Summary
يمثل حقن داخل عضلة القلب عن طريق الجلد الموجهة ضربات القلب طريقة فعالة وموثوقة، واستهدافها لتقديم وكلاء نقل الجينات أو الخلايا في قلب الفئران. باتباع الخطوات الواردة في هذا البروتوكول، يمكن للمشغل سرعان ما تصبح المختصة في هذا، تقنية مينيملي تنوعا.
Abstract
نماذج الفئران من مرض القلب والأوعية الدموية مهمة للتحقيق في الآليات المرضية في جسم المريض واستكشاف علاجات التجدد المحتملة. تتم التجارب التي تنطوي على حقن عضلة القلب حاليا الوصول الجراحي المباشر من خلال بضع الصدر. في حين مريحة عندما يؤديها في وقت التلاعب التجريبية أخرى مثل ربط الشريان التاجي، والحاجة إلى إجراء الغازية للتسليم داخل عضلة القلب يحد التصاميم التجريبية المحتملة. من أي وقت مضى مع تحسين دقة الموجات فوق الصوتية وطرائق التصوير المتقدمة موسع، فمن الممكن الآن لأداء روتيني الموجهة بالأمواج فوق الصوتية، حقن داخل عضلة القلب عن طريق الجلد. هذه الطريقة فعالة وموثوق بها وكلاء يسلم إلى المنطقة المستهدفة من عضلة القلب. وتشمل مزايا هذه التقنية تجنب الأمراض الجراحية، ومرفق لاستهداف مناطق عضلة القلب بشكل انتقائي تحت توجيه الموجات فوق الصوتية، وفرصة لتقديم injectate إلى myocardiuم في عدة فترات زمنية محددة سلفا. مع تقنية يمارس، مضاعفات من حقن داخل عضلة القلب نادرة، والفئران العودة بسرعة إلى النشاط العادي على التعافي من التخدير. باتباع الخطوات الواردة في هذا البروتوكول، المشغل مع تجربة تخطيط صدى القلب الأساسية يمكن أن تصبح بسرعة المختصة في هذا، تقنية مينيملي تنوعا.
Introduction
أمراض القلب هي السبب الرئيسي للوفاة بين الرجال والنساء في الولايات المتحدة، وهو ما يمثل 600،000 حالة وفاة سنويا 1. نماذج الفئران من أمراض القلب والشرايين هي ذات أهمية حاسمة للتحقيق في الآليات الفيزيولوجية المرضية لاستكشاف العلاجات المحتملة. تسليم عضلة القلب من ناقلات الجينات العلاج والخلايا والرنا تعديل، وغيرها من العوامل العلاجية التحقيق تصاريح من إمكاناتها العلاجية لأمراض القلب 2-7 الجذعية. حاليا، هناك خيارات محدودة للتسليم عضلة القلب من العوامل العلاجية في نماذج الماوس 6. يستخدم الحقن داخل عضلة القلب تحت رؤية مباشرة عادة، ولكن يحتاج إلى القص أو بضع الصدر ويقتصر على المنطقة المكشوفة من القلب. في حين مريحة عندما يؤديها في وقت التلاعب التجريبية أخرى مثل LAD ربط، والحاجة إلى إجراء الغازية للتسليم داخل عضلة القلب يحد التصاميم التجريبية المحتملة ويقدم لآثار dditional من الإجراء (على سبيل المثال، والتليف بسبب بضع الصدر). تم الإبلاغ عن تسليم التامور عن طريق الجلد من ناقلات فيروسية، ولكن الموقع وتوزيع كيل العلاجية ليست متجانسة ويصعب السيطرة 8. نتائج حقن الشريان التاجي عن طريق الجلد في توزيع أكثر تجانسا من المواد المحقونة، ولكن فعالة وقابلة للتكرار تسليم التاجي يتحدى في نماذج الفئران.
هنا، نحن تصف الصدر داخل عضلة القلب تقنية الحقن المغلقة التي تسمح مينيملي، مشغل تسيطر استهداف العوامل العلاجية تحت توجيه الموجات فوق الصوتية. تقنية سهلة التعلم، يغني عن الحاجة إلى بضع الصدر أو القص ويصاحب مضاعفاتها التجريبية، وتوفر قدرا أكبر من المرونة على توقيت ومواقع الحقن داخل عضلة القلب. وبالتالي، حقن داخل عضلة القلب بمساعدة ضربات القلب يمثل طريقة بسيطة وفعالة للغاية من الناحية الفنية من التلاعبعضلة القلب في الفئران نماذج تجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع الخطوات المذكورة تحت البروتوكولات التي وافقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من مستشفى الأطفال في بوسطن.
1. إعداد
- تقييم أداء التشريحي والوظيفي الأساسي التي كتبها القلب تخطيط صدى القلب قبل البدء في بروتوكول الحقن، لأن الموقف محول الثابتة الأمثل للحقن داخل عضلة القلب قد لا تسفر عن آراء المثلى القياسية لترسيم التشريح وتقييم وظيفة.
- يظهر الإعداد حقن في أرقام 1A-1C. وضع حقنة فارغة مع إبرة مغمد، أعلى شطبة المنحى، في المشبك حقنة (انظر الشكل 1C) وتأمين محول بالموجات فوق الصوتية التحقيق في المشبك مسح الرأس (انظر الشكل 1B). تخفيف مسح الرأس قفل المشبك الكرة المشتركة (الشكل 1B) والتلاعب التوجه محول بحيث تتماشى بالتوازي مع محور الإبرة. إصلاح scan-موقف رئيس من خلال تشديد مسح الرأس قفل المشبك الكرة المفصل.
ملاحظة: للحقن في فئران بالغة، وإبرة G 30 مع 1 في / 2.5 سم طول هو الأمثل. حقنة 1 مل يمكن استخدامها لكميات أكبر، بينما حقنة gastight يمكن استخدامها للتحكم أكثر دقة من وحدات التخزين الصغيرة (5-10 ميكرولتر). - تطبيق هلام الموجات فوق الصوتية متحررا إلى الطرف محول مع ملعقة لتغطية الرأس على طول مجملها. unsheathe بعناية الإبرة واستخدام إبرة جبل ضوابط لدفع الإبرة مباشرة تحت محول وداخل هلام الموجات فوق الصوتية لتصور. إجراء تعديلات طفيفة باستخدام إبرة جبل السيطرة بحيث يتم تصور الإبرة بشكل واضح على طوله على صورة الموجات فوق الصوتية. إذا كان محاذاة بشكل صحيح محول موازية لإبرة في الخطوة 1.4، ثم ينبغي أن تبقى الإبرة داخل الطائرة التصوير كما تقدمت بها وسحب مع مفتاح التحكم حقن (الشكل 1C).
- في الخطوات اللاحقة، لا تخل الحاجةلو / محول المحاذاة الأفقية عن طريق تحريك إما في المحور الأفقي. بدلا من ذلك، استهداف مناطق محددة من القلب للحقن عن طريق تغيير الرأسي (المحور الصادي) موقف إبرة جبل وعن طريق تحريك منصة الحيوان.
- نقل محول متفوق من منصة الحيوان باستخدام جهاز التحكم ارتفاع المسح الضوئي (الشكل 1B) للسماح موضع لاحق من الفأرة تخدير على منصة الحيوان. هذا لن يعطل محاذاة محور س للمحول على محور طويل من الإبرة.
- إزالة الحقنة التي كانت تستخدم لمحاذاة من المشبك حقنة وتجاهل بعناية. تحميل إبرة جديدة و محقنة مع injectate لحجم الهدف النهائي، والسماح لمساحة ميتة في طرف الحقنة. كن حذرا لإزالة فقاعات الهواء. وضع الحقنة في المشبك حقنة دون تعديل في محاذاة محور س. التراجع تماما الحقنة باستخدام جهاز التحكم الحقن.
ملاحظة: لأغراض التدريب الأولية، واستخدام اللون الأزرق ايفان لصبغ (1٪)، التريبان الزرقاء وصمة عار (0.4٪) أو تعليق المجهرية الفلورسنت مثل injectate يمكن أن يساعد المشغل في تأكيد الكفاءة ونجاح الحقن المستهدفة.
2. حقن
- بدوره على دفئا متكاملة من منصة التدفئة وضعه لمدة 37 درجة مئوية. وضع منصة الحيوان 180 درجة من التوجه التصوير المعتاد، مع المشبك خرطوم التخدير ورئيس الحيوان الأقرب إلى المشغل. وهذا يسمح للقلب (في الجانب الأيسر من الصدر) ليكون المماثل إلى المشبك المحاقن والإبر. ملاحظة: في اتجاه عقارب الساعة تعديلات طفيفة الدوران الإضافيين لمنصة الحيوان قد تكون ضرورية لتوجيه صحيح للقلب الطائرة القص التصوير محور القصير التي سيتم استخدامها للحقن (الشكل 2A)
- اعداد الفئران للتخطيط صدى القلب كما ذكرت سابقا 9. تخدير الماوس في غرفة الاستقراء مع 2٪ الأيزوفلورين. إزالة شعر الصدر مع كريم إزالة الشعر لد تطبيق التشحيم هلام لكلتا العينين لمنع جفاف الصلبة.
- رفع محول باستخدام المسح الضوئي السيطرة ارتفاع الرأس (الشكل 1B). وضع مستلق تخدير الماوس فوق منصة الحيوانية ساخنة مع خطم داخل مخروط الأنف إيصال٪ الأيزوفلورين 1-3 (أرقام 2A-2B). إدراج بلطف التحقيق المستقيم والشريط الكفوف أربعة إلى أقطاب ECG، وتطبيق هلام الكهربائي للاتصال الكهربائي.
ملاحظة: يجب ضمان مستوى مناسب من التخدير من أجل المعاملة الإنسانية للحيوانات. ينبغي أن يكون هناك أي تغيير في معدل ضربات القلب وأي رد على موضع إبرة من خلال جدار الصدر. المتكاملة التحكم في درجة الحرارة التماثل الساكن منصة الحيوان ينبغي أن تستخدم للحفاظ على سوائية الحرارة (37 ± 0.5 ° C)، وانخفاض درجة الحرارة سوف يؤدي إلى بطء نسبي، توسع البطين، واحتمال عدم الراحة. - بمجرد أن الفأر هو آمن على منصة الحيوان، وانخفاض محول على depilaتيد الصدر باستخدام المسح الضوئي السيطرة ارتفاع الرأس (الشكل 1B). الإعداد الأمثل لحقن الموجات فوق الصوتية للقلب هو أن تصور في القص القصير التوجه المحور، وفقا لتقنية تخطيط صدى القلب القياسية. وتناوب على منصة الحيوان 20-30 درجة في اتجاه عقارب الساعة للحصول على نافذة الصوتية الأمثل للحقن في الطائرة التصوير محور القصير (أرقام 2A-2B). ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن إجراء الحقن من القص الطويل التوجه محور بواسطة عكس اتجاه عقارب الساعة تناوب على منصة الحيوان (الشكل 2C).
- استخدام ضوابط تعديل منصة الحيوان لضبط مجال الرؤية واستهداف أي موقع الحقن المطلوب في عضلة القلب البطين الأيسر. عموم ذهابا وإيابا من قمة إلى قاعدة القلب لاستهداف موقع الحقن المطلوب في عضلة القلب البطيني الأيسر (الأرقام 3A-3C). ملاحظة: midpapillary القص عرض محور القصير (الشكل 3A) يقدم reproduciblمعالم الإلكترونية التي تتيح متابعة التصوير من موقع الحقن. ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن استخدام عرض المحور الطويل المجاور للقص لاستهداف موقع الحقن محدد مسبقا (الشكل 3D).
- بدءا من حقنة في المشبك حقنة تراجعوا تماما، تقدم ببطء الحقنة نحو الصدر الحيوان من خلال تحويل اتجاه عقارب الساعة السيطرة حقن (الشكل 4A). للسماح التصور الموجات فوق الصوتية واضح على كل من القلب وطرف الإبرة وهي تقترب من الصدر، واستخدام الكثير من هلام الموجات فوق الصوتية على الجانب الأيسر من الصدر وتحسين نافذة الصوتية عن طريق وضع حقل واسع من الرأي على الضوابط تخطيط صدى القلب. تعيين نقطة اتصال / منطقة في موقع الهدف للحقن. تعديلات طفيفة على إبرة جبل ضوابط يمكن تحسين صورة الإبرة على طوله.
ملاحظة: بعض أجهزة الموجات فوق الصوتية لها وظيفة دليل البرامج إبرة تمديد رقميا خط طول المحور الطويل للإبرة من خلال لعضلة القلب المستهدفة(الشكل 4B). هذه أداة برمجية يمكن أن يكون مفيدا ولكن ليس ضروريا. - مع الحيوان مخدرا بشكل مناسب (1-3٪ الأيزوفلورين مختلطة مع 0،5-0،8 لتر / دقيقة 100٪ أكسجين)، ودفع الإبرة من خلال جدار الصدر من الفأرة وإلى عضلة القلب، ومراقبة بعناية الموقف من طرف الإبرة مشطوف على الإطلاق مرات. وقف تقدم عند طرف الإبرة داخل عضلة القلب هو الهدف (الشكل 4C). يجب أن يكون طرف مشطوف كله بشكل آمن داخل عضلة القلب، لتجنب تسرب injectate في الفضاء التامور.
- عندما غيض في الموقع المطلوب، تقديم injectate بالضغط على المكبس حقنة. تقديم injectate ببطء، على مدى 5-30 ثانية (اعتمادا على حجم يجري تسليمها). يمكن أن يتم تسليم ما يصل إلى 50 ميكرولتر من injectate دون المساومة على وظيفة البطين. وظهور echobright عابرة للمنطقة حقن عضلة القلب قد يكون واضحا بعد حقن ناجحة. فترة وجيزة (ثانية) من bradycard قريبويلاحظ IA أحيانا مع الحقن في عضلة القلب وسرعان ما يحل.
- بمجرد تدار injectate، سحب الإبرة فورا بواسطة عكس اتجاه عقارب الساعة دوران مفتاح التحكم الحقن. يجب أن تبقى الماوس تحت التخدير لعدة دقائق من الملاحظة تخطيط صدى القلب لتأكيد الحفاظ على وظيفة البطين وأي مضاعفات postprocedural. إذا أشار، مناطق متعددة من عضلة القلب يمكن حقن متسلسل من اعادة تموضع من زاوية الإبرة من النهج تعديل منصة الحيوان. بعد الحقن داخل عضلة القلب، يتم وضع الماوس في قفص من تلقاء نفسها وسمح للتعافي من التخدير تحت الملاحظة.
- لا تترك حيوان غير المراقب حتى استعاد وعيه أنه كاف للحفاظ على الاستلقاء القصية. لا عودة الحيوان الذي خضع لحقن داخل عضلة القلب للشركة من الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما. يجب وضع القفص على وسادة thermoregulated مع إعادةعدي توفير المياه والماوس الغذائي. وليس من المتوقع Postprocedural الانزعاج وعدم استئناف مناسب السلوك العادي بعد وقت قصير من تدخل يشير إلى وجود المضاعفات المحتملة (انظر مناقشة).
- تجاهل بعناية الإبرة مباشرة بعد الانتهاء من الحقن داخل عضلة القلب لتقليل مخاطر الإصابة الحادة إلى المشغل أو من المارة. يمكن إعادة استخدام إبرة يؤدي إلى تصد من طرف مما يجعلها أكثر صعوبة لاختراق عضلة القلب ويؤدي إلى ارتفاع خطر المضاعفات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
حقن الفئران داخل عضلة القلب مع الأزرق صبغ أو المجهرية الفلورسنت
حقن صبغة زرقاء ايفان هو مفيد لأغراض التدريب. بعد فترة وجيزة الحقن، والموت ببطء الماوس وإزالة القلب لتصور موقع حقن صبغة زرقاء ويبين الشكل 5 مثالا لحقن ناجحة، مع صبغة زرقاء التسلل عضلة القلب على مستوى منتصف العضلات الحليمية (الشكل 5A، والمنطقة المغلقة بواسطة خط منقط). سوف ايفانز صبغة زرقاء تغسل من الأنسجة في غضون ساعات قليلة. لأكثر العلامات على موقع الحقن دائمة، المجهرية الفلورسنت التي لا تزال قائمة إلى أجل غير مسمى في موقع الحقن يمكن استخدامها. يوضح أرقام 5C-5F أهداف حقن متعددة في الأمامي والخلفي غادر جدران البطين.
حقن اتش في عضلة القلب
لتصور تسليم اتش لعضلة القلب عن طريق الموجات فوق الصوتية دليلحقن التطوير، ونحن حقن اتش فيها cardiomyocyte محددة تروبونين الفئران T المروج 10 محركات التعبير عن الثدييات كودون الأمثل لجنة المساواة العرقية 11. تم تحديد مجال إعادة التركيب لجنة المساواة العرقية بوساطة باستخدام الفئران Rosa26 mTmG، لجنة المساواة العرقية في إعادة التركيب الذي ينطفئ بروتين فلوري الأحمر (RFP) ويتحول على بروتين الفلورية الخضراء (GFP). حقنة واحدة من 50 فيروس ميكرولتر (2.8 × 10 9 وحدات المعدية / مل) تنشيط إقليميا GFP التعبير خلال 7 أيام من الحقن (الشكل 6). ويقدر بعض تسلل عضلة القلب الإقليمي على طول طائرات الأنسجة خارج الموقع الأولي للحقن في الصور مقطوع.
الرقم 1. الموجات فوق الصوتية الموجهة الإعداد الحقن. A) لمحة عامة عن نظام السكك الحديدية المتكاملة، والتي تسمحق محاذاة حقن حقنة والموجات فوق الصوتية مسح الرأس. B) الموجات فوق الصوتية ضوابط رأس المسح الضوئي. يتم تأمين رأس المسح في الموقف، الانحياز إلى حقنة الحقن. يتم ضبط مجال الرؤية عن طريق تحريك الحيوانات منصة. C) ضوابط حقن حقنة.
الرقم 2. الأمثل لتحديد المواقع الماوس على منصة الحيوان للحقن إبرة الموجهة بالأمواج فوق الصوتية. أ) توجه منصة الحيوان وإبر ومحول للحقن داخل عضلة القلب من الطائرة التصوير محور القصير. B). المقربة من مسار الإبرة تحت الحقل محول للعرض من خلال كمية سخية من هلام الموجات فوق الصوتية لأنها تمر في التجويف الصدري جيم) توجه منصة الحيوان وإبر ومحول للinje داخل عضلة القلبction في الطائرة التصوير منذ فترة طويلة محور القص.
الرقم 3. صور الموجات فوق الصوتية التمثيلية للعضلة القلب لاستهداف في محور القصير ومحور طويل طائرات القص. AC) محور الصور قصيرة من البطين الأيسر في مستوى منتصف العضلات الحليمية (A)، تحت العضلات الحليمية (B) وقمة القلب (C). D) محور الطويلة صورة يتظاهرون حقن داخل عضلة القلب في البطين الأيسر الجدار الأمامي. سهام تسليط الضوء على موقف رمح الإبرة.
الرقم 4. صور الممثل 2D ضربات القلب. A) B) وظيفة إبرة دليل تراكب الانحياز على طول المحور الطويل للإبرة والتنبؤ دورة (الخط الأخضر المنقط) من خلال عضلة القلب الأمامي. C) حقن عضلة القلب مع شطبة من الإبرة مدفونة داخل جدار عضلة القلب الأمامي.
الشكل 5. بمناسبة موقع الحقن مع صبغ ايفان الأزرق أو المجهرية الفلورسنت. حقن داخل عضلة القلب من صبغة زرقاء في الجدار الأمامي عضلة القلب. A) القسم عرضية من القلب على مستوى العضلات midpapillary، مما يدل على تسرب الصبغة 30 دقيقة بعد تسليم داخل عضلة القلب للالبطين الأيسر. B) المرئية من الموقع ثقب الإبرة على السطح الجانبي الأيسر من عضلة القلب. C، D) عضلة القلب الفئران مما يدل بلي فلوري الحمراء بعد 7 أيام من الحقن داخل عضلة القلب منفصل في الأمامي والخلفي غادر جدران البطين. E، F) يسار عضلة القلب البطيني مقطوع في العضلات منتصف حليمي في الطائرة عرضية من ترسب قلب يتظاهرون من بلي فلوري الحمراء. كانت بلي المنتشرة في جميع أنحاء سطح قطع بسبب التشتت في المخزن المؤقت أثناء وبعد قطع القلب مع شفرة السكين.
الرقم 6. وضع العلامات الفلورية الجدار الأمامي للعضلة القلب Rosa26 mTmG بعد الحقن داخل عضلة القلب واحد من TNT-iCreاتش. A) المجهر الضوئي من الجدار الأمامي للقلب كله الفئران 7 أيام بعد الحقن الفيروسة الغدانية الإقليمي. B) صورة فلوري (EGFP) في نفس القلب يدل التنفيذ الناجح والتنبيغ عضلة القلب عن طريق ناقلات الفيروسة الغدانية. C، D) قسم عرضية في مستوى العضلات منتصف حليمي، مما يدل على مدى ترنسفكأيشن الإقليمي من الحقن داخل عضلة القلب واحد من اتش (50 ميكرولتر من 2.8 × 10 9 وحدات المعدية / مل).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن تسليمها البيولوجية لعضلة القلب عن طريق الحقن المباشر داخل عضلة القلب، حقن داخل التأمور، أو إدارة غير مباشرة عبر مجرى الدم. ووصف مؤخرا خلية مقرها محاكمات العلاج في نماذج احتشاء عضلة القلب نهجا بضع الصدر مفتوحة للتسليم injectate 12-14. عامل مهم في نجاح أي تدخل علاجي عضلة القلب يتوقف على اختيار الطريق التسليم. ويتحقق أعلى جرعة المحلية البيولوجية عن طريق تسليم داخل عضلة القلب 15،16. الحقن داخل عضلة القلب تحت التصور المباشر هو الأسلوب الأكثر مباشرة ويسمح لإدارة المستهدفة داخل عضلة القلب 17. ومع ذلك، هذا الأسلوب هو أيضا الأكثر الغازية، لأنه يتطلب فتح تجويف الصدر والتأمور لفضح عضلة القلب الهدف 18. أجزاء من القلب، مثل السطح الظهري لها، لا تصور بسهولة وضخت باستخدام هذا الأسلوب. والغزو من procedيقيد لدى عودتهم أيضا جداول الجرعات العلاجية المحتملة. هنا، نحن تصف تقنية بسيطة من الناحية الفنية، يمكن الاعتماد عليها وقابلة للتكرار لتقديم البيولوجية أو المخدرات تحت إرشاد الموجات فوق الصوتية بشكل آمن عن طريق الحقن داخل عضلة القلب عن طريق الجلد، من دون الاعتلال والقيود التعرض بضع الصدر الجراحي. في أكثر من 150 الفئران المحقونة حتى الآن، بعد أن تم الحصول على الكفاءة الفنية الأولى، كان معدل وفيات periprocedural لدينا أقل من 5٪ عندما تم استهداف أقل من أربعة مواقع عضلة القلب في وقت واحد. إجمالي حجم injectate تصل إلى 200 ميكرولتر وجيد التحمل من المستغرب بواسطة قلب الفئران. عضلة القلب الأمامي يفسح المجال كذلك هدفا للحقن، وبالنظر إلى التوجه مواز لهذه المنطقة من عضلة القلب على محور طويل من الإبرة، الإبرة السماح بالبقاء في عضلة القلب بشكل أكثر أمانا. من المهم أن المشغل تصور طرف مشطوف كامل في عضلة القلب قبل الحقن، وهذا يضمن تسليم الكامل للinjectate دون التسرب إلى الأنسجة المحيطة بها. الرعاية لضمان طرف الإبرة يبقى دائما مرئية داخل عضلة القلب هو أيضا حرج للحقن عضلة القلب ناجحة. عندما تمارس مع صبغة زرقاء ايفان، وسوف الحقن غير مقصود في غرفة البطين يؤدي في الماوس بسرعة بتطوير ونه الازرق مرئية أكثر وضوحا في الجلد نزعه. ومن الجدير بالذكر أيضا أن إدخال الإبرة من خلال جدار الصدر تتحدد فقط عن طريق الموجات فوق الصوتية عرض الصورة في عضلة القلب الهدف المقصود وليس من قبل أي معالم التشريحية سطح الماوس. لإيكوغرافية ذوي الخبرة، والكفاءة في حقن داخل عضلة القلب يمكن أن يتحقق بشكل معقول بعد الممارسة على 4-5 المحاولات.
وتمر الإبرة من خلال جدار الصدر، يجب أن تمر عبر الفضاء وربي. ليس من غير المألوف أن يكون لإجراء تعديلات طفيفة على طائرة التصوير مرة واحدة من خلال الفضاء وربي للحفاظ على طرف مشطوف بوضوح في الرأي. عشروعادة ما يتم ذلك من خلال تعديلات طفيفة من منصة الحيوان أو الضوابط حقن حقنة. وينبغي أن يتم إدخال بعض التعديلات الطفيفة مرة الإبرة من خلال القفص الصدري ولكن قبل مرت عليه في عضلة القلب لمنع تهتك عضلة القلب والصدمة من تكرار التلاعب طرف الإبرة. للحد من مخاطر تدمي التأمور، ينبغي أن يكون الهدف هو تدخل القلب من المرات القليلة التي يراها ضرورية لاستكمال تسليم injectate. على الرغم من أن تقنية الموضحة هي للحقن داخل عضلة القلب في الطائرة محور قصيرة من القلب، فمن الممكن على حد سواء لحقن في الطائرة القص محور طويل من القلب عن طريق تعديل بسيط من منصة الحيوان لتتماشى مع هذه الطائرة (الشكل 2C) وإعادة توجيه الإبرة لدخول الهدف المقصود من عضلة القلب (الشكل 3D).
يمكن تأكيد باستخدام مؤشر نجاح الحقن داخل عضلة القلب صبغ تليها examinat المرضية فوريايون من القلب الماوس حقن. سوف حقن تعليق المجهرية الفلورسنت تبقى إلى أجل غير مسمى في موقع الحقن، ويمكن أن تدار بصورة متزامنة مع وكيل آخر لتحديد المنطقة المستهدفة. هو الموت الرحيم الماوس باستخدام ثاني أكسيد الكربون المستنشق من قبل أفراد مدربين في بروتوكولات التعامل مع الحيوانات المؤسسية. وفحص سطح القلب تكشف عن المنطقة المحقونة، وسوف تشريح القلب مع مصفوفة القلب تسفر المقاطع العرضية التي سوف تظهر المنطقة المحقونة. عند رغبتك فى الحقن المتكررة و / أو التصوير من نفس المنطقة عضلة القلب مع مرور الوقت، فإنه من المفيد استخدام طائرات التصوير القياسية واستهداف المعالم التشريحية استنساخه. على سبيل المثال، وأنها مريحة لاستخدام الطائرة التصوير محور القصير لاستهداف البطين الأيسر على مستوى العضلات midpapillary (الشكل 3A). المضاعفات المحتملة هي أشد تمزق عضلة القلب / تمزق وما يترتب عليه نزيف و / أو تدمي التأمور. خطر عشرهو زيادة تعقيد مع التمريرات المتكررة من الإبرة (أربعة أو أكبر) من خلال عضلة القلب، حقن السريع لبلعة السوائل، إعادة استخدام تلميح إبرة اضعافها، واستخدام الفئران الصغيرة (تحت 15 ز) الفئران. إذا تحقن أهداف متعددة داخل عضلة القلب متسلسل (الجدار الأمامي، الجدار الجانبي أو جدار أدنى)، فمن الأمثل لتحقيق ذلك في ثلاث تمريرات أو أقل من الإبرة من خلال عضلة القلب لتقليل خطر حدوث مضاعفات إجرائية. الجدران الجانبية للعضلة البطين الأيسر يمكن حقن بالتزامن مع مرور واحد من الإبرة من خلال جدار الصدر (أرقام 5E و 5F) لأنها محاذاة موازية لبعضها البعض ولكن أي هدف جدار عضلة القلب الآخر سيتطلب إعادة الإدراج من الإبرة من خلال جدار الصدر بعد تعديل زاوية الإبرة. لا ينبغي oversedated الماوس كما بطء القلب (تحت 400 نبضة في الدقيقة) قد تزيد من حجم نهاية الانبساط وبشكل ملحوظ تقليل سمك جدار عضلة القلب. لديناالتجربة بالنسبة للفئران للتعافي من الإجراء بسرعة وambulate في أقفاصها في غضون دقائق من التعافي من التخدير. مضاعفات، عندما لا تنشأ، هي مفاجئة وتحدث في وقت التدخل.
على الرغم من هذا البروتوكول هو مكتوب للحقن داخل عضلة القلب، وهو تعديل طفيف من الموقف النهائي طرف الإبرة يسمح للمشغل لاستهداف الحقن إلى مجرى الدم من تجويف البطين الأيسر للتسليم الشرياني الجهازي وكيل. الانسحاب على المكبس حقنة يمكن تأكيد ما إذا كان الطرف شطبة هو في غرفة البطين الأيسر (الأكسجين الدم الغني يستنشق) أو في كتلة العضلات عضلة القلب. مع ناقلات فيروسية ذات كفاءة عالية وجهاز محددة اليوم، وتحديدا في الغدة المرتبطة المصلي فيروس 9 ناقلات مع المروج معين القلب، ويمكن للمحقق التكيف مع هذه التقنية كبديل للالرجعية المداري الحقن أو الذيل الوريد لتحقيق التسليم الآمن للأعلى الحمل الفيروسي في التاجيالتداول، مع انخفاض امتصاص مرور الأول عن طريق الكبد. في نموذج الفئران postinfarct المزمن، عضلة القلب ندوب ومتليفة قد لا تصلح جيدا للحقن داخل عضلة القلب نظرا للهدف الجدران رقيقة الناتجة المشغل لديه لدفن رأس الإبرة في. ومع ذلك، ينبغي المناطق المنطقة الحدودية من عضلة القلب تكون قابلة للحقن داخل عضلة القلب و نوافذ الصوتية بعد بضع الصدر هي أكثر من كافية لتوجيه الموجات فوق الصوتية ناجحة.
الموجات فوق الصوتية الموجهة، حقن داخل عضلة القلب في النماذج الحيوانية يمثل جيد التحمل، طريقة فعالة، مينيملي، ومباشرة من الناحية الفنية لعوامل بيولوجية التسليم إلى عضلة القلب. هذا الأسلوب يمكن استخدامه بسهولة للتسليم الناجح لناقلات الجينات أو الخلايا العلاجات القائمة في أي نقطة زمنية تجريبية في نموذج الفئران، بما في ذلك الإجراءات بعد بضع الصدر مفتوحة السابقة. الحصول على الألفة والكفاءة والمعدات وإجراء الحقن وضمان النجاح لاحقا في نماذج تجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vevo 2100 ultrasound imaging system | Visualsonics | ||
| Vevo Integrated Rail System III | Visualsonics | ||
| Microscan MS400 transducer | Visualsonics | ||
| Microscan MS550D transducer | Visualsonics | ||
| PrecisionGlide needles | BD | 305128 | 30 G x 1 in/2.5 cm |
| 1 cc slip tip syringe | Exel International | 26048 | or equivalent |
| Gastight 50 μl glass syringes | Hamilton | 1705 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250 | or equivalent |
| Isoflurane | Baxter | AHN3640 | or equivalent |
| Aquasonic 100 | Parker Laboratories | (01-08) | or equivalent |
| Polystyrene microspheres (red fluorescent) | Life Technologies | F-8842 | or equivalent |
References
- Kochanek, K. D., et al. Deaths: final data for 2009. Natl Vital Stat Rep. 60 (3), 1-117 Forthcoming.
- Strauer, B. E., Steinhoff, G. 10 years of intracoronary and intramyocardial bone marrow stem cell therapy of the heart: from the methodological origin to clinical practice. J Am Coll Cardiol. 58, 1095-1104 (2011).
- Cheng, K., et al. Intramyocardial autologous cell engraftment in patients with ischaemic heart failure: a meta-analysis of randomised controlled trials. Heart Lung Circ. 22 (11), 887-894 (2013).
- Fischer-Rasokat, U., et al. A pilot trial to assess potential effects of selective intracoronary bone marrow-derived progenitor cell infusion in patients with nonischemic dilated cardiomyopathy: final 1-year results of the transplantation of progenitor cells and functional regeneration enhancement pilot trial in patients with nonischemic dilated cardiomyopathy. Circ Heart Fail. 2, 417-423 (2009).
- Seth, S., et al. Percutaneous intracoronary cellular cardiomyoplasty for nonischemic cardiomyopathy: clinical and histopathological results: the first-in-man ABCD (autologous bone marrow cells in dilated cardiomyopathy) trial. J Am Coll Cardiol. 48, 2350-2351 (2006).
- Ladage, D., et al. Percutaneous methods of vector delivery in preclinical models. Gene Ther. 19, 637-641 (2012).
- Zangi, L., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nat Biotechnol. 31, 898-907 (2013).
- Laakmann, S., et al. Minimally invasive closed-chest ultrasound-guided substance delivery into the pericardial space in mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 386 (3), 227-238 (2013).
- Respress, J. L., Wehrens, X. H. Transthoracic echocardiography in mice. J Vis Exp. (39), e1738 (2010).
- Wang, G., et al. Characterization of cis-regulating elements and trans-activating factors of the rat cardiac troponin T gene. J Biol Chem. 269, 30595-30603 (1994).
- Shimshek, D. R., et al. Codon-improved Cre recombinase (iCre) expression in the mouse. Genesis. 32, 19-26 (2002).
- Lichtenauer, M., et al. Intravenous and intramyocardial injection of apoptotic white blood cell suspensions prevents ventricular remodelling by increasing elastin expression in cardiac scar tissue after myocardial infarction. Basic Res Cardiol. 106 (4), 645-655 (2011).
- Herrmann, J. L., et al. Postinfarct intramyocardial injection of mesenchymal stem cells pretreated with TGF-alpha improves acute myocardial function. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 299 (1), 371-378 (2010).
- Zhou, Y., et al. Direct injection of autologous mesenchymal stromal cells improves myocardial function. Biochem Biophys Res Commun. 390 (3), 902-907 (2009).
- Campbell, N. G., Suzuki, K. Cell delivery routes for stem cell therapy to the heart: current and future approaches. J Cardiovasc Transl Res. 5 (5), 713-726 (2012).
- Hou, D., et al. Radiolabeled cell distribution after intramyocardial, intracoronary, and interstitial retrograde coronary venous delivery: implications for current clinical trials. Circulation. 112, Suppl 9. 150-156 (2005).
- Dib, N., et al. Recommendations for successful training on methods of delivery of biologics for cardiac regeneration: a report of the International Society for Cardiovascular Translational Research). JACC Cardiovasc Interv. 3 (3), 265-275 (2010).
- Dib, N., et al. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 177-181 (2011).
