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Biology

Ratiometric bimolecular संकेतकों का उपयोग जीवित कोशिकाओं में एकल इंजीनियर शाही सेना टेप के वास्तविक समय इमेजिंग

Published: August 6, 2014 doi: 10.3791/51544
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1
1Department of Bioengineering, University of Pennsylvania, 2Integrated DNA Technologies, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

Ratiometric bimolecular बीकन (RBMBs) जीवित कोशिकाओं में छवि एक इंजीनियर शाही सेना टेप करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ, हम RBMBs, microporation और वास्तविक समय में एक शाही सेना टेप के फ्लोरोसेंट इमेजिंग द्वारा कोशिकाओं में RBMBs के वितरण की तैयारी और शुद्धि का वर्णन.

Abstract

दोनों जीन अभिव्यक्ति के अस्थायी और स्थानिक विनियमन सेल समारोह पर महत्वपूर्ण परिणाम हो सकते हैं कि बढ़ अहसास ही जीवित कोशिकाओं में व्यक्तिगत शाही सेना टेप कल्पना करने के लिए विभिन्न तकनीकों का विकास करने के लिए प्रेरित किया है. हाल ही में वर्णित किया गया है कि एक होनहार तकनीक 3'-untranslated क्षेत्र में RBMB लक्ष्य अनुक्रम के कम से कम चार मिलकर दोहराता शामिल करने के लिए इंजीनियर थे कि शाही सेना टेप का पता लगाने के लिए एक oligonucleotide आधारित ऑप्टिकल जांच, ratiometric bimolecular बीकन (RBMB), का इस्तेमाल करता. RBMBs विशेष रूप से पूरक शाही सेना को संकरण पर एक उज्ज्वल फ्लोरोसेंट संकेत फेंकना तैयार कर रहे हैं, लेकिन अन्यथा बुझती रहते हैं. इस दृष्टिकोण में एक कृत्रिम जांच के उपयोग के लाल स्थानांतरित, photostable की अनुमति देता है, और अत्यधिक छोड़नेवाला कार्बनिक रंजक इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. एक व्यापक क्षेत्र फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जब असतत प्रतिदीप्ति स्थानों में इंजीनियर शाही सेना टेप परिणामों के लिए कई RBMBs के बंधन. नतीजतन, व्यक्तिगत शाही सेना टेप की आवाजाही आसानी से फ्लोरोसेंट छवियों का एक समय श्रृंखला लेने से वास्तविक समय में देखे जा सकते हैं. यहाँ हम microporation द्वारा कोशिकाओं में तैयारी और शुद्धि RBMBs की, वितरण का वर्णन है और लाइव सेल एकल शाही सेना टेप की इमेजिंग.

Introduction

शाही सेना टेप की अभिव्यक्ति और विनियमन सेल व्यवहार और भाग्य को नियंत्रित करने के लिए काफी हद तक जिम्मेदार है कि एक जटिल और गतिशील प्रक्रिया है. हुक्म सेल समारोह में शाही सेना के महत्व को कुछ समय के लिए जाना जाता रहा है, हालांकि, यह दो सबसे शाही सेना विश्लेषण उपकरणों ऐसे प्रतिलेखन फोड़ के रूप में महत्वपूर्ण विनियामक घटनाओं पर कब्जा करने के लिए आवश्यक स्थानिक और लौकिक संकल्प की कमी के बाद से, शाही सेना के बीच स्पष्ट कनेक्शन आकर्षित करने के लिए अक्सर मुश्किल होता है तस्करी, और स्थानीय शाही सेना प्रसंस्करण. इस व्यक्ति ने शाही सेना टेप वास्तविक समय 1 में जीवित कोशिकाओं में देखे जा करने की अनुमति है कि कई तकनीकों के आगमन के लिए प्रेरित किया है. शायद, इन तकनीकों के सबसे प्रमुख 3'-UTR 2,3 में MS2 बाध्यकारी साइट का मिलकर दोहराता शामिल करने के लिए इंजीनियर किया गया है कि शाही सेना को लक्षित करने के लिए एक GFP-MS2 संलयन प्रोटीन का इस्तेमाल करता. करीब निकटता में कई GFP अणुओं लाकर, व्यक्तिगत शाही सेना टेप के रूप में उज्ज्वल फ्लोरोसेंट धब्बे दिखाई देते हैंप्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से. GFP-MS2 प्रणाली प्रत्यक्ष दृश्य और ट्रांसक्रिप्शनल की माप 4,5 फोड़, अद्वितीय उप सेलुलर स्थानीयकरण और प्रसंस्करण 6-9 का पता लगाने, और शाही सेना परिवहन 10 की वास्तविक समय इमेजिंग सहित शाही सेना व्यवहार में अभूतपूर्व अंतर्दृष्टि, प्रदान की गई है. हालांकि, GFP-MS2 प्रणाली की जबरदस्त क्षमता के बावजूद, अबाध GFP-MS2 संलयन प्रोटीन इस तकनीक की बहुमुखी प्रतिभा और गतिशील रेंज की सीमा है कि एक उच्च पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट संकेत बना सकते हैं. कई दृष्टिकोण subcellular अपार GFP-MS2 10 की compartmentalization, प्रोटीन टुकड़ा complementation 11, और वैकल्पिक शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन सहित, इस पृष्ठभूमि संकेत सीमित करने के लिए विकसित की है और 12 को लक्षित करता किया गया है. हालांकि, इन तरीकों के सभी शाही सेना लक्ष्य और GFP MS2 संलयन प्रोटीन के रिश्तेदार और कुल अभिव्यक्ति के प्रति संवेदनशील रहते हैं.

एक एक के रूप मेंGFP-MS2 प्रणाली को lternative, आणविक बीकन भी 3'-UTR 13,14 में पूरक बाध्यकारी साइट का मिलकर दोहराता इंजीनियर के साथ शाही सेना टेप का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. आणविक बीकन एक पेय के साथ एक छोर पर और एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के साथ दूसरे छोर पर चिह्नित कर रहे हैं कि बाल के लिये कांटा बनाने oligonucleotide जांच कर रहे हैं. पेय आरएनए फ्लोरोसेंट संवाददाता लक्ष्य और करने के लिए बाध्य नहीं है जब एक कम फ्लोरोसेंट राज्य में जिसके परिणामस्वरूप, पास में रहते हैं. संकरण करने पर, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर और पेय के अलावा मजबूर कर रहे हैं और प्रतिदीप्ति बहाल है. GFP-MS2 प्रणाली, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा पहचाना जा सकता है कि एक उज्ज्वल फ्लोरोसेंट स्थान में एक भी शाही सेना प्रतिलेख परिणामों पर कई आणविक बीकन के बंधन के लिए इसी प्रकार; हालांकि, पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कारण अपार आणविक बीकन की बुझती विन्यास के लिए, बहुत कम होने की उम्मीद है. दुर्भाग्य से, चालाक सक्रियण तंत्र के बावजूद कि मीटर में शामिल किया हैolecular बीकन डिजाइन, जीवित कोशिकाओं में पेश किया है जब बाल के लिये कांटा रचना में नहीं रहते हैं आणविक बीकन unhybridized कि बढ़ती सबूत मौजूद है. नतीजतन, वे काफी संकेत करने वाली पृष्ठभूमि कम कर देता है एक झूठी सकारात्मक संकेत उत्पन्न करते हैं. 15,16, इस कमी को दूर करने के लिए, हमने हाल ही में जीवित कोशिकाओं, ratiometric bimolecular बीकन (चित्रा 1 ए RBMBs) में इमेजिंग शाही सेना के लिए एक नया सिंथेटिक जांच विकसित की है. RBMBs कम बाल के लिये कांटा शाही सेना (shRNA) और आणविक बीकन दोनों से सुविधाओं के साथ एक संकर संरचना है कि फार्म दो 2'-O-मिथाइल oligonucleotide किस्में से बना रहे हैं. एक 3'-UU की अधिकता के साथ लंबे समय तक डबल असहाय डोमेन shRNA की विशेषता है, जबकि पाश और प्रतिदीप्ति सक्रियण तंत्र, आणविक बीकन के समान है. shRNA सुविधाओं न्यूनतम नमूदार गिरावट के साथ हम> 24 घंटा तक बढ़ जाती है intracellular जीवन भर पाया है जो परमाणु निर्यात,, ड्राइव करने के लिए तैयार है, और कर रहे हैंपाश की गैर विशिष्ट उद्घाटन रोकता है. एक परिणाम RBMBs आणविक बीकन से एक काफी उच्च संकेत करने वाली पृष्ठभूमि प्रदर्शन के रूप में.

RBMBs आरएनए आधारित जांच के रूप में ही परमाणु निर्यात क्षमताओं के पास नहीं है डीएनए आधारित जांच के बाद, डीएनए oligonucleotides उपयोग कर तैयार नहीं किया जा सकता कि यह ध्यान दिया जाना चाहिए. Structurally, RBMB पाश आमतौर पर शाही सेना संकरण पर विशिष्टता और चयनात्मकता के बीच एक संतुलन बनाने के लिए, लंबे समय 15 और 21 ठिकानों के बीच बनाया गया है. दो स्वयं पूरक डोमेन से रूपों कि कम स्टेम आमतौर पर 4 ठिकानों होने के लिए बनाया गया है. एक लंबे समय तक स्टेम चुना जाता है, RBMB पाश और लक्ष्य शाही सेना के बीच संकरण की दर काफी 17,18 धीमा है. एक छोटी स्टेम अनुक्रम चुना जाता है जब इसके विपरीत, पिघलने तापमान एक उच्च पृष्ठभूमि संकेत करने के लिए अग्रणी, 37 डिग्री सेल्सियस पर स्टेम पाश संरचना को बनाए रखने के लिए अक्सर बहुत कम है. RBMB की विशिष्टता भी लाल हैस्टेम लंबाई छोटा है के रूप में uced. भी RBMB प्रदर्शन को प्रभावित कर सकते RBMB स्टेम पाश के अनुक्रम के बाद से, यह सावधानी से 19 का चयन किया जाना चाहिए. विशेष रूप से, आदर्श पाश दृश्यों, कम से कम माध्यमिक संरचना होनी चाहिए कम से कम माध्यमिक संरचना के साथ शाही सेना दृश्यों को संकरण, प्रोटीन बाध्यकारी साइटों से बचने, और बाध्यकारी बंद लक्ष्य से बचें. RBMB और शाही सेना माध्यमिक संरचना दोनों की भविष्यवाणियों ऐसे mfold 20 के रूप में सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है. पूरक बंद लक्ष्य साइटों एक न्यूक्लियोटाइड बेसिक स्थानीय असाइनमेंट खोज उपकरण (ब्लास्ट) का उपयोग पहचान कर सकते हैं. हालांकि, क्योंकि मॉडल भविष्यवाणियों और प्रोटीन नीलामी साइटों की पहचान करने में कठिनाई में विसंगतियों की, सभी RBMBs की विशिष्टता अंततः प्रयोगात्मक सत्यापित किया जाना चाहिए.

वांछनीय है, संकरण राज्य के प्रति असंवेदनशील है कि एक unquenched संदर्भ डाई RBMB 15 में जोड़ा जा सकता है. एक संदर्भ डाई के अलावा जनसंपर्क कर सकते हैंजांच वितरण के लिए एक मार्कर ovide और कुल सेलुलर प्रतिदीप्ति की अधिक सटीक मापन के लिए आवश्यक हैं, तो ratiometric इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. संदर्भ रंगों माप वितरण में सेल करने वाली सेल विविधताओं के कारण पृष्ठभूमि में अंतर के लिए समायोजित करने की अनुमति देता है. हालांकि, व्यक्तिगत शाही सेना इमेजिंग जब संदर्भ डाई आवश्यक नहीं है देखिए. विशेष रूप से, कुछ संदर्भ रंगों नाभिक में एक से थोड़ा अधिक पृष्ठभूमि संकेत करने के लिए अग्रणी, नाभिक से RBMBs के निर्यात के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं.

अच्छी तरह से डिजाइन जब लक्ष्य शाही सेना में कम से कम चार RBMB बाध्यकारी साइटों (चित्रा 1 बी) 16 शामिल करने के लिए इंजीनियर है, तो RBMBs, एकल जीवित कोशिकाओं में छवि व्यक्तिगत शाही सेना टेप करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. RBMBs कुशलतापूर्वक सेल व्यवहार्यता 21 पर कोई प्रभाव नहीं करने के लिए थोड़ा के साथ, microporation के माध्यम से कोशिकाओं प्रकार की एक विस्तृत श्रृंखला में दिया जा सकता है, और जीन अभिव्यक्ति की मात्रात्मक माप किया जा सकता है30 मिनट के भीतर हासिल कर ली. अपार RBMBs से प्रतिदीप्ति कुशलता से बुझती है, क्योंकि इसके अलावा, कार्यप्रणाली, RBMB एकाग्रता और लक्ष्य शाही सेना के स्तर को काफी असंवेदनशील है. यहाँ हम RBMBs तैयार करने और शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया पद्धति का विस्तृत वर्णन है, साथ ही microporation के माध्यम से जीवित कोशिकाओं में RBMBs के वितरण के लिए एक सामान्य प्रक्रिया है और वास्तविक समय में एक शाही सेना टेप के इमेजिंग प्रदान करते हैं.

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में, एक oligonucleotide (RBMB1) एक CF640R रिपोर्टर डाई के साथ अपनी 5'-अंत में चिह्नित किया गया और अनुक्रम है: 5'- mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC mAmAmA mCmAmC mAmAmC mUmCmC म्यू mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC Mumu -3 '. बाल के लिये कांटा संरचना के गठन ड्राइव जो स्व पूरक डोमेन, बोल्ड में हैं. दूसरा oligonucleotide (RBMB2) एक आयोवा काला RQ-SP पेय के साथ 3'-अंत में लेबल और अनुक्रम किया गया था: 5'-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC -3 '.

RBMBs 1. तैयारी

  1. RBMB1 और RBMB2 oligonucleotides युक्त ट्यूब की एक त्वरित स्पिन प्रदर्शन करना, सूखे oligonucleotide 100 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए DNase और RNase मुक्त पानी में ट्यूब के नीचे, और resuspend पर सुनिश्चित करने के लिए. उदाहरण के लिए, oligonucleotide के 10 nmole नमूना पानी के 100 μl में resuspended किया जाना चाहिए.
  2. Measure यूवी तुलना स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा RBMB1 और RBMB2 शेयर नमूनों की सटीक एकाग्रता.
    1. एक microcentrifuge ट्यूब में (कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना) 117 μl DPBS के साथ RBMB नमूना के 3 μl मिलाएं.
    2. DPBS के साथ खाली स्पेक्ट्रोफोटोमीटर और 200-800 एनएम से absorbance के उपाय. नोट: पीक 260 एनएम absorbances और 650 एनएम दिखाई जानी चाहिए.
    3. समीकरण का उपयोग, 260 एनएम (या RBMB1 के लिए 650 एनएम) पर absorbance के आधार पर RBMB नमूने के शेयर एकाग्रता की गणना:
      शेयर एकाग्रता (एम) एक 260 260 एनएम पर absorbance और कमजोर पड़ने कारक 40 है जहां एक 260 * कमजोर पड़ने कारक / विलुप्त होने गुणांक =.
      नोट: RBMB के लिए विलुप्त होने गुणांक oligonucleotide निर्माता द्वारा प्रदान की विनिर्देश शीट पर पाया जा सकता है. 650 एनएम पर CF640R के विलुप्त होने के गुणांक 103,000 है.
  3. 100 माइक्रोन RBMB1 के 20 μl, 100 माइक्रोन RBMB2 के 30 μl, मिक्स 6 μl 10x; फॉस्फेट बफर (10x फॉस्फेट बफर: 480 मिमी कश्मीर 2 4 HPO, 45 मिमी 2 के.एच. पीओ 4, 140 मिमी नाह 2 4 पीओ, पीएच 7.2) और 4 μl DNase और RNase मुक्त पानी. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण सेते हैं. नोट: यह आमतौर पर लगभग 50 पढ़ाई के लिए पर्याप्त है.
  4. किसी भी unhybridized RBMB2 oligonucleotides दूर करने के लिए 75 प्रस्तुत ग्रेड Superdex का उपयोग कर एक तरल क्रोमैटोग्राफी स्तंभ तैयार करें. मिश्रित जांच की छोटी मात्रा को शुद्ध करने के लिए एक ~ 4 मिलीलीटर बिस्तर मात्रा के साथ एक 8 एमएल (0.7 x 20 सेमी) तरल क्रोमैटोग्राफी स्तंभ का प्रयोग करें.
  5. धो 0.6 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर एक प्रवाह में चल रहे एक सिरिंज पंप का उपयोग कर ~ साथ 1x फॉस्फेट बफर के 50 मिलीलीटर Superdex संतुलित करना और. तरल पदार्थ के सभी बिस्तर मात्रा में प्रवेश करती है इससे पहले, सिरिंज पंप बंद करो यह अलग है, और शेष तरल गंभीरता से स्तंभ के माध्यम से चलते हैं.
  6. क्रोमैटोग्राफी स्तंभ पर RBMB मिश्रण (60 μl) लोड.
    1. RBMB नमूना पूरी तरह से जाने के बादबिस्तर में प्रवेश किया, धीरे धीरे पूरे नमूना पूरी तरह से कॉलम में प्रवेश किया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए बिस्तर के ऊपर से 1x फॉस्फेट बफर का एक और 250 μl जोड़ें.
    2. 1x फॉस्फेट बफर के साथ रिम के लिए स्तंभ भरें. शीर्ष बंद करें, और सिरिंज पंप शुरू - सिरिंज से भरा जाना चाहिए ~ 50 मिलीलीटर पीबीएस 1x और 0.6 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर चलाते हैं.
    3. RBMB स्तंभ के नीचे nears बार - RBMB नमूना आम तौर पर आसानी से जांच में शामिल डाई के रंग की वजह से देखे जा सकते हैं - microcentrifuge ट्यूब प्रति 2 बूँदें (1.5 मिलीलीटर) में प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा. Microcentrifuge ट्यूबों के भीतर रंग साफ हो जाता है एक बार नमूना एकत्रित करना बंद करो.
  7. आम तौर पर 5-6 ट्यूब - - रंग RBMB नमूना युक्त ट्यूबों का मिश्रण है और एक केन्द्रापसारक फिल्टर डिवाइस (10,000 मेगावाट कटऑफ) में लोड. 20 मिनट के लिए या वांछित मात्रा तक 10,000 आरसीएफ में नमूना अपकेंद्रित्र. नोट: ये गति और समय होगा, सामान्यतया~ 30 μl के अंतिम मात्रा उपज.
  8. यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा शुद्ध RBMB नमूना की सटीक एकाग्रता उपाय.
    1. केंद्रित RBMB नमूना के 3 μl ले लो और एक microcentrifuge ट्यूब में 117 μl DPBS के साथ मिश्रण.
    2. DPBS के साथ खाली स्पेक्ट्रोफोटोमीटर और 200-800 एनएम से absorbance के उपाय. नोट: पीक 260 एनएम absorbances और 650 एनएम दिखाई जानी चाहिए.
    3. समीकरण का उपयोग, 650 एनएम पर absorbance के आधार पर संकरित RBMB के शेयर एकाग्रता की गणना:
      शेयर एकाग्रता (एम) एक 650 650 एनएम पर absorbance है जहां एक 650 * कमजोर पड़ने कारक / विलुप्त गुणांक =, कमजोर पड़ने कारक 40 है.
      नोट: 650nm पर CF640R के लिए विलुप्त होने गुणांक 103,000 है और आयोवा काला RQ के लिए विलुप्त होने के गुणांक है ~ 20,000. विलुप्त होने के गुणांक additive हैं और संकरण के प्रति संवेदनशील नहीं हैं. इसलिए, शेयर RBMB नमूना approximatel की एक संयुक्त विलुप्त होने गुणांक है650 एनएम पर वाई 123,000.
  9. भविष्य में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर नाम और एकाग्रता और दुकान के साथ उचित ट्यूब लेबल.

8 अच्छी तरह से संभाग coverglass लेपित पाली-D-लाइसिन की 2. तैयारी

  1. एक बाँझ वातावरण में निष्फल पानी की 25 मिलीलीटर में पाली डी lysine (lyophilized पाउडर, जी विकिरणित) की 5 मिलीग्राम भंग करके पाली डी lysine की एक 0.2 मिलीग्राम / एमएल समाधान तैयार है.
  2. एक बाँझ वातावरण में, एक 8 अच्छी तरह से संभाग coverglass के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 0.2 मिलीग्राम / एमएल पाली डी lysine समाधान के 200 μl जोड़ें.
  3. सेल संस्कृति हुड में 16-18 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  4. पाली डी lysine Aspirate और बाँझ आसुत जल के साथ अच्छी तरह से 3 बार धोएं. नोट: लेपित चैम्बर स्लाइड 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.

3 जांच डिलिवरी

नोट: कम से कम 4-अनुक्रमिक बाँध के साथ शाही सेना व्यक्त कि एक एकीकृत जीन का निर्माण शामिल करना चाहिए इस्तेमाल किया सेल प्रणाली3'-untranslated क्षेत्र (UTR) में RBMB के लिए साइटों आईएनजी. लक्ष्य दृश्यों RBMB की पाश के लिए पूरक होना चाहिए. यह एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, एक ही सेल लाइन एक ही जीन का निर्माण व्यक्त करने के लिए इंजीनियर किया कि सलाह दी, लेकिन मिलकर दोहराता बिना है. इस प्रोटोकॉल में, एक मानव fibrosarcoma सेल लाइन, HT1080, 3'-UTR में RBMB लक्ष्य अनुक्रम के 96 संगठनों ने मिलकर दोहराता साथ GFP आरएनए व्यक्त करने के लिए इंजीनियर था. नियंत्रण सेल लाइन जंगली प्रकार GFP आरएनए व्यक्त करने के लिए इंजीनियर था.

  1. एक दिन की जांच के वितरण से पहले 40-50% confluency पर एक T25 फ्लास्क में प्लेट कोशिकाओं. संस्कृति 1% कलम / strep और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक DMEM मीडिया के साथ कोशिकाओं, और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  2. अगले दिन, microporator पर बारी और 950 वी, 2 दालों, 25 मिसे के लिए microporation मापदंडों की स्थापना की. इन मानकों HT1080 कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन वे निर्भर सेल प्रकार हैं और adjus हो सकता है: नोटटेड अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए निर्माता के निर्देशों में वर्णित है.
  3. 4 मिलीलीटर electrolytic बफर साथ microporation ट्यूब भरें और microporation स्टेशन पर जगह है.
  4. शुद्ध RBMB का जायजा नमूना बाहर ले लो और यह defrost. 1x फॉस्फेट बफर के साथ 12 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए कई microliters पतला. 1 μl प्रत्येक microporation के लिए आवश्यक है.
  5. पिपेट FBS के साथ, लेकिन एक microcentrifuge ट्यूब में एंटीबायोटिक दवाओं के बिना संस्कृति के माध्यम से 1 मिलीलीटर. नोट: यह कुछ समय के लिए, microporation डिवाइस के पास, microporation के बाद तुरंत कोशिकाओं को निलंबित करने के लिए उपयोग किया जाएगा और अलग सेट किया जा सकता है. संस्कृति मीडिया में एंटीबायोटिक दवाओं का समावेश microporation के बाद सेल व्यवहार्यता में कमी होगी.
  6. एक बार 1 मिलीलीटर Ca 2 और 2 मिलीग्राम + मुक्त DPBS के साथ कोशिकाओं को धोने, इंजीनियर HT1080 कोशिकाओं (60-80% मिला हुआ) से सेल संस्कृति मीडिया निकालें, और 1-2 मिनट के लिए 1 मिलीलीटर trypsin के साथ सेते हैं.
  7. Trypsinizatio बंद करोएंटीबायोटिक दवाओं और फिनोल लाल के बिना 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक 1 मिलीलीटर DMEM मीडिया, उनका कहना है, और दो 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में कोशिकाओं हस्तांतरण द्वारा एन.
  8. 5 मिनट के लिए 200 XG पर microcentrifuge ट्यूब में कोशिकाओं स्पिन. सतह पर तैरनेवाला, resuspend निकालें और 1 मिलीलीटर DPBS के अंतिम मात्रा में सेल छर्रों गठबंधन.
  9. अच्छी तरह से मिश्रित सेल निलंबन से 10 μl ले लो और कोशिकाओं गिनती.
  10. यकीन है कि वे अच्छी तरह बिखरे हैं बनाने के लिए और एक नया 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में DPBS के साथ 300,000 कोशिकाओं को हस्तांतरण और 5 मिनट के लिए 200 XG पर नीचे स्पिन करने के लिए ऊपर और नीचे कई बार कोशिकाओं पिपेट.
  11. सेल गोली परेशान नहीं सावधान किया जा रहा है, सतह पर तैरनेवाला निकालें. कोशिकाओं अच्छी तरह बिखरे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए 11 μl मेजबान बफर और विंदुक ऊपर और नीचे कई बार में गोली Resuspend. किसी भी हवाई बुलबुले उत्पन्न करने के लिए नहीं भूलें. नोट: एयर बुलबुले microporation दौरान एक चिंगारी के कारण और गरीब RBMB वितरण और कोशिका मृत्यु में परिणाम होगा.
  12. पतला RBMB (12 माइक्रोन) की 1 μl जोड़ें और ऊपर pipetting द्वारा और कई बार नीचे अच्छी तरह से मिश्रण. फिर किसी भी हवाई बुलबुले उत्पन्न करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा.
  13. महाप्राण RBMB सेल मिश्रण की 10 μl, microporation पिपेट का उपयोग, और microporation ट्यूब में पिपेट डालें. Microporation शुरू करने के लिए प्रारंभ बटन पुश. नोट: टिप में नहीं दिखाई हवाई बुलबुले होना चाहिए.
  14. Microporator की स्क्रीन पूरा होने से पता चलता है जब, FBS के साथ लेकिन एंटीबायोटिक दवाओं के बिना 1 मिलीलीटर संस्कृति के माध्यम से, पहले तैयार किया गया था कि microcentrifuge ट्यूब में 10 μl मिश्रण निष्कासित, स्टेशन से पिपेट हटा दें. ट्यूब की ओर से पक्ष कई बार कमाल से धीरे मिलाएं.
  15. 5 मिनट के लिए 200 XG पर कोशिकाओं स्पिन और कोशिकाओं में वितरित नहीं किया गया है कि किसी भी RBMBs दूर करने के लिए, FBS के साथ लेकिन एंटीबायोटिक दवाओं के बिना 1 मिलीलीटर फिनोल लाल मुक्त मध्यम संस्कृति में कोशिकाओं दो बार धो लें. FBS के साथ लेकिन बिना 400 μl फिनोल लाल मुक्त संस्कृति के माध्यम से Resuspendएंटीबायोटिक दवाओं.
  16. प्लेट अच्छी तरह से प्रति या वांछित confluency पर 200 μl में 8 अच्छी तरह से संभाग coverglass लेपित पाली डी lysine में microporated कोशिकाओं.
  17. वैकल्पिक: यह नाभिक छवि के लिए वांछनीय है, 0.01 मिलीग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता में कोशिकाओं को Hoescht 33342 जोड़ें.
  18. एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में संभाग coverglass रखें. कोशिकाओं coverglass सतह पर बसने के लिए पर्याप्त समय है, इसलिए है कि इमेजिंग के लिए पहले 1-2 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं. नोट: इमेजिंग 30 मिनट के बाद microporation जैसे ही किया जा सकता है.

4 छवि अधिग्रहण

  1. लाइव सेल चरण शीर्ष ऊष्मायन प्रणाली पर बारी और यह 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, और 75% आर्द्रता पहुंचता है जब तक यह संतुलित करना.
  2. माइक्रोस्कोप और फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत पर बारी और Metamorph सॉफ्टवेयर खोलें. नोट: माइक्रोस्कोप नियंत्रण और छवि अधिग्रहण के लिए अन्य इसी तरह के सॉफ्टवेयर पैकेज भी इस्तेमाल किया जा सकता है.
  3. को Immersol तेल लागू करेंउद्देश्य.
  4. लाइव सेल चरण शीर्ष ऊष्मायन प्रणाली को microporated कोशिकाओं के साथ संभाग coverglass स्थानांतरण. तापमान तक चरण शीर्ष प्रणाली सेते हैं और सीओ 2 का स्तर स्थिर हो रहे हैं.
  5. Metamorph सॉफ्टवेयर में अधिग्रहण टैब खोलें. , क्षेत्र खोजने के लिए शो लाइव बटन पर क्लिक करें सफेद रोशनी के नीचे ध्यान समायोजित और बंद करो लाइव बटन पर क्लिक करें.
  6. मोल टैब के अंतर्गत, क्लिक करें और धारा अधिग्रहण पॉप अप बटन खोलने, और वांछित फिल्म अधिग्रहण मापदंडों की स्थापना की. Cy5 / CF640R फिल्टर का उपयोग कर 150 फ्रेम मोल और हार्ड ड्राइव करने के लिए छवियों को बचाने.

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Representative Results

व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2) ने उतारी जब फौरन RBMBs की उपस्थिति में HT1080 कोशिकाओं के microporation निम्नलिखित, इंजीनियर थे कि व्यक्ति आरएनए देखिए अपने 3'-UTR में कई RBMB बाध्यकारी साइटों को शामिल करने के रूप में उज्ज्वल फ्लोरोसेंट धब्बे दिखाई देते हैं. के रूप में कुछ के रूप में चार RBMB बाध्यकारी साइटों के साथ व्यक्तिगत शाही सेना टेप रहते कोशिकाओं में imaged किया जा सकता है, 3'-UTR में बाध्यकारी साइटों अधिक RBMB, मजबूत फ्लोरोसेंट संकेत. संकेत की वजह से photobleaching के लिए खो दिया है से पहले इसके अलावा, अब प्रत्येक प्रतिलिपि करने के लिए बाध्य कर रहे हैं कि अधिक RBMBs आरएनए देखे जा सकते हैं. इस प्रोटोकॉल में, आरएनए 3'-UTR में RBMB लक्ष्य अनुक्रम के 96 संगठनों ने मिलकर दोहराता शामिल करने के लिए इंजीनियर था. स्ट्रीमिंग छवियों का अधिग्रहण व्यक्तिगत शाही सेना टेप वास्तविक समय (मूवी 1) में imaged किया जा अनुमति देता है. व्यक्तिगत शाही सेना टेप आसानी से कोशिका द्रव्य और नाभिक ओ के भीतर चल देखा जा सकता हैकोशिकाओं च. स्पॉट की सबसे दुर्लभ मामलों में, ब्राउनियन या उप वाचाल आंदोलनों से गुजरना प्रकट करते हुए निर्देशित परिवहन के दौर से गुजर एक आरएनए (मूवी 2) मनाया जाएगा. शाही सेना टेप आम तौर पर एक सीधे पथ (चित्रा 3) के साथ तेजी से स्थानांतरित शोध करे; हालांकि, कुछ आरएनए घुमावदार रास्तों का अनुसरण करें या दिशा में अचानक परिवर्तन कैसे कर सकता हूँ. इन आंदोलनों प्रकृति में यादृच्छिक हैं और यहां का अधिग्रहण कम समय फ्रेम (यानी <1 मिनट) के भीतर छोटे समग्र विस्थापन प्रदर्शन जो ब्राउनियन आंदोलनों, के लिए इसके विपरीत में हैं. निर्देशित आरएनए आंदोलनों सूक्ष्मनलिकाएं और microfilaments साथ शाही सेना के परिवहन के साथ संगत कर रहे हैं. इन प्रयोगों RBMBs जीवित कोशिकाओं में व्यक्तिगत शाही सेना टेप इमेजिंग के लिए एक बहुमुखी और मजबूत उपकरण प्रदान कि संकेत मिलता है.

चित्रा 1
चित्रा1 RBMBs के योजनाबद्ध और जीवित कोशिकाओं. ए) पूरक लक्ष्य शाही सेना की उपस्थिति और अनुपस्थिति में RBMBs में कार्यप्रणाली इस्तेमाल किया छवि व्यक्तिगत शाही सेना देखिए. अभाव या लक्ष्य शाही सेना में, RBMB प्रतिदीप्ति बुझती है. लक्ष्य शाही सेना की उपस्थिति में, RBMB प्रतिदीप्ति बहाल है. बी) एकाधिक RBMBs व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी से पता लगाया जा सकता है कि एक उज्ज्वल फ्लोरोसेंट जगह बनाने के प्रत्येक शाही सेना प्रतिलेख बाँध. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
Stably एक साथ शाही सेना व्यक्त HT1080 कोशिकाओं) 96 संगठनों ने मिलकर दोहराता या RBMB बाध्यकारी साइट की बी) 4-मिलकर दोहराता में चित्रा 2 प्रतिनिधि छवि3'-UTR, RBMBs के intracellular प्रसव के बाद. 96 संगठनों ने मिलकर दोहराता की उपस्थिति व्यक्तिगत शाही सेना टेप उज्ज्वल फ्लोरोसेंट धब्बे के रूप में दिखाई देता है. केवल 4-मिलकर दोहराता युक्त शाही सेना भी देखे जा सकते हैं, लेकिन फ्लोरोसेंट स्पॉट की तीव्रता बहुत मंद और असाधारण कम पृष्ठभूमि के क्षेत्रों में अक्सर ही detectable है. विशेष रूप से चमकीले धब्बों की छोटी संख्या नहीं बढ़ रहा है कि शाही सेना से मेल खाती है. स्केल बार:. 10 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
एक शाही सेना प्रतिलेख की चित्रा 3 असेंबल परिवहन निर्देशित दौर से गुजर. प्रतिलेख के प्रक्षेपवक्र बाएं सबसे पैनल में दिखाया गया है. प्रक्षेपवक्र एक भी एफ के ऊपर मढ़ा हैसमय श्रृंखला की टहनी. स्केल बार:. 2.5 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Stably RBMBs के intracellular प्रसव के बाद, 3'-UTR में RBMB बाध्यकारी साइट के 96 संगठनों ने मिलकर दोहराता साथ शाही सेना व्यक्त HT1080 कोशिकाओं की 1 मूवी प्रतिनिधि फिल्म. व्यक्तिगत शाही सेना टेप के रूप में उज्ज्वल फ्लोरोसेंट धब्बे दिखाई देते हैं. स्केल बार:. 10 माइक्रोन वीडियो देखने के लिए यहां क्लिक करें.

मूवी 2 का निर्देशन परिवहन के दौर से गुजर एक शाही सेना प्रतिलेख की प्रतिनिधि फिल्म. स्केल बार:. 10 माइक्रोन वीडियो देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

एक पारंपरिक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग जीवित कोशिकाओं में छवि एक इंजीनियर शाही सेना टेप करने की क्षमता प्रत्येक शाही सेना प्रतिलेख और अपार फ्लोरोसेंट जांच से निकलती एक कम फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि के साथ जुड़े होने के लिए एक उज्ज्वल और photostable फ्लोरोसेंट संकेत की आवश्यकता है. इस विधि में, एक उज्ज्वल फ्लोरोसेंट संकेत प्रत्येक शाही सेना प्रतिलेख पर, (96 तक) कई oligonucleotide आधारित फ्लोरोसेंट जांच, यानी RBMBs hybridizing द्वारा हासिल की है. हालांकि, के रूप में कुछ के रूप में चार बाइंडिंग साइटों 16 पर्याप्त हैं. सामूहिक संकेतों वास्तविक समय में ट्रैक कर सकते हैं कि एक उज्ज्वल फ्लोरोसेंट स्थान में परिणाम. सामूहिक संकेत खो दिया है पहले फ्लोरोसेंट रंगों का एक बड़ा अंश photobleached होना चाहिए, क्योंकि कई जांच की उपस्थिति भी, अब इमेजिंग समय के लिए अनुमति देता है. यह इस तकनीक आरएनए जीव विज्ञान में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान और वें मापने से लेकर शाही सेना व्यवहार की एक विस्तृत श्रृंखला के अध्ययन के लिए अनुमति देगा कि कल्पना हैलक्ष्य शाही सेना के अद्वितीय subcellular स्थानीयकरण पैटर्न देख विभिन्न बाहरी उत्तेजनाओं, शाही सेना के भाग्य और जीवन भर का अध्ययन, और शाही सेना विनियमन में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए शाही सेना की तस्करी के ई प्रतिक्रिया. इसके अलावा यह आरएनए अभिव्यक्ति में (यानी ऊपर और नीचे विनियमन) परिवर्तन ट्रैक करने के लिए संभव हो सकता है. यह क्षमता अभी तक पुष्टि नहीं की गई है हालांकि, हम पहले से शाही सेना की नकल संख्या काफी सटीकता से जीवित कोशिकाओं 22 में अप करने के लिए 24 घंटे के लिए मात्रा निर्धारित किया जा सकता है कि पता चला है. इसके अलावा, RBMBs जीन अभिव्यक्ति के स्तर को प्रभावित करने के लिए नहीं दिखाई देते. संयुक्त, इन परिणामों के एक सेल द्वारा कोशिका के आधार पर सही ट्रैक किए गए थे इस समय अवधि में जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन, और RBMBs शाही सेना स्थिरता में वृद्धि के लिए नेतृत्व या आरएनए गिरावट धीमा नहीं था कि कि प्रारंभिक सबूत प्रदान करते हैं. हालांकि, यह सब तो हद जीन अभिव्यक्ति वास्तव में इस समय के दौरान बदल क्या स्पष्ट नहीं है.

सामान्य तौर पर, यह हैजीन अभिव्यक्ति में कोई वृद्धि आसानी से पहचाना जा उम्मीद है कि; कारण नवगठित देखिए बाध्य करने के लिए स्वतंत्र है कि सेल में अपार RBMB की बहुतायत है. लेकिन, क्या कम स्पष्ट है RBMBs अनुवाद और गिरावट के दौरान शाही सेना से अलग कर देना कैसे है और शाही सेना अभिव्यक्ति / गिरावट और इन टेप के इमेजिंग के बीच कुछ अंतराल है. अतिरिक्त अध्ययन अभी भी बेहतर इन स्थितियों में RBMB प्रदर्शन को समझने के लिए आवश्यक हैं.

एक शाही सेना टेप इमेजिंग के लिए कई वैकल्पिक तरीकों पहले से सूचित किया गया है. शामिल जल्द से जल्द पढ़ाई fluorescently पृथक शाही सेना टेप लेबलिंग और आम तौर पर microinjection 23,24 से, कोशिकाओं में इन टेप फिर से शुरू. संकेत करने वाली पृष्ठभूमि में इस दृष्टिकोण की वजह से किसी भी अपार फ्लोरोसेंट रंगों को दूर करने की क्षमता के लिए बहुत अधिक है, लेकिन मनाया आरएनए व्यवहार सही रूप Tru का प्रतिनिधित्व करता है कि क्या चिंताएं हैंई आरएनए प्रसंस्करण. इस कमी को सबसे आम समाधान यहां प्रस्तुत RBMB दृष्टिकोण के अनुरूप एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर से बाध्य किया जा सकता है कि 3'-UTR में मिलकर दोहराता, साथ इंजीनियरिंग transgenes शामिल किया गया है. पिछला फ्लोरोसेंट संवाददाताओं केवल सामान्यतः पालक 25, और GFP के रूप में भेजा आरएनए aptamers, बंधन पर प्रतिदीप्ति कि छोटे अणुओं को शामिल किया है. पालक अभी तक एक शाही सेना टेप इमेजिंग के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया है, लेकिन छवि वैश्विक अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया गया है. इसके विपरीत, GFP सफलतापूर्वक छवि एक शाही सेना टेप करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. 3'-UTR 2,10 में MS2 बाध्यकारी साइट का मिलकर दोहराता साथ निर्माण इस दृष्टिकोण में, एक GFP संवाददाता बैक्टीरियल फेज MS2 (GFP-MS2) की कोट प्रोटीन से जुड़े हुए है और एक इंजीनियर शाही सेना को बांधता है. इस दृष्टिकोण यहाँ वर्णित दृष्टिकोण के समान है, वहीं RBMBs कई लाभ प्रदान करते हैं. उदाहरण के लिए, RBMBs एक व्यापक div प्रदान करता है, जो जैविक fluorophores इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा करने की अनुमतिबेहतर photostability और फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ तुलना में बेहतर चमक के साथ विकल्पों की ersity. इसके अलावा, लगभग अवरक्त के लिए अब तक में फेंकना कि कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जैविक fluorophores कर रहे हैं. लाल स्थानांतरित उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के साथ रंगों के चयन का लाभ इन तरंगदैर्य पर मनाया कम सेलुलर autofluorescence से उपजा है. Autofluorescence के उच्च स्तर को आसानी से शाही सेना संकरण के साथ जुड़े किसी भी फ्लोरोसेंट संकेत डूब सकता है, नाटकीय रूप से autofluorescence कम करने की क्षमता संकेत करने वाली पृष्ठभूमि में एक महत्वपूर्ण बढ़ावा देता है. RBMBs का उपयोग करने का एक अन्य महत्वपूर्ण लाभ अनबाउंड जांच से संकेत काफी बुझती है. विभिन्न दृष्टिकोण GFP अभिव्यक्ति के स्तर को नियंत्रित करने, अबाध GFP-MS2 दृष्टिकोण में GFP, जैसे, परमाणु स्थानीयकरण संकेतों के उपयोग की पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कम करने के लिए उठाए गए हैं, और विभाजन GFP complementation 1,10,11,26,27, हालांकि एक वास्तविक शमन moie की उपस्थितिRBMB डिजाइन के भीतर Ty बहुत अधिक प्रयोगात्मक लचीलेपन के साथ उपयोगकर्ताओं को प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, RBMB दृष्टिकोण आरएनए अभिव्यक्ति और जांच एकाग्रता के रिश्तेदार और कुल स्तर दोनों के लिए अपेक्षाकृत असंवेदनशील है. वास्तव में, व्यक्तिगत टेप परिमाण के एक आदेश है कि अवधि RBMB सांद्रता के साथ imaged किया जा सकता है. उच्च photostability, उज्जवल संकेत, और कम पृष्ठभूमि के संयुक्त फायदे सीमित विशेषज्ञता के साथ माइक्रोस्कोपी उपयोगकर्ताओं के लिए कहीं अधिक सुलभ RBMBs साथ वास्तविक समय शाही सेना इमेजिंग प्रयोगों बनाते हैं.

शायद, इस तरह के GFP के रूप में एक आणविक संवाददाता के विपरीत, इस तरह के RBMBs रूप बहिर्जात जांच का उपयोग करने का सबसे उल्लेखनीय नुकसान, intracellular वितरण के लिए की जरूरत है. सौभाग्य से, विकल्पों में से एक नंबर मौजूद हैं, जैसे, microinjection 28, अभिकर्मक एजेंट 29, सेल मर्मज्ञ पेप्टाइड्स 30, और streptolysin हे (SLO) 31. निजी तौर पर, हम microporation ने पाया है किआम तौर पर> 95% व्यवहार्यता और वितरण दक्षता 21 में जिसके परिणामस्वरूप सबसे उपयोगकर्ता के अनुकूल और बहुमुखी विकल्प,. Microliter मात्रा electroporation प्रक्रिया गर्मी पीढ़ी, धातु आयन विघटन, पीएच परिवर्तन और ऑक्साइड गठन सहित अक्सर electroporation के साथ जुड़े कई हानिकारक घटनाओं में कमी दर्शाती है क्योंकि यह संभावना है. RBMBs एक ही प्रयोग में> 100,000 कोशिकाओं में दिया जा सकता है के बाद से महत्वपूर्ण बात है, microporation, भी उच्च throughput पढ़ाई करने के लिए उत्तरदायी है.

जीवित कोशिकाओं में छवि शाही सेना स्थानीयकरण और आंदोलन को RBMBs उपयोग करने के कई फायदे के बावजूद, सीमाओं और चुनौतियों का एक संख्या अभी भी बने हुए हैं. शायद, सबसे बड़ी चुनौती सतत संपर्क के तहत कुछ मिनट से अधिक के लिए शाही सेना को ट्रैक करने में असमर्थता है. इस photobleaching और फोकल इमेजिंग विमान से बाहर स्थानांतरित करने के लिए शाही सेना की क्षमता दोनों का परिणाम है. उज्जवल और अधिक photostable रंजक अल कर सकते हैंइन कमियों के leviate दोनों हर रंग उत्तेजित हो सकता है समय की संख्या बढ़ रही है और अनुमति से असतत फ्लोरोसेंट धब्बे फोकल हवाई जहाज़ से अधिक दूरी पर हो imaged. Photostability को बढ़ाने के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण उनके जीवनकाल 32 का विस्तार करने के लिए जैविक फ्लोरोफोरे से निकटता में quenchers triplet राज्य का उपयोग जो आत्म चिकित्सा रंगों का प्रयोग शामिल है. एक अन्य विकल्प आत्म बुझाना है कि नहीं जुड़ा fluorophores की एक बड़ी संख्या से बना रहे हैं जो फ्लोरोसेंट amplifying संयुग्मित पॉलिमर, का उपयोग हो सकता है. इन पॉलिमर कई बार एकल जैविक fluorophores की तुलना में उज्जवल है और अभी तक अभी भी कुशलता से एक भी शमन आधा भाग 33,34 से बुझती किया जा सकता है; हालांकि, इस क्षेत्र में अतिरिक्त काम अब भी जरूरत है. यह यह टी है कि यह सुनिश्चित करने के लिए मुश्किल है क्योंकि यह समय की विस्तारित अवधि के ऊपर छवि के लिए एक एकल आरएनए प्रतिलिपि नहीं की जा सकती, प्रति सेकंड एक फ्रेम दर> 1 फ्रेम के साथ, कि विरामी इमेजिंग ध्यान दिया जाना चाहिएवह एक ही शाही सेना प्रतिलेख फ्रेम करने के लिए फ्रेम से पता लगाया जा रहा है. बेशक, एकल कोशिका के स्तर पर जीन अभिव्यक्ति की मात्रात्मक मूल्यांकन एक सेल आधार प्रति 16,35,36 पर व्यक्तिगत फ्लोरोसेंट स्पॉट की गिनती के माध्यम से, लंबे समय तख्ते पर अभी भी संभव है. इस मामले में, यह व्यक्ति टेप का ट्रैक रखने के लिए आवश्यक नहीं है. कुल मिलाकर, यह RBMBs आरएनए समारोह में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करने में सक्षम हैं कि विश्वास और पारंपरिक माइक्रोस्कोपी उपकरण और सीमित विशेषज्ञता के साथ एक इंजीनियर शाही सेना टेप की इमेजिंग के लिए सक्षम बनाता है.

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Disclosures

डॉ मार्क Behlke और डॉ लिंग हुआंग पांडुलिपि में वर्णित यौगिकों से कुछ के लिए इसी तरह की बिक्री के लिए oligonucleotides प्रदान करता है जो IDT द्वारा नियोजित कर रहे हैं. IDT लेकिन नहीं, एक सार्वजनिक रूप कारोबार कंपनी है, और वे व्यक्तिगत रूप से IDT में / इक्विटी किसी भी शेयर ही नहीं है.

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन कैरियर पुरस्कार (0953583) और स्वास्थ्य NCI / R21-CA116102 के राष्ट्रीय संस्थान, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766 द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nuclease-free water Life Technologies AM9932 no DEPC-treated
DPBS Life Technologies 14190-144 No Ca2+ and Mg2+
Cary 100 UV-Vis spectrophotometer Agilent Technologies
Potassium phosphate dibasic Fisher Scientific P290-500
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific P284-500
Sodium phosphate monobasic Fisher Scientific S381-500
Microcentrifuge tubes Eppendorf 22364111 1.5 ml
Chromatography column Kimble Chase Life Science 420400-0720 0.7 x 20 cm
Superdex 75 prep grade GE healthcare 17-1044-01
Syringe pump Braintree Scientific BS-300
Syringe BD 301035 60 ml, Luer-lok tip
Centrifugal filter units Millipore UFC501096 MW 10,000 cutoff
Centrifuge 5418 Eppendorf
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P7280-5MG lyophilized powder, g-irradiated
8-well chambered coverglass Fisher Scientific 155409 Working volume 0.2-0.5 ml
HT1080 ATCC CCL-121 Human Fibrosarcoma cell line
Cell culture flask Corning 430639 25 cm2
DMEM Life Technologies 11965084 High glucose
DMEM without phenol red Life Technologies 21063029 High glucose
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F2442-500ML
Penecillin/streptomycin Life Technologies 15140122
Trypsin Life Technologies 25300054 0.05% Trypsin-EDTA
Neon transfection system Life Technologies MPK5000
Neon transfection system kit Life Technologies MPK1096
Hemacytometer Fisher Scientific 02-671-10
Hoescht 33342 Life Technologies H1399
IX-81 Inverted fluorescence microscope Olympus
SOLA light engine Lumencor
Metamorph Molecular Devices Software controlling microscope
Immersol oil 518F Fisher Scientific 12-624-66B

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References

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Song, Y., Zhang, X., Huang, L., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons. J. Vis. Exp. (90), e51544, doi:10.3791/51544 (2014).

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