Summary
超声引导经皮内注射表示一个高效，可靠和可靶向形式的递送基因转移剂或细胞进入小鼠心脏。按照本协议所列的步骤，操作者可以在这个多才多艺，微创技术迅速成为主管。
Abstract
心血管疾病的小鼠模型是研究病理生理机制，探索潜在的再生疗法很重要。累及心肌注射实验，通过开胸手术直接进入正在执行。同时方便在另一个实验操作时，如冠状动脉结扎时执行的，需要进行侵入性手术的心肌内交付限制了潜在的实验设计。随着不断提高超声的分辨率，先进的无创成像方式，现在是可行的执行例行超声引导下经皮内注射。这种方式有效，可靠地提供代理心肌的目标区域。这种技术的优点包括：避免手术并发症的，该设施为目标选择性地在超声引导下心肌的区域，并有机会提供注射液的myocardium在多个预定的时间间隔。随着实践的技术，从内注射的并发症是罕见的，老鼠迅速从麻醉恢复正常活动的恢复。按照本协议所列的步骤，基本经验的超声心动图的操作者可以快速在这种通用的，微创技术成为称职。
Introduction
心脏疾病是导致死亡的男性和女性在美国的首要原因，占每年60万人死亡1。心血管疾病的小鼠模型是研究病理生理机制，并探索潜在的治疗非常重要。心肌递送基因治疗载体，干细胞，修饰RNA，以及它们的治疗潜力的心脏疾病2-7其它治疗剂允许调查。目前，有用于在小鼠模型6心肌递送治疗剂的选择有限。心肌内注射在直视下被普遍使用，但需要胸骨切开或开胸并仅限于心脏的暴露区域。而方便的时候在另外一个实验操作，如法援署结扎时进行，需要进行侵入性手术的心肌内交付限制了潜在的实验设计，并引入了从过程dditional影响（ 例如 ，纤维化由于开胸手术）。经皮心包递送病毒载体已被报道，但在现场和治疗剂的分布是不均匀的，而且很难控制8。经皮冠状动脉注射导致注射的材料，但有效的和可重复的冠状动脉提供更多的均匀分布是具有挑战性的小鼠模型。
在这里，我们描述一个胸外心肌内注射技术，使微创，操作员控制的超声引导下治疗药物靶向。该技术是简单易学，避免了需要开胸或胸骨切开术和随之而来的实验性的并发症，并且提供了关于定时和心肌内注射的位点具有更大的灵活性。因此，超声心动图辅助心肌内注射代表了技术上的简单而高效的操纵方法心肌细胞在小鼠实验模型。
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Protocol
根据批准的波士顿儿童医院的机构动物照顾及使用委员会的协议进行所有的描述的步骤。
1，准备工作
- 开始注射方案之前进行超声心动图基线心脏解剖和功能评估，为心肌内注射的最佳固定传感器位置可能不会产生划定解剖和功能评估的最佳标准的意见。
- 注入设置示于图1A-1C。放置带护套的针的空注射器，斜面朝上，在针筒夹持件（参见图1C），并固定超声换能器探头的扫描头夹紧装置（参见图1B）。松开扫描头夹紧球锁关节（ 图1B）和操作传感器的方向，使其平行于针的轴线。固定扫描拧紧扫描头夹球锁关节头位置。
注：对于注射成年小鼠中，地下30针用1 / 2.5厘米长是最优的。 1ml注射器可用于较大的体积，而以气密注射器可用于更精确地控制较小的体积（5-10微升）。 - 自由地应用于超声凝胶至所述换能器头用刮刀以覆盖沿着其全部的头部。小心出鞘针并使用针安装控制前进直属换能器和用于可视化的超声凝胶内的针。使用针安装控制，使针清楚地显现沿其在超声波图像上的长度小的调整。如果所述换能器被适当地对准平行于针在步骤1.4中，然后将针应保持在成像平面内，因为它是前进和撤回与喷射控制旋钮（ 图1C）。
- 在随后的步骤中，请勿打扰，需要通过移动或者在横轴LE /换能器的水平取向。相反，通过改变针的垂直（y轴）的位置安装并通过移动动物平台定位的心脏注射的特定区域。
- 从使用扫描高度控制（ 图1B），以允许将麻醉小鼠随后放置到动物平台的动物平台移动所述换能器优。这不会破坏传感器的x轴对准到针的长轴。
- 除去，是使用用于对准从针筒夹持并小心丢弃的注射器。加载新的针头和注射器与注射液的最终目标体积，从而允许在该注射器尖端死空间。请注意，以去除气泡。将注射器插入针筒夹持件，而无需调整其x轴对准。完全缩回使用喷射器上的注射器。
注：对于初次训练的目的，采用伊文思蓝的染料（1％），台盼蓝染色（0.4％）或荧光微球注射剂的悬浮液可以帮助运营商在确认能力和有针对性的注射成功。
2，注射
- 打开加热平台的集成暖和，并将其设置为37℃。将动物平台180°从通常的摄像方向，在麻醉的软管夹最靠近操作者的动物和头部。这使得心脏（在胸部的左侧）为同侧的针筒夹持件和针。注意：附加次要顺时针旋转调整动物的平台可能有必要正确地定向所述心脏对于将用于注射（ 图2A）胸骨旁短轴像平面。
- 准备老鼠超声心动图如先前报道9。麻醉的小鼠中的感应室，用2％异氟醚。删除胸毛与脱毛膏的ð申请润滑凝胶到双眼，以防止巩膜的干燥。
- 提高利用扫描头高度控制（ 图1B）的换能器。将麻醉的小鼠仰卧上盖的加热动物平台内的鼻锥体提供1-3％的异氟烷（ 图2A-2B）的口鼻部。轻轻插入直肠探头，并用胶带将四只爪子的心电电极，施加电极凝胶的电接触。
注：麻醉的适当水平，必须确保人道待遇的动物。应在心脏速率没有变化，并通过胸壁到针的放置没有响应。动物平台的集成稳态温度控制应该被用于维持正常体温（37℃±0.5℃），因为低温会导致相对的心动过缓，心室扩张，并且可能不适。 - 一旦鼠标是动物平台上的安全，降低换能器到depila泰德胸部用扫描头高度控制（ 图1B）。最佳超声设置注射是对心脏进行可视化在胸骨旁短轴方向，按照标准的超声心动图技术。旋转动物平台20-30°顺时针旋转，以获得最佳的声窗口用于注射在短轴成像平面（ 图2A-2B）。注意：可替换地，喷射可以从胸骨旁长轴方向由动物平台（ 图2C）的逆时针旋转执行。
- 使用动物平台调整控制以调整视场，并针对任何所需的注射部位在左心室心肌。潘回的往复从顶点到心脏的基部为目标的左心室心肌（ 图3A-3C）的所需注射位置。注：midpapillary胸骨旁短轴观（ 图3A）提供reproduciblê地标允许注射部位的后续成像。注意：可替换地，胸骨旁长轴视图可用于靶向预定的注射部位（ 图3D）。
- 与在完全缩回针筒夹持的注射器开始，慢慢转动喷射控制顺时针方向（ 图4A）前进朝向动物的胸注射器。以使两者的心脏和针尖清晰超声可视化，因为它接近胸部，使用大量超声凝胶的胸部以上的左侧并通过在超声心动图的控制设置的宽视场优化声学窗口。在目标部位注射设定焦点/区。微调针安装控件可以优化沿其长度的指针的图像。
注意：某些超声波机器具有针导向的软件功能，通过与靶心肌以数字方式延伸沿针的长轴的线（ 图4B）。这样的软件工具可以是有益的，但不是必须的。 - 与动物适当镇静剂（1-3％异氟醚混合0.5-0.8升/分钟100％氧气），通过胸壁的鼠标和进入心肌推进针头，仔细观察斜口针尖端的位置在所有次。停止行进时，针尖是目标心肌（ 图4C）内。整个斜尖应该是安全范围内的心肌，以避免注射液漏入心包腔。
- 当尖端处于所需的位置，由推压注射器柱塞，提供注射剂。提供的注射液慢慢地，在5-30秒（取决于体积交付）。截至50微升注射液的可交付不影响心功能。瞬态echobright外观注入心肌区域可能会成功注射后明显。一个简短的（秒）期间相对bradycard的IA偶尔会注意到，注射到心肌并迅速解决。
- 一旦注射液被给药，迅速拔出针头的注射控制旋钮逆时针旋转。鼠标应保持在麻醉下进行的超声心动图观察几分钟，确认保存心室功能并没有任何的术后并发症。如果指明，心肌的多个区域可以被串行地通过调节动物平台重新定位的方式将针的角度的注入。心肌内注射后，将小鼠放置在其自己笼中，并使其从麻醉下的观察来恢复。
- 不要让动物无人看管，直到它已经恢复了足够的意识来维持胸骨斜卧。不返回已经历心肌内注射到其他动物的公司，直到完全恢复的动物。网箱应放在与真是个温控垫安以轩提供水和鼠标的饮食。操作后的不适并不预期干预失败后不久，适当地恢复正常的行为提出了一个潜在的并发症（见讨论）。
- 小心地丢弃针头心肌内注射完成后，立即以减少锐器伤害到操作者或旁观者的风险。重复使用的针可导致针尖钝化使它更具挑战刺穿心肌和导致并发症的风险较高。
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Representative Results
小鼠心肌内注射蓝色染料或荧光微球
注射伊文思蓝染料是用于培训目的。一旦注射后，安乐死的小鼠并取出心脏以可视化的注入蓝色染料的位置， 图5示出了一个成功的注射液，例如，用蓝色染料渗入心肌在中期乳头肌水平（ 图5A，区域包围由虚线）。伊文思蓝染料将洗出组织的几个小时之内。为更持久的注射部位的标记，可使用该无限期地保留在注射部位的荧光微球。 图5C-5F示出了前部和后部的左心室壁上的多次喷射的目标。
腺病毒注射到心肌
通过超声引导可视化腺病毒的交付心肌ð注入，我们注射腺病毒在哺乳动物的心肌特异性大鼠肌钙蛋白T启动10个驱动器的表达密码子优化的Cre重组酶11。的Cre介导的重组的域，使用ROSA26 mTmG小鼠，其中Cre重组酶的重组熄灭红色荧光蛋白（RFP），并接通绿色荧光蛋白（GFP）来确定。单注50微升病毒（2.8×10 9传染性单位/毫升）区域启动7天内注射（ 图6），GFP的表达。沿着注射之外的初始部位组织平面部分区域心肌浸润赞赏的切片图像。
图1：超声引导下注入的设置。综合铁路系统一）概述，以容许注射器和超声波扫描头。 二）超声扫描头控制第对齐。扫描头被锁定在适当位置，对准到注射器。视场被移动的动物平台。℃）注射注射器控制调整。
图中鼠标2最佳定位的动物平台，超声引导下穿刺注射。动物平台，针和换能器内注射从短轴成像平面B）。通过超声波凝胶，因为它传递到胸腔大方量特写视图传感器的电场作用下针的路径的）方向，C）的动物平台，针的方向和换能器的心肌内麟蹄ction在胸骨旁长轴像平面。
图心肌的代表性的超声图像在胸骨旁短轴和长轴的平面定位。 AC）左心室在中期乳头肌（A）的水平短轴图像，乳头肌下方 （B）和心脏的心尖 （C）D）的长轴图像显示出心肌内注射于前左心室壁。箭头突出针轴的位置。
图4。代表性的二维超声心动图的图像。一） 乙）针导向叠加功能的沿所述针的长轴和通过前心肌预测过程（绿色虚线）。℃）注入心肌对准的长度的针针头埋在前壁心肌壁内的斜面。
图5标记的注射部位与伊文思蓝染料或荧光微球。心肌内注射的蓝色染料进入前壁心肌壁A）的心脏在midpapillary肌肉的电平的横截面，显示出的染料30分钟后的浸润心肌内递送至左心室。 二）从对心肌的C，D）的小鼠心肌展示红色荧光微球分离心肌内注射的前，后左心室壁，E，F）左7天后左侧面的可见针头穿刺部位心肌中的红色荧光微珠的心脏显示出沉积的横向平面剖开在中期乳头肌。整个切面散微珠是由于期间并用刀背割的心脏后，分散到缓冲区。
图6。ROSA26 mTmG心脏的前壁心肌壁的单一心肌内注射TNT的，ICRE后荧光标记腺病毒。 A）小鼠整个心脏的前壁光镜区域的腺病毒注射液。 二）荧光图像（EGFP）在同一心脏后7天由腺病毒载体，C，D）的横截面展示成功交付和心肌传导中期乳头肌水平，从一个单一的心肌内注射腺病毒的展示区域转染的程度（50微升的2.8×10 9个感染单位/毫升）。
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Discussion
生物可以通过血液输送到心肌的直接心肌内注射，心包内注射，或间接施用。在心肌梗死模型最近基于细胞的疗法试验已述的开胸术的方法来注射液12-14的输送。在心肌治疗干预的成功的重要因素取决于传递路线的选择。生物的最高局部剂量是通过心肌内递送15,16来实现的。心肌内注射在直视下是最直接的方法，并允许有针对性给药的心肌17内。然而，这种方法也是最侵入性的，因为它需要开口胸腔和心包，露出靶心肌18。心脏的部分，诸如它的背表面上，不容易观察，并使用该方法注入。的程序，里面的侵袭尤尔也制约了潜在的治疗给药方案。在这里，我们描述了一种技术上简单的，可靠的和可再现的方法，以提供生物或药物超声引导下安全地通过经皮内注射，没有疾病和外科开胸曝光的约束。在超过150个小鼠注射到今天为止，得到初期的技术能力后，我们的围手术期死亡率低于5％时，小于4的心肌部位进行靶向于任一时刻。高达200微升注射液体积总被出乎意料地良好，由鼠心脏的耐受性。前壁心肌很适合作为注射的目标，由于心肌的针的长轴的该区域的平行取向，使针更可靠地保持在心脏的肌肉。重要的是，运营商在可视注射前心肌整个斜尖，因为这样可以确保全额交割的仁济很重要ctate无渗漏到周围组织。小心，以确保针尖始终保持在可见心肌也是成功的心肌注射的关键。当用伊文思蓝染料练，无意注射入心室腔，将导致小鼠迅速发展蓝色色调可见最清楚，在脱毛的皮肤。还值得一提的通过胸壁的针插入仅仅由预定目标的心肌，而不是由鼠标的任何表面解剖标志显示的超声波图像来确定。对于一个有经验的超声心动图，在能力内注射可以合理的做法后4-5尝试实现的。
当针穿过胸壁，它必须通过肋间空间。这种情况并不少见有一次通过肋间作出轻微调整成像平面，以保持斜尖清晰视野内。日是通常通过动物平台或注射器控制细微的调整来实现的。的细微的修改应做一次针是通过胸廓但之前它已经通过进心肌，防止心肌裂伤和创伤从重复注射针尖端的操作。为了尽量减少心包积血的危险，我们的目标应该是有必要的，以完成交货注射液的进入心脏的几十倍。虽然所描述的技术可用于心肌内注射的心脏的短轴面，同样可行通过动物平台的简单调整在心脏的胸骨旁长轴面注入，以配合此平面（ 图2C）和变向针进入心肌的预期目标（ 图3D）。
成功的心肌内注射可以通过使用指示器来确认染料中，接着立即病理考试系统离子注入小鼠心脏中。注射荧光微球的悬浮液将无限期地保留在注射部位和可以伴随给药与另一种试剂来标记目标区域。鼠标使用吸入二氧化碳每体制动物处理方案经过培训的人员实施安乐死。检查心脏表面，就会发现注射区域，并与基体心脏切片的心脏将产生横截面，将展示注射区域。时重复注射相同的心肌区域的和/或成像时所需的时间的推移，它有利的是使用标准的成像平面和目标再现的解剖标志。例如，它可以方便地使用短轴成象平面到目标左心室在midpapillary肌水平（ 图3A）。最严重的潜在并发症是心肌裂伤/破裂和随之而来的出血和/或心包积血。次的风险是与针（4或更高）的经心肌反复通，迅速注入流体丸的，重用钝的针尖，并使用较小的小鼠的并发症的增加（在15克）的小鼠。如果在心肌内的多个目标被连续注入（前壁，侧壁或下壁），它是最佳的，以实现此三道次或更少的针贯通心肌，以减少手术并发症的风险。左心室心肌的侧壁可以同时与一个通针穿过胸壁（ 图5E和5F）被注入，因为它们对齐彼此平行，但任何其他的心肌壁的目标将需要重新插入针穿过胸壁下针的角度调整。鼠标不应oversedated心动过缓（下每分钟400次），可以增加舒张末期容积和显著降低心肌壁厚。我们经验是老鼠从快速的程序中恢复，并从麻醉中复苏分钟内笼子里走动。并发症，什么时候出现的，他们都是突然出现，并在介入的时间。
尽管该协议是用于心肌内注射写入，微微最终针尖位置的变形允许操作员针对注射入左心室腔的试剂的全身动脉输送血液。向后拉的针筒柱塞可以确认该斜面尖端是否在左心室腔（富氧血液吸出），或在心肌肌肉质量。与今天的高效率和器官特异性病毒载体，特别是腺相关病毒血清型9矢量与心肌特异性启动子，研究者可以适应这种技术作为替代眼窝或尾静脉注射，以达到高的安全传递病毒载量进入冠状循环，具有降低的第一遍吸收由肝脏。在慢性postinfarct鼠模型中，疤痕和纤维化心肌可能不太适合于心肌内注射给予所得薄壁目标操作者必须埋在针尖英寸然而，心肌边界区的区域应是适合于心肌内注射和开胸后声窗是绰绰有余成功超声引导。
超声引导下，心肌内注射在动物模型代表了良好的耐受性，有效，微创和技术上简单的方法来传递生物制剂对心肌。这种技术可以很容易地用于成功交付基因载体或基于细胞的疗法在任何试验时间点在鼠模型中，包括现有开胸手术程序之后。获取熟悉和能力的设备和注射过程会确保后续成功的实验模型。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vevo 2100 ultrasound imaging system | Visualsonics | ||
| Vevo Integrated Rail System III | Visualsonics | ||
| Microscan MS400 transducer | Visualsonics | ||
| Microscan MS550D transducer | Visualsonics | ||
| PrecisionGlide needles | BD | 305128 | 30 G x 1 in/2.5 cm |
| 1 cc slip tip syringe | Exel International | 26048 | or equivalent |
| Gastight 50 μl glass syringes | Hamilton | 1705 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250 | or equivalent |
| Isoflurane | Baxter | AHN3640 | or equivalent |
| Aquasonic 100 | Parker Laboratories | (01-08) | or equivalent |
| Polystyrene microspheres (red fluorescent) | Life Technologies | F-8842 | or equivalent |
References
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