.2.
NOTA: Se incuba la reacción a la temperatura recomendada por el fabricante de la enzima de restricción. Asegúrese de que no hay ningún sitio de restricción presentes dentro o aguas abajo del sitio de unión del cebador utilizado para la preamplificación en el ADN de interés. Para la elección de combinaciones de enzimas enzimas de restricción / limitación adecuados referirse a 9.
- La exposicion complejo ADN-Bead para MPS por 1 min y desechar el sobrenadante. Añadir 8,5 l de H 2 O, 1 l de 10x tampón de enzima de restricción y 0,5 l de enzima de restricción y se incuba la reacción durante 1 hora. Repita el paso 4.1.2.
- La ligación de DS Linker (LK)
- La exposicion complejo ADN-Bead para MPS por 1 min y desechar el sobrenadante. Añadir 5 l de H 2 O, 1 l de tampón 10x FastLink, 1 l de ATP (10 mM), 2 l vinculador casete desde el paso 1.2 y 1 l Fast-Link ADN ligasa (2 U / l). Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Repita el paso 4.1.2.
- La desnaturalización de ADN de doble cadena sintetizado
- La exposicion complejo ADN-Bead para MPS por 1 min y desechar el sobrenadante. Resuspender complejo ADN-bolas en 5 l 0,1 N NaOH. Incubar 5 min a temperatura ambiente en un agitador horizontal.
- Exponer complejo de ADN-Talón a MPS durante 1 min y recoger unión vector de genoma-preamplificada que contiene sobrenadante en nuevo tubo de 1,5 ml. Proceder de inmediato con el paso 6 o tienda sobrenadante a -20 ° C.
5. NrLAM-Procedimiento
- La ligación del enlazador de cadena sencilla (SSLC) (nrLAM solamente)
- La exposicion complejo ADN-Bead desde el paso 3.3 para MPSdurante 1 min y el sobrenadante de descarte. Añadir 6,5 l de H 2 O, 1 l CircLigase 10x tampón de reacción, 0,5 l de MnCl2 (50 mM), 0,5 l de ATP (1 mM), 1 l de oligonucleótido ssLinker y 0,5 l CircLigase (100 U / l). Incubar a 60 ° C durante 1 hora.
- Añadir 90 l de H 2 O y se exponga a MPS durante 1 min. Desechar el sobrenadante y lavar complejo ADN-bolas en 100 l de H 2 O. Una vez más exponer a MPS por 1 min, el sobrenadante y resuspender descarte complejo ADN-Bead de 10 l H 2 O.
6. Exponencial de amplificación me
- Para cada muestra a analizar preparar una reacción de PCR de 50 l.
- Pipetear 2 ADN molde l (del paso 4.4.2 (LAM) o 5.1.2 (nrLAM)) en un tubo de PCR de 0,2 ml.
- Preparar mezcla maestra de PCR como se describe en la Tabla 3. Añadir 48 l de mezcla maestra a cada muestra de la etapa 6.1.1 y amplificar las uniones genoma del vector por PCR conditions ejemplificados en la Tabla 3. productos de la PCR se pueden almacenar a 4 ° C durante un máximo de 4 días o largo plazo a -20 ° C.
7. Separación Magnética de la PCR Producto
- Preparar perlas magnéticas como se ejemplifica en los pasos 3.1.1 - 3.1.3. Resuspender las perlas en 20 l (para LAM) o 50 l (para nrLAM) de solución 6 M de LiCl (6 M de LiCl, mM de Tris-HCl 10, EDTA 1 mM). Mezclar 20 l (LAM) o 50 l (nrLAM) de reacción de PCR de la etapa 6.1.2 con perlas magnéticas preparadas (paso 7,1) e incubar en un agitador horizontal (300 rpm) durante 2 horas a temperatura ambiente. Complejo de grano de ADN se puede incubar en un agitador durante la noche o se almacenó a 4 ° C durante hasta 4 días.
- La exposicion complejo ADN-Bead para MPS por 1 min, retirar el sobrenadante y resuspender complejo ADN-bolas en 100 l de H 2 O. La exposicion complejo ADN-Bead para MPS por 1 min y desechar el sobrenadante.
- Resuspender complejo ADN-Bead de 20 l (LAM) o 5 l (nrLAM) 0,1 N NaOH. Incubate durante 10 min a temperatura ambiente en un agitador horizontal, exponga a MPS durante 1 min y recoger el ADN que contiene sobrenadante amplificado en nuevo tubo de 1,5 ml. Proceder de inmediato con el paso 8.1 o tienda sobrenadante a -20 ° C.
8. Exponencial de amplificación II
- Para cada muestra a analizar preparar una reacción de PCR de 50 l.
- Pipetear 2 l de ADN plantilla (de la etapa 7.3) en un tubo de PCR de 0,2 ml.
- Preparar mezcla maestra de PCR como se describe en la Tabla 4. Añadir 48 l de mezcla maestra a cada muestra de la etapa 8.1.1 y amplificar las uniones genoma del vector por las condiciones de PCR ejemplificados en la Tabla 4. Productos de la PCR se pueden almacenar a 4 ° C durante hasta 4 días o largo plazo a -20 ° C.
- Para visualizar (NR) productos LAM-PCR, carga de 10 l del producto de PCR de la etapa 8.1.2 en un gel de agarosa al 2%. Si las bandas son visibles, analizar 10 l de producto de LAM-PCR en gel de alta resolución. PRECAUCIÓN: Etbromuro hidium es mutagénico. Trabaje con mucho cuidado y siempre use guantes apropiados.
9. Preparación para la secuenciación de alto rendimiento
- Purificación de (nr) productos LAM-PCR
- Mezclar 40 l PCR-producto del paso 8.1.2 con 44 l de temperatura ambiente AMPure XP perlas magnéticas. Incubar 5 minutos a temperatura ambiente y exponerlo a MPS durante 2 min.
- Desechar el sobrenadante y lavar dos veces con 200 l 70% de EtOH en las MPS.
- Desechar el sobrenadante y complejo ADN-Bead resuspender en 30 l H 2 O. Incubar 1 min y transferir el sobrenadante a fresco tubo 0,2 ml. Determinar la concentración de ADN purificado.
- Fusionprimer PCR para añadir la secuenciación de adaptadores específicos.
- Para cada muestra a analizar preparar una reacción de PCR de 50 l.
- Pipeta x l (40 ng) de ADN en un tubo de PCR de 0,2 ml. Volumen de ADN debe ser igual en cada muestra y en el intervalo de 0,5 a 25 l.
- Prepare la mezcla maestra de PCR como se describe en la tabla 5 Agregar (50 - x). L de mezcla maestra a cada muestra a partir del paso 9.2.2 e introducir adaptadores de secuenciación a (nr) productos LAM-PCR por PCR condiciones ejemplificados en la Tabla 5 los productos de PCR. puede almacenarse a 4 ° C durante un máximo de 4 días o largo plazo a -20 ° C.
- Para visualizar Fusionprimer-PCR productos de carga 10 l de producto de PCR de la etapa 9.2.3 en un gel de agarosa al 2%. Purificar el producto remanente PCR como se describe en los pasos 9.1.1 - 9.1.3. Analizar 1 l producto de PCR purificado de la etapa 9.4 en un dispositivo de electroforesis de alta resolución automatizado para cuantificar con precisión la concentración y el fragmento de tamaño de los productos Fusionprimer-PCR.
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Representative Results
LAM-PCR resulta en la amplificación de las uniones genoma de vector con un tamaño de fragmento definido para cada unión. El tamaño de los fragmentos individuales de PCR depende de la distancia entre la ubicación de la ADN conocida en el genoma y el sitio de reconocimiento de enzima de restricción más cercano. Esto permite la visualización de la diversidad de uniones amplificados en muestras analizadas por electroforesis en gel, por ejemplo., Aunque sólo sea sola (monoclonales), varios (oligoclonales), o múltiples bandas (policlonales) están presentes en el gel. Los resultados de LAM-PCR se visualizan mejor mediante geles de electroforesis de alta resolución (Figura 2A), pero también se pueden visualizar en un 2% en geles de agarosa (Figura 2B). nrLAM-PCR resulta en fragmentos de PCR de diversas longitudes para cada unión individual. Las muestras así monoclonales, oligoclonales o policlonales aparecen como una mancha por electroforesis y no se pueden distinguir visualmente. Visualizando el producto nrLAM-PCR sobre gel de agarosa al 2% es suficiente para determinar éxitoproceso del protocolo (Figura 2 C). Después de secuenciar el ADN genómico recuperado se puede alinear a la respectiva genoma del huésped para identificar posiciones exactas de la ubicación del vector (Figura 3A). Anotación del genoma permite analizar el repertorio es para diferentes características vectoriales como preferencia para la integración en gen que codifica regiones (Figura 3B) o cerca de los sitios de inicio de transcripción (Figura 3C).
Figura 1. Esquema de la estructura de LAM-PCR y nrLAM-PCR. A) Ambos métodos comienzan con una etapa previa de amplificación inicial de vector uniones genoma utilizando cebadores biotinilados hibridarse cerca del final de la secuencia de ADN conocida (repetición terminal larga aquí (LTR) de un vector retroviral). Resultados Preamplificación en biotiniladossDNA de diferente tamaño para uniones genoma del vector idénticos o diferentes. SsDNA biotinilado se capturó sobre las partículas magnéticas. B) Para LAM PCR, etapas de reacción enzimáticos compuestos de la síntesis de ADN de doble cadena, digestión de restricción y la ligadura de un ADN enlazador conocido generar productos de diferentes tamaños con secuencias conocidas en ambos extremos del producto. Debido al polimorfismo de longitud de restricción cada unión amplificado tiene una longitud característica. Después de la desnaturalización del producto de LAM-PCR se amplificó por PCR anidada con enlazador y cebadores específicos del vector. C) Para nrLAM una secuencia de unión al ADNmc se liga directamente al extremo desconocido de la ssDNA preamplificada de A) que permite la amplificación exponencial mediante PCR anidada con enlazador y vector cebadores específicos. Esta cifra se ha modificado a partir de 2,12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. >
Figura 2. Los resultados representativos de LAM-PCR y nrLAM-PCR. Un B) Análisis, LAM-PCR de ADN aislado a partir de sangre periférica de los pacientes de terapia de genes tratados. El número de bandas en el gel se corresponde con el número de está presente en la muestra. Geles de alta resolución (B) son más adecuados para visualizar clonalidad de muestras analizadas de 2% de geles de agarosa (A). C) Análisis nrLAM-PCR del vector lentiviral clones de células individuales o células transducidas a granel. Independientemente del número de sitios de inserción amplificados una mancha se ve en el gel después de la electroforesis. M, escalera de 100 pb; MC, monoclonal; OC, oligoclonales; PC, policlonal. Esta cifra se ha modificado a partir de 2,9.
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Figura 3. Ejemplos representativos de ES análisis por LAM-PCR y posterior secuenciación de alto rendimiento. ES distribución en dos pacientes de gammaretroviral (azul) o lentiviral (verde) ensayos de terapia genética clínica. Después de que se pueden evaluar de secuenciación y mapeo de productos LAM-PCR para el genoma respectivo por ejemplo:.. Una) Genoma-amplia distribución de es b) Diferencia de acuerdo a la preferencia para la inserción en regiones codificantes de genes entre gammaretroviral y vectores lentivirales y C) preferencia por la inserción cerca de los sitios de inicio de transcripción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Propósito | Nombre | Secuencia (5'-3 ') |
| LK-universales | LC1 | GACCCGGGAGATCTGAATTCAGTGGCACAG CAGTTAGG |
| LK-AATT | LC2 (AATT) | AATTCCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCA GATC |
| LK-CG | LC2 (CG) | CGCCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCAGATC |
| LK-TA | LC2 (TA) | TACCTAACTGCTGTGCCACTGAAATCAGATC |
| LK-nrLAM-PCR | SSLC | (P) CCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCAGATC TCCCGGGTddC |
| Preamplificación | LTR-I (dirección 3 ') | (B) AGTAGTGTGTGCCCGTCTGT |
| LTR-I (dirección 5 ') | (B) TTAGCCAGAGAGCTCCCAGG | |
| Exponencial de amplificación I | LTR-II (dirección 3 ') | (B) GTGTGACTCTGGTAACTAGAG |
| LTR-II (dirección 5 ') | (B) GATCTGGTCTAACCAGAGAG | |
| LC-E | GACCCGGGAGATCTGAATTC | |
| Amplificación exponencial II | LTR-III (dirección 3 ') | GATCCCTCAGACCCTTTTAGTC |
| LTR-III (dirección 5 ') | CCCAGTACAAGCAAAAAGCAG | |
| LC-II | GATCTGAATTCAGTGGCACAG |
Tabla 1. Oligonucleótidos para LAM-y nrLAM-PCR para amplificar lentiviral IS. SSLC es fosforilados en el extremo 5 '(P) y tiene al 3' didesoxycytidin (ddC) para evitar la multimerización de la SSLC durante la ligadura. En general, (nr) cebadores LAM-PCR deben consistir de 18-25 nucleótidos y no deben alinear para el genoma del huésped. Los cebadores para la preamplificación se deben colocar tan cerca como sea posible (≤ 120 pb) en el extremo 5 'o 3' del vector. Dos cebadores adicionales para exponencial de PCR I y II deben ser colocados entre el cebadorutilizado para la preamplificación y el extremo del vector. Los cebadores para la preamplificación y exponencial PCR que necesitan ser 5'-fosforilado (P).
| Reactivo | Volumen (l) | Concentración | Parámetros de PCR | Temperatura | Tiempo | |
| H2O | 43 - x | La desnaturalización inicial | 95 ° C | 5 min | ||
| Buffer | 5 | 10 x | La desnaturalización | 95 ° C | 45 seg | |
| dNTP | 1 | 10 mM (LAM); 0,5 M (nrLAM) | Recocido | 60 ° C | 45 seg | 2 x 50 Ciclos |
| LTR-me | 0.5 | 0,17 M | Elongación | 72 ° C | 60 seg (LAM); 10 seg (nrLAM) | |
| TaqPolimerasa | 0.5 | 2,5 U / l | Elongación final | 72 ° C | 5 min (sólo LAM) |
Tabla 2. Las condiciones de PCR para la preamplificación de las uniones genoma del vector (paso 2). Columnas 1-3 muestran los reactivos de PCR utilizados para la amplificación de una sola muestra de ADN. Columnas 4-6 ejemplifican el programa de PCR para preamplificar uniones genoma del vector.
| Reactivo | Volumen (l) | Concentración | Parámetros de PCR | Temperatura | Tiempo | |
| H 2 O | 40.5 | La desnaturalización inicial | 95 ° C | 5 min | ||
| Buffer | 5 | 10 x | La desnaturalización | 95 ° C | 45 seg | |
| dNTP | 1 </ Td> | 10 mM | Recocido | 60 ° C | 45 seg | 35 Ciclos |
| LTR-II | 0.5 | 16,7 M | Elongación | 72 ° C | 60 seg (LAM); 5 seg (nrLAM) | |
| LC-E | 0.5 | 16,7 M | Elongación final | 72 ° C | 5 min (sólo LAM) | |
| Taq Polimerasa | 0.5 | 2,5 U / l |
Tabla 3. Las condiciones de PCR para la amplificación exponencial I (paso 6). Columnas 1-3 muestran los reactivos de PCR utilizados para la amplificación exponencial de una única muestra de ADN. Columnas 4-6 ejemplifican el programa de PCR se utiliza para amplificar exponencialmente una muestra después de la ligadura de la secuencia de engarce.
| Reactivo | Volume (l) | Concentración | Parámetros de PCR | Temperatura | Tiempo | |
| H 2 O | 40.5 | La desnaturalización inicial | 95 ° C | 5 min | ||
| Buffer | 5 | 10 x | La desnaturalización | 95 ° C | 45 seg | |
| dNTP | 1 | 10 mM | Recocido | 60 ° C | 45 seg | 35 Ciclos |
| LTR-III | 0.5 | 16,7 M | Elongación | 72 ° C | 60 seg (LAM); 5 seg (nrLAM) | |
| LC-II | 0.5 | 16,7 M | Elongación final | 72 ° C | 5 min | |
| Taq Polimerasa | 0.5 | 2,5 U / l |
Tabla 4. Las condiciones de PCR para la amplificación exponencial I (paso 8). Columnas 1-3 muestran los reactivos de PCR utilizados para la amplificación exponencial anidada de una sola muestra. Columnas 4-6 ejemplifican el programa de PCR utilizado para la amplificación exponencial anidada de genoma de vector de uniones de una muestra.
| Reactivo | Volumen (l) | Concentración | Parámetros de PCR | Temperatura | Tiempo | |
| H 2 O | 42.5 - x | La desnaturalización inicial | 95 ° C | 2 min | ||
| Buffer | 5 | 10 x | La desnaturalización | 95 ° C | 45 seg | |
| dNTP | 1 | 10 mM | Recocido | 58 ° C | 45 seg | 12 Ciclos |
| Fusionprimer A | 0.5 | 10 M | Elongación | 72 ° C | 60 seg | |
| Fusionprimer B | 0.5 | 10 M | Elongación final | 72 ° C | 5 min | |
| Taq Polimerasa | 0.5 | 2,5 U / l |
Tabla 5. PCR-Condiciones para Fusionprimer-PCR (paso 9.2). Columnas 1-3 muestran los reactivos de PCR utilizados para la introducción de los adaptadores de secuenciación a (nr) productos LAM-PCR. Columnas 4-6 ejemplifican el programa de PCR utilizado para Fusionprimer-PCR.
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Discussion
La técnica de LAM-PCR permite la identificación de secuencias de ADN desconocidas que flanquean una región de ADN conocida. Debido a la alta sensibilidad resultante de preamplificación de las uniones con cebadores específicos de hibridación en la secuencia de ADN conocida, es posible amplificar y detectar incluso uniones raras hasta el nivel de una sola célula. Contrariamente, en una situación policlonal LAM-PCR es capaz de amplificar miles de diferentes uniones en una sola reacción.
Sin embargo, debido a la utilización de enzimas de restricción sólo una subfracción de la integrome puede ser analizada por LAM-PCR para la presencia de uniones con cada enzima de restricción en particular. Por lo tanto, el análisis repetido de la misma muestra con diferentes enzimas se recomienda 9. Si no hay amplicones LAM-PCR están presentes en el gel, más probable es que la distancia entre la ubicación del fragmento de ADN conocido y el sitio de reconocimiento más cercano de la enzima de restricción elegido es demasiado grande como para dar lugar a productos de LAM-PCR9. En este caso otras enzimas deben ser utilizados para amplificar la unión.
nrLAM es independiente de la utilización de enzimas de restricción y por lo tanto representa un método muy valiosa para caracterizar exhaustivamente secuencias que flanquean una secuencia de ADN conocida. La omisión de digestión de restricción a partir de los resultados de protocolo en la pérdida de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción específico que caracteriza cada unión amplificado. En lugar cada cruce amplificada está representado por productos de PCR de diferentes tamaños resultantes en una mancha en el gel después de la electroforesis, independiente de la diversidad de uniones amplificados.
Ambos productos LAM-y nrLAM-PCR son perfectamente adecuados para abajo secuenciación de alto rendimiento. Secuenciación de alto rendimiento de (nr) productos LAM-PCR y mapeo de secuencias en bruto recuperados a la correspondiente genoma permite caracterizar desconocido flanquea el ADN o la identificación de la localización exacta de los cruces vector del genoma 30.Mediante la introducción de secuencias de código de barras en los fusionprimers varios cientos de productos de LAM-y nrLAM-PCR se pueden secuenciar en una carrera de secuenciación 30.
Debido a la alta sensibilidad, LAM-PCR es propenso a la contaminación si se ejecuta sin atención. Por lo tanto, un medio ambiente de calidad para PCR y especial atención a limpiar el manejo del protocolo es de suma importancia para amplificar con éxito a lo desconocido que flanquean el ADN sin contaminar las muestras. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente que incluye ADN genómico no transducidas y un control de agua para cada reacción de PCR como controles negativos en el protocolo LAM-PCR. Si las muestras de control indican que la contaminación cruzada se produjo durante el protocolo, los productos de cada punto de pausa se pueden utilizar para repetir partes del protocolo. Cuando las bandas están todavía presentes, se recomienda para descartar todos los reactivos (por ej., Primers, dNTPs, polimerasas, etc) y repetir el (nr) Protocolo de LAM-PCR con nuevas alícuotas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq DNA Polymerase | Genaxxon Bioscience GmbH | M3001.5000 | Alternative Taq Polymerases may be used |
| PCR Buffer | Qiagen | 201203 | Use of this buffer is recommended |
| dNTP-Mixture | Genaxxon Bioscience GmbH | M3015.4020 | or any other dNTPs |
| Oligonucleotides (Primers) | MWG Biotech | HPLC purified | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11206D | |
| PBS | Gibco | 14190-086 | 0.1% wt/vol BSA |
| 6 M LiCl | Roth | 3739.1 | 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA |
| Tris-HCl, pH 7.5 | USB Corporation | 22637 | or any other supplier |
| EDTA | Applichem | A1103,0250 | or any other supplier |
| Klenow Polymerase | Roche Diagnostics | 10104523001 | |
| Hexanucleotide mixture | Roche Diagnostics | 11277081001 | |
| Restriction endonuclease | NEB | or any other supplier | |
| Fast-Link DNA ligation kit | Epicentre Biotechnologies | LK11025 | |
| CircLigase ssDNA Ligase Kit | Epicentre Biotechnologies | CL4111K | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | or any other supplier |
| Agarose LE | Roche Diagnostics | 11685660001 | or any other supplier |
| TBE buffer | Amresco | 0658 | or any other supplier |
| Ethidium bromide | Applichem | A2273,0005 | Ethidium bromide is mutagenic |
| 100 bp DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | or any other DNA ladder |
| 20 mM NaCl | Sigma-Aldrich | 71393-1L | or any other supplier |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158501 | for use with 1.5 ml Tubes |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158696 | for use with 96-well plates |
| Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membrane | Millipore | UFC503096 | |
| PerfectBlue Gelsystem Midi S | PeqLab | 40-1515 | or other electrophoresis system |
| TProfessional 96 | Biometra | 050-551 | or other Thermocycler for 96-well plates |
| Orbital shaker KS 260 basic | IKA | 2980200 | or other horizontal shaker |
| PCR softtubes 0.2 ml | Biozym Scientific GmbH | 711082 | or other 0.2 ml PCR tubes |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 12682 | or other 1.5 ml tubes |
| Gel documentation system | PeqLab | or any other gel documentation system | |
| Nanodrop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Spreadex EL1200 precast gel | Elchrom Scientific | 3497 | |
| Submerged gel electrophoresis apparatus SEA 2000 | Elchrom Scientific | 2001E | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA |
References
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