Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تحليل Phosphopeptide من القوارض بربخي المني

Published: December 30, 2014 doi: 10.3791/51546
Automatic Translation
1, 1, 1, 2
1School of Environmental and Life Science, University of Newcastle, 2Drug Delivery, Disposition and Dynamics, Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Monash University

Abstract

الحيوانات المنوية هي فريدة من نوعها تماما بين أنواع الخلايا. على الرغم من أن تنتج في الخصية، يتم تبديل كل من النسخ الجيني النووي والترجمة من مرة واحدة تبدأ الخلية الجولة ما قبل المؤشر إلى استطال وتفرق في ما المعترف بها شكليا باعتباره الحيوان المنوي. ومع ذلك، فإن الحيوان المنوي هو غير ناضج جدا، عدم وجود القدرة على الحركة أو الاعتراف البيض. كل من هذه الأحداث وقعت مرة واحدة عبور الحيوانات المنوية جهازا الثانوية المعروفة باسم البربخ. خلال النهار مرور ~ 12 الذي يستغرقه خلية الحيوان المنوي بالمرور عبر البربخ، والتعديلات بعد متعدية من البروتينات الموجودة تلعب دورا محوريا في نضوج الخلية. واحد جانب كبير من هذا القبيل هو بروتين الفسفرة. من أجل توصيف الأحداث الفسفرة التي تحدث أثناء الحيوانات المنوية النضج، يجب وضع حد سواء النقي السكان الخلية الحيوانات المنوية وقبل تجزئة من phosphopeptides. باستخدام تقنيات الظهر فلاشينغ، وهي طريقة لعزل النقي الحيوانات المنوية سويرد F عالية الجودة والعائد من epididymides البعيدة أو الذيلية. يتم شرح الخطوات لإذابة، والهضم، وقبل تجزئة من phosphopeptides الحيوانات المنوية من خلال تيو 2 تقارب اللوني. مرة واحدة معزولة، phosphopeptides يمكن حقنها MS لتحديد كلا الحدثين الفسفرة البروتين على بقايا الأحماض الأمينية محددة وتحديد مستويات الفسفرة التي تحدث أثناء عمليات نضوج الحيوانات المنوية.

Introduction

وبعد أن خرجت من الخصية، الحيوانات المنوية والتباين الشديد بعد بشكل ملحوظ، وهذه الخلايا هي غير ناضجة 1،2. على هذا النحو، فإنها تفتقر ظيفة كاملة، بما في ذلك القدرة على السباحة وربط لبويضة 3. على الرغم من أن مزيدا من النضج للخلية الحيوان المنوي هو مطلوب، وهذا لا يمكن أن يتم عبر طرق الكنسي، ومنذ في هذه المرحلة من عملية تمايز الخلايا، وأنهم غير قادرين على النسخ الجيني والمزيد من البروتين الحيوي 4. ويمنح الاختصاص البيولوجي على الحيوانات المنوية عند خروجهم من الخصية وإدخال جزء من الجهاز التناسلي الذكري المعروف باسم البربخ 5. البربخ هو ملفوف بإحكام، أنبوب التباين الشديد الذي يربط القنوات صادر (الخصية) إلى الأسهر وموجود في جميع الثدييات الذكور 6. الحيوانات المنوية اكتساب تدريجيا إمكانية التسميد من خلال النسب بربخي، والاعتماد على البيئة اللمعية المتغيرة باستمرار التي هي كرعتيد من قبل الخلايا الظهارية بربخي المحلية 7. مختلف الأنشطة إفرازية وإعادة الاستيعابية الحالية في فعل بربخي الوسط لتعديل الحيوانات المنوية نفسها، وتغيير من البروتين، والكربوهيدرات والدهون تكوين 6. وقد تجسدت أهمية البربخ، وخاصة المنطقة الأولية "الفرد" هذا الهيكل باستخدام تقنيات ربط الجراحية 8. الحيوانات المنوية داخل الخصية المحتجزة من قبل ناقل القناة ربط تفتقر تماما في أي القدرة على تخصيب البويضة 9-11.

بالإضافة إلى البيئة بربخي، مسارات نقل الإشارة في إطار عمل الحيوانات المنوية لمرحلة ما بعد translationally تعديل تكملة الخلايا المنوية الموجودة. على سبيل المثال، الحيوانات المنوية من المناطق الأولى من البربخ عرض أنماط مختلفة من البروتين الفسفرة بالمقارنة مع تلك المناطق الأخيرة 5،12. وهذا ليس مستغربا لأن هناك اختلافات واسعة في جapability من الحيوانات المنوية من هذه المناطق. على سبيل المثال، الحيوانات المنوية من وقت مبكر، والفرد من البربخ وimmotilite. في المقابل، سوف الخلايا المنوية من منطقة ذيل الخضوع إلى الأمام الحركة التقدمية مرة واحدة وضعت في المتوسط ​​متساوي التوتر. منذ خلايا بربخي الحيوانات المنوية غير قادرة على دي نوفو البروتين الحيوي، ويجب أن تكون جميع المسارات الجوهرية التي تنظم وظائف الحيوانات المنوية من خلال التعديلات بعد متعدية (PTM). وبالتالي، فإنه من المعقول أن البروتينات، وعلى وجه الخصوص يجب أن يكون التحقيق في PTMs مثل الفسفرة أحد المحاور الرئيسية إذا أردنا أن نفهم الحيوانات المنوية خلية النضج.

طريقة بديلة للحصول على الحيوانات المنوية من epididymidies لاستخدام-backflushing الرجعية 13-16. على الرغم من أن هذه التقنية هي بالتأكيد أكثر استهلاكا للوقت، ويأخذ درجة أكبر من المهارة من قبل المشغل، والحيوانات المنوية الحصول على إثبات باستمرار نقاء تتجاوز 99.99٪. وبالإضافة إلى ذلك، وعلى عكس جميع التقنيات الأخرى، كاليفورنيا الحيوانات المنويةن تكون معزولة في حالة هادئة، مما يجعل من الممكن لدراسة كيفية يبدأ الحيوانات المنوية على الحركة. كما تحضير العينة هو الجانب الأكثر أهمية لتحليل البروتين، وأصبح عزل الحيوانات المنوية واحدة من أهم جوانب دراسات الحيوانات المنوية بروتيوميك. يوفر هذا البروتوكول تفسيرا حول كيفية الحيوانات المنوية يتم عزل من البربخ الفرس. وفي أعقاب ذلك، ويرد الإجراء تخصيب 2 phosphopeptide تيو، مع إشارة محددة حول كيفية استخراج الببتيدات من الخلايا المنوية متباينة للغاية. ويمكن استخدام النهج MS التمييز phosphopeptides تغيير إذا كان للمرء أن يقارن بربخي الحيوانات المنوية الذيلية في دولة واحدة (immotile أو غير بالأهلية) إلى آخر (متحركة، بالأهلية، وكان رد فعل جسيم طرفي، الخ) مما يجعل هذا النهج قوية لدراسة الحيوانات المنوية وظيفة.

Protocol

1. إعداد وسائل الإعلام والثقافة أطباق

  1. جعل 200 مل من Biggers يتن ويتن (BWW) 17 حل العاملة بإضافة 5.54 غرام كلوريد الصوديوم، 0.356 غرام بوكل، 0.25 غ CaCl 2، 0.162 غرام H 2 KO 4 P، وز 0.294 MgSO 4 الى 1 L من الماء ملي-Q . هذا هو الحل الأوراق المالية ويمكن أن تبقى في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر.
  2. من محلول المخزون، إضافة 420 ملغ من NaHCO 3 - 200 الجلوكوز ملغ، 6 ملغ البيروفات الصوديوم، 600 ملغ الأبقار مصل الزلال، 0.74 اكتات الصوديوم مل و 4.0 مل من العازلة HEPES إلى 193 مل من الأسهم BWW. هذا هو الحل العمل ويتم دائما الطازجة في اليوم ومعايرتها إلى 37 درجة مئوية قبل استخدام.
  3. لجعل قنية، واتخاذ البولي إثيلين (PE) الأنابيب التي يبلغ قطرها الداخلي 0.4 ملم وقطرها الخارجي من 1.1 ملم وعقد على نار خفيفة (عادة لهب الميثانول) ان هذه الأنابيب يبدأ في الذوبان. سحب على الفور أنابيب outwارض لتمتد وجعل القطر الخارجي أضيق.
  4. قطع لإنتاج تضييق نهاية واحدة والذي يسمح لالقسطرة أسهل من الأسهر.
  5. قطع الطرف الآخر من قنية إلى حوالي 15 سم. إدراج 30 G الإبرة في نهاية حادة، ونعلق حقنة 3 مل إليها (تراجع بالكامل).
  6. جعل لسان حال شفط عن طريق قطع بطول 20 سم من PE أنابيب (4.2 ملم القطر الداخلي، 6.4 مم القطر الخارجي). إدراج لسان حال إلى نهاية واحدة.
  7. إدراج حامل أنبوب الزجاج الشعرية الصغيرة والزجاج الصغيرة الشعرية بحد ذاتها (عادة 3 ميكرولتر للماوس، 40 ميكرولتر لفأر).

2. إزالة Epididymides من ماوس

  1. الموت ببطء الفئران وفقا للإجراءات وافق IACUC محددة لكل مؤسسة.
  2. خذ الحيوان وجعل شق صغير في كيس الصفن لفضح البربخ. سحب الخصية والبربخ من تجويف باستخدام زوج من # 5 ملقط ساعاتي.
  3. قطع الأسهر تبقى بحيث 1-2 سم على الأقل تعلق على البربخ الفرس. وبالإضافة إلى ذلك، وقطع قنوات ناقل الداني والأنسجة التي تربط البربخ إلى الخصية وإزالة المسار بأكمله التناسلي الذكري.
  4. وضع المسار بأكمله التناسلي الذكري تحت المجهر تشريح مع مجموعة والتكبير في ترتيب 5-40X.

3. Cannulating البربخ

  1. الشريط أسفل قنية إلى المجهر، بحيث 1-2 سم من ضاقت نهاية (مخروطية) مجاني وضوحا من خلال العدسة.
  2. خذ زوج من ساعاتي # 5 ملقط وقفل بلطف كل جانب من الأسهر وسحب الأسهر على قنية، بحيث قنية يذهب الى الأسهر.
  3. خذ طول مضفر الأسود الحرير غير قابل للامتصاص المعالجة (حجم 5-0) وربط عقدة حول الأسهر مقنى. ضمان يتم سحبها عقدة بإحكام لعقد قنية داخل الأسهر عندما يكون ضغط الهواء الابام يتم تطبيق الحقنة.

4. إلى الوراء أو Backflushing من الذيل بربخي المني

  1. باستخدام الساعات # 5 ملقط، والاستيلاء على نهاية البعيدة للepididymides الفرس وإزالة الغلالة البيضاء الغلالة من أجل فضح أنبوب صغير بربخي واحد.
  2. باستخدام ملقط، وسحب بلطف أنبوب صغير إلى فضح وثم ندف بعيدا وذلك لخلق فرصة للحيوانات المنوية أن يطلق سراحه.
  3. دفع بلطف على مل 3 (الماوس) أو 20 مل (الفئران) حقنة وذلك لطرد الهواء من الحقنة في الأسهر. في الضغط المناسب، سوف الحيوانات المنوية تبدأ تأتي ببطء للخروج من أنبوب صغير كسر في نهاية البعيدة للالبربخ الفرس. في هذا الوقت، وتطبيق الشفط للسان حال لرسم الحيوانات المنوية في الزجاج الشعرية. ملاحظة: عادة في الماوس، 2-3 ميكرولتر من الحيوانات المنوية يمكن الحصول عليها تبعا لعمر الحيوان. الوصية الفئران، على متوسط ​​العائد 30-40 ميكرولتر.

5. غسلوالناشر الحيوانات المنوية في التحضير لالبروتيوميات

  1. طرد الحيوانات المنوية من الزجاج الشعرية في 1 مل من محلول من حل BWW (37 ° C) التي تهب بلطف إلى لسان حال أو ربط حقنة وطرد الهواء وذلك لدفع الحيوانات المنوية مرة أخرى للخروج من الشعيرات الدموية.
  2. وبمجرد تنتشر الخلايا المنوية، وغسل 3X (300 x ج، 5 دقائق) مع 1 مل BWW لإزالة البروتينات تلويث. بعد غسل النهائي، وإزالة طاف. ملاحظة: عند هذه النقطة، وخلايا الحيوانات المنوية يمكن تجميد لاستخدامها لاحقا.
  3. ذوبان البروتينات باستخدام 4٪ CHAPS، 2 M ثيوريا، و 50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.4 لمدة 1 ساعة مع vortexing لفترات متقطعة.
  4. بعد الناشر الخلايا، وأجهزة الطرد المركزي (10،000 x ج، 20 دقيقة)، واتخاذ طاف ونقل إلى أنبوب جديد. ملاحظة: عند هذه النقطة، والبروتين الكمي لا يمكن أن يؤديها.

6. ذرتين من الكبريت بوند الحد من والألكلة

  1. إضافة 10 ملي DTT كما التركيز النهائي للبروتينات هي lysed، vortالسابق واحتضان في RT لمدة 30 دقيقة.
  2. إضافة 50 ملي idodoacetamide كما تركيز النهائي لالمحللة، دوامة واحتضانها في RT لمدة 30 دقيقة في الظلام.

7. الهطول

  1. الميثانول الكلوروفورم يعجل العينة عن طريق إضافة 1 حجم المحللة (400 ميكرولتر كمثال)، إضافة مجلد واحد (400 ميكرولتر) من الميثانول و 0.5 حجم (200 ميكرولتر) الكلوروفورم.
  2. دوامة العينة وتدور (10،000 x ج، 2 دقيقة).
  3. لاحظ أن مرحلتين ستظهر بعد الطرد المركزي. تجاهل جميع ولكن 2 ملم من الطبقة العليا (والحرص على عدم تعكير صفو اجهة).
  4. إضافة 1 الحجم (400 ميكرولتر) من الميثانول، أنبوب عكس 1-2x بلطف لمزج ومرة ​​أخرى تدور (10،000 x ج، 15 دقيقة). تجاهل طاف أن تضيع والهواء الجاف بيليه لمدة 3-4 دقيقة.

8. التربسين الهضم

  1. إعادة التربسين في 25 ملي بيكربونات الأمونيوم التي تحتوي على 1 M اليوريا إلى نسبة 50: 1 (W / W، البروتين: التربسين) وحضنت اوفهrnight عند 37 درجة مئوية ويفضل في 700 دورة في الدقيقة على thermomixer.
  2. تدور (10،000 x ج، 15 دقيقة) لتكوير المواد غير مهضوم. نقل طاف لأنبوب جديد.

9. Phosphopeptide التخصيب

  1. أداء تنقية وإثراء phosphopeptides من تريبسيني الهضم كما هو موضح سابقا (18). تمييع الببتيدات زيتية 10 أضعاف في المخزن DHB [عازلة DHB يتكون من: 350 ملغ / مل 2،5 حمض dihydrobenzesulfonic (DHB)، 80٪ (ت / ت) ACN (الأسيتونتريل)، 2٪ (ت / ت) TFA (trifluoroacetic حمض)] وتطبيق لتجف تيو 2 حبات (200 ميكروغرام).
  2. ترك على محور دوار في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  3. غسل العينة مع العازلة DHB، وتدور وإزالة طاف. ثم غسل العينة ثلاث مرات مع غسل عازلة [80٪ ACN (ت / ت)، 2٪ TFA (ت / ت)] لإزالة DHB.
  4. بعد زيادة ونقصان النهائي، أزل مباشرة phosphopeptides باستخدام شطف العازلة من خلال إضافة 25 ميكرولتر من هيدروكسيد الأمونيوم بنسبة 2.5٪، ودرجة الحموضة ≥ 10.5 الحل. Sدبوس وإزالة طاف. تحييد فورا مع ~ 0.3 ميكرولتر حمض الفورميك.

Representative Results

جودة النتائج من أي تحليل البروتين تعتمد بشكل كبير على المواد انطلاق. مع MS الحديثة، والتقطت التلوث طفيفة في الأعمال التحضيرية عينة بسهولة. لذا، فمن الأهمية بمكان، في حالة البروتينات خلية الحيوان المنوي، لاختيار الأسلوب الذي يعطي الحيوانات المنوية نقية للغاية. كما هو موضح في الشكل رقم 1، ويستخدم backflushing إلى الوراء لاسترداد خلايا الحيوانات المنوية من البربخ الفرس. وهذا ينطوي على cannulating الأسهر مع أنابيب PE الذي يسمح احد لتطبيق ببطء ضغط الهواء من الحقنة المرفقة. يوضح الشكل 1A البربخ ذيل جنبا إلى جنب مع الأسهر. 1B الشكل هو قرب النار لكيفية ربط الأسهر حيث يتم إدخال قنية. في القيام، لذلك، يتم الافراج الحيوانات المنوية في نهاية رفعه من أنبوب صغير واحد من epididymides الذيلية. كما هو مبين في الشكل 2A، يتم استخراج الحيوانات المنوية من مناطق ذروة caudوامتص من البربخ وتصل إلى الزجاج الشعرية في حالة هادئة (الشكل 2B). وهذا له العديد من المزايا التقليدية أساليب "السباحة إلى أعلى"، وليس أقلها هو القدرة على إجراء تحليل phoshoproteomic من الحيوانات المنوية قبل وبعد تفعيل الحركة. ويمكن بعد ذلك طرد الحيوانات المنوية في وسائل الإعلام من اختياره. الشكل 2C (الجانب الأيسر) يوضح كيفية الحيوانات المنوية تبدو على الفور بعد طرد إلى BWW سائل الإعلام. وتجمعت العديد من الخلايا معا. ومع ذلك، أثبتت بعد 10 دقيقة اختصاص الخلايا لأنها تسبح إلى التجانس في الحل (الشكل 2C، والحق خلايا الجانب). منذ تقنية backflushing لها تأثير ضئيل جدا على خلايا الحيوانات المنوية، ونحن الحصول على ما يقرب من 100٪ من الحركة والخلايا تفريق بسرعة إلى وسائل الإعلام دون استفزاز خارجي. في تجربة نموذجية backflushing، تعافى الحيوانات المنوية من السويسرية الفأر يحتوي علىبين 1-5 × 10 6 خلايا. هذا يعتمد بدرجة كبيرة على عمر الحيوان ويمكن أن تختلف من سلالات مختلفة من الفئران. في الجرذ النرويجي، نحصل عادة 200 × 10 6 الحيوانات المنوية، ± 20٪. الشكل 2D يمثل نقاء الحيوانات المنوية التي تم الحصول عليها من البربخ ذيل الفئران.

إلى جانب عينة نفسها، واحدة من القضايا الرئيسية المتعلقة إعداد العينات هو العائد من التربسين الهضم. هطول الأمطار البروتين يلعب دورا رئيسيا، ليس فقط في إزالة المنظفات والأملاح غير المرغوب فيها، وكلاهما غير متوافقة مع MS، ولكن أيضا في تغيير طبيعة البروتينات. لقد وجدنا هطول الأمطار الميثانول كلوروفورم أن تعمل بشكل أفضل. تم الإبلاغ عن هذا الإجراء ليس فقط لترسيب البروتينات وفيرة المنخفضة أفضل من غيرها بما في ذلك TCA هطول الأمطار 19، لكنه لا يملك مزايا إضافية. وبعد TCA هطول الأمطار، وغالبا ما يكون من الضروري إعادة ضبط درجة الحموضة بعد تعليق بيليه TCA التي يمكن أن تبقى تماماالحمضية. على الرغم من أن بيليه عجلت من TCA يمكن غسلها في المحاليل العضوية عالية لإزالة الحامض، وهذا يضيف لعينة المناولة وirreproducibility النتائج. إن الفشل في تحييد الحامض يؤدي ذلك إلى ضعف عوائد الببتيد زيتية. الميثانول كلوروفورم هطول الأمطار ليس فقط سريعة ولكن لن تحمض العينة الشكل 3 يوضح بيليه البروتين ينظر عادة من 100 ميكروغرام من العينة بين الطور البيني السفلي والعلوي.

يمكن أن يحدث عزلة phosphopeptides في عدد من الطرق. ومع ذلك استنساخ يعتمد على الكيفية التي تم التعامل معها العينة وبما يصل إلى هذه المرحلة. واحدة من وأساليب النامية الأكثر شيوعا هو تيو 2، وضعت أصلا من قبل مجموعة من مارتن لارسن 18،20،21. وعلى الرغم من وصفها بأنها عملية لاستخدامها في microcolumns، يمكننا الحصول على بيانات استنساخه باستخدام دفعة اللوني. نجاح العملية يتوقف بشكل كبير على شطف العازلة، التي يجب أن تكون مجنونا البريد لتكوين الصحيح. خلاف ذلك لا مزال phosphopeptides على الإطلاق.

استنساخ البيانات بروتوكول وتمثيلية من تيو 2 إثراء phosphopeptides من ذيل بربخي الحيوانات المنوية في غير متحركة (الشكل 4 أعلى) ومتحركة (الشكل 4 أسفل) دولة من م / ض 650-670 يمكن رؤيتها. لقد أثبتنا أن هذا هو أسلوب استنساخه للغاية حتى عند استخدام مكررات البيولوجي 17. الشرائط الزرقاء التي تظهر مع مرور الوقت هي الببتيدات يبلغ حجمه من C18 نانو العمود كما تركيز زيادات الأسيتونتريل. ومن الواضح في عدد السكان متحركة (ن = 3 هو مبين، ن = 8 عادة تشغيل)، هناك مجموعة الببتيد، مع كتلة monoisotopic حول دا مجموعة 651.5 التي هي غائبة تماما في نطاق غير متحركة. ثم يتم استخدام جنبا إلى جنب مطياف الكتلة لتحديد هذا الببتيد.

546 / 51546fig1highres.jpg "/>
الشكل 1: القسطرة من البربخ ذيل (A) صورة من البربخ الفرس. وسجلت قنية نفسه الى فضح سم تقريبا 1-2 من نهاية سحبت مسبقا. يتم إدراج ذلك في الأسهر باستخدام غرامة # 5watchmakers ملقط. ويقام (B) وقنية في مكان عن طريق ربط حرير ناعم حول شريحة تحتوي على كل الأسهر وقنية. من الماوس، يتم جمع ما يقرب من 2-3 ميكرولتر من خلايا بربخي الذيلية والسوائل بتركيز 1 × 10 6 / ميكرولتر. من الفئران (كما هو موضح)، ويتم الحصول على حوالي 30-40 ميكرولتر من السائل بتركيزات مماثلة.

الشكل 2
الشكل 2: الشعرية الزجاج المستخدمة في جمع الحيوانات المنوية بربخي المختص. (A) واحدة أنبوب صغير من ذروة ذيل البريد pididymis غير معزولة ومقطوعة. موقف تقريبي من هذا الذي يحدث هو ​​مبين. (B) وأعلى الصورة يظهر أنبوب زجاجي الشعرية فارغ ويظهر أسفل واحد من الفئران backflushed سابقا. لا يوجد أي تلوث الدم والحد الأدنى من التلوث الخلايا الظهارية. (C) وبما أن الحيوانات المنوية لا تزال لم تهذبها في السائل بربخي، وأنها لم تبدأ في تشغيله. عندما يتم طرد الحيوانات المنوية في البداية في حل BWW، وأنها تأتي بها باعتبارها "السلسلة" المدمجة (الجانب الأيسر). يتم تأسيس بسهولة اختصاص الخلية، منذ بعد 10 دقيقة معظم الحيوانات المنوية تسبح في حل من دون أي إزعاج خارجي (الجانب الأيمن). (D) صورة للقسامة من الخلايا بربخي الذيلية على الفور بعد أن تم ترك للسباحة من يدل على نقاء الخلايا.

g3highres.jpg "/>
الشكل (3): الميثانول كلوروفورم هطول الأمطار كانت مرة واحدة تذوب الحيوانات المنوية، وجزء للذوبان هو الميثانول كلوروفورم عجل لضمان تمسخ من البروتينات وإزالة المواد الملوثة. يظهر بيليه البروتين على واجهة بين المرحلتين الميثانول / الماء والكلوروفورم. تتم إزالة الطبقة العليا بعناية حتى لا تعكر صفو هذا بيليه. ومن الشائع أن ترك حوالي 2-3 ملم من المرحلة العليا حتى لا يضيع البروتين.

الشكل (4)
الرقم 4: نموذجي تيو 2 -enriched الملف الشخصي phosphopeptide باستخدام بروتوكول وصفها، تم عزل الذيلية بربخي الحيوانات المنوية في أي immotile (أعلى، N = 3) أو الدول متحركة (أسفل، N = 3). كتلة الببتيد مع كتلة أحادية النظائر من ~ 651.5 Dوأظهرت ليكون حاضرا في السكان متحركة ولكن غائبة تماما في تلك immotile (السهم). ويشار إلى مقارنات من هذا النوع على أنها "خالية من التسمية (القائم على MS)". ثم يتم استخدام كتلة الببتيد والوقت الاحتفاظ لاستهداف مجمع لل، جنبا إلى جنب الشامل الطيف وتحديد البروتين الذي تم اشتقاق الببتيد.

Discussion

الخطوات الحاسمة لتحليل البروتين ناجحة وقابلة للتكرار من الحيوانات المنوية هي: 1) الطهارة من المواد ابتداء. 2) إزالة الأملاح غير المرغوب فيها والمنظفات. 3) تغيير طبيعة البروتينات إلى مداها الكامل وذلك للسماح التربسين لهضم ارتفاع العائد من البروتينات و4) التقليل من عينة التعامل مع للحد من فقدان الببتيد.

من أجل backflush البربخ الفرس بنجاح، لا بد من تحديد المنطقة التي من الحيوانات المنوية وخروج. في حالة كل من الفئران والجرذان، وهذا هو في ذروة منطقة مقعرة، في وسط المنطقة الذيلية من البربخ (انظر الشكل 2A). إذا كان أحد يأتي مزيد من نحو الأسهر، backflushing هو أسهل ونسبة النجاح أعلى عموما. ومع ذلك، وهذا يأتي في فقدان أعداد الحيوانات المنوية. بدلا من ذلك، إذا كان أحد يحاول التحرك أكثر الأقرب إلى المحكمة، ثم كمية الضغط اللازم لدفع الحيوانات المنوية مرة أخرى من خلال epididymالقنوات آل غالبا ما تكون عالية، لدرجة أن الأضرار التي لحقت البربخ يحدث لا محالة.

يتم تنفيذ Backflushing من البربخ تقليديا باستخدام المياه المشبعة الزيوت المعدنية ومحلول ملحي متوازن في الحقنة نفسها على أنها وسيلة لإزالة الحيوانات المنوية 22-25. كلا الإجراءات يمكن أن تكون إشكالية LC-MS. أولا، من المرجح أن منع نانو نانو C18 الأعمدة التي تستخدم أساسا في جميع أنحاء العالم لتحليل البروتين ويجب الحرص حتى يتم أن أيا قدما في إجراء المعدنية. إذا حدث هذا، فإنه من المستحيل أن يستمر ويتم فقدان العينة أساسا. هذا يمكن التغلب عليها عن طريق استخدام BWW أو حلول الملح متوازنة الأخرى في الحقنة، ولكن، على الرغم من أن هذا هو الناجح، فإننا سرعان ما اعترف بأن العديد من الحيوانات المنوية تصبح متحركة بأسرع ما جاء الحل BWW في الاتصال ومختلطة مع بربخي الذيلية الخلايا. للتحايل على هذه المشكلة ونحن ببساطة backflush الحيوانات المنوية مع الهواء. هو ليس فقط التأهيليةإيتي من الحيوانات المنوية مشابه لذلك من أساليب تعتمد على السائل، ولكن كمية غير متطابقة.

Phosphoproteomics ربما يكون واحدا من الطرق الوحيدة لإنشاء مسارات الإشارات التي تحدث في الحيوانات المنوية بعد القذف. واحد من المسارات الرئيسية نحن نحقق هو عملية تمكين الطاقات. الحيوانات المنوية يجب أن تخضع "تمكين الطاقات" قبل أنها قادرة على ربط إلى البويضة. في الممارسة العملية، ويتحقق هذا في الأساس التي يحتضنها الحيوانات المنوية لفترة من الوقت (40 دقيقة الماوس، الجرذان 1.5 ساعة، الإنسان 3-24 ساعة) في حل BWW مع ألبومين المصل. سابقا، نحن وغيرنا قد أظهرت دورا لعدة تحركات المشاركين في تمكين الطاقات. من الفائدة، حذف PKA μ II إنتاج الفئران التي تسبح بشكل عفوي في المختبر الحيوانات المنوية، ولكن لا يمكن الخضوع hyperactivation 26. وهذا الأخير هو السمة المميزة لتمكين الطاقات، حيث الحيوانات المنوية تغيير نمط السباحة الخاصة بهم من سرعة عالية، وانخفاض السعة، إلى أدنى مستوىالسرعة، ضربت السعة العالية التردد. لقد أظهرنا تحركات المصب تشارك في هذه العملية تشمل pp60-تنظيم الاوراق المالية (SRC) 13،27 ج-نعم 28 و ج-ABL 14. ومن المثير للاهتمام، وتثبيط SRC يتوقف تعتمد على تمكين الطاقات التيروزين الفسفرة 13. ومع ذلك، وهذا يمكن التغلب عليها مع حمض okadaic، مما يوحي بأن SRC لا تشارك مباشرة في بداية العام التيروزين الفسفرة 29 ولكن قد تنظم الفوسفاتيز 29. المشكلة مع استخدام BWW كوسيلة لإجبار الحيوانات المنوية من البربخ هو أنه بمجرد تفعيلها، والحيوانات المنوية الماوس فقط تأخذ حوالي 40 دقيقة توفير القدرة. وبالنظر إلى أن عزل الحيوانات المنوية قد يستغرق 5 دقائق / الماوس وغالبا ما تستخدم عدة فئران في التجربة، ثم الحيوانات المنوية سيكون في مراحل مختلفة من النضج في بداية التجربة. للتغلب على هذا، وضغط الهواء يمكن استخدامها لدفع الحيوانات المنوية من البربخ الذيلية في قنية الزجاج. هي كل inact الحيوانات المنوية ليس فقطإيف وأساسا لأنها يمكن العثور عليها في الوسط الذيلية، فإنه يجعل من الممكن مقارنة phosphoproteomics غير متحركة ومتحركة.

يجب أن تبقى التعامل مع phosphoproteomics عينة إلى أدنى حد ممكن عند مقارنة الحيوانات المنوية في دولتين وظيفية مختلفة. استخدام الميثانول الكلوروفورم على الطرق التقليدية الأخرى من البروتين هطول 1) يقلل من الحاجة إلى اتخاذ خطوات غسل اضافية، و2) يزيل تقريبا جميع آثار من الأملاح والدهون و3) لديه قدرة ثبت لترسيب البروتينات وفرة على ارتفاع منخفض فوق TCA 19. ويوصى هطول الأمطار البروتين قبل التربسين الهضم منذ وهذا لا يساعد على تفسد البروتين (الذي يساعد على الهضم التربسين)، ولكن يزيل الكثير من نواتج الأيض MS-تتنافى الموجودة في الخلية.

المقارنة بين phosphopeptides الحيوانات المنوية يمكن القيام به في عدد من الطرق. على المستوى الأساسي، وبمقارنة بسيطة من phosphopeptide المحددة في عينة واحدة، لأنه في آخرويمكن أن يتم العينة في عملية تعرف باسم "العد الطيفي". ومع ذلك كان الانتقاد في هذا النهج أساسا لأن الدراسات البروتين الأولى كانت تستخدم مكررات منخفضة (لمناقشة أشمل رؤية Lundren وآخرون 30). نهج أكثر تطورا هو أن ننظر إلى شدة الببتيد كتلة الأم ومقارنة هذا مع عينات أخرى (مقارنة خالية من التسمية). في المثال هو موضح في الشكل (4)، الببتيد غائبة عن من غير متحركة (الشكل 4 أعلى) ولكن موجودة في متحركة (الشكل 4 أسفل) الحيوانات المنوية من م / ض 650-670 يمكن رؤيتها. هذه العملية، ويشار إلى تسمية يستند إلى MS-الكمي الحرة هي استراتيجية خالية من التسمية.

استراتيجية بديلة تستخدم عادة لتقليل كمية من يدير المطلوبة لتقدير بروتيوميك هو استخدام النظائر. كما كتلة نظير مختلفة، مطياف الكتلة يمكن استخدامها لمقارنة شدة من elutالببتيدات جي. ومع ذلك، خلافا لمعظم أنواع الخلايا الأخرى، وبعض العلامات النظائر لا يمكن تطبيقها على الحيوانات المنوية. على سبيل المثال، إضافة النظائر المستقرة (يحصل على إضافة النظائر الثقيلة واحد لعينة واحدة، في حين نسخة أخف يحصل على إضافة إلى آخر) يمكن استخدامها في زراعة الأنسجة. عندما تحصل على دمج نظائر في البروتين، وتحليل البروتينات يمكن أن يؤديها من خلال الجمع بين اثنين من العينات (مضاعفة). ولكن في حالة الحيوانات المنوية، وهذا لا يمكن القيام به، وذلك ببساطة بحكم حقيقة أن 1) يتطلب وضع العلامات النظائر العديد من المقاطع (تصل إلى 8) في زراعة الأنسجة و2) خلايا الحيوانات المنوية لا يوجد لديه النسخ الجيني النووي والترجمة، وبالتالي، أنهم لا يستطيعون دمج نظائر في جميع البروتين على أية حال. طريقة واحدة لتجنب ذلك هي أن تأمر الفئران radiolabelled، ومع ذلك، وهذه هي مكلفة المعروف. نهج بديل هو استخدام علامة كيميائية. وقد تم ذلك عندما تمت مقارنة الفئران غير بالأهلية مع الفئران بالأهلية. في هذه الحالة، D 0 وD 31. ويمكن أن تشمل المناهج الأخرى استخدام iTRAQ (علامة إسوي الضغط عن الكميات النسبية والمطلقة)، حيث وصفت lysines كيميائيا مع النظائر الإعلام المختلفة. ICAT (النظائر مشفرة بطاقة تقارب) حيث وصفت cysteines مع النظائر الإعلام المختلفة ووضع العلامات المياه الثقيلة والخفيفة.

في كل حالة من الحالات، ومع ذلك، يحتاج إلى شيء واحد أن يوضع في الاعتبار. وMS تقارير فقط ما هو موجود في العينة، وهذا هو انعكاس لكل ما حدث إلى أن عينة تصل إلى تلك النقطة. التقليل من تناول عينة في حين تعظيم العائد في كل خطوة من الضروري لتحليل البروتين ناجحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,5-Dihydroxy-1,4-benzoquinone Aldrich 195464
2-D Quantitation Kit VWR (GE Healthcare) 80-6483-56
Albumin from bovine serum Sigma A7030
Ammonia solution 25% Merck 1.05432
Ammonium bicarbonate Sigma A6141
Calcium chloride Sigma C5080
CHAPS 3-[3-(cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate Research Organics 1300C
Chloroform BDH 10077.6B
Disodium hydrogen phosphate Merck 1.06580
Dithiothreitol (DTT) Sigma D9779
Formic acid Sigma O6440
Glucose Sigma G6152
Glutamine-L Sigma G7513
Hepes (free acid) Sigma H3375
Iodoacetic acid free acid Sigma I4386
Lactic acid Sigma L1750
Magnesium chloride Res. Org. 0090M
Methanol Merck 10158.6B
Percoll (sterile) VWR (GE Healthcare) GEHE17-0891-01
Phosphatase Inhibitor Cocktail Halt ThermoFisher Scientific (Pierce) PIE78420
Potassium chloride Sigma P9333
Potassium hydrogen carbonate Medical Store CH 600
Sodium bicarbonate Sigma S3817
Sodium chloride Sigma S7653
Sodium dihydrogen phosphate Merck 1.06346
Sodium hydrogen carbonate BDH 10247.4V
Sodium pyruvate Sigma S8636
Tris, ultra pure grade Amresco (Astral) AM0497
Trypsin Gold, mass spec grade Promega V5280
Urea Sigma U5128
Zinc chloride Sigma Z0173
0.4 mm Polyethylene tubing Goodfellow ET317100
30 G needle Terumo NN2038R
3 ml Syringe Terumo SS035
4.2 mm Polyethylene tubing Goodfellow ET317640
Braided silk (5-0) Dynek CSS0100
Trichloroacetic acid Sigma 299537
TiO2 beads (from disassembled column) Titansphere 6HT68003
Eppendorf Tube Eppendorf 22431081
C7B30 Sigma C0856

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blandau, R., Rumery, R. E. The relationship of swimming movements of epididymal spermatozoa to their fertilizing capacity. Fertil. Steril. 15, 571-579 (1964).
  2. Tournade, A. Différence de motilité des spermatozoïdes prélevés dans les divers segments de l’épididyme. C. R. Soc. Biol. 74, 738-739 (1913).
  3. Wyker, R., Howards, S. S. Micropuncture studies of the motility of rete testis and epididymal spermatozoa. Fertil. Steril. 28, 108-112 (1977).
  4. Eddy, E. M. Male germ cell gene expression. Recent progress in hormone research. 57, 103-128 (2002).
  5. Lin, M., Lee, Y. H., Xu, W., Baker, M. A., Aitken, R. J. Ontogeny of Tyrosine Phosphorylation-Signaling Pathways During Spermatogenesis and Epididymal Maturation in the Mouse. 75 (4), 588-597 (2006).
  6. Jones, R. Plasma membrane structure and remodelling during sperm maturation in the epididymis. J. Reprod. Fertil. Suppl. 53, 73-84 (1998).
  7. Robaire, B., Hinton, B. T., Orgebin-Crist, M. C. The Epididymis. Neill, J. D. 3, Elsevier. 1072-1120 (2006).
  8. Lacham, O., Trounson, A. Fertilizing capacity of epididymal and testicular spermatozoa microinjected under the zona pellucida of the mouse oocyte. Mol. Reprod. Dev. 29, 85-93 (1991).
  9. Bedford, J. M. Effects of duct ligation on the fertilizing ability of spermatozoa from different regions of the rabbit epididymis. J. Exp. Zool. 166, 271-281 (1967).
  10. Orgebin-Crist, M. C. Studies on the function of the epididymis. Biol, Reprod. 1, 155-175 (1969).
  11. Orgebin-Crist, M. C. Maturation of spermatozoa in the rabbit epididymis: effect of castration and testosterone replacement. J. Exp. Zool. 185, 301-310 (1973).
  12. Lin, M., Hess, R., Aitken, R. J. Induction of sperm maturation in vitro in epididymal cell cultures of the tammar wallaby (Macropus eugenii): disruption of motility initiation and sperm morphogenesis by inhibition of actin polymerization. Reproduction. 124, 107-117 (2002).
  13. Baker, M. A., Hetherington, L., Aitken, R. J. Identification of SRC as a key PKA-stimulated tyrosine kinase involved in the capacitation-associated hyperactivation of murine spermatozoa. J. Cell. Sci. 119, 3182-3192 (2006).
  14. Baker, M. A., Hetherington, L., Curry, B., Aitken, R. J. Phosphorylation and consequent stimulation of the tyrosine kinase c-Abl by PKA in mouse spermatozoa; its implications during capacitation. Dev. Biol. 333, 57-66 (2009).
  15. Baker, M. A., et al. Use of Titanium Dioxide To Find Phosphopeptide and Total Protein Changes During Epididymal Sperm Maturation. J. Proteome. Res. 10 (3), 1004-1017 (2010).
  16. Baker, M. A., Weinberg, A., Hetherington, L., Velkov, T., Aitken, J. Post-Ejaculatory Changes in the Metabolic Status of Rat Spermatozoa as Measured by GC-MS. Metabolomics. 11, 1-14 (2012).
  17. Biggers, J. D., Whitten, W. K., Whittingham, D. G. The culture of mouse embryos in vitro. , Freeman. (1971).
  18. Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Mol. Cell. Proteomics. 4, 873-886 (2005).
  19. Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal. Biochem. 138, 141-143 (1984).
  20. Thingholm, T. E., Jorgensen, T. J., Jensen, O. N., Larsen, M. R. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides using titanium dioxide. Nat. Protoc. 1, 1929-1935 (2006).
  21. Thingholm, T. E., Larsen, M. R. The use of titanium dioxide micro-columns to selectively isolate phosphopeptides from proteolytic digests. Methods. Mol. Biol. 527, 57-66 (2009).
  22. Ecroyd, H., Asquith, K. L., Jones, R. C., Aitken, R. J. The development of signal transduction pathways during epididymal maturation is calcium dependent. Dev. Biol. 268, 53-63 (2004).
  23. Ecroyd, H., Jones, R. C., Aitken, R. J. Tyrosine Phosphorylation of HSP-90 During Mammalian Sperm Capacitation. Biol. Reprod. 69 (6), 1801-1807 (2003).
  24. Jones, R., Mann, T., Sherins, R. Peroxidative breakdown of phospholipids in human spermatozoa, spermicidal properties of fatty acid peroxides, and protective action of seminal plasma. Fertil. Steril. 31, 531-537 (1979).
  25. Wade, M. A., Jones, R. C., Murdoch, R. N., Aitken, R. J. Motility activation and second messenger signalling in spermatozoa from rat cauda epididymidis. Reproduction. 125, 175-183 (2003).
  26. Nolan, M. A., et al. Sperm-specific protein kinase A catalytic subunit C{alpha}2 orchestrates cAMP signaling for male fertility. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13483-13488 (2004).
  27. Mitchell, L. A., Nixon, B., Baker, M. A., Aitken, R. J. Investigation of the role of SRC in capacitation-associated tyrosine phosphorylation of human spermatozoa. Mol. Hum. Reprod. 14, 235-243 (2008).
  28. Leclerc, P., Goupil, S. Regulation of the human sperm tyrosine kinase c-yes. Activation by cyclic adenosine 3',5'-monophosphate and inhibition by Ca(2). Biol. Reprod. 67, 301-307 (2002).
  29. Krapf, D., et al. Inhibition of Ser/Thr phosphatases induces capacitation-associated signaling in the presence of Src kinase inhibitors. J. Biol. Chem. 285, 7977-7985 (2010).
  30. Lundgren, D. H., Hwang, S. I., Wu, L., Han, D. K. Role of spectral counting in quantitative proteomics. Expert. Rev. Proteomics. 7, 39-53 (2010).
  31. Platt, M. D., Salicioni, A. M., Hunt, D. F., Visconti, P. E. Use of differential isotopic labeling and mass spectrometry to analyze capacitation-associated changes in the phosphorylation status of mouse sperm proteins. J. Proteome. Res. 8, 1431-1440 (2009).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 94، الحيوانات المنوية بربخي، phosphopeptides، وثاني أكسيد التيتانيوم، واحمرار الوراء، الطيف الشامل، الكمي
تحليل Phosphopeptide من القوارض بربخي المني
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Baker, M. A., Hetherington, L.,… More

Baker, M. A., Hetherington, L., Weinberg, A., Velkov, T. Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa. J. Vis. Exp. (94), e51546, doi:10.3791/51546 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter