Summary
本論文では、エルバックス40Wは成体ラットの網膜への薬物送達のための徐放方法として使用することができる方法を詳しく説明します。調製ローディング、および眼への薬剤 - 樹脂複合体を送達するためのプロトコルが記載されている。
Abstract
網膜は、眼内の深い位置するように網膜の疾患は治療が困難である。薬物送達の侵襲的方法は、多くの場合、これらの疾患を治療するために必要とされる。そのような網膜浮腫や新生血管などの慢性網膜疾患は、通常、効果的に症状を治療するために、複数の眼内注射を必要とします。しかし、これらの注入に関連したリスクは、薬物の再配達に伴って増加。したがって、代替的な送達方法は、再注入のリスクを最小化するために確立される必要がある。他のいくつかの研究は、眼の中にゆっくり化学物質を放出することが可能な材料を通って、長時間にわたって薬物を送達するための方法を開発した。この研究では、成体ラット網膜への薬物送達のためのビヒクルとして機能するのElvax 40W、共重合樹脂の使用を概説する。樹脂を作製し、薬物がロードされる。薬剤 - 樹脂複合体は、それがゆっくりとtiの上に薬物を放出する硝子体腔に移植される私。この方法は、2 - アミノ-4 - ホスホノ（APB）、ブロック網膜の光反応をグルタミン酸類似体を用いて試験した。これは、APBをゆっくりと樹脂から遊離されることを実証した、と、移植後7日目までに、網膜応答をブロックすることができた。これは、この共重合体樹脂を用いた徐放性薬物送達は、網膜を治療するために有効であり、更なる試験で治療的に使用することができることを示している。
Introduction
これらの疾患は、一般に、長期間の治療を必要とする糖尿病や高血圧などの慢性疾患の治療は、しばしば人生のために、多くの課題を提示する。これは、頻繁な投薬の必要性を減らす徐放性薬物送達システムの開発を求めている。これらの徐放方法の有効性は、糖尿病を治療するために必要なインスリン注射の数を減らすために、インスリンポンプの開発により実証されている。眼の慢性疾患、その内部層に影響を与え、特にものは、侵襲的な手続きを経て、薬物の頻繁な投与を必要とします。人間の目に影響を与える一つのこのような慢性疾患は、加齢黄斑変性症（AMD）です。それは、ビジョンを開始する責任眼球の奥に位置する神経組織の層である中心網膜に影響します。 AMDは、西側世界1における失明の主な原因である。再処理すると、特定の課題tinal疾患、薬物は、しばしば送達の侵襲的方法を必要とする眼、この深い層に到達するために必要とされることである。薬剤は通常、硝子体内注射を使用して、硝子体チャンバーと網膜に投与される。しかし、各注射で眼内炎、網膜剥離、白内障及び硝子体出血2後噴射を含む合併症の危険性がある。このリスクは、薬物のすべての再注入と乗算される。
複数回の注射の必要性を減少させることは、AMDの治療において大きな利点であろう。新しい血管の成長が特徴であり、AMDの湿潤型を治療するために、確立された治療戦略は、VEGF阻害剤3を使用して内皮増殖因子（VEGF）を標的とすることである。現在、これらを繰り返し、硝子体内注射を介して配信されます。同様に、黄斑浮腫、糖尿病性網膜症の一般的な合併症の治療において、コルチコステロイドは、反復注射を介して配信されている 徐放性薬物送達システムの概念は、最初の動物組織5中に小分子を送達するためにシリコーンゴム車両を用いて説明した。それ以来、他の徐放方法は、眼において試験されたいくつかのそれらのより大きな分子を送達するために開発されている。そのような生分解性ミクロスフェア、ポリ-ラクチド-コ-グリコリド（PLGA）ナノ粒子およびリン脂質小胞（リポソーム）などの粒子担体は、送達ビヒクル6,7として有用であり得る。 PLGAナノ粒子およびリポソームは、時間7を介して強膜を横切って抗がん剤を送達するそれらの能力についてインビトロ環境で比較した。どちらの車がゆっくりと薬剤を放出するのに有効であった。しかし、研究は唯一のin vitro環境で行われた。 Bochot ら （2002）8は、試験しリポソームの有効性は、 インビボで網膜に分子を送達する。彼らは、リポソームが正常ウサギの網膜に小さなオリゴヌクレオチドを提供することを明らかにした。著者らは、リポソームは、網膜疾患8の処置に有益であり得ることを示唆した。しかし、硝子体中に浮遊するためにこれらの小胞の性質は、彼らが可能性が高いにじみやビジョン9を損なうことを意味します。 岡部ら （2003）、10はウサギにおいてβ-メタゾンを適用するために33％のエチレン-酢酸ビニルからなる非生分解性ポリマーディスクを使用する。彼らは、強膜ポケットにディスクを移植し、1ヶ月まで10硝子体および網膜への薬物の効果的な放出を示した。しかし、この特定のプロトコルでは、インプラントは、比較的大きな剛性であり、大規模な強膜切開や縫合など、より複雑な外科手術を必要とした。 以前の研究では、TISSUを調査電子のウサギの眼の角膜にそれらを注入することにより、さまざまなポリマーの車両への応答、およびアルコール中で洗浄したエチレン - 酢酸ビニル共重合体は、炎症または刺激を引き起こさないことを見出した。これらの複合体は、いくつかの薬剤11に依存して100日までの超過、長期間動物組織へのより大きな化合物の送達を持続することが示された。共重合体樹脂のような一タイプはエルバックス40Wの形で工業的に開発された（ 'W'アミド添加剤の重量のエチレン - ビニルアセテートコモノマー含量40重量％、ペレットの取り扱いを改善する）。この共重合体樹脂は室温と体温の両方で安定な不活性物質である。これは、生体組織におけるアレルギーまたは毒性を引き起こすことが示されていない。この樹脂は、効果的にそのような乳管システム12、一次聴覚野13,14 <などのさまざまなシステムの機能を調査する別の実験モデルにおいて、薬の多種多様を提供してきました/ SUP>、そしてカエルの視覚システム15。この樹脂はまた亀16,17、ニワトリ胚18,19の開発に薬物を送達するために眼に使用されており、大人のフェレットは20を網膜。ラット中枢神経系において、樹脂のみ脳21-23で使用されているが、ラットの眼におけるその使用が報告されていない。 他の方法よりもゆっくりと網膜に薬物を送達するために、この共重合体樹脂を使用する利点は、それが目に炎症または刺激を引き起こさず、安定な化合物であることである。それは、通常、代わりに硝子体中に浮遊の送達部位に留まるように、粒子担体とは異なり、薬剤 - 樹脂複合体は、移植後に視力を損なわない。それだけで、目の角膜輪部に近い硝子体腔に簡単な注入工程を必要とし、移植後の縫合を必要としない。近年、など、いくつかの新規な送達システムの出現があったカプセル化細胞技術（ECT）24,25、26、およびマイクロフィルム27をヒドロゲル。しかしながら、薬剤 - 樹脂複合体を製造し、送達するための現在の研究で使用される方法は、それによって基本的な研究環境で使用するための、より有利で、追従しやすく、安価でもある。長期の薬物治療を送達するためにこの複合体を使用することの課題は、より少ない硝子体内注射を持つことの治療上の利益を最大化する薬剤の最適濃度を決定することである。 本稿では、成体ラット網膜の長期治療のための薬剤 - 樹脂複合体の使用を実証することを目的とする。この送達様式の有効性は、薬物としてのグルタミン酸類似体2 - アミノ-4 - ホスホノ（APB）を用いて試験する。 APBブロック網膜28にグルタミン酸、内因性神経伝達物質を模倣することによって、ON双極細胞の光応答。 APBは、その受容体のためのグルタミン酸と競合する、それブロックガーゼT応答。 APBは、網膜機能を制御し、そのような電図（ERG）のような電気生理学的方法を使用してその効果を測定するために生理学的研究に使用されている。以前の研究では、APBは、短期29と現像網膜の長期治療の両方に使用されている;後者は、30日間30毎日、眼内注射を介して、単回投与を与えることに関与。前作28,29,31で示唆されているように、APBと同じ量（50μMの濃度で滅菌生理食塩水中の0.092 mgを、）すべての注射のために使用した。私たちは、眼内に薬物を送達するために徐放車両等の薬剤 - 樹脂複合体をテストするために、APBを選びました。この研究で概説された方法は、16,32、複雑な薬-樹脂の製造に関わる前述の方法と似ています。しかし、私たちにもディテール特に成体ラットの眼での使用。眼内へのAPB-ロードされた樹脂の外科的移植の後、ERGは、APBをrを廃止かどうかを確立するために実施したetinal光応答は、従って、APBが正常硝子体および網膜中に放出されたかどうか。
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Protocol
行ったすべての実験は、眼科と視覚研究における動物の使用に関するARVO声明に従った、とラクイラの動物倫理委員会の大学とオーストラリア国立大学動物実験倫理委員会の承認を得て。成体ラット（P100-200）は、この研究を通して使用した。
1共重合樹脂ペレットを作成
- 通風室の小さなガラスビーカーに20エルバックス40Wペレットを配置します。
- 全てのペレットをカバーするために確保し、100％エタノールでビーカーを埋める。
- パラフィルムでビーカーを覆い、及び7〜10日間室温で100％エタノールでペレットを浸す。注：これ以降のステップから、樹脂を処理するか、保存するために、金属やプラスチックを使用しないでください。
2のロードのための医薬品の溶液を調製
- 0.1％ジメチルスルホキシド（DMSO）で選択される薬物を溶解する。ボリューム内の40μlに薬液を構成している。単回投与で与えられる薬物の3倍の濃度で樹脂をロードします。
3。薬剤 - 樹脂複合体を準備し、ロード
- 別の小さなガラスビーカーに20洗浄したペレットを転送します。約45分間、4ミリリットルのジクロロメタン中のペレットを溶解する。ペレットが溶解している間パラフィルムでビーカーをカバー。
- 0.001 mg / mlの濃度に0.1％DMSOに溶解してファストグリーンFCFの溶液を調製する。
- 1ピペットを取り、以前の準備の薬剤溶液40μlを策定。ファストグリーン溶液40μlを持つ別のピペットをロードします。
- ビーカーに同時に2つのソリューションを追加します。グリーン色素が均一に混合全体に分散されるまで攪拌棒ガラスを用いて急速に混合する。
- 速やか樹脂を凍結する高速に10分間ドライアイスの上にビーカーを転送します。
- 溶媒を蒸発させるために "蒸発室」を設置。埋める硫酸カルシウム小石と三分の一に大きなコンテナをバックアップします。小石でよくを作成し、慎重に小石をチャンバー内にビーカーを安定させるために、ビーカーの半分まで到達するようにウェル内にビーカーを置く。
- パラフィルムを有するより大きな外側のコンテナをカバー。
- 冷凍庫に蒸発チャンバーを転送します。 2〜3週間、-20℃で保管してください。
4。外科的移植のための薬剤 - 樹脂複合体を準備します
- 冷凍庫から蒸発室を削除します。ガラス皿に固体薬剤 - 樹脂ブロックの転送を氷上に保持。
- 顕微鏡やルーペの助けを借りて、トレパンやパンチツールを使用して、ブロックから直径約0.05ミリメートル、長さが0.1ミリメートルの部分をカット。
- 凍結防止の材料（ 例えば 、アルミ箔）のブロックの残りの部分をラップし、必要になるまで-20℃で保管してください。
5。外科的インプラントのラットの目への薬物 - 樹脂複合体
注：リグノカイン塩酸分地元の不快感をimizes。
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Representative Results
全視野電図（ERG）が網膜上APBの効果を検出するために使用された。 ERGが実行された方法については、以下の研究33,34を参照してください。簡単に述べると、動物を麻酔した後、金電極は、眼の角膜上に置き、参照電極は、網膜の電気的活動を記録するために、目の間の前方頭皮に入れた。刺激は、電子フラッシュユニットを使用して生成され、強度が10〜10ロッドごとに有効感光性分子の数を表し6光異性化、の範囲であった。これらの実験では、ERG記録は、1日および7日後の手順で行った。仲間は目が未処理の内部対照として使用した左のに対し各動物の右眼は、薬剤 - 樹脂複合体を移植した。
図1は、ロッド当たり光異性化の増加にb波の振幅の変化を示している（φ）。対照眼では、b波の振幅は、フラッシュ強度が増加するにつれて増加する。 図1Aに、レチナール応答記録は、移植後1日目に与えられている。注入された眼は、対照眼と同様の振幅パターンを示した。両眼間の振幅差が10 6φた（p <0.0001）に有意に異なった。これは、この初期の段階で、薬剤-樹脂複合体は、より高いフラッシュ強度に達するまでレチナール応答に影響を及ぼさないことを示している。 図1Bは 、移植後7日目にERG応答の変化を示している。 1日のレコーディングに匹敵する振幅を有する制御目と比較した場合、b波は、移植された眼内のフラッシュ強度のすべてのレベルで廃止されている。これは、1日た（p <0.0001）に移植された眼のためのすべての振幅に有意に異なる。これはレチナール応答はimplantatiた後（1週間）により廃止されたことを示している眼への薬剤 - 樹脂複合体の上。
図1の薬剤-樹脂複合体の移植後1日目および1週にb波の振幅注入目は緑色で示されているのに対し、両方のパネルは、対照眼は、オレンジ（四角）に示されている（丸）。 *は二つの目、P <0.0001の間で、この時点で重要性を表しています。すべてのグループの場合はn = 5（A）の眼への薬物-樹脂複合体の注入後のb波1日の振幅。フラッシュ強度（ロッドφあたり光異性）との関係でb波の振幅は、レチナール応答の指標である。 10 6φ、注入された目を除いて、すべてのフラッシュ強度における眼の間のb波の振幅に有意差は存在しない低い振幅を有する。 （B）注入後のb波1週間（7日間）の振幅。両眼から記録された振幅は、すべてのフラッシュ強度で有意に異なる。移植された網膜では、b波の振幅は、いずれの刺激強度で測定可能ではありませんでした。
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Discussion
本稿では、網膜への薬物の徐放性送達のための薬剤 - 樹脂複合体の使用を実証した。私たちは、比較的安価で小型の動物モデルにおいて適用が容易である方法を提供することを目的とした。
APBの機能は、グルタミン酸類似体として作用することを考えると、眼における網膜の応答をブロックする。結果は、APBは、1週間の着床後による網膜応答の閉塞を引き起こしたことを示している。これはAPBが正常硝子体および網膜に放出されたことを示し、その効果は、眼に限定されたことを薬剤 - 樹脂複合体に注入されたこと。薬の完全な効果は、移植（ 図1B）の後に明らかな一週間となりました。 図1（a）は 、移植後1日目に、b波の有意な減少が移植眼の中の10 6φ強度でのみ存在していたことを示しています。これは、この初期の時点でそれを示すことができる応答コーン経路、 より高い光強度に、影響を受けた。樹脂は網膜にAPBを提供できる時間の長さを決定するために、更なる時間点を調査する必要があります。それは0-7日の期間内にさらなる時間点で記録がレチナール応答が完全に廃止されているかを正確に決定するために、移植後3〜5日、時、例えば、注意すべきであることが提案されている。さらに、記録はAPBがためにリリースされる時間を決定するために、7日を超えて注意する必要があります。 APBは、継続的に硝子体にゆっくりと放出されている場合、レチナール応答が廃止され続けるだろう、これは明らかである。
本研究では、薬剤 - 樹脂複合体は、網膜への送達のために安全であることが見出された。 APBは、0.1％DMSOに溶解した。 0.6％以上の濃度では、DMSOは、網膜毒性を引き起こす可能性があります。しかしながら、0.1％のDMSOをへ化合物を送達するための安全な車両であることが見出されているラットの目35、この濃度は、本研究における全ての実験を通して使用した。インプラントは鋸状縁で硝子体腔にtransclerally挿入した。インプラントは、ERG記録が行われた後に採取したラットの眼の凍結切片における鋸状縁に留まることが観察された。インプラントのこの配置は、薬物 - 樹脂複合体は視覚障害を引き起こさないことを保証します。薬剤 - 樹脂複合体が関与するこの方法は、他の化合物（出版準備中）でテストされており、それは、眼への構造的または機能的損傷が移植後2ヶ月まで観察されなかったことが分かった。 60匹の動物の合計は移植し、そして症例の90％において、インプラントの位置は変化しないままであった。
必要に応じていくつかの変更は、技術にすることができる。これらの実験では、APBの単回用量の3倍の濃度は、樹脂中に装填した（50μM×3 = 150μM）であり、この証ロード用薬液を調製するための指針として使用することがULD。しかし、樹脂中の薬物の有効濃度は可変であり、そして試験され、それに応じて修正すべきである。分析が行われる時点は、樹脂が薬物を放出するのに有効である時間の長さを決定するために、改変することができる。これらの実験では、薬剤の安定した効果的な用量は少なくとも1週間の薬剤 - 樹脂複合体を介して配信されることが示されたので、それは、組織の分析は少なくとも1週間移植した後に行われることが推奨される。薬物負荷工程の間に、ファストグリーンは、混合物が均質化されたことを保証するために使用した。他の生物学的に安全な色の染料は、グリーンFastに樹脂中の薬物の均一性を視覚化するために代替として使用することができる。この方法の制限は、ファストグリーン色素は均一な混合の唯一の尺度であるということです。この技術は、わずかな広告と、代替の動物モデルおよび薬物を使用して試験することができるメソッドにjustments。薬物のより高い量が送達される必要がある場合、より大きなサイズのインプラントが必要であり得る。これらのモデルで成功した場合、この共重合体樹脂は、経時的に継続的な効果を有する網膜にゆっくりと薬物を送達するための治療選択肢として考えられる。
特別な注意が取られるべきであるプロトコル内のいくつかの重要なステップがあります。プラスチックと金属の楽器は、樹脂の合成及び取扱い全体で使用すべきではありません。ジクロロメタンは、プラスチックを溶解し、金属を腐食させることができ、これは、ポリマーの汚染を防止する。薬剤 - 樹脂ブロックの適切な乾燥度は、外科的移植のためにそれを使用する前に達成されるべきである。薬物および樹脂を含有するビーカーを完全に溶剤を蒸発させるために硫酸カルシウムにさらされていることを確認します。あるいは、凍結乾燥機は、薬物 - 樹脂を凍結乾燥するために使用することができる。薬剤 - 樹脂ブロックは、溶媒が完全に蒸発したときに使用できる状態にあり、唯一の固体青みがかったブロックは、ビーカーに残っています。移植のためのブロックから一枚をカットすると、それぞれの作品は、作品が非常に小さいして保存することは困難ですとして手術の直前に調製する必要があります。トレフィンまたはパンチツールは、各部分がほぼ同量の薬物が含まれていることを確実にする、等しいサイズの部分を切断するために使用されるべきである。 25 G針による穿刺創傷内にピースを挿入するときに最後に、慎重に創傷内にピースを導くために罰金、先のとがったピンセットを使用します。手術用顕微鏡またはハイパワールーペを視覚的補助として使用されるべきである。
唯一の親水性薬物および化合物はこの方法を用いて試験された。薬剤は、ポリマーとジクロロメタンと混合したときに薬剤 - 樹脂複合体は、任意の望ましくない沈殿または副産物の形成を示していない。ことが示唆されているそれぞれの新しい薬剤、濃度、効果の半減期、及び樹脂混合物との任意の可能な反応を有するべきで方法が適切であるかどうかを決定するために、ユーザがテストされる。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Elvax 40W Pellets | Du Pont, DE, USA | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA | ||
| 2-amino-4-phosphonobutyric acid (APB) | Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA | A1910 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA | 34856 | |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA | ||
| Drierite, calcium sulfate | Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA | 238910 | |
| Ketamine, Ilium Ketamil | Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia | ||
| Xylazine, Ilium Xylazil-20 | Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia | ||
| Atropine sulphate, Minims eye drops | Bausch & Lomb Pty. Ltd., NSW, Australia | ||
| Tetracaine hydrochloride, Minims eye drops | Bausch & Lomb Pty. Ltd., NSW, Australia | ||
| Chloramphenicol, Chlorsig ointment | Aspen Pharma Pty. Ltd., NSW, Australia | ||
| Pentobarbital, Lethabarb | Virbac Australia Pty. Ltd., NSW, Australia | ||
| Lidocaine hydrochloride, Ilium Lignocaine-20 | Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia | ||
| Uni-Core Punch Tool | World Precision Instruments Inc., FL, USA | ||
| Curved Forceps | World Precision Instruments Inc., FL, USA | ||
| Operating Microscope, Zeiss OPMI 99 | Zeiss, West Germany | ||
| 25 G Insulin needle | Terumo Corp., Tokyo, Japan | ||
| Dumont tweezers | World Precision Instruments Inc., FL, USA |
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