Introduction
מוטציות בדנ"א סדירות בתאי המין יכולים להוביל להצלחה ברבייה מופחתת, ואם ירשו, עלול לגרום למחלה גנטית או נטייה מוגברת לסרטן אצל צאצאיהם 1-3. ראיות משמעותיות מוכיחות כי חלק גדול ממוטציות דה נובו בירושה מתאי המין מצד אבי 4, וכי מספר המוטציות בצאצאים מתואם חיובי עם גיל אב בעת ההפריה 5. השיעור גבוה יותר של מוטציות זכר הוא האמין להיות תוצאה של ההבדל בגיל בgametogenesis בין המינים, בהגדלת מספר חלוקות תא זרע ראשוניות בהשוואה למספר חלוקות תא oogenic בנקבה בתאי המין 2, וירידה הדרגתית בדנ"א לתקן יעילות עם גיל אצל גברים. כל הגורמים הללו תורמים להסתברות מוגברת של טעויות שכפול בתאי המין הזכריים 6. עם זאת, ההשפעה של חשיפה אבהית לEnviroגורמי nmental בתדירות של מוטציות דה נובו נשאר לא ברורים. עם זאת, מספר גדול של גורמים סביבתיים ידוע כדי לגרום למוטציות תאי נבט במכרסמים 7, ויש ראיות גוברים שחלק מהסוכנים אלה יכול להשפיע גם על תאי המין האנושיים 8. למרות חששות אלה, כימיקלים נבדקים באופן שיגרתי ביכולתם לגרום למוטציות בתאים סומטיים למטרות תקינות והמקובל להניח שבדיקות סומטי יש בם כדי להגן על תאי המין. לכן, כימיקלים רק לעתים רחוקות העריכו ביכולתם לגרום למוטציות תאי נבט.
בדיקות המוטגניות תאי נבט אחת סיבות הושמטו במידה רבה מתהליך קבלת החלטות רגולטוריות הוא חוסר מתודולוגיות מעשיות. שיטות מסורתיות המבוסס על מכרסמים, כגון קטלני 9 וספציפיות לוקוס 10 בדיקות הדומיננטיות, להעריך שיעורי מוטציה תא חיידק על ידי הבקיע פנוטיפים מוטציה בעוברים או צאצאים שלהורים נחשפו. מבחני אלו דורשים שימוש במספר גדול מאוד של בעלי חיים, זמן ומשאבים כדי לרכוש תוצאות משמעותיות מבחינה סטטיסטית.
למרות מספר שיטות המודרניות לכימות מוטציה תא החיידק צמחו לאחרונה, רבים סובלים חסרונות במונחים של פרקטיות שלהם, יעילות, ואת הרלוונטיות ביולוגיות. לדוגמא, לחזור על מוטציות אורך בחוזרים בד בבד פשוט לוקוסים מורחבים (Estr) ניתן לכמת בתאי נבט גבריים תוך שימוש בגישה PCR מולקולה בודדת 15. עם זאת, ביצוע של שיטה זו יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית ומייגע, ושלא כמו מוטציות נקודה, המשמעות הביולוגית ובריאותם של שינויים באורך חוזר של לוקוסי Estr מאוד לא יציבים תישאר 16 לא ברורים. טכנולוגיות רצף הגנום כולו מודרניות יכולות לספק שפע של נתונים משמעותיים מבחינה ביולוגית כאשר חלים על הבעיה של מוטציות תורשתיות 4,17, אבל העלות הגבוהה, שיעורי שגיאה גבוהים, האימות הקשורים נדרשותכדי לאשר את המוטציות, ואתגרים ביואינפורמטיקה עדיין להגביל את היישום השגרתי של אפשרות זו ביכולת בדיקת רגולציה 18.
בזאת, אנו מתארים שיטה מעשית לכימות מוטציות הנגרמות באופן ישיר בתאי הנבט של עכברי זכרים מהונדסים. פרוטוקול זה מתואר למודל MutaMouse המהונדס, שבו יש עותקים בשרשור מרובים של וקטור הפאג λgt10 רקומביננטי המכיל גן כתב Escherichia coli lacZ שולב שני העותקים של כרומוזום 3 19 (איור 1).
פרוטוקול זה הוא רלוונטי גם למכרסמים מהונדסים דגמים אחרים (TGR) המבוססים על אותם העקרונות (BigBlue עכבר וחולדה, או עכבר פלסמיד lacZ, וכו '.) או גני כתב מעט שונים (עכבר דלתא GPT ועכברוש, מודלים TGR נסקרו בet למברט אל. 20). שיטה זו מבוססת על assay המוטציה TGR המתואר שבפורסם לאחרונהומתוקן קו מנחה מבחן OECD 21 ואנו לפרט על השיקולים המיוחדים הנדרשים כדי להתאים הערכה של מוטציות בתאי המין הגבריים בגלל המאפיינים הייחודיים של יצירת תאי זרע. בקצרה, assay כרוך בחשיפת עכברים הטרנסגניים זכר לחומר mutagenic, ואחריו זמן דגימה שבו נגעים טרום מוטאציות קבועות למוטציות יציבים. בזמן הדגימה נבחר, עכברים מורדמים ותאי נבט נאספים משתי יותרת האשך cauda או אבוביות זרע. כפי שנראה להלן, השפעות mutagenic בשלבים שונים של יצירת תאי זרע ניתן לקבוע על ידי בחירת הזמן בין החשיפה ואיסוף דגימה. מוסיף מהונדס, הכוללים מספר עותקים של הגנום הפאג λ לכל תא, מבודדים מהדנ"א הגנומי תא חיידק וארוז לתוך capsids הריק λ הפאג יצירת חלקיקי הפאג λ זיהומיות המשמשים לאחר מכן להדביק E. מארח coli. החיידקים הנגועים גדלים על אין תמיכה בבחירהתקשורת מופרזת שיכול להבחין בין תאים המכילים וקטור עם העתק שעבר מוטציה של lacZ מתאי מחסה lacZ wild-type. השפעת mutagenic של חשיפה בתאי המין הזכרי נקבעת על ידי השוואת התדירות של transgenes מוטציה בין שליטה ועכברים שטופלו (איור 2, שנסקר בלמברט et al. 20). מספר גדול של תאי נבט יכול להיות assayed מעכבר אחת, נותן רגישות מעולה assay זה על פני שיטות מסורתיות, תוך צמצום מספר בעלי החיים הדרושים. ובגלל שאין ציוד או הכשרה מיוחד נדרש, assay זה מספק אפשרות מעשית ויעילה לבדיקת המוטציה של תא הנבט ברוב מעבדות ביולוגיה המודרניות טוקסיקולוגיה / מולקולריות.
דרישה הכרחית אחת ליישום האפקטיבי של assay המוטציה של תא הנבט TGR היא הבנה של מחזור הזרע הראשוני (איור 3). הזמן לתאי נבט עכבר כדי להתקדם מstתאים אותם באבוביות הזרע לspermatogonia, spermatocytes, spermatids, ולבסוף להתבגר זרע ביותרת האשך (כלומר. יצירת תאי זרע) היא כ 49 ימים. מוטציה יכולה להתרחש בשלבים שונים של המחזור הזה והוא לעתים קרובות ספציפי מתחם. שתי תכונות עיקריות שהם רלוונטיים במיוחד לmutagenesis בתאי נבט גבריים הן הפסקת סינתזת DNA במהלך מיוזה המוקדמת, והאובדן ההדרגתי של יכולת תיקון DNA 6 בהודעה מיוזה-המאוחרת, שני תהליכים הנדרשים לאינדוקציה והקיבוע של רוב המוטציות.
בגלל המאפיינים הייחודיים אלה של יצירת תאי זרע, יש שלושה משתנים ניסיוניים קריטיים להתנהלות של assay המוטציה של תא הנבט TGR: (1) זמן ממשל מתחם בדיקה; זמן הדגימה (2); ו (3) הבחירה של אוכלוסיית תאי נבט לאסוף לניתוח (איור 3 ולוח 1). זמן מנהל הוא experimeמשתנה פתיחות opening סגירות closures שקובעת כמה תאי יעד ארוכים נחשפים לתרכובות הבדיקה. גם אורכו של זמן הממשל יכול לשמש יעד חשיפות לסוגי תאים ספציפיים או שלבים של יצירת תאי זרע. לדוגמא, ממשל יום אחד יכול לשמש כדי לקבוע את ההשפעות של חשיפה אקוטית לסוג תא מסוים אחד. בדומה לכך, חשיפה יכולה להיות ממוקדת לשלב זרע ראשוני כל, למשל על ידי פגיעת spermatocytes רק חלוקת meiotically, או mitotically חלוקת spermatogonia באמצעות זמן ממשל 2 בשבוע וזמן דגימה מתאים. פעמים כרוניות ותת כרוניות ממשל משמשות כדי להעריך את ההשפעות של חשיפה לטווח ארוכה, על מנת להבטיח הפצה הפרמקוקינטי מספקת של מתחם הבדיקה, או לאפשר להצטברות מספקת של מוטציות מחומרי גורמי מוטציות חלשות (לדוגמא זמן ממשל 28 יום מומלץ במבחן OECD קו מנחה).
זמן דגימה הוא משתנה הקריטי לקביעה שבשלב של יצירת תאי זרע תאי המטרה היו בעת החשיפה. זמן הדגימה מכתיב כמה זמן, ולכן איך התקדם הרבה יותר במחזור הזרע הראשוני, תאים עוברים דרך לאחר החשיפה. לדוגמא, כדי לחקור תופעות בspermatogonia תאי גזע, זמן דגימה> 49 ימים נדרשים אם איסוף זרע הבשיל באופן מלא, או> 42 ימים אם איסוף תאי נבט לא בוגרים מאבוביות הזרע, על מנת להבטיח כי יש לו את כל התאים שנאספו מספיק זמן כדי לפתח מנחשף נובע תאים. חשוב לציין כי זמן דגימה של לפחות 70 ימים יהיה עדיף להפגין השפעת תאי גזע אמיתית כדי לספק מספיק זמן להפצה הפרמקוקינטי של toxicant, לחיסול התאים שנחשפו בשלבים מאוחר יותר של יצירת תאי זרע, ולתת דין וחשבון ל תקופה של עקרות זמניות שעלולים להתרחש ~ 6 שבועות לאחר חשיפה לתרכובות mutagenic מאוד 22. באופן דומה, זמן דגימה של 21 ימים יבטיח כי Colle הזרעcted מיותרת אשך cauda היה רק השלים מיוזה ביום האחרון של חשיפה.
ניתן לאסוף תאי נבט כזרע בוגר מיותרת אשך cauda, או כתערובת של סוגי תאי זרע ראשוניים שונים מאבוביות הזרע. זרע למבוגרים להישאר בcauda ל~ 3 ימים, כך שניתן לקבוע ברמת דיוק יחסי סוג התא או שלב של יצירת תאי זרע שממנו הזרע מקורו לכל עיצוב ניסיוני נתון. לפיכך, ניתוח של היתרי זרע cauda ממוקד חקירות של השפעות מוטציה בשלב מסוים. מצד השני, השעיות תא שנאספו מאבוביות הזרע מכילות תערובת של סוגי תאי נבט שונים בשלבים שונים של פיתוח, ובכך להציע רזולוציה עניות יותר של שלב הזרע הראשוני שבמוטציות מקורו. בנוסף, השעיות תא התאוששו מאבוביות הזרע נוטות להכיל ייצוג יתר של spermatids, ואחריו spermatocytes, וverכמה spermatogonia y ותאי גזע (פרופורציות אלה מיוצגות על ידי פסים לבנים סיימו באיור 3). יתר על כן, השעיות הוכנו מאבוביות הזרע עשויות להכיל גם תאים סומטיים שונים. כך, משום שסוגי תאים רבים כל כך נמצאים, יכולות להיות מושפעות השפעות מוטאציות על ידי מגוון רחב של תאים שאינם יעד. עם זאת, איסוף דגימות מאבוביות זרע מציע אפשרות חסכונית לבו זמנית הקרנת סוגים שונים של תא הנבט, ושילוב קל של ניתוח תא חיידק לפרוטוקול בדיקת OECD הסטנדרטי למוטציה סומטיים.
לחזור ולהדגיש, בהתאם לצרכים של החוקר, זמן ממשל, זמן דגימה ואוכלוסיית תאים שנאספו יכול להיות מותאם לחקור את ההשפעות של חשיפה בסוגי תאים שונים ובשלבים שונים של תהליך יצור תאי זרע. על ידי הבחירה בזהירות משתנה אלה, יכולים להיות מתוכננים ניסויים למחקרים מכניסטית ממוקדים, או לבדיקת רגולציה כללית יותרing מטרות.
כדי להשיג בקיאות בassay, אנו ממליצים על השימוש בנטילה דרך פה חריף של 100 מ"ג / קילוגרם N-אתיל-N-nitrosourea (ENU), ואחריו 70 יום זמן דגימת בקרה חיובית כ. ניתוח של זרע cauda כך מטרות תאי גזע spermatogonial (איור 3), אשר בדרך כלל מציגים עלייה של פי 4-5 בתדירות מוטציה (MF) על הפקדים הבאים מינון mutagenic הזה מאוד של ENU. יש לציין כי מינון זה ידוע לגרום 6 שבועות עקרות לפרסם חשיפה, ובכך זה לא יכול להיות מנת שליטה מתאימה לזמני דגימה קצרים יותר. מינון זה יהיה גם לייצר גידול לזיהוי בMF ברוב הרקמות סומטיות 20. תוצאות הנציג המובאות להלן נוצרו בעקבות משטר חשיפה אקוטי +70 באמצעות שלוש מנות של ENU עד וכולל 100 מ"ג / קילוגרם.
Protocol
כל הפרוטוקולים מעורבים בעלי חיים, תחזוקה וטיפול אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים של הבריאות בקנדה.
1 חשיפות בעלי החיים
- באופן אקראי להפיץ עכברים הטרנסגניים זכר (8-12 שבועות) כדי לשלוט בקבוצות וקבוצות טיפול (= 5 לכל קבוצת דקות) עכברי .Treat עם מתחם בדיקה ובקרה רלוונטית על ידי מסלול חשיפה מתאים לזמן ממשל הנבחר. בחר את זמן הדגימה המתאים בהתאם לסוג תא הזרע הראשוני של עניין (איור 3).
- לאחר זמן הדגימה, להרדים עכברים על ידי נקע בצוואר הרחם בהרדמה isofluorane (או שיטה מתאימה אחרת). לצייר בזהירות את האשכים מחתך בבטן או בצק האשכים, ולהסיר את epididymides cauda. (איור 4, לצפייה בוידאו מפורט של אוסף יותרת האשך לראות Duselis et al. 24). לחלופין, לאסוף את האשכים אם ניתוח אבובית seminiferousתאים של. הקפאה בחנקן נוזל חנות ב -80 ° C לשימוש מאוחר יותר.
.2 בידוד והעיכול של cauda זרע
- להפשיר cauda יותרת האשך על קרח. העבר את cauda המופשר בצלחת פטרי וביסודיות ברר עם להב סכין מנתחים או סכין גילוח.
- הוסף 700 μl של טמפרטורת חדר D-PBS לצלחת פטרי. באמצעות קצה רחב נשא 1,000 μl פיפטה, זרע שחרור מcauda על ידי ציור ושחרור ההשעיה עד D-PBS הופך חלקית עם זרע (כ 10 פעמים). הערה: כדי להכין את קצה פיפטה רחב נשא לחתוך 2-3 מ"מ מהקצה של קצה פיפטה פלסטיק.
- השעיה סינון דרך מסנן רשת נירוסטה לתוך צינור 1.5 מ"ל טרי. שטוף את צלחת פטרי עם 700 μl נוסף של D-PBS ולהעביר לאותו צינור 1.5 מ"ל דרך מסנן הרשת. הסר רשת, למקם את הצינור על קרח.
- חזור על שלבים 2.1-2.3 לדגימות שנותרו.
- ספין samplesat 11,000 XG במשך 3 דקות. supernatant למזוג בזהירות. הימנע מלהפריע גלולה.
- הוספת 1.0 מ"ל ציטראט הקר 1x נתרן מלוח (SSC). מערבולת עד גלולה היא לגמרי מחדש תלויה. זה לפעמים ייקח כמה סיבובים של vortexing.
- הוסף 15 μl של 10% SDS. הפוך / לנער במרץ ל30 שניות לשבש תאים שאינם זרע. רעד מדי בעדינות יגרום הפרעה בינוני אשר גלולה לא תתבצע כראוי בשלב הבא.
- ספין ב11,000 XG למשך 2 דקות. גלולה רופפת, "רכה" מעידה על שיבוש החלקי של תאים סומטיים בשל מספיק רועד בשלב 2.7. במקרה זה, פשוט לנער את המדגם שוב, ותטווה מחדש עד גלולה הדוקה נוצר. למזוג בזהירות supernatant. הימנע מלהפריע גלולה. בקצרה לסובב שוב ולהסיר supernatant נותר עם 200 פיפטה μl.
- הוספת SSC הקר 940 0.2X μl ומערבולת עד גלולה היא resuspended. גלולה זו עלולה להיות קשה מאוד למחדש להשעות ועשויה להימשך מספר סבבים של vortexing. לפעמים הגושים שלסלסול הוא בלתי נמנע.
- הוספת 120 μl β-mercaptoethanol, 100 μl 10% SDS, 20 μl 0.5M EDTA, pH 8, ו20 proteinase μl K (60 מ"ג / מ"ל, מוכן טרי). מערבבים היטב ולעכל לילה עם סיבוב על 37 מעלות צלזיוס. המשך למיצוי פנול / כלורופורם.
.3 פנול הפקה / כלורופורם של DNA מcauda הזרע
הערה: מאחר שהדנ"א הגרעיני בspermatids שלב מאוחר וזרע בוגר הוא ומורכב עם protamines, והוא תמצית מאוד בהשוואה לדנ"א של תאים סומטיים, שיטות בידוד חומצות גרעין קונבנציונליות לא תניב DNA של תשואה מספיקה ובטהרה לassay המוטציה לעבוד ביעילות. עקירות פנול, כלורופורם מרובים לאחר עיכול אגרסיווי נדרשות לשחרר ולטהר את הזרע DNA (המבוסס על שיטות מ15).
- תא זרע העברה לעכל לצינור פוליפרופילן 15 מ"ל.
- הוסף 2 מ"ל של פנול: תערובת כלורופורם (1: 1). סובב צינור ב22 סל"דבמשך 3 דקות.
- צנטריפוגה ב 1,600 XG עבור 10 דקות ולהעביר את השכבה העליונה מימית יחד עם שכבת הממשק מטושטשת לצינור 15 מ"ל טרי.
- חזור על השלבים 3.1.2 ו3.1.3 3x, אבל משנה את זמני סיבוב 3 דקות, 4 דקות, ו -6 דקות, בהתאמה. על החזרה הסופית, להימנע מהעברה כל שכבת הממשק "מטושטשת".
- לאחר חילוץ 4 th, להוסיף 70 μl של 3M NaAc, pH 5.2 לכל 1 מ"ל של תמצית מימית ו2 מ"ל של כלורופורם: isoamyl אלכוהול (24: 1). סובב צינור ב22 סל"ד 12 דקות.
- צנטריפוגה ב 1,600 XG עבור 10 דקות ולהעביר את השכבה העליונה מימית לצינור 15 מ"ל טרי.
- משקע DNA על ידי הוספת 2 כרכים של אתנול מוחלט ובעדינות מסתובב הצינור בצד שלה עם נדנדה עדינה.
- לאסוף DNA על ידי הדפסה ברקע על קצה פיפטה מרעה אטום חום. יש לשטוף DNA על ידי מתערבל קצה pipet ב70% יבשים אתנול ואוויר במשך 5 דקות.
- לאחר חילוץ, לפזר משקע DNA ב40 - 100 μl Triחיץ s-EDTA, pH .8 חנות ב 4 ° C. לאפשר DNA לפזר על 4 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימאלית של שני ימים לפני שתמשיך לassay המוטציה lacZ. אם תיתקל בבעיות מסיסות הם נתקלו, DNA יכול להיות מומס נוסף על 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפני השימוש. קבע את הריכוז של DNA עם spectrophotometre ב260 ולהבטיח שהריכוז של DNA המומס הוא בין 200-2,000 ng / μl.
.4 בידוד ועיכול של תאי ניבט מseminiferous קשיות
- אם קפוא, להפשיר אשך על קרח (שעה כ 1). העברת אשך לצלחת זכוכית גרוסה.
- החזק קצה אחד של האשך עם זוג המלקחיים. בקצה השני של האשך, לנקב חור בכמוסת האפיתל באמצעות זוג נוסף של מלקחיים או מספריים לנתיחה (איור 5 א). לסחוט אבוביות זרע דרך לנקב וזורקים את הקפסולה אפיתל (איור 5).
- dd 500 μl של טמפרטורת חדר D-PBS לאבוביות זרע decapsulated.
- זווית רולר רקמות (גומי סיליקון מצויד בחוזקה על צינור מסתובב באופן חופשי 5 מ"מ קוטר נירוסטה, או מכשירים דומים), כך שקצה אחד נמצא במגע עם הצלחת בזווית משוערת של 5-10 ° (איור 5 ג). מבלי להחיל כל לחץ, בעדינות להזיז את הגלגלת קדימה ואחורה על פני הצינוריות עד שהם שטוחים וD-PBS הופך חלקית עם תאים שוחררו (כ 5-10x).
- הוסף עוד 500 μl של D-PBS מעל הצינוריות ובעדינות להתהפך tubules כמה פעמים נוספות.
- מעבירים את ההשעיה תא צינור 1.5 מ"ל microfuge תוך מזעור כמות צינוריות מנותקות מועברת (איור 5D).
- חזור על שלבים 4.5-4.6 לאסוף יותר תאים במידת צורך.
- הרשה 1 - 2 דקות לכל צינוריות שנאספו בטעות להתיישב לתחתית של התחתית. העבר את D-PBS לfrאש 1.5 מ"ל צינור והותיר אחריו הצינוריות התיישבו (כ 100 μl של D-PBS). Aliquot קטן של השעיה זו ניתן לבדוק תחת מיקרוסקופ (לעומת שלב) על מנת להעריך את הרכב אוכלוסיית התאים.
- ספין למטה התאים ב 11,000 XG למשך 30 שניות. למזוג בזהירות את supernatant מבלי להפריע גלולה. התא גלולה יכול להיות קפוא ב -80 מעלות צלזיוס, בשלב זה במידת צורך.
- להפשיר תאים במידת הצורך. העברה ל15 מ"ל תאי צינור פוליפרופילן והגלול ב 5 מ"ל של חיץ תמוגה (10 מ"מ טריס pH 7.6, 10 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1 מ"ג / מ"ל proteinase K, 1% SDS). Digest הלילה בחממה עם סיבוב על 37 C °.
- המשך למיצוי פנול / כלורופורם.
.5 פנול / כלורופורם הפקת DNA מתאי seminiferous אבובית נבט
הערה: חילוץ פחות אגרסיווי משמש כדי לבודד DNA של תאי נבט אבוביות זרע, מכיוון שיש סוגי התאים עדיין לא התקדמו דרך nעיבוי uclear.
- הוסף 5 מ"ל של פנול: תערובת כלורופורם (1: 1) לעיכול תא tubules לילה seminiferous. סובב צינור ב22 סל"ד 20 דקות.
- צנטריפוגה ב 1,600 XG עבור 10 דקות ולהעביר את השכבה העליונה מימית, תוך הימנעות שכבת הממשק "מעורפלת", לצינור 15 מ"ל טרי.
- הוספה של 5 M NaCl 100 μl לכל 5 מ"ל תמצית מימית (בדרך כלל 5 מ"ל הוא התאושש)
- הוסף 5 מ"ל של כלורופורם: isoamylalcohol (24: 1). סובב צינור ב22 סל"ד 12 דקות.
- צנטריפוגה ב 1,600 XG עבור 10 דקות ולהעביר את השכבה העליונה מימית לצינור 15 מ"ל טרי.
- משקע DNA על ידי הוספת 2 כרכים של אתנול מוחלט ובעדינות מסתובב והיפוך צינורות.
- לאסוף DNA על ידי הדפסה ברקע על קצה פיפטה מרעה נאטמה. יש לשטוף DNA על ידי מתערבל קצה pipet ב70% יבשים אתנול ואוויר במשך 5 דקות.
- לפזר DNA ב40-100 μl חיץ טריס-EDTA, pH .8 חנות ב 4 ° C. לאפשר DNA לפזר על 4 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימאלית של שניימים לפני שתמשיך לassay המוטציה lacZ (ראה שלב 3.9). אם תיתקל בבעיות מסיסות הם נתקלו, DNA יכול להיות מומס נוסף על 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפני השימוש. קבע את הריכוז של DNA עם spectrophotometre ב260 ולהבטיח כי הריכוז הוא בין 200 ו -2,000 ng / μl.
.6 Assay המוטציה LacZ
זיהום חיידקים או פטרייתי יכול להפריע ליעילות אריזה, כמו גם צמיחת רובד וניקוד. לכן זה קריטי לבצע את assay lacZ באמצעות אמצעי ספטית המתאימים על מנת למנוע זיהום של תקשורת תגובת אריזה, התרבות המארחת וצמיחה.
- היום לפני Assay: הכן אגר תחתונים ותרבות הלילה
- שמונה צלחות (4 צלחות להבקיע מוטציות, 4 צלחות לספור כייל) המכיל 8 מ"ל תחתון אגר כל נדרשים לדגימה (כלומר., 64 מ"ל לדוגמה). אגר התחתון הוא זהה עבור שניהםצלחות ספירת מוטציה וכיילו. הכן אגר תחתון מספיק למספר הדגימות בטיפול. הסביבה נקיה מהחיידקים לשפוך לתוך 90 מ"מ צלחות פטרי (8 מ"ל לכל צלחת) ולאפשר אגר לבסס. הערה: אפשר להכין את צלחות אגר תחתונה ל1 שבוע מראש.
- בצינור 50 מ"ל להוסיף 10 מ"ל מרק LB, של פתרון מלטוז 20% 100 μl, 25 אמפיצילין μl (20 מ"ג / מ"ל) ו20 kanamycin μl (5 מ"ג / מ"ל). לחסן עם א ' coli (lacZ - / גייל -) 25 ולגדול בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד ב240 סל"ד.
- יום 1: תאים תת תרבות
- תאים תת תרבות על ידי הכנת 1: של תרבות הלילה בLB הטרי (ללא אנטיביוטיקה) 100 דילול. נפח של 8 מ"ל של תת נדרש לדגימה. דגירה על 37 מעלות צלזיוס עם רעד ב240 סל"ד על 3.5 שעה עד OD 600 = 1.
- כאשר OD 600 = 1, השעיה פער תא באופן שווה ל50 צינורות מ"ל ו צנטריפוגות ב 1,300 XG ב 15 מעלות צלזיוס למשך 10דקות. הסר supernatant מחדש להשעות תאים במחצית הנפח המקורי (כלומר., 4 מ"ל לדוגמה) של LB המכיל 10 מ"מ MgSO 4. שים תאים בצד עד צורך [צעד 6.2.4.3].
- יום 1: אריזת DNA במבדה הפאג חלקיקים
- לחמם את אמבט מים ל30 מעלות צלזיוס.
- באמצעות קצה רחב נשא 10 μl פיפטה, העברת 4 DNA μl לצינור 1.5 מ"ל. הערה: ניתן לבצע צעד זה ביום או יותר מראש כדי לקצר את זמן הכנה.
- לחמם את הצינור הראשון (אדום) מערכת תמצית אריזת הפאג (צינור 1 לכל 2 דגימות). בקצרה ספין כדי לאסוף תמצית בחלק תחתון של צינור.
- העבר את 4.8 μl של תמצית אריזה מהצינור הראשון לדגימת DNA ומערבבים על ידי ערבוב עדין עם קצה פיפטה. בקצרה ספין למטה דגימות בצינורות. דגירה של 1.5 שעות ב30 ° C אמבט מים.
- לחמם את צינור תמצית אריזה השנייה (הכחולה) (1 שפופרת ל~ 15 דגימות). בקצרה ספין כדי לאסוף תמצית בתחתיתשל צינור.
- העבר את 4.8 μl של תמצית אריזה מהצינור השני לדגימת DNA ומערבבים על ידי ערבוב עדין. בקצרה ספין למטה דגימות בצינורות. דגירה של 1.5 שעות נוספות ב30 ° C אמבט מים.
- להשעות Re חלקיקי הפאג ארוז ב500 חיץ SM μl ומערבבים על ידי החלפה ל30 דקות ב20 סל"ד.
- אחרי הסיבוב, דגימות בקצרה מערבולת ו צנטריפוגות ב XG 11,000 עבור 30 שניות כדי לאסוף דגימות בחלק תחתון של צינורות. חלקיקי הפאג מוכנים לזיהום [צעד 6.2.4].
- יום 1: הכן למעלה אגר
- הכן אגר נפרד עליון לצלחות כייל וצלחות בחירת מוטציה. כל דגימה דורשת 4 צלחות כייל, ו4 צלחות מוטציה. כל צלחת דורשת 8 מ"ל אגר עליון. הוסף את פניל-β-D-galactopyranoside הסוכן סלקטיבית (P-Gal) לראש בחירת המוטציה אגר רק. הכן שני agars העליון מראש (יום assay) ולשמור על 50 מעלות צלזיוס לפני הוספת 4 MgSO לשני agars העליון, וPGאל למוטציה אגר בחירה.
- יום 1: תאי הדבקה עם הפאג ארוז וציפוי
- תווית שני צינורות 50 מ"ל לדגימה: 1 צינור "מוטציה" לדגימה ו1 צינור "כייל" לדגימה
- לייבל 8 צלחות אגר לדגימה: 4 צלחות "מוטציה" לדגימה ו4 צלחות "כייל" לדגימה
- Aliquot 2 מ"ל של תאי resuspended [מצעד 6.2.1.2] על צינור אחד.
- הוסף 500 μl של חלקיקי הפאג ארוזים [מצעד 6.2.2.8] ל( תאים המכילים) צינור "מוטציה" 50 מ"ל. לערבב בעדינות ולאפשר חלקיקי הפאג להדביק תאים ל30 דקות בטמפרטורת חדר.
- לאחר 30 דקות, בקצרה מערבולת נגועה תאים ולהעביר 15 μl של תאים נגועים ל50 מ"ל המתאים צינור "כייל" (המכיל תאים).
- לדוגמה כייל צלחת, להוסיף 30 מ"ל של אגר חם (50 ° C) "כייל" מלמעלה (לא מכילים P-Gal) לצינור "כייל" 50 מ"ל. מייד distribתערובת אגר / תא אוטה בין 4 הצלחות "כייל" (~ 8 מ"ל לכל צלחת). לעבוד במהירות, כך שאגר העליון לא להתקרר בטפטפות, ולנסות לא להכניס בועות אוויר.
- צלחת הדגימות "מוטציה" הבא. ודא P-Gal מתווסף לאגר "בחירת מוטציה" העליון. הוסף 30 מ"ל של אגר חם "בחירת מוטציה" (המכיל P-Gal) לצינור "מוטציה" 50 מ"ל. מייד להפיץ תערובת אגר / תא בין 4 צלחות "מוטציה" (~ 8 מ"ל לכל צלחת).
- לאפשר צלחות לביסוס (~ 15 דקות) ולאחר מכן להפוך ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך לילה.
- יום 2: שלטי ספירה
- לאחר דגירה הלילה, לספור את מספר השלטים על לוחות המוטציה וכייל. למספר גדול של שלטים, לספור רק חלק מהצלחת להעריך את המניין הכולל (לדוגמא., לעתים קרובות ¼ של צלחת כייל יהיו בין 100-200 לוחות). מינימאלי של 100 לוחות יש לספור לכל צלחת כאשר counting חלק מהצלחת.
- לחשב את מספר היחידות פלאק ויוצרים (PFUs) לμl של תאים. הדבר נעשה על ידי חלוקת מספר השלטים על הלוחות "כייל" על ידי הנפח של תאים מצופים (15 μl).
- השתמש במספר PFUs / μl להעריך את המספר הכולל של PFUs בהיקף הכולל של תאים נגועים מצופים על צלחות "מוטציה" (PFUs / μl * [2 מ"ל תאים + 0.5 מ"ל חלקיקים ארוזים הפאג - 15 μl לצלחות כייל] ).
- להעריך את MF על ידי חלוקת המספר הכולל של לוחות מוטציה לספור על 4 צלחות "מוטציה" במספר הכולל המשוער של PFUs בהיקף הכולל של תאים נגועים נקבעו מהצלחות "כייל".
- כאשר lacZ MF הספונטני הוא בסדר הגודל של 3 x 10 -5 בקבוצת הביקורת, כפי שלתאי נבט MutaMouse, הקו המנחה OECD ממליץ על מינימום של 125,000 ל 300,000 PFUs שאינה מוטציה לכל בעל חיים להיות מסךed למוטציה על מנת לקבל אות בסיס אמינה. מודלים מהונדסים אחרים עשויים MF הספונטני נמוך יותר, ובמקרה כזה יהיה צורך במספר רב יותר של PFUs. מבחן כוח סטטיסטי יכול להתבצע על מנת לקבוע את המספר המזערי של PFUs ובעלי חיים הנדרש להשגת הרזולוציה הרצויה. נתונים ממשכפל מרובה ניתן אספו כדי לספק את דרישת PFU מינימום זה, בתנאי שהם אינם מייצרים תדרי מוטציה שונים באופן משמעותי.
.7 סטטיסטיקה
היחידה הניסיונית לניתוח היא העכבר. הנתונים המופקים מassay זה בדרך כלל לא מתפלגים נורמלי. ככזה, בחר בשיטה הסטטיסטית לניתוח המבוסס על מאפיין ההפצה של נתונים.
הערה: תקן ניתוחים פרמטריים (. למשל, ANOVA) עשויה להיות מועסק אם שינוי הנתונים מתאים מיושם כדי להשוות את השונות של התגובה על פני הטווח של observation. פואסון או ניתוחי רגרסיה הבינומי הם לעתים קרובות יותר מתאים. ניתוח פרמטרית גם יכול להיות מועסק. אנחנו באופן שיגרתי להעסיק רגרסיה פואסון באמצעות הליך מודל ליניארי כללי (כלומר., Proc GENMOD) בv.9.2 SAS (SAS Institute, Cary, NC) כפי שתואר על ידי Lemieux et al 26.
Representative Results
עם ספירת פלאק ממוצעת של 200,000 לוחות לכל בעל חיים, אנו בדרך כלל לצפות MF רקע ממוצע של כ 2.8 x 10 -5 בתאי נבט גבריים עם סטיית תקן של 1.7 x 10 -5 בקבוצות הביקורת שלנו (המבוסס על נתונים משמונה עצמאיים ניסויים). עם ספירה זו פלאק, רמת רקע ושונות, קבוצות מינון עם n = 5 חיות כל יש בם כדי לזהות עלייה של 2 קיפול בMF עם כוח> 0.8.
תוצאות מדווחות בדרך כלל בפורמטים טבלאיים או גרפיים. לוח 2 ואיור 6 מראים תוצאות נציג מזרע cauda של זכרים MutaMouse (n = 5 לכל קבוצה) שנחשף למנה אחת חריפה אוראלית של 0, 25, 50, ו100 מ"ג / קילוגרם N-אתיל-N-nitrosourea (ENU) ואחריו זמן דגימה 70 יום. תקופת 70 יום זה מאפשרת המדידה של אירועי מוטאציות שהתרחשו בזרע שהיו בתאי גזע spermatogonial בעת החשיפה (איור 3). צפיפויות לוחית טיפוסיות על צלחות מוטציה וכיילו מוצגות באיור 7. כפי שמתוארות בטבלה 2 ואיור 6, חשיפת ENU חריפה הנגרמת עלייה תלוית מינון משמעותית בMF של תאי גזע spermatogonial. המינון הנמוך מושרה עלייה משמעותית 2.6 לקפל מעל פקדים, שהייתה לי MF בסיסי של 2.6 x 10 -5. אינדוקציה המרבית התרחשה במינון הגבוה, שהושר על גידול של פי 4.4 על פקדים.
ניתן למצוא דוגמא של assay זה מבוצע על תאי נבט אבובית seminiferous בדאגלס et al. 27, שבו MF נקבע בתאי נבט אבובית במרווחי זמן שונים הבאים זריקת intraperitoneal חוזרת 5 יום 50 מ"ג / קילוגרם ENU. במחקר ש, תדרי מוטציה בתאי seminiferous גדלו עד 15 ימים לאחר טיפול ונשארו קבוע לאחר מכן.
| אקספומשטר בטוח | רקמה שנאספה | סוג תא שנאסף (תא מטרה) | שלב של תא המטרה בתחילת החשיפה | שלבים עברו במהלך חשיפה |
| חריף + 70 | Cauda | זרע למבוגרים | תאי גזע | תאי גזע |
| 14 + 21 | Cauda | זרע למבוגרים | Spermatogonia | Spermatid |
| 14 + 35 | Cauda | זרע למבוגרים | תאי גזע | Spermatocyte |
| 28 + 3 | Cauda | זרע למבוגרים | Spermatocyte | Spermatocyte Spermatid זרע למבוגרים |
| קשיות | תאי גזע | תאי גזע | תאי גזע | |
| Spermatogonia | Spermatogonia | Spermatogonia | ||
| Spermatocyte | Spermatocyte | |||
| Spermatid | Spermatid | |||
| 28 + 49 | Cauda | זרע למבוגרים | cel גזע | תאי גזע |
| קשיות | תאי גזע Spermatogonia Spermatocyte Spermatid | תאי גזע | תאי גזע |
טבלת 1 סוגים סלולריים ושלבים של יצירת תאי זרע שממוקדים על ידי assay המוטציה מכרסם המהונדס על ידי עיצובים ניסיוניים שונים.
| קבוצת המינון | # בעלי חיים | המוטציה PFU | סה"כ PFU | MF (x10 -5) | ממוצע MF (x 10 -5) | שינוי של פי | p-value |
| בקרה | 1 | 5 | 180,245 | 2.8 | 2.6 | 1.0 | - |
| 2 | 4 | 137,835 | 2.9 | ||||
| 3 | 11 | 385,672 | 2.9 | ||||
| 4 | 2 | 431,396 | 0.5 | ||||
| 5 | 6 | 152,413 | 3.9 | ||||
| 25 מ"ג / קילוגרם | 6 | 17 | 162,353 | 10.5 | 6.9 | 2.6 | 0.0002 |
| 7 | 14 | 150,094 | 9.3 | ||||
| 8 | 4 | 154,401 | 2.6 | ||||
| 9 | 9 | 154,401 | 5.8 | ||||
| 10 | 12 | 196,978 | 6.1 | ||||
| 50 מ"ג / קילוגרם | 11 | 17 | 155,727 | 10.9 | 9.3 | 3.6 | <0.0001 |
| 12 | 11 | 135,847 | 8.1 | ||||
| 13 | 25 | 193,499 | 12.9 | ||||
| 14 | 12 | 133,859 </ Td> | 9.0 | ||||
| 15 | 14 | 252,807 | 5.5 | ||||
| 100 מ"ג / קילוגרם | 16 | 26 | 170,968 | 15.2 | 11.5 | 4.4 | <0.0001 |
| 17 | 28 | 234,584 | 11.9 | ||||
| 18 | 10 | 145,289 | 6.9 | ||||
| 19 | 35 | 292,236 | 12.0 | ||||
| 20 | 22 | 190,848 | 11.5 |
לוח 2: תדירות המוטציה lacZ בזרע cauda של מ 'גברים מהונדסיםקרח נחשף בחריפות לENU כשהיו תאי spermatogonial גזע (זמן = יום 1 ממשל, זמן דגימה = 70 ימים). PFU = יחידת יצירת פלאק, MF = תדירות מוטציה.
איור 1 ייצוג סכמטי של מבנה הפאג λgt10.
איור 2 מתאר של assay המוטציה תא החיידק מכרסם המהונדס.
איור 3 תרשים סכמטי של תהליך יצור תאי זרע בעכבר וסוגי התאים וPHAs es שממוקדים על ידי assay המוטציה מכרסם המהונדס על ידי עיצובים ניסיוניים שונים הערה:. ברים הלבנים סיימו מייצגים את חלקם היחסי של סוגי תאים קיימים בהשעיות תא שהוכנו מאבוביות הזרע (כלומר spermatids> spermatocytes>> תאי גזע spermatogonia). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4 אוסף של יותרת האשך cauda העכבר. ) עושה חתך בבטן לכיוון שק אשכים. B) זהה את epididymal שומן כרית. C) משוך בעדינות את כרית השומן כדי להוציא את האשכים ויותרת האשך. D) אתר, ולהסיר את יותרת האשך cauda.
ss = "jove_content" FO: לשמור-together.within-page = "תמיד"> 
איור 5 הכנת ההשעיה של תאי נבט מאבוביות הזרע. ) מבצעת חתך בכמוסת האפיתל של האשך, חושף אבוביות הזרע. B) אבוביות הזרע הם סחט של הקפסולה. C) רולר רקמות עובר בעדינות על הצינוריות בזווית של 5-10 מעלות ל לשחרר את תאי נבט הכלול בתוך. D) ההשעיה תא החיידק נאסף לעיבוד נוסף.
איור 6 ייצוג גרפי של תדירות המוטציה lacZ בזרע MutaMouse נחשף בחריפות כתאי גזע לENU (n = 5). כלמשולש מייצג את MF של חיה אחת. * p <0.05 כפי שנקבע על ידי רגרסיה פואסון.
איור 7 צלחות אגר נציג מassay המוטציה המכרסם המהונדס עם שלטים נוצרו על דשא של א ' חיידקי מארח coli. ) הצלחות "המוטציה" תהיה לי מעט מאוד לוחות (מסומנים בחיצים), במיוחד בקבוצות מינון שליטה, אשר יהיו מעת לעת אפס שלטים על כמה צלחות. B) הצלחות "כייל" יכולות להיות מאות שלטים.
Discussion
בהשוואה לשיטות מסורתיות, assay המוטציה של תא הנבט TGR מספק אמצעי מהיר יותר, חסכוני יותר, ורגיש יותר לכימות מושרה במוטציות תאי נבט vivo. על ידי הערכת transgene MF ישירות בזרע, בניגוד לצאצאים, מספר בעלי החיים, זמן ומשאבים הדרושים להערכת המוטגניות בתאי המין של כל תרכובת אחת מצטמצמים באופן משמעותי. במונחים של רגישות, שהיינו מסוגלים לזהות גידול משמעותי 2.6 לקפל בתאי גזע spermatogonia MF בעקבות חשיפה לENU / קילוגרם 25 מ"ג רק באמצעות 5 חיות לכל קבוצת מינון. בניגוד לכך, assay המוקד הספציפי לא היה מסוגל לזהות כל שינוי משמעותי בMF באותו מינון זה באמצעות> 3,000 עכברים בקבוצה החשופה ו> 500,000 עכברי שליטה 28.
בנוסף להתאמתה לשתי חקירות מכניסטית ורגולציה, שיטה זו מספקת הזדמנות למחקרים השוואתיים בין גופני וmutati שורת הנבטעל שיעורים. הראיות אחרונות עולה כי לכמה סוכני מוטציות תאי נבט יכולות להיגרם בריכוז נמוך מהנדרש למוטציה סומטיים. לדוגמא, חשיפה ממושכת לN-hydroxymethylacrylamide, מטבוליט של acrylamide קרצינוגן מזון 12, מגבירה את תדירות מוטציות תאי נבט קטלניות דומיננטיות בעכברים מבלי להשפיע על תדירות הגרעינון בתאי דם אדומים, מידה מסורתית של תא סומטי נזק ציטוגנטית 13. בנוסף, חשיפה של עכברים לשני תדרי המוטציה גורם עשן טבק הזרם המרכזי והעקיף גבוהים בלוקוסי DNA חוזרים טנדם בזרע במינונים שלא להגדיל את תדירות הגרעינון דם 14. ממצאים אלה קוראים תיגר על ההנחה שבדיקות genotoxicity סומטי היא תמיד הגנה של תאי המין, ולחזק את הביקוש לאמצעים יותר יעיל וחסכוניים לכמת תדירות מוטציה של תא נבט. עם זאת, הראיות לגורמי מוטציות תאי נבט מועדפים היא עדיין חלשות, בעיקר בשל המחסור בנתונים זמינים להשוואת שיעורי מוטציה ברקמות תא סומטי וניבטו. Assay המוטציה TGR מאפשר בדיקה והשוואה של שיעורי מוטציה מושרה ברקמות מרובות משתמשים באותו transgene מקבילים. לפיכך, מוטציה השוואתית בדיקה באמצעות assay TGR יעזור למלא פערי נתונים המקיפים את האפשרות של תופעות תא חיידק מועדפים.
הערכה בו זמנית של מוטציה תא סומטי וניבט לבדיקת רגולציה תהיה גם לשפר את היעילות על ידי הקטנת מספר בעלי החיים הדרושים. הקו המנחה OECD למוטציה סומטיים ממליץ זמן ממשל 28 יום, ואחריו זמן של שלושה ימים דגימה (28 + 3). ניתוח של זרע cauda עשוי להציע רגישות עניים בנקודה זו בזמן, שכן הוא מתמקד בתאים שנחשפו בעיקר בשלבי spermatocyte וspermatid יצירת תאי הזרע (איור 3). תאים בשלבים אלה אינם לסנתז DNA ובהדרגה לאבד את היכולת שלהם לתיקון DNA 6 </ Sup>. יתר על כן, זרע cauda הדגימה בנקודה זו בזמן לא יצליח לזהות מוטציות המתרחשות בתאי spermatogonia וגזע. לפיכך, להשתלבות בעיצוב 28 + 3, הקו המנחה OECD ממליץ איסוף תאי נבט מאבוביות הזרע. אוכלוסייה מעורבת זה מכילה תאים שמקורם בסינתזה של DNA וסוגי תאי תיקון מיומן, הכוללים תאי גזע, ונחשפות על פני רוב שלבי זרע ראשוניים. עם זאת, בשל האופי המעורב של תאים אלה, ניתוח תא אבוביות זרע אינו מספק מידע שלב ספציפי. יתר על כן, קיים חשש שנוכחותם של תאים שאינם יעד יכולה להשפיע על MF נצפה (למשל שיחות mutagen תא חיידק חיוביות כוזבות עקב זיהום של תאים סומטיים שעברו מוטציה, או דילול של אות תא חיידק שעבר מוטציה מתאי נבט DNA תיקון לקוי) . כרגע יש מספיק נתונים ללהסיק האם תוצאות מתאי אבוביות זרע ב28 + 3 הצעה אותה רגישות וסגוליותזרע cauda של בנקודות זמן מאוחר יותר. המעבדה שלנו היא משווה כיום MFS המושרה בתאי seminiferous tubules וזרע cauda נאספו לאחר פעמים דגימה שונות כדי לטפל בנקודה זו. נציין כי הקו המנחה OECD מצביע על זמן דגימה חלופי של 28 ימים לרקמות החלוקה לאט כגון הכבד, שעשויה גם להיות מתאים לניתוח תא חיידק. עם זאת, הנתונים זמינים הוא עדיין לא מספיק ואין באפשרותנו כיום להמליץ תכנון ניסוי אחד ואחד לניתוח סימולטני של תאים סומטיים ותאי נבט באמצעות assay המוטציה TGR לבדיקת רגולציה.
אחד מאפיינים של assay זה שיש לציין הוא שאירועי מוטאציות מוערכים על transgene שאינו עכברי. עם זאת, יש עדויות רבות לכך שtransgene מגיב לחומרי גורמי מוטציות סביבתיות באופן דומה לגנים אנדוגני 20. בנוסף, מכיוון שמקורותיה המדויקים של אירועי מוטאציות עצמאיים קשיםלפתור, תוצאות הן בדרך כלל כפי שדווחו בתדירות מוטציה (בניגוד לתדירות מוטציה). תדירות המוטציה בפועל יכולה להיפתר אם תוצאות מתוקנות להרחבה משובט (כלומר. החלוקה והכפלה של תא מוטציה יחיד שיכול לתרום לתדירות הנצפית של מוטציות transgene) על ידי רצפי DNA. רצף של transgenes המוטציה ניתן לבצע כדי לאפיין את מוטציות lacZ, ולזהות מוטציות שעשויות לנבוע מאירועי הרחבה משובטים, למרות שזה מוסיף באופן משמעותי לזמן והעלות של הניתוח. בנוסף לגן lacZ, theλgt10 וקטור מהונדס מטפח גן חלופי טמפרטורה תלויה מוטציה-כתב: גרסה של הגן כת"ש λ, שהוא (294 נ"ב לעומת 3021 נ"ב lacZ, איור 1) קצר יותר וקלים יותר לרצף 29. רצף גם מאפשר הניתוח של ספקטרום המוטציה המושרה, מתן תובנה mutatioמנגנון סופי של המתחם בשאלה. דוגמא קיצונית להרחבה משובט היא ההתרחשות של מוטציה "קופה" (כלומר., מוטציות transgene בשלב מאוד מוקדם של הפיתוח של איבר שתורמות לMF באופן דרמטי גבוה, לעתים מאות עד אלפי פעמים יותר מאשר ברקע). בעלי חיים או רקמות עם מוטציה "קופה" יש להסיר מהניתוח.
Assay שתארנו הוא רחב החלים על מודלים TGR אחרים כגון עכבר BigBlue וחולדה, ועכבר פלסמיד lacZ, אשר כולם נמל וקטורים דומים כתב מוטציה (שנסקרו ב20). רובם המכריע של מחקרי תאי נבט שנערכו עד כה, כי שימוש בשיטות דומות התמקדו גורמי מוטציות מאופיינות כמעט באופן בלעדי על גם כמו ENU וקרינה (שנסקרה ב30). צפוי כי עם שחרורו האחרון של הקו המנחה מבחן OECD לassay TGR, assay זה יהיהפופולרי יותר ויותר להקרנה כימית והערכת רגולציה. התאגדות של assay המוטציה של התא הנבט TGR לסוללת בדיקת רגולציה תהיה למלא את הפער הקיים על ידי התרת הערכה יעילה של אינדוקציה מוטציה בתאי נבט 11. יתר על כן, assay זה יכול לשמש כדי למדוד MF כמעט בכל רקמות, מתן אמצעים מתאימים להשוואת הרגישויות היחסית של תאים סומטיים ותאי נבט לאינדוקציה של מוטציות על ידי סוכנים סביבתיים בנקודתי קצה גנטיות זהות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MutaMouse | Covance | - | |
| E. coli (lacZ-/galE-) | Covance | - | See reference 25 in manuscript |
| Chloroform | Caledon | 3001-2-40 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (D-PBS) | Gibco | 14190-250 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5 M, pH 8 | Sigma-Aldrich | 03690 FLUKA | |
| Isoamyl alcohol | Caledon | 2/10/7900 | |
| Lennon LB broth base | Invitrogen | 12780-029 | |
| Stainless steel mesh filter | Sigma-Aldrich | S3770 | |
| Transpack packaging extract | Agilent Technologies | 200220 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Ethyl alcohol, anhydrous (EtOH) | Commercial Alcohols | - | |
| Ampicilin | Gibco | 11593-027 | prepare 20 mg/ml in dH2O |
| Kanamycin | Gibco | 11815-024 | prepare 5 mg/ml in dH2O |
| Phenol | Invitrogen | 15509-097 | Saturate in 0.1 M Tris-HCl as per manufacturers direction |
| Phenyl-β-D-galactopyranoside (P-Gal) | Sigma-Aldrich | P6501 | dissolve 3 g per 10 ml of dimethylformamide |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530-031 | prepare 60 mg/ml solution dH2O just before use, 20 µl per sample |
| Sodium acetate (NaAc) | Fisher Scientific | BP333-500 | prepare 3 M solutution, pH 5.2 |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L4390 | prepare 10% solution in dH2O |
| 1 M MgSO4 | 24.6 g MgSO4·7H2O per 100 ml dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year | ||
| LB Broth | 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl per 1 L dH2O. Autoclave and cool | ||
| Saline sodium citrate (SSC) | 150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate, pH 7.0 | ||
| SM Buffer | 5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4·7H2O, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 5.0 ml of gelatin (2% w/v), per 1 L dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year | ||
| TE buffer | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8 |
References
- Ahmadi, A., Ng, S. C. Fertilizing ability of DNA-damaged spermatozoa. J. Exp. Zool. 284 (6), 696-704 (1999).
- Crow, J. F. The origins, patterns and implications of human spontaneous mutation. Nat. Rev. Genet. 1 (1), 40-47 (2000).
- Nelson, K., Holmes, L. B. Malformations due to presumed spontaneous mutations in newborn infants. N. Engl. J. Med. 320 (1), 19-23 (1989).
- Kong, A., et al. Rate of de novo mutations and the importance of father's age to disease risk. Nature. 488 (7412), 471-475 (2012).
- Michaelson, J. J., et al. Whole-genome sequencing in autism identifies hot spots for de novo germline mutation. Cell. 151 (7), 1431-1442 (2012).
- Marchetti, F., Wyrobek, A. J. DNA repair decline during mouse spermiogenesis results in the accumulation of heritable DNA damage. DNA Repair (Amst). 7 (4), 572-581 (2008).
- Marchetti, F., Wyrobek, A. J. Mechanisms and consequences of paternally-transmitted chromosomal abnormalities. Birth Defects Res. C. Embryo. Today. 75 (2), 112-129 (2005).
- Demarini, D. M. Declaring the existence of human germ-cell mutagens. Environ. Mol. Mutagen. 53 (3), 166-172 (2012).
- Epstein, S. S. Use of the dominant-lethal test to detect genetic activity of environmental chemicals. Environ. Health. Perspect. 6, 23-26 (1973).
- Russell, W. L. X-ray-induced mutations in mice. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 16, 327-336 (1951).
- Singer, T. M., Yauk, C. L. Germ cell mutagens: Risk assessment challenges in the 21st century. Environ. Mol. Mutagen. 51 (8-9), 919-928 (2010).
- Tareke, E., Rydberg, P., Karlsson, P., Eriksson, S., Tornqvist, M. Acrylamide: A cooking carcinogen. Chem. Res. Toxicol. 13 (6), 517-522 (2000).
- Witt, K. L., et al. Mouse bone marrow micronucleus test results do not predict the germ cell mutagenicity of N-hydroxymethylacrylamide in the mouse dominant lethal assay. Environ. Mol. Mutagen. 41 (2), 111-120 (2003).
- Marchetti, F., Rowan-Carroll, A., Williams, A., Polyzos, A., Berndt-Weis, M. L., Yauk, C. L. Sidestream tobacco smoke is a male germ cell mutagen. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (31), 12811-12814 (2011).
- Yauk, C. L., Dubrova, Y. E., Grant, G. R., Jeffreys, A. J. A novel single molecule analysis of spontaneous and radiation-induced mutation at a mouse tandem repeat locus. Mutat. Res. 500 (1-2), 147-156 (2002).
- Niwa, O. Indirect mechanisms of genomic instability and the biological significance of mutations at tandem repeat loci. Mutat. Res. 598 (1-2), 61-72 (2006).
- Campbell, C. D., et al. Estimating the human mutation rate using autozygosity in a founder population. Nat. Genet. 44 (11), 1277-1281 (2012).
- Beal, M. A., Glenn, T. C., Somers, C. M. Whole genome sequencing for quantifying germline mutation frequency in humans and model species: Cautious optimism. Mutat. Res. 750 (2), 96-106 (2012).
- Shwed, P. S., Crosthwait, J., Douglas, G. R., Seligy, V. L. Characterisation of MutaMouse lambdagt10-lacZ transgene: Evidence for in vivo rearrangements. Mutagenesis. 25 (6), 609-616 (2010).
- Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R. Detailed review of transgenic rodent mutation assays. Mutat. Res. 590 (1-3), 1-280 (2005).
- OECD. OECD Guideline for the testing of chemicals: Transgenic rodent somatic and germ cell gene mutation assays. , (2011).
- Rodriguez, M., Panda, B. B., Ficsor, G. Testes weight reflect ethylnitrosourea induced histopathology in mice. Toxicol. Lett. 17 (1-2), 77-80 (1983).
- Russell, L. B. Effects of male germ-cell stage on the frequency, nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse. Genetica. 122 (1), 25-36 (2004).
- Duselis, A. R., Vrana, P. B. Harvesting sperm and artificial insemination of mice. J. Vis. Exp. (3), 184 (2007).
- Gossen, J. A., Molijn, A. C., Douglas, G. R., Vijg, J. Application of galactose-sensitive E. coli strains as selective hosts for LacZ- plasmids. Nucleic Acids Res. 20 (12), 3254 (1992).
- Lemieux, C. L., et al. Simultaneous measurement of benzo[a]pyrene-induced pig-a and lacZ mutations, micronuclei and DNA adducts in muta mouse. Environ. Mol. Mutagen. 52 (9), 756-765 (2011).
- Douglas, G. R., Jiao, J., Gingerich, J. D., Gossen, J. A., Soper, L. M. Temporal and molecular characteristics of mutations induced by ethylnitrosourea in germ cells isolated from seminiferous tubules and in spermatozoa of lacZ transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (16), 7485-7489 (1995).
- Russell, W. L., Hunsicker, P. R., Raymer, G. D., Steele, M. H., Stelzner, K. F., Thompson, H. M. Dose--response curve for ethylnitrosourea-induced specific-locus mutations in mouse spermatogonia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79 (11), 3589-3591 (1982).
- Swiger, R. R., Cosentino, L., Shima, N., Bielas, J. H., Cruz-Munoz, W., Heddle, J. A. The cII locus in the MutaMouse system. Environ. Mol. Mutagen. 34 (2-3), 201-207 (1999).
- Singer, T. M., Lambert, I. B., Williams, A., Douglas, G. R., Yauk, C. L. Detection of induced male germline mutation: Correlations and comparisons between traditional germline mutation assays, transgenic rodent assays and expanded simple tandem repeat instability assays. Mutat. Res. 598 (1-2), 164-193 (2006).
