Summary
Ce document décrit comment Elvax 40W peut être utilisé comme un procédé à libération lente pour l'administration de médicaments à la rétine de rat adulte. Le protocole de préparation, de chargement et délivrant le complexe médicament-résine de l'œil est décrite.
Abstract
Maladies de la rétine sont difficiles à traiter que la rétine se trouve au fond de l'œil. Les méthodes invasives de délivrance de médicaments sont souvent nécessaires pour traiter ces maladies. Maladies rétiniennes chroniques telles que l'oedème de la rétine ou de la néovascularisation nécessite généralement plusieurs injections intra-oculaires pour traiter efficacement la maladie. Cependant, les risques associés à ces injections augmentent avec la livraison répétée de la drogue. Par conséquent, les méthodes de prestation des services doivent être mis en place afin de minimiser les risques de réinjection. Plusieurs autres études ont développé des méthodes pour délivrer des médicaments au fil du temps étendue, à travers des matériaux capables de libérer des substances chimiques lentement dans l'oeil. Dans cette enquête, nous décrivons l'utilisation de Elvax 40W, une résine de copolymère, d'agir comme un véhicule pour la livraison de médicaments à la rétine de rat adulte. La résine est faite et chargé avec le médicament. Le complexe médicament-résine est ensuite implanté dans la cavité vitréenne, où elle libère lentement le médicament au-dessus de timoi. Cette méthode a été testée en utilisant du 2-amino-4-phosphonobutyrate (APB), un analogue du glutamate qui bloque la lumière de réponse de la rétine. Il a été démontré que l'APB est lentement libéré à partir de la résine, et a été capable de bloquer la réponse rétinienne à 7 jours après l'implantation. Ceci indique que l'administration de médicaments à libération lente en utilisant cette résine de copolymère est efficace pour le traitement de la rétine, et pourrait être utilisée avec d'autres tests sur le plan thérapeutique.
Introduction
Le traitement des maladies chroniques comme le diabète et l'hypertension artérielle présente de nombreux défis, comme ces maladies nécessitent des traitements pour des périodes de temps prolongées, souvent pour la vie. Cela a appelé à l'élaboration de systèmes de délivrance de médicaments à libération lente, ce qui réduit la nécessité de la fréquence des prises. L'efficacité de ces méthodes à libération lente a été démontré par le développement des pompes à insuline, afin de réduire le nombre d'injections d'insuline nécessaires pour traiter le diabète. Les maladies chroniques de l'œil, en particulier celles qui affectent ses couches internes, nécessitent l'administration fréquente de médicaments grâce à des procédures invasives. L'une de ces maladies chroniques affectant l'œil humain est liée à l'âge de dégénérescence maculaire (DMLA). Elle affecte la rétine centrale, qui est une couche de tissu nerveux situé à l'arrière de l'œil responsable de l'initiation vision. La DMLA est la principale cause de cécité dans le monde occidental 1. Un défi particulier au traitement de remaladies-intestinaux est que le médicament est nécessaire pour atteindre cette couche profonde dans les yeux, ce qui nécessite souvent des méthodes invasives de livraison. Les médicaments sont habituellement administrés à la chambre vitrée et la rétine en utilisant des injections intravitréennes. Cependant, à chaque injection il existe un risque de complications post-injection, y compris l'endophtalmie, décollement de la rétine, hémorragie vitréenne cataracte et 2. Ce risque est multiplié par chaque réinjection du médicament.
Réduction du besoin de plusieurs injections serait un avantage majeur dans le traitement de la DMLA. Pour traiter la forme humide de la DMLA, où croissance de nouveaux vaisseaux est une caractéristique, la stratégie thérapeutique établie est de cibler les facteurs de croissance endothéliaux (VEGF) utilisant des inhibiteurs du VEGF 3. À l'heure actuelle, ceux-ci sont offerts par des injections répétées intravitréennes. De même, dans le traitement de l'oedème maculaire, une complication fréquente de la rétinopathie diabétique, les corticostéroïdes sont fournis par des injections répétées La notion d'un système de livraison de médicament à libération lente a été décrite pour la première utilisation d'un véhicule de caoutchouc de silicone à livrer de petites molécules dans les tissus animaux 5. Depuis, d'autres méthodes de libération lente ont été développés pour délivrer des molécules plus grandes, dont plusieurs ont été testés dans les yeux. des supports de particules, telles que les microsphères biodégradables, le poly-lactide-co-glycolide (PLGA), des nanoparticules et des vésicules phospholipidiques (liposomes) peuvent être utiles en tant que véhicules de délivrance à 6,7. Des liposomes et des nanoparticules de PLGA ont été comparés dans un milieu in vitro pour leur aptitude à délivrer des agents anti-cancer à travers la sclérotique dans le temps 7. Les deux véhicules ont été efficaces en libérant lentement les médicaments. Cependant, l'étude a été effectuée seulement dans un environnement in vitro. Bochot et al. (2002) 8 testésl'efficacité des liposomes pour délivrer des molécules à la rétine in vivo. Ils ont démontré que les liposomes livrer avec succès des petits oligonucléotides à la rétine de lapin. Les auteurs ont suggéré que les liposomes peuvent être bénéfiques dans le traitement de maladies de la rétine 8. Cependant, la nature de ces vésicules à flotter dans le corps vitré signifie qu'ils vont probablement brouiller ou altérer la vision 9. Okabe et al. (2003) 10 utilisé des disques de polymère non biodégradable composée de 33% d'acétate de vinyle-éthylène à appliquer bêta-méthasone chez le lapin. Ils ont implanté des disques dans une poche sclérale et démontré la libération efficace du médicament dans le corps vitré et la rétine pendant un mois 10. Toutefois, dans ce protocole particulier, l'implant est relativement large et rigide, et a nécessité une intervention chirurgicale plus complexe comprenant une grande incision sclérale et la suture. Une étude antérieure a enquêté sur le tissue réponse à divers véhicules polymères par leur implantation dans la cornée de l'œil du lapin, et ont trouvé que les copolymères éthylène-acétate de vinyle lavées dans de l'alcool n'ont pas provoqué une inflammation ou une irritation. Ces complexes ont été montrés pour soutenir la prestation de composés plus grands dans les tissus animaux pendant des périodes de temps prolongées, certains dépassant jusqu'à 100 jours dépendant de la drogue 11. Un tel type de résine de copolymère a été développé industriellement sous la forme d'Elvax 40W (40% en poids d'éthylène-acétate de vinyle teneur en comonomère avec un additif d'amide "W" pour améliorer le traitement des pastilles). Cette résine de copolymère est une substance inerte qui est stable à la température ambiante et corporelle. Il n'a pas été démontré de causer des allergies ou de la toxicité dans les tissus biologiques. Cette résine a effectivement livré une grande variété de médicaments dans différents modèles expérimentaux qui étudient les fonctions des divers systèmes, comme le système canalaire mammaire 12, le cortex auditif primaire 13,14 </ Sup>, et la grenouille du système visuel 15. Cette résine a également été utilisé dans les yeux pour délivrer des médicaments au développement de tortue 16,17, 18,19 embryon de poulet, et furet adulte rétines 20. Dans le système nerveux central de rat, la résine n'a été utilisé que dans le cerveau de 21 à 23, mais son utilisation dans l'oeil de rat n'a pas été documentée. Les avantages de l'utilisation de cette résine de copolymère à délivrer des médicaments à la rétine lentement par rapport aux autres procédés, est qu'il est un composé stable qui ne provoque pas l'inflammation ou l'irritation de l'oeil. A la différence des supports de particules, le complexe médicament-résine ne serait pas gêner la vision après l'implantation, comme il reste généralement au niveau du site de livraison au lieu de flotter dans l'humeur vitrée. Il ne nécessite qu'un procédé d'implantation facile dans la cavité vitréenne à proximité du limbe de l'oeil, et ne nécessiterait pas de suture après l'implantation. Récemment, il ya eu une émergence dans plusieurs systèmes de distribution de nouvelles, commetechnologie des cellules encapsulées (ECT) 24,25, 26 hydrogels, et microfilms 27. Toutefois, le procédé utilisé dans la présente étude pour préparer et délivrer le complexe médicament-résine est à la fois facile à suivre et peu coûteux, étant de ce fait plus avantageuse pour une utilisation dans un environnement de recherche de base. Le défi de l'utilisation de ce complexe pour fournir des traitements médicamenteux à long terme est de déterminer la concentration optimale du médicament qui permettra de maximiser les bénéfices thérapeutiques d'avoir moins d'injections intravitréennes. Cet article vise à démontrer l'utilisation du complexe médicament-résine pour le traitement à long terme de la rétine de rat adulte. L'efficacité de ce mode de distribution est testée en utilisant l'analogue du glutamate 2-amino-4-phosphonobutyrate (APB) en tant que médicament. Blocs APB la lumière de réponse des cellules bipolaires ON en imitant le glutamate, un neurotransmetteur endogène dans la rétine 28. Lorsque APB est en concurrence avec le glutamate pour son récepteur, il bloque le light réponse. APB a été utilisé dans des études physiologiques pour contrôler la fonction rétinienne et de mesurer son effet en utilisant des méthodes électrophysiologiques tels que électrorétinogramme (ERG). Dans des études antérieures, l'APB a été utilisé à la fois à court terme 29 et le traitement à long terme de la rétine en développement; celle-ci consistait à donner une seule dose par injection intra-oculaire par jour pendant 30 jours 30. La même quantité d'APB (0,092 mg dans une solution saline stérile, à une concentration de 50 uM) a été utilisée pour toutes les préparations injectables, comme le suggère précédente 28,29,31 de travail. Nous avons choisi APB pour tester le complexe médicament-résine comme un véhicule à libération lente pour délivrer des médicaments dans l'œil. Les méthodes décrites dans cette étude sont similaires aux méthodes décrites précédemment concernant la préparation de la drogue résine complexe 16,32; Cependant, nous avons également en détail l'utilisation en particulier dans l'oeil de rat adulte. Après l'implantation chirurgicale de la résine APB-chargé dans l'oeil, ERG a été effectuée pour déterminer si APB abolit la rréponse à la lumière etinal, et donc de savoir si l'APB a été lancé avec succès dans le vitré et la rétine.
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Protocol
Toutes les expériences menées sont en conformité avec la Déclaration ARVO pour l'utilisation d'animaux dans ophtalmique et Vision Research, et avec l'approbation de l'Université du comité d'éthique animale de l'Aquila et le Comité d'éthique de l'expérimentation animale de l'Université nationale australienne. Des rats adultes (P100-200) ont été utilisés tout au long de cette étude.
1 Préparez les boulettes de résine de copolymère
- Placer 20 boulettes Elvax 40W dans un petit récipient en verre dans la sorbonne.
- Remplir le bécher avec 100% d'éthanol assurer de couvrir tous les granulés.
- Couvrir le bécher avec du parafilm, et tremper les pastilles dans 100% d'éthanol à la température ambiante pendant 7-10 jours. NOTE: A partir de cette étape en avant, ne pas utiliser le métal ou plastique pour traiter ou stocker la résine.
2 Préparer la solution de médicaments pour le chargement
- Dissoudre le médicament de choix dans 0,1% de diméthylsulfoxyde (DMSO). Ajouter la solution de médicament à 40 pi de volume.Charger la résine avec trois fois la concentration du médicament qui serait donnée en une seule dose.
3 Préparer et charger le complexe médicament-résine
- Transférez les 20 culots lavés à un autre petit récipient en verre. Dissoudre les pastilles dans 4 ml de dichlorométhane pendant environ 45 min. Couvrir le bécher avec Parafilm tandis que les pastilles se dissolvent.
- Préparer une solution de Fast Green FCF par dissolution dans 0,1% de DMSO à une concentration de 0,001 mg / ml.
- Prenez une pipette, et établit 40 pl de la solution de médicament préparé plus tôt. Charger une autre pipette avec 40 pi de solution vert rapide.
- Ajouter les deux solutions simultanément dans le bécher. Mélanger à l'aide rapidement un agitateur en verre jusqu'à ce que le colorant vert est réparti uniformément dans le mélange.
- Transférer rapidement le bécher sur la glace sèche pendant 10 min à jeûner geler la résine.
- Mettre en place une "chambre d'évaporation" pour évaporer le solvant. Remplissez ungrand récipient, jusqu'à un tiers de galets de sulfate de calcium. Créez un puits dans les cailloux, et placer soigneusement le bécher dans le puits afin que les cailloux atteindre jusqu'à la moitié du gobelet, pour stabiliser le bécher dans la chambre.
- Couvrez le récipient extérieur plus grand avec du parafilm.
- Transférer la chambre d'évaporation dans le congélateur. Conserver à -20 ° C pendant 2-3 semaines.
4 Préparez le complexe médicament-résine pour l'implantation chirurgicale
- Retirer la chambre d'évaporation du congélateur. Transférer le solide bloc drogue résine dans un plat de verre conservées sur de la glace.
- Avec l'aide d'un microscope ou loupe, couper un morceau d'environ 0,05 mm de diamètre et de 0,1 mm de longueur du bloc à l'aide d'un outil de trépan ou d'un poinçon.
- Envelopper le reste du bloc en matériau anti-gel (par exemple, une feuille d'aluminium) et conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation.
5. chirurgicale Implant le complexe médicament-résine dans l'œil Rat
NOTE: La lidocaïne chlorhydrate minimizes inconfort local.
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Representative Results
Plein champ électrorétinogramme (ERG) a été utilisé pour détecter l'effet de l'APB sur la rétine. Pour plus de détails sur la façon dont l'ERG a été réalisée, se reporter aux études 33,34 suivantes. En bref, après anesthésie de l'animal, une électrode d'or a été placée sur la cornée de l'oeil, et l'électrode de référence est placée dans le cuir chevelu antérieure entre les deux yeux, à enregistrer l'activité électrique de la rétine. Les stimuli ont été générés en utilisant une unité de flash électronique et de l'intensité variaient de 10 à 10 juin photo-isomérisation, ce qui représente le nombre de molécules photosensibles activés par tige. Dans ces expériences, les enregistrements ERG ont été prises à 1 et 7 jours après la procédure. L'oeil droit de chaque animal a été implanté avec le complexe médicament-résine, tandis que le compagnon de l'oeil gauche a été utilisé comme contrôle interne non traité.
La figure 1 montre les variations de l'amplitude de l'onde b avec une augmentation de la photo-isomérisation par la tige(Φ). Dans l'œil de contrôle, l'amplitude de l'onde b augmente à mesure que l'intensité du flash augmente. Dans la figure 1A, les enregistrements de réponse de la rétine sont donnés un jour après l'implantation. L'œil implanté montré un modèle d'amplitude similaire à l'œil de commande. La différence d'amplitude entre les deux yeux est devenu significativement différentes à 10 6 φ (p <0,0001). Cela indique que, à ce stade précoce, le complexe médicament-résine n'a pas d'effet sur la réponse de la rétine jusqu'au plus grande intensité du flash. Figure 1B montre l'évolution de la réponse ERG à 7 jours après l'implantation. L'onde b est supprimée à tous les niveaux de l'intensité du flash dans les yeux implanté, par rapport à l'œil de contrôle, qui a des amplitudes comparables aux enregistrements 1 jour. Cela est très différent de toutes les amplitudes de l'oeil implanté à 1 jour (p <0,0001). Cela montre que la réponse de la rétine a été abolie par (une semaine) après les implantatisur le complexe de résine-substance active dans l'oeil.
Figure 1: L'amplitude de l'onde b à 1 jour et 1 semaine après l'implantation du complexe médicament-résine. Pour les deux panneaux, l'œil de commande est représenté en orange (carrés), alors que l'œil implanté est représenté en vert ( cercles). Le symbole * représente importance à ce point entre les deux yeux, où p <0,0001. Pour tous les groupes, n = 5 (A) L'amplitude de l'onde b 1 jour après l'implantation du complexe médicament-résine dans l'œil. L'amplitude de l'onde b en fonction de l'intensité du flash (photoisomérisation par tige φ) est un indicateur de la réponse rétinienne. Il n'y a pas de différence significative dans l'amplitude de l'onde b entre les deux yeux de tous les intensités de flash à l'exception de 10 6 φ, où l'oeil implantéa une amplitude plus faible. (B) L'amplitude de l'onde b 1 semaine (7 jours) après l'implantation. Les amplitudes enregistrées des deux yeux sont significativement différents à toutes les intensités de flash. Dans la rétine implanté, l'amplitude de l'onde b n'était pas mesurable à des intensités de stimulation.
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Discussion
Cette étude a démontré l'utilisation d'un complexe médicament-résine pour la distribution à libération lente de médicaments de la rétine. Nous nous sommes efforcés de présenter une méthode qui est relativement peu coûteux et facile à appliquer dans un petit modèle animal.
Etant donné que la fonction de APB est d'agir comme un analogue du glutamate, il bloquera la réponse rétinienne dans l'oeil. Les résultats montrent que APB provoqué le blocage de la réponse rétinienne d'une semaine après l'implantation. Ceci indique que APB a été libéré avec succès dans le corps vitré et la rétine, et que son effet est limitée à l'oeil que le complexe résine-substance active a été implanté dans. Le plein effet de la drogue est devenu évident une semaine après l'implantation (figure 1B). Figure 1A montre que, à un jour après l'implantation, une réduction significative de l'onde b n'était présent à l'intensité de φ 10 6 dans l'oeil implanté. Cela peut indiquer que, à ce point de temps au début, seul levoie de cône, qui répond à la hausse des intensités de lumière, a été touchée. Pour déterminer la longueur de temps que la résine peut fournir l'APB de la rétine, d'autres points dans le temps devraient être étudiées. Il est proposé que les enregistrements à d'autres points de temps dans la durée 0-7 jours devraient être prises, par exemple, à 3 et 5 jours après l'implantation, de déterminer exactement quand la réponse rétinienne est complètement abolie. En outre, les enregistrements doivent être prises au-delà de 7 jours, afin de déterminer combien de temps l'APB est libéré pour. Ce serait évident que la réponse rétinienne continuerait d'être aboli si APB est continuellement libéré lentement dans le corps vitré.
Dans cette étude, le complexe résine-substance active a été trouvé pour être sans danger pour la livraison de la rétine. APB a été dissous dans du DMSO à 0,1%. À des concentrations égales ou supérieures à 0,6%, le DMSO peut provoquer une toxicité rétinienne. Toutefois, 0,1% de DMSO a été trouvé être un véhicule en toute sécurité pour l'administration de composés à l'oeil de rat 35, et cette concentration a été utilisée dans toutes les expériences de cette étude. Les implants ont été insérés transclerally dans la cavité vitréenne de l'ora serrata. Les implants ont été observés à rester à l'ora serrata en coupes cryogéniques de l'oeil de rat, qui a été recueilli après les enregistrements d'ERG ont été faites. Ce positionnement de l'implant garantit que le complexe médicament-résine ne provoque pas de troubles de la vision. Cette méthode impliquant le complexe médicament-résine a été testé avec d'autres composés (publication en préparation), et il a été constaté qu'aucun dommage structurel ou fonctionnel de l'œil a été observé jusqu'à deux mois après l'implantation. Un total de 60 animaux ont été implantés, et dans 90% des cas, la position de l'implant est resté inchangé.
Plusieurs modifications peuvent être apportées à la technique, si nécessaire. Dans ces expériences, trois fois la concentration d'une dose unique de APB a été chargé dans la résine (50 uM x 3 = 150 pM), et ce shoULD être utilisé comme un guide pour la préparation de la solution de médicament pour le chargement. Cependant, la concentration efficace du médicament dans la résine est variable, et doit être testée et modifiée en conséquence. Les points de temps où l'analyse est menée peut également être modifié, afin de déterminer combien de temps la résine est efficace pour libérer le médicament. Dans ces expériences, on a montré que la dose efficace stable du médicament est délivré par l'intermédiaire du complexe résine-substance active pendant au moins une semaine, il est donc recommandé que l'analyse du tissu est réalisée au moins une semaine après l'implantation. Au cours de l'étape de chargement de médicament, vert rapide a été utilisé pour s'assurer que le mélange a homogénéisé. D'autres colorants de couleurs biologiquement sûrs peuvent être utilisés comme une alternative aux Fast Green, de visualiser l'uniformité du médicament à l'intérieur de la résine. Une limitation de cette méthode est que le colorant vert rapide est la seule mesure d'un mélange uniforme. Cette technique pourrait également être testé en utilisant des modèles et des médicaments vétérinaires alternatifs, avec seulement annonce mineurajustements de la méthode. Si une plus grande quantité de médicament doit être délivré, une taille plus grande implant peut être nécessaire. En cas de succès dans ces modèles, cette résine de copolymère peut être considéré comme une option thérapeutique pour délivrer des médicaments à la rétine lentement pour avoir un effet continu dans le temps.
Il ya plusieurs étapes critiques dans le protocole où des précautions supplémentaires doivent être prises. instruments en plastique ou en métal ne doivent pas être utilisés dans la synthèse et la manipulation de la résine. Cela empêche la contamination du polymère, comme le dichlorométhane peut dissoudre le plastique et le métal se corrode. Sécheresse correcte du bloc drogue résine doit être réalisé avant de l'utiliser pour l'implantation chirurgicale. Assurez-vous que le récipient contenant le médicament et la résine est entièrement exposé au sulfate de calcium afin d'évaporer le solvant. En variante, un appareil de lyophilisation peut être utilisé pour sécher le gel résine-substance active. Le bloc médicament-résine est prête à être utilisée lorsque le solvant est complètement évaporé, etseulement un bloc bleu solide reste dans le bécher. Lors de la coupe un morceau du bloc pour l'implantation, chaque pièce ne doit être préparée immédiatement avant la chirurgie que les pièces sont très petites et sont difficiles à stocker. Un outil de trépan ou poinçon doit être utilisé pour couper des morceaux de taille égale, en veillant à ce que chaque pièce contient approximativement la même quantité de médicament. Enfin, lors de l'insertion de la pièce dans la plaie de ponction faite par l'aiguille 25 G, utilisez fines pinces pointues pour guider attentivement la pièce dans la plaie. Un microscope opératoire ou pouvoir loupe élevé devraient être utilisés comme une aide visuelle.
Seuls les médicaments et les composés hydrophiles ont été testés en utilisant cette méthode. Les complexes médicament-résine ont montré aucune précipitation ou sous-produit indésirable formation, lorsque le médicament a été mélangé avec le polymère et le dichlorométhane. Il est suggéré que, à chaque nouveau médicament, la concentration, la demi-vie de l'effet, et toutes les réactions possibles avec le mélange de résine devraittester par l'utilisateur de déterminer si le procédé est approprié.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à divulgation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Elvax 40W Pellets | Du Pont, DE, USA | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA | ||
| 2-amino-4-phosphonobutyric acid (APB) | Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA | A1910 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA | 34856 | |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA | ||
| Drierite, calcium sulfate | Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA | 238910 | |
| Ketamine, Ilium Ketamil | Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia | ||
| Xylazine, Ilium Xylazil-20 | Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia | ||
| Atropine sulphate, Minims eye drops | Bausch & Lomb Pty. Ltd., NSW, Australia | ||
| Tetracaine hydrochloride, Minims eye drops | Bausch & Lomb Pty. Ltd., NSW, Australia | ||
| Chloramphenicol, Chlorsig ointment | Aspen Pharma Pty. Ltd., NSW, Australia | ||
| Pentobarbital, Lethabarb | Virbac Australia Pty. Ltd., NSW, Australia | ||
| Lidocaine hydrochloride, Ilium Lignocaine-20 | Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia | ||
| Uni-Core Punch Tool | World Precision Instruments Inc., FL, USA | ||
| Curved Forceps | World Precision Instruments Inc., FL, USA | ||
| Operating Microscope, Zeiss OPMI 99 | Zeiss, West Germany | ||
| 25 G Insulin needle | Terumo Corp., Tokyo, Japan | ||
| Dumont tweezers | World Precision Instruments Inc., FL, USA |
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