Summary
הזרקת intramyocardial מלעורית מונחה אקו מייצגת שיטה יעילה, אמינה, וניתן למקד עבור המשלוח של סוכני העברת גנים או תאים לתוך הלב העכברי. בעקבות הצעדים המפורטים בפרוטוקול זה, המפעיל יכול להיות מוכשר במהירות בטכניקה תכליתית, פולשנית זו.
Abstract
מודלים עכבריים למחלת לב וכלי דם הם חשובים לחקר מנגנוני pathophysiological ולחקור טיפולי התחדשות פוטנציאליים. ניסויים הכוללים הזרקה בשריר הלב מבוצעים כיום על ידי גישה כירורגית ישירה באמצעות פתיחת בית החזה. בעוד נוח כאשר היא מבוצעת בזמן אחר מניפולציה ניסויית כגון קשירת עורקים כלילית, את הצורך בפרוצדורה פולשנית למסירת intramyocardial מגביל עיצובים ניסיוניים פוטנציאל. עם אי פעם שיפור הרזולוציה אולטרסאונד ושיטות הדמיה לא פולשנית מתקדמות, עכשיו זה אפשרי לביצוע, הזרקת intramyocardial מלעורית מונחה אולטרסאונד באופן שיגרתי. טיפול זה יעיל ומהימן מספק סוכנים לאזור מיקוד של שריר לב. יתרונות של שיטה זו כוללים הימנעות מתחלואה ניתוחית, מתקן למקד אזורים של שריר לב באופן סלקטיבי בהנחיית אולטרסאונד, ואת ההזדמנות כדי לספק injectate לmyocardiuמ 'במרווחי זמן מרובים, שנקבע מראש זמן. בעזרת טכניקה התאמנה, סיבוכים מהזרקת intramyocardial הם נדירים, ועכברים לחזור במהירות לפעילות רגילה בהתאוששות מהרדמה. בעקבות הצעדים המפורטים בפרוטוקול זה, המפעיל עם ניסיון אקו בסיסי יכול להיות מוכשר במהירות בטכניקה תכליתית, פולשנית זו.
Introduction
מחלות לב היא סיבת מוות המובילה לגברים ולנשים בארצות הברית, והיוו 600,000 מקרי מוות בשנה 1. מודלים עכבריים למחלת לב וכלי דם הם חשובים ביותר לחקר מנגנוני pathophysiological ולחקר טיפולים פוטנציאליים. משלוח בשריר הלב של וקטורי ריפוי גנטיים, תאי גזע, RNAs שונה, וחקירת היתרי סוכנים טיפוליים אחרת של הפוטנציאל הטיפולי שלהם למחלות לב 2-7. נכון לעכשיו, יש אפשרויות מוגבלות למסירה בשריר הלב של סוכנים טיפוליים בעכברי מודל 6. הזרקת Intramyocardial תחת הדמיה ישירה היא נפוצה, אבל דורשת sternotomy או פתיחת בית החזה, והוא מוגבל לאזור החשוף של הלב. בעוד נוח כאשר היא מבוצעת בזמן אחר מניפולציה ניסויית כגון קשירת LAD, את הצורך בפרוצדורה פולשנית למסירת intramyocardial מגביל עיצובים ניסיוניים פוטנציאל ומציגהשפעות dditional מההליך (למשל, סיסטיק בשל פתיחת בית החזה). משלוח קרום הלב מלעורית של וקטורים ויראליים דווח, אבל באתר וההפצה של סוכן טיפולי אינו הומוגנית וקשה לשליטה 8. תוצאות הזרקה כלילית מלעורית בהפצה הומוגני יותר של חומר מוזרק, אבל מסירה כלילית יעילה ושחזור מאתגרות במודלים עכבריים.
כאן, אנו מתארים טכניקה סגורה חזה intramyocardial הזרקה המאפשרת מיקוד פולשנית, מפעיל המבוקר של סוכנים טיפוליים בהנחיית אולטרסאונד. הטכניקה קלה ללימוד, חוסכת את הצורך בפתיחה בית החזה או sternotomy והסיבוכים הניסיוניים הדיילת שלהם, ומספקת גמישות רבה יותר בעיתוי ובאתרים של הזרקת intramyocardial. לפיכך, הזרקת intramyocardial בסיוע אקו מייצגת שיטה טכנית פשוטה ויעילה מאוד של מניפולציהשריר לב במודלים ניסיוניים עכבריים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השלבים המתוארים בוצעו תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של בית החולים לילדים בבוסטון.
.1 הכנה
- לבצע הערכה אנטומית ותפקודית של הלב בסיסית על ידי בדיקת אקו לפני תחילת פרוטוקול ההזרקה, כעמדה רגשי קבועים האופטימלית להזרקת intramyocardial לא עשויה להניב תצוגות סטנדרטי אופטימליות להתוויית האנטומיה והערכה של תפקוד.
- התקנת ההזרקה מוצגת איורים 1A-1C. מניחים מזרק ריק עם מחט נדן, כלפי מעלה פוע אוריינטציה, במהדק המזרק (ראו איור 1 ג) ולאבטח את החללית מתמר אולטרסאונד במהדק סריקת הראש (ראה איור 1). שחרר את משותף נעילת מהדק כדור סריקת הראש (איור 1) ולתפעל את כיוון המתמר כך שיהיה מיושר מקביל לציר של המחט. תקן scan-עמדת ראש על ידי הידוק משותף נעילת מהדק כדור סריקת הראש.
הערה: לקבלת זריקה בעכברים בוגרים, מחט G 30 עם אורך 1 סנטימטר ב/ 2.5 היא אופטימלית. מזרק 1 מ"ל יכול לשמש לנפחים גדולים יותר, ואילו מזרק gastight יכול לשמש לשליטה מדויקת יותר של כמויות קטנות יותר (5-10 μl). - החל ג'ל אולטרסאונד בנדיבות על קצה המתמר עם מרית כדי לכסות את הראש לאורך כולו. לשלוף בזהירות את המחט ולהשתמש במחט הר בקרות כדי לקדם את המחט ישירות תחת המתמר ובתוך ג'ל אולטרסאונד להדמיה. לבצע התאמות קטין באמצעות מחט הר שליטה, כך שהמחט דמיינה בבירור לאורכו על תמונת אולטרסאונד. אם המתמר היה מיושר במקביל כראוי למחט בשלב 1.4, אז המחט צריכה להישאר בתוך מטוס ההדמיה כפי שהוא מתקדם ונסוג עם ידית שליטת הזרקה (איור 1 ג).
- בשלבים הבאים, לא להפריע את הצורךיישור אופקי le / מתמר על ידי הזזת או בציר האופקי. במקום זאת, להתמקד באזורים ספציפיים של הלב להזרקה על ידי שינוי המצב האנכי (ציר y) של מחט הר ועל ידי הזזת פלטפורמת בעלי החיים.
- הזז את המתמר superiorly מהפלטפורמה של בעלי החיים באמצעות השליטה בגובה סריקה (איור 1), כדי לאפשר המיקום הבא של העכבר הרדים על גבי הפלטפורמה של בעלי החיים. זה לא ישבש את יישור ציר x של המתמר לציר של המחט הארוכה.
- הסר את המזרק ששימש ליישור ממהדק המזרק וזורקים בזהירות. טען את המחט החדשה ומזרק עם injectate לגמר יעד הנפח, ומאפשר לשטח מת בקצה המזרק. להיות זהיר כדי להסיר בועות אוויר. הנח את המזרק לתוך מהדק המזרק ללא התאמת יישור ציר x שלה. באופן מלא לחזור בי המזרק באמצעות שליטת ההזרקה.
הערה: למטרות הכשרה ראשוניות, השימוש בכחול של אווןצבע (1%), כתם Trypan הכחול (0.4%) או השעיה של microspheres ניאון כמו injectate יכול לסייע למפעיל במאשר מיומנות והצלחה של הזרקה ממוקדת.
.2 הזרקה
- הפעל משולב חם יותר של פלטפורמת החימום ולהגדיר אותו ל37 C °. מניחים את פלטפורמת בעלי החיים 180 ° מכיוון ההדמיה הרגיל, עם מהדק צינור הרדמה והראש של החיה הקרובה ביותר למפעיל. הדבר זה מאפשר ללב (בצד השמאל של החזה) להיות ipsilateral למהדק המזרק והמחט. הערה: התאמות סיבוב נוספות בכיוון השעון קטין לפלטפורמת בעלי החיים עשויות להיות נחוצות כדי לכוון את הלב בצורה נכונה למטוס ליד עצם ציר קצר ההדמיה שישמש להזרקה (איור 2 א).
- הכן עכברים לבדיקת אקו כפי שדווח בעבר 9. להרדים את העכבר בתא אינדוקציה עם 2% isoflurane. הסרת שיער חזה עם שיער קרם להסרתd להחיל הסיכה ג'ל לשתי העיניים כדי למנוע התייבשות של לובן העין.
- הרם את המתמר באמצעות השליטה בגובה ראש הסריקה (איור 1). הנח את פרקדן העכבר הרדים על גבי פלטפורמת החיה המחוממת עם החוטם בתוך חרטום אספקת 1-3 isoflurane% (2A-2B איורים). הכנס בעדינות בדיקה רקטלית והדבק את ארבע כפות הרגליים לאלקטרודות א.ק.ג., יישום ג'ל אלקטרודה למגע חשמלי.
הערה: רמה מתאימה של הרדמה יש להבטיח ליחס האנושי של בעלי החיים. לא צריך להיות שום שינוי בקצב לב ולא תגובה למיקום של המחט דרך קיר החזה. יש להשתמש בבקרות ההומיאוסטטית המשולבת של פלטפורמת בעלי החיים טמפרטורה כדי לשמור על טמפרטורה נורמלית (37 ± 0.5 ° C), כהיפותרמיה תגרום ברדיקרדיה יחסית, הרחבה של חדר, ואי נוחות אפשרית. - ברגע שהעכבר הוא מאובטח על הפלטפורמה של בעלי החיים, להפחית את המתמר על depilaחזה טד באמצעות השליטה בגובה ראש הסריקה (איור 1). התקנת אולטרסאונד האופטימלית להזרקה היא ללב להיות דמיין בכיוון הציר הקצר ליד העצם, כמו לכל טכניקת אקו סטנדרטית. סובב את פלטפורמת בעלי החיים 20-30 ° בכיוון השעון כדי לקבל את חלון אקוסטי האופטימלי להזרקה במטוס ההדמיה ציר הקצר (איורים 2A-2B). הערה: לחלופין, הזרקה יכולה להתבצע מנטיית ציר ארוכה ליד עצם על ידי סיבוב נגד כיוון השעון של פלטפורמת בעלי החיים (איור 2 ג).
- השתמש בפקדי התאמת פלטפורמה של בעלי החיים כדי להתאים את שדה הראייה ולמקד כל אתר הזרקה רצויה בשריר הלב של החדר השמאלי. לכוון את המצלמה חזרה-ושוב מהקודקוד לבסיס של לב כדי למקד את מיקום ההזרקה הרצויה בשריר הלב של החדר השמאלי (A3-C3 איורים). הערה: התצוגה ליד עצם midpapillary קצר הציר (איור 3 א) מציעה reproduciblציוני דרך דואר המאפשרים הדמיה מעקב של אתר ההזרקה. הערה: לחלופין, תצוגת הציר הארוכה ליד העצם יכולה לשמש יעד אתר הזרקה מוגדר מראש (איור 3D).
- החל עם המזרק במהדק המזרק חזר באופן מלא, להתקדם לאט לאט את המזרק לכיוון החזה של בעל החיים על ידי הפיכת כיוון השעון שליטת הזרקה (איור 4 א). כדי לאפשר הדמיה אולטרסאונד ברורה של שני הלב וקצה המחט כפי שהוא מתקרב החזה, להשתמש בשפע של ג'ל אולטרסאונד על הצד השמאלי של החזה ולייעל את חלון אקוסטי על ידי הגדרת שדה ראיה רחב על פקדי אקו. הגדר את הנקודה / אזור מוקדי באתר היעד להזרקה. התאמות קלות למחט הר פקדים יכולים למטב את התמונה של המחט לאורכו.
הערה: יש לו מכונות אולטרסאונד חלק תוכנת מדריך מחט פונקציה להאריך דיגיטלי קו לאורך הציר של המחט הארוכה דרך לשריר לב היעד(איור 4). כגון כלי תוכנה יכולים להיות מועילים אבל לא הכרחי. - עם בעלי החיים מסוממים כראוי (1-3% isoflurane מעורבבים עם 0.5-0.8 ליטר / דקה 100 חמצן%), לקדם את המחט דרך קיר החזה של העכבר ולתוך שריר הלב, התבוננות בזהירות את המיקום של קצה המחט המשופע בכל פעמים. לעצור קידום כאשר קצה המחט הוא בתוך שריר לב היעד (איור 4C). הקצה משופעים כולה צריך להיות מאובטח בתוך שריר הלב, כדי למנוע דליפת injectate אל תוך חלל קרום הלב.
- כאשר הקצה הוא במיקום הרצוי, לספק injectate על ידי לחיצה על בוכנת המזרק. לספק injectate לאט, מעל 5-30 שניות (בהתאם לכמות שנמסר). עד 50 μl של injectate יכול להיות מועבר מבלי להתפשר על תפקוד חדר. הופעת echobright חולפת לאזור שריר הלב שהוחדר יכולה להיות ביטוי לאחר זריקה מוצלחת. תקופה קצרה (שניות) של bradycard היחסיIA יצוין מדי פעם עם זריקה לתוך שריר הלב ובמהירות פותר.
- ברגע שinjectate כבר מנוהל, מייד למשוך את המחט על ידי סיבוב נגד כיוון השעון של כפתור בקרת הזרקה. העכבר צריך להיות כל הזמן תחת הרדמה במשך כמה דקות של התבוננות אקו כדי לאשר תפקוד חדר השתמר ואין סיבוכי postprocedural. אם צוין, אזורים מרובים של שריר לב יכולים להיות מוזרקים באופן סדרתי על ידי מיקום מחדש של הזווית של מחט גישה של על ידי התאמה של הפלטפורמה לבעלי החיים. לאחר הזרקת intramyocardial, העכבר ממוקם בכלוב בכוחות עצמו ואיפשר להתאושש מהרדמה תחת השגחה.
- אל תשאיר חיה ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספיק כדי לשמור על כיבה sternal. אל תחזרו בעלי חיים שעברו הזרקת intramyocardial לחברתם של בעלי חיים אחרים, עד שהתאושש באופן מלא. הכלוב צריך להיות ממוקם על משטח thermoregulated עם מחדשמתן ady של דיאטת מים ועכבר. אי נוחות Postprocedural לא צפויה וכישלון לחדש כראוי התנהגות נורמלית זמן קצר לאחר ההתערבות מציע סיבוך פוטנציאלי (ראה דיון).
- להשליך בזהירות את המחט מייד לאחר השלמת הזרקת intramyocardial כדי למזער את הסיכון לפציעה חדה למפעיל או עוברי האורח. שימוש חוזר במחט עלולה לגרום להקהיה של הקצה שהופך אותו מאתגר יותר כדי לחדור את שריר הלב וכתוצאה מכך בסיכון גבוה יותר של סיבוכים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הזרקת Intramyocardial עכברית עם צבע הכחול או Microspheres פלורסנט
הזרקה של הצבע הכחול של אוון היא שימושית למטרות אימונים. זמן קצר לאחר הזרקה, להרדים את העכבר ולהסיר את הלב לדמיין את מיקומו של הצבע הכחול המוזרק. איור 5 מראה דוגמא של זריקה מוצלחת, עם צבע כחול חדירת שריר הלב ברמת שריר אמצע פפילרי (איור 5A, האזור סגור בקו מקווקו). צבע הכחול אוונס יהיה לשטוף החוצה של הרקמה בתוך כמה שעות. במשך יותר קבוע סימון של אזור ההזרקה, יכול לשמש microspheres הניאון שיישארו לזמן בלתי מוגבל במקום ההזרקה. דמויות 5C-5F ממחיש מטרות הזרקה מרובות בקירות של החדר הקדמי וגם אחורי עזב.
הזרקת אדנווירוס לשריר לב
כדי להמחיש את המסירה של אדנווירוס לשריר לב על ידי מדריך אולטרסאונדהזרקת ד, אנו מזריקים אדנווירוס שבו ביטוי 10 כונני cardiomyocyte ספציפי אמרגן T טרופונין העכברוש של היונקים קודון-מותאם 11 Cre. תחום של רקומבינציה בתיווך Cre נקבע באמצעות עכברי Rosa26 mTmG, שבי רקומבינציה Cre מכבה חלבון אדום ניאון (RFP) ופונה על חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). זריקה אחת של 50 וירוס μl (2.8 x 10 9 יחידות / מ"ל זיהומיות) אזורית מופעלת ביטוי של GFP תוך 7 ימים מהזרקה (איור 6). כמה חדירת שריר לב אזורית לאורך מישורי רקמה מעבר לאתר הראשוני של הזרקה היא מוערכת בתמונות המחולקות.
הגדרה מודרכת-אולטראסאונד איור 1 הזרקה. סקירה כללית) של מערכת רכבות משולבת, המאפשרתיישור של של מזרק הזרקה ואולטרסאונד ראש. B סריקה) בקרות ראש סריקת אולטראסאונד. ראש הסריקה נעול בעמדה, ומיושר למזרק להזרקה. שדה הראייה מותאם על ידי העברת השליטה בבעלי החיים פלטפורמה. C) מזרק הזרקה.
איור 2 מיצוב אופטימלי של עכבר על הפלטפורמה של בעלי החיים להזרקת מחט מונחה אולטרסאונד. אוריינטציה) של פלטפורמת בעלי החיים, המחט ומתמר להזרקת intramyocardial ממטוס ההדמיה הקצרה ציר.. צילום מקרוב, דרכו של המחט תחת השדה של מתמר מבט דרך כמות נדיבה של ג'ל אולטרסאונד כשהוא עובר לתוך חלל בית החזה B) . אוריינטציה של פלטפורמת בעלי החיים, המחט ומתמר לinje intramyocardial C)ction במטוס ההדמיה ארוך ציר העצם.
איור 3 תמונות אולטרסאונד נציג של שריר הלב למיקוד במטוסי ציר קצר וציר ארוך עצם. AC) תמונות קצרות ציר של החדר השמאלי ברמה של אמצע פפילרי השרירים (), מתחת לשרירי פפילרי (ב) ושיאו של הלב תמונה (C). ד) ארוכה ציר מדגימה הזרקת intramyocardial בקיר של החדר השמאלי הקדמי. חיצים לסמן את המיקום של פיר המחט.
איור 4 תמונות הנציג 2D אקו. ) B) מיושר לאורך ציר זמן של המחט וחיזוי כמובן (קו מקווקו ירוק) דרך שריר הלב הקדמי. C) יצוקה שריר לב עם שיפוע של המחט הקבור בתוך קיר שריר הלב הקדמי.
איור 5 סימון באתר ההזרקה עם הצבע הכחול של אוון או microspheres ניאון. הזרקת Intramyocardial של צבע כחול בקיר שריר הלב הקדמי.) סעיף רוחבי של הלב ברמה של שרירי midpapillary, הממחיש את החדירה של דקות הצבע 30 לאחר משלוח intramyocardial לחדר שמאלי. B) אתר לנקב גלוי מהמחט על פני השטח לרוחב השמאלי של שריר הלב. C, D) שריר לב Murine מפגין microbeads ניאון אדום 7 ימים לאחר הזרקת intramyocardial נפרדת בקדמי וגם האחוריים של החדר השמאלי הקירות. E, F) שמאל שריר לב של חדר מחולק בשריר אמצע פפילרי במטוס הרוחבי של הלב מדגים בתצהיר של microbeads ניאון האדום. microbeads פזורים על פני השטח החתך היה כתוצאה מפיזור למאגר במהלך ואחרי חיתוך הלב עם להב סכין.
איור 6 תיוג פלורסנט של קיר שריר הלב הקדמי של לב Rosa26 mTmG לאחר הזרקת intramyocardial אחת של TNT-iCreאדנווירוס. ) במיקרוסקופ אור של הקיר הקדמי של לב שלם עכברי 7 ימים לאחר הזרקת adenoviral אזורית. ב ') תמונת פלורסנט (EGFP) באותו הלב הוכחת מסירה מוצלחת ותמרת שריר לב על ידי וקטור adenoviral. C, D) סעיף רוחבי ב רמת שריר אמצע פפילרי, הממחיש את היקף transfection האזורי מהזרקת intramyocardial יחידה של אדנווירוס (50 μl של 2.8 x 10 9 יחידות / מ"ל מדבק).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ביולוגיים יכול להיות מועבר לשריר הלב על ידי הזרקה ישירה intramyocardial, הזרקת intrapericardial, או ממשל עקיף באמצעות זרם הדם. ניסויי טיפול אחרונים תא מבוסס במודלי אוטם שריר לב שתיארו גישת פתיחת בית החזה פתוחה למסירת injectate 12-14. גורם חשוב בהצלחה של התערבות טיפולית בשריר הלב תלוי בבחירה של מסלול משלוח. המנה המקומית הגבוהה ביותר של ביולוגי מושגת על ידי 15,16 משלוח intramyocardial. הזרקת Intramyocardial תחת הדמיה ישירה היא השיטה הפשוטה ביותר ומאפשרת לממשל ממוקד בשריר הלב 17. עם זאת, שיטה זו היא גם חודרנית ביותר, כפי שהוא דורש פתיחה של חלל החזה וקרום לב כדי לחשוף את שריר לב היעד 18. חלקים של הלב, כגון פני השטח הגבי שלה, לא דמיינו בקלות והזריקו שימוש בשיטה זו. הפולשנות של procedיור גם מגביל את לוחות הזמנים מינון טיפוליים פוטנציאליים. כאן, אנו מתארים טכניקה פשוטה מבחינה טכנית, אמינה ושחזור כדי לספק ביולוגיים או תרופות תחת אולטרסאונד-הדרכה בבטחה על ידי הזרקת intramyocardial מלעורית, ללא תחלואה והאילוצים של חשיפת פתיחת בית החזה כירורגית. -150 עכברים שהוזרקו למועד, לאחר מיומנות טכנית ראשונית הושגה, שיעור תמותת periprocedural שלנו היה מתחת לגיל 5% כאשר פחות מארבעה אתרים בשריר הלב היו ממוקדים בכל זמן נתון. כרכי injectate כוללים של עד 200 μl היו נסבלים באופן מפתיע גם על ידי הלב העכברי. שריר הלב הקדמי משאיל את עצמו היטב כיעד להזרקה, נתן את הכיוון המקביל של אזור זה של שריר לב לציר של המחט הארוך, המאפשר את המחט להישאר בשריר הלב באופן מאובטח יותר. חשוב שהמפעיל לדמיין את הקצה המשופע כולו בשריר הלב לפני ההזרקה, כמו זו מבטיחה אספקה מלאה של injectate ללא דליפה לתוך הרקמה הסובבת. אכפת לי כדי להבטיח את קצה המחט תמיד נשאר גלוי בתוך שריר הלב הוא קריטי גם להזרקה בשריר הלב מוצלחת. כאשר מתאמן עם הצבע הכחול של אוון, הזרקת בשוגג לתוך תא חדרית תגרום העכבר מתפתח במהירות גוון כחול לעין באופן הברור ביותר בעור המקולף. כמו כן, ראוי לציין כי החדרת מחט דרך דופן החזה נקבע אך ורק על ידי תמונת אולטרסאונד המוצגות של שריר לב המטרה המיועד ולא על ידי כל ציוני דרך אנטומיים משטח של העכבר. לechocardiographer מנוסה, מיומנת בהזרקת intramyocardial יכולים להיות מושגת באופן סביר אחרי אימון על 4-5 ניסיונות.
כמחט עוברת דרך קיר החזה, היא צריכה לעבור דרך חלל הצלע. אין זה נדיר שיש לבצע התאמות קלות למטוס ההדמיה פעם בחלל הצלע כדי לשמור על הקצה המשופע בבירור בתוך נוף. ההוא בדרך כלל נעשה באמצעות התאמות קלות של פלטפורמת בעלי החיים או בקרות מזרק הזרקה. צריכים לעשות שינויים הקלים ברגע שהמחט היא באמצעות כלוב הצלעות אך לפני שהוא עבר לשריר הלב על מנת למנוע קריעה בשריר הלב וטראומה ממניפולצית קצה מחט חוזרת ונשנית. כדי למזער את הסיכון של hemopericardium, המטרה צריכה להיות כדי להיכנס ללב ככמה פעמים כנחוצות להשלמת מסירה של injectate. למרות שהטכניקה המתוארת היא להזרקת intramyocardial במטוס ציר הקצר של הלב, זה אפשרי במידה שווה להזריק במטוס הציר ארוך ליד העצם של הלב באמצעות התאמה פשוטה של פלטפורמת בעלי החיים כדי ליישר עם המטוס הזה (איור 2 ג) והפניית המחט להיכנס ליעד המיועד של שריר לב (איור 3D).
הזרקת intramyocardial מוצלחת יכול להיות מאושרת על ידי שימוש באינדיקטור צבע שאחריו examinat פתולוגי המיידייון של לב העכבר המוזרק. הזרקה של השעיה של microspheres הניאון תישאר לזמן בלתי מוגבל במקום ההזרקה וניתן יהיה לתת במקביל עם סוכן אחר כדי לסמן את אזור המיקוד. העכבר הוא מורדמים באמצעות שאיפת פחמן דו חמצני על ידי אדם מיומן לפרוטוקולי טיפול בבעלי החיים מוסדיים. בדיקה של פני השטח הלב תגלה האזור המוזרק, וכבש הלב עם מטריצת לב יניב חתכים שידגימו את האזור המוזרק. כאשר הזרקה ו / או הדמיה חוזרות ונשנות של אותו האזור בשריר הלב היא רצויה לאורך זמן, זה יתרון לשימוש מטוסי הדמיה סטנדרטיים ולמקד ציוני דרך אנטומי לשחזור. לדוגמא, הוא נוח לשימוש מטוס הדמיה קצר הציר למקד החדר השמאלי ברמת שריר midpapillary (איור 3 א). הסיבוך הפוטנציאלי החמור ביותר הוא חתך / קרע בשריר הלב וכתוצאה מכך דימום ו / או hemopericardium. הסיכון של ההוא עליות סיבוך עם מעברים חוזרים ונשנים של המחט (ארבעה או יותר) דרך שריר הלב, הזרקה מהירה של בולוס הנוזלים, שימוש חוזר בקצה מחט קהה, ושימוש בעכברים קטנים יותר (מתחת לגיל 15 ז) עכברים. אם יעדים מרובים בתוך שריר הלב מוזרקים באופן סדרתי (קיר קדמי, קיר לרוחב קיר או נחותים), זה אופטימלי כדי להשיג את זה בשלושה מעברים או פחות של המחט דרך שריר לב כדי למזער את הסיכון לסיבוכים פרוצדורליים. הקירות הצדדיים של שריר לב של חדר השמאלי יכולים להיות מוזרקים במקביל למעבר אחד של המחט דרך קיר החזה (5E דמויות ו5F) כפי שהם ליישר מקבילים זה לזה, אך כל קיר יעד שריר לב אחר ידרוש מחדש החדרת המחט דרך קיר חזה לאחר התאמת זווית מחט. העכבר לא צריך להיות oversedated כברדיקרדיה (מתחת 400 פעימות לדקה) עלולות להגביר את הקצה הדיאסטולי הנפח ולהפחית באופן משמעותי עובי קיר שריר הלב. שלנוניסיון הוא לעכברים להתאושש מההליך במהירות ולambulate בכלובים שלהם בתוך דקות של התאוששות מהרדמה. סיבוכים, כאשר הם מתעוררים, הם פתאומיים ומתרחשים בעת ההתערבות.
למרות שפרוטוקול זה נכתב עבור הזרקת intramyocardial, שינוי קל של מיקום קצה מחט סופי מאפשר למפעיל לכוון הזרקה למחזור הדם של חלל החדר השמאלי למסירת עורקים מערכתית של סוכן. מושך בחזרה על בוכנת המזרק יכול לאשר אם הקצה שפוע הוא בתא של החדר השמאלי (דם עשיר בחמצן להישאף) או במסת שריר בשריר הלב. עם וקטורים של היום יעיל ואיבר ספציפי מאוד ויראלי, במיוחד וקטור adeno הקשורים serotype הווירוס 9 עם אמרגן ספציפי לב, חוקר יכול להתאים טכניקה זו כחלופה לרטרו מסלולית הזרקה או וריד זנב כדי להשיג אספקה מאובטחת של גבוה עומס נגיפי לכליליתבמחזור, עם קליטה הראשונה לעבור מופחתת על ידי הכבד. במודל העכברי postinfarct הכרוני, שריר הלב המצולק וfibrotic לא יכול להשאיל את עצמו היטב להזרקת intramyocardial ניתנו יעד קירות דק כתוצאה המפעיל יש לקבור את קצה המחט ב. עם זאת, אזורי אזור הגבול של שריר לב צריכים להיות נוחים להזרקה וintramyocardial חלונות אקוסטיים לאחר פתיחת בית החזה הם יותר מתאים להנחיית אולטרסאונד המוצלחת.
אולטראסאונד מודרך, הזרקת intramyocardial במודלים של בעלי חיים מייצגת שיטה נסבלת היטב, יעילה, פולשנית, ומבחינה טכנית פשוטה לסוכנים ביולוגיים משלוח לשריר הלב. טכניקה זו יכולה להיות מועסק בקלות למסירה המוצלחת של וקטורי גן או טיפולים מבוססים תאים בכל נקודת זמן ניסוי במודל עכברי, לרבות לאחר נהלי פתיחת בית החזה פתוחים לפני. רכישת היכרות ויכולת עם הציוד והליך ההזרקה יהיהלהבטיח את ההצלחה הבאה במודלים ניסיוניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vevo 2100 ultrasound imaging system | Visualsonics | ||
| Vevo Integrated Rail System III | Visualsonics | ||
| Microscan MS400 transducer | Visualsonics | ||
| Microscan MS550D transducer | Visualsonics | ||
| PrecisionGlide needles | BD | 305128 | 30 G x 1 in/2.5 cm |
| 1 cc slip tip syringe | Exel International | 26048 | or equivalent |
| Gastight 50 μl glass syringes | Hamilton | 1705 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250 | or equivalent |
| Isoflurane | Baxter | AHN3640 | or equivalent |
| Aquasonic 100 | Parker Laboratories | (01-08) | or equivalent |
| Polystyrene microspheres (red fluorescent) | Life Technologies | F-8842 | or equivalent |
References
- Kochanek, K. D., et al. Deaths: final data for 2009. Natl Vital Stat Rep. 60 (3), 1-117 Forthcoming.
- Strauer, B. E., Steinhoff, G. 10 years of intracoronary and intramyocardial bone marrow stem cell therapy of the heart: from the methodological origin to clinical practice. J Am Coll Cardiol. 58, 1095-1104 (2011).
- Cheng, K., et al. Intramyocardial autologous cell engraftment in patients with ischaemic heart failure: a meta-analysis of randomised controlled trials. Heart Lung Circ. 22 (11), 887-894 (2013).
- Fischer-Rasokat, U., et al. A pilot trial to assess potential effects of selective intracoronary bone marrow-derived progenitor cell infusion in patients with nonischemic dilated cardiomyopathy: final 1-year results of the transplantation of progenitor cells and functional regeneration enhancement pilot trial in patients with nonischemic dilated cardiomyopathy. Circ Heart Fail. 2, 417-423 (2009).
- Seth, S., et al. Percutaneous intracoronary cellular cardiomyoplasty for nonischemic cardiomyopathy: clinical and histopathological results: the first-in-man ABCD (autologous bone marrow cells in dilated cardiomyopathy) trial. J Am Coll Cardiol. 48, 2350-2351 (2006).
- Ladage, D., et al. Percutaneous methods of vector delivery in preclinical models. Gene Ther. 19, 637-641 (2012).
- Zangi, L., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nat Biotechnol. 31, 898-907 (2013).
- Laakmann, S., et al. Minimally invasive closed-chest ultrasound-guided substance delivery into the pericardial space in mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 386 (3), 227-238 (2013).
- Respress, J. L., Wehrens, X. H. Transthoracic echocardiography in mice. J Vis Exp. (39), e1738 (2010).
- Wang, G., et al. Characterization of cis-regulating elements and trans-activating factors of the rat cardiac troponin T gene. J Biol Chem. 269, 30595-30603 (1994).
- Shimshek, D. R., et al. Codon-improved Cre recombinase (iCre) expression in the mouse. Genesis. 32, 19-26 (2002).
- Lichtenauer, M., et al. Intravenous and intramyocardial injection of apoptotic white blood cell suspensions prevents ventricular remodelling by increasing elastin expression in cardiac scar tissue after myocardial infarction. Basic Res Cardiol. 106 (4), 645-655 (2011).
- Herrmann, J. L., et al. Postinfarct intramyocardial injection of mesenchymal stem cells pretreated with TGF-alpha improves acute myocardial function. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 299 (1), 371-378 (2010).
- Zhou, Y., et al. Direct injection of autologous mesenchymal stromal cells improves myocardial function. Biochem Biophys Res Commun. 390 (3), 902-907 (2009).
- Campbell, N. G., Suzuki, K. Cell delivery routes for stem cell therapy to the heart: current and future approaches. J Cardiovasc Transl Res. 5 (5), 713-726 (2012).
- Hou, D., et al. Radiolabeled cell distribution after intramyocardial, intracoronary, and interstitial retrograde coronary venous delivery: implications for current clinical trials. Circulation. 112, Suppl 9. 150-156 (2005).
- Dib, N., et al. Recommendations for successful training on methods of delivery of biologics for cardiac regeneration: a report of the International Society for Cardiovascular Translational Research). JACC Cardiovasc Interv. 3 (3), 265-275 (2010).
- Dib, N., et al. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 177-181 (2011).
