Introduction
生殖細胞における散発DNA変異は、減少し繁殖成功につながることや、継承された場合には、子孫1-3で癌に対する遺伝的疾患または高められた素因の原因となります。実質的な証拠が新生突然変異の大部分は父方の生殖細胞系列4から継承されることを示している、と子孫における変異の数は、積極的に受胎5の時に父方の年齢と相関していること。男性の突然変異のより高い割合が男女間の配偶子形成時の年齢差の結果であると考えられている、女性の生殖細胞系列2 oogenic細胞分裂の数と比較して精子形成細胞分裂より多くの、そしてDNAの進行性の低下男性では年齢とともに修復効率。これらの要因はすべて、男性の生殖細胞系列6の複製エラーの確率が増加に寄与している。しかし、父方の暴露の影響は、エンバイロする新生突然変異の頻度にnmental要因は不明である。それにもかかわらず、環境因子の多数のげっ歯類7の生殖細胞突然変異を誘発することが知られており、これらの薬剤のいくつかは、ヒト生殖細胞系8に影響を与えることができることの証拠があるれている。これらの懸念にもかかわらず、化学物質が日常的に規制目的のために体細胞において変異を誘導するそれらの能力について試験し、それは一般的に体細胞試験は生殖細胞を保護するのに十分であると仮定する。したがって、化学物質はまれにしか生殖細胞突然変異を誘導するそれらの能力について評価されていない。
生殖細胞変異原性試験は、主に規制意思決定プロセスから省略されている一つの理由は、実用的な方法論の欠如である。このような優性致死9および特定の遺伝子座10のテストなどの伝統的な齧歯類ベースの方法は、胚または子孫の変異表現型をスコアリングすることにより生殖細胞突然変異率を推定露出した両親。これらのアッセイは、統計的に意味のある結果を取得するために、動物、時間とリソースの非常に多数の使用を必要とする。
生殖細胞変異を定量化するためのいくつかの近代的な方法は、最近浮上しているが、多くは彼らの実用性、効率性、および生物学的関連性の面で欠点を抱えている。例えば、遺伝子座は、単一分子PCR法15を用いて、雄性生殖細胞に定量することができる拡張した単純なタンデムリピート（エストル）で長さ変異を繰り返す。しかし、この方法の実行は技術的に困難かつ面倒であることができ、点突然変異とは異なり、非常に不安定エストル遺伝子座の反復長の変化の生物学的および健康的意義は不明である16。現代の世代突然変異4,17の問題に適用した場合に全ゲノムシーケンシング技術は、生物学的に意味のあるデータを豊富に提供することができますが、高コスト、高エラー率、必要に関連した検証変異を確認し、バイオインフォマティクスの課題は、依然として規制のテスト容量18には、このオプションの日常的な適用を制限する。
ここで、私たちは、トランスジェニック雄マウスの生殖細胞内に直接誘導された変異を定量化するための実用的な方法を説明している。このプロトコルは、第3染色体19（ 図1）の両方のコピーに組み込まれ、大腸菌lacZレポーター遺伝子を含む組換えをλgt10ファージベクターの複数の連結のコピーを有するトランスジェニックMutaMouseモデル、に記載されている。
このプロトコルは、（。BigBlueマウスおよびラット、またはlacZのプラスミドマウスなど ）も同じ原理に基づいて、他のトランスジェニックげっ歯類（TGR）のモデルに関連しているか、わずかに異なるレポーター遺伝子（GPTデルタマウスおよびラット、TGRのモデルはランバートらに検討文献 20）。この方法は、最近リリースされたに記載されたTGRの突然変異試験に基づいていますやOECDテストガイドライン21を改訂し、私たちが原因精子形成の独特の特性のため、男性の生殖細胞系列の変異の評価に対応するために必要な特別な考慮事項について記述する。簡単に述べると、このアッセイは、予め突然変異病変が安定した突然変異に固定されたサンプリング時間に続いて、変異原性物質に対するトランスジェニック雄マウスを曝露することを含む。選択されたサンプリング時間に、マウスを安楽死させ、生殖細胞は、精巣上体尾または精細管のいずれかから収集される。以下に説明するように、精子形成の異なる段階において変異原性は、露光及びサンプル収集の間の時間を選択することによって決定することができる。細胞当たりのλファージゲノムの複数のコピーを含むトランスジェニックインサートは、生殖細胞のゲノムDNAから単離し、次いでE.を感染させるために使用されている感染性λファージ粒子を作成する空のλファージカプシドにパッケージングされている大腸菌ホスト。感染した細菌は、セレク上に成長させる野生型のlacZを保有する細胞からlacZの突然変異したコピーを有するベクターを含む細胞を区別することができる電性メディア。男性の生殖細胞系列への露光の変異原性効果は、対照と処置マウスとの間の変異導入遺伝子の頻度と比較することによって決定される（ランバートらに概説図2、 図20）。生殖細胞の大多数は、必要な動物の数を削減しながら、従来の方法に対するこのアッセイの優れた感度を与え、単一のマウスからアッセイすることができる。全く特殊な装置やトレーニングを必要としないためと、このアッセイは、最も近代的な毒物学/分子生物学の研究室で生殖細胞突然変異検査のための実用的かつ効率的なオプションを提供します。
TGR生殖細胞突然変異試験の効果的な適用のための一つの本質的な要件は、精子形成サイクル（ 図3）を理解することである。マウスの生殖細胞がSTから進行するまでの時間全角精原細胞への精細管中の細胞、精母細胞、精子細胞、および最終的に精巣上体に精子を成熟（ すなわち精子形成）は、約49日である。変異は、このサイクルのさまざまな段階で発生し、多くの場合、化合物に特異的であることができます。雄の生殖細胞における変異誘発に特に関連ある二つの主要な機能は、早期減数分裂時のDNA合成の停止、及び後期ポスト減数分裂時のDNA修復能6の進行性の喪失、の誘導および固定のために必要な2つのプロセスであるほとんどの突然変異。
そのため、精子形成のこれらのユニークな特性のため、TGR生殖細胞突然変異試験の実施のための3つの重要な実験的な変数があります：（1）試験化合物投与時間が; （2）サンプリング時間;及び（3）分析のために収集する生殖細胞集団の選択（ 図3及び表1）。管理時間がexperimeです長い標的細胞が試験化合物にさらされている方法を決定NTAL変数。投与時間の長さはまた、特定の細胞型または精子の位相に対するエクスポージャーを標的化するために使用することができる。例えば、一日の投与は、特定の細胞型急性曝露の影響を決定するために使用することができる。同様に、露光のみ減数分裂割る精母細胞を標的とする、または有糸分裂2週間の投与時間と適切なサンプリング時間を使用して、精原細胞を分割することにより、例えば、全体の精子形成相に集束させることができる。慢性および亜慢性投与回数は、例えば（長期曝露の影響を評価するために試験化合物の十分な薬物動態学的分布を確実にするために、または弱い変異原の変異の十分な蓄積を可能にするOECD試験で推奨される28日間の投与時に使用され指針）。
サンプリング時間は、時を決定するための重要な変数である精子形成の段階は、標的細胞は、露光時であった。サンプリング時間は、どのくらいの時間が決まるので、どのくらいのさらなる精子形成サイクルに沿って、細胞が曝露後に通過する。例えば、幹細胞精原細胞における効果を調べるために、サンプリング時間> 49日>は42日、完全に成熟した精子を採取する場合に必要な、またはされ、収集されたすべてのセルがするのに十分な時間があったことを確認するために、精細管から未成熟生殖細胞を採取する場合暴露さから発生して細胞を生じる。それは、少なくとも70日のサンプリング時間が精子形成の後の段階で曝露された細胞の除去のために、毒性の薬物動態学的分布のための十分な時間を提供するために、真の幹細胞の効果を実証することが好ましい、とを考慮していることに留意することが重要である〜6週間の高い変異原性化合物22にさらされた後に発生することがあり、一時的な無菌性の期間。同様に、21日のサンプリング時間は、精子のコレを確実にする精巣上体尾からCTEDはちょうど暴露の最終日に減数分裂を完了しているだろう。
生殖細胞は、精巣上体尾から、または精細管からの各種の精子形成細胞型の混合物として成熟精子として採取することができる。成熟精子は、相対精度で精子は、任意の実験計画のために発信された精子の細胞型または位相を決定することが可能となる、〜3日間、尾部に残る。このように、尾部精子が許すの分析は非常に段階特異的突然変異の影響の調査を目標と。一方、精細管から採取した細胞懸濁液は、発達の異なる段階で、さまざまな生殖細胞型の混合物を含有し、従って、変異が発信された精子相の乏しい分解能を提供する。また、精細管から回収した細胞懸濁液は、精母細胞、続いて、過剰表現精子細胞を含有する傾向があり、版yのいくつ精原細胞および幹細胞（これらの比率は、 図3に卒業白いバーで表されます）。また、精細管から調製懸濁液はまた、さまざまな体細胞を含むことができる。非常に多くの細胞型が存在するので、したがって、突然変異の効果は、非標的細胞のさまざまな影響を与えることができる。しかし、精細管から試料を採取することは、同時に複数の生殖細胞型、および体細胞突然変異のための標準OECDテストプロトコルに生殖細胞分析の容易な統合をスクリーニングするための経済的なオプションを提供しています。
治験責任医師、投与時間、サンプリング時間及び収集細胞集団のニーズに応じて、繰り返しにさまざまな細胞型における精子形成の異なる段階での曝露の影響を調べるために調整することができる。慎重にこれらの変数を選択することにより、実験を、またはより一般規制試験の対象と機構的研究のために設計することができるる目的。
アッセイで習熟を達成するために、70日サンプリング時間陽性対照として、続いて100mg / kgのN-エチル-N-ニトロソウレア（ENU）の急性経口投与の使用をお勧めします。尾部精子の分析は、このように一般的にENUのこの非常に変異原投与後対照より突然変異体頻度（MF）における4〜5倍の増加を示し、精原幹細胞（ 図3）、標的とする。これは、この用量は、このようにより短いサンプリング時間に適した制御用量でなくてもよく、露光後6週間無菌性を誘導することが知られていることに留意すべきである。この用量は、ほとんどの体細胞組織20におけるMFの検出可能な増加を生成します。以下に代表的な結果は、最大ENUの3用量を用いて、および100mg / kgを含む急性70暴露レジメンに従って作製した。
Protocol
畜産、メンテナンスや取り扱いに関わるすべてのプロトコールはカナダ保健省の動物管理委員会によって承認された。
1動物のエクスポージャー
- ランダムに選択された投与時期に適切な暴露経路による試験化合物および関連するコントロールを持つグループと治療グループ（グループ当たり最小= 5）.Treatマウスを制御するために、（8-12週齢）トランスジェニック雄マウスを配布します。興味のある精子形成細胞型（ 図3）に応じて適切なサンプリング時間を選択してください。
- サンプリング時間後に、イソフルラン麻酔下で頸椎脱臼（または他の適切な方法）によりマウスを安楽死させる。慎重に腹部や陰嚢の切開から精巣を引き出し、馬尾上体を切除します（ 図4、Duselis らを参照の精巣上体、コレクションの詳細な映像を表示する。24）。精細管を分析する場合には別の方法として、精巣を収集の細胞。後で使用するために-80℃で液体窒素とストアにフリーズ。
馬尾精子の2離と消化
- 氷の上で尾上体解凍。ペトリ皿に解凍した馬尾を移し、徹底的にメスまたはカミソリの刃でミンチ。
- ペトリ皿に室温D-PBS700μlのを追加します。 D-PBSは、精子（約10倍）と濁るまで懸濁液を描画し、放出することによって、ワイドボア千μlのピペットチップ、尾からの放出の精子を使用した。注：ワイドボアピペットチップを調製するためには、プラスチック製のピペットチップの先端から2〜3ミリメートルを切る。
- 新しい1.5mlチューブにステンレス製のメッシュフィルターで濾過してサスペンション。 D-PBSの追加の700μlのペトリ皿を洗うとメッシュフィルターを介して同じ1.5ミリリットルチューブに移す。メッシュを取り外し、チューブを氷上に置きます。
- 繰り返して、残りのサンプルについての2.1から2.3を繰り返します。
- 3分間11000×gでsamplesatスピン。上清を慎重にデカント。ペレットを乱さないようにしてください。
- 1.0ミリリットルの冷1×生理食塩水クエン酸ナトリウム（SSC）を追加します。ペレットまで、渦が完全に再懸濁する。これはときどきボルテックス数ラウンドがかかります。
- 10％SDS15μlのを追加します。反転/非精子細胞を破壊するために30秒間激しく振る。あまりにも静かに振る不十分な混乱をもたらすであろうし、ペレットは、以下のステップで適切に形成されません。
- 2分間11000×gでスピン。ゆるい、「ふわふわ」ペレットは、ステップ2.7における揺れが不十分のために体細胞の不完全な崩壊を示している。この問題が発生した場合は、もう一度サンプルを振ると、固いペレットが形成されるまでリスピン。注意深く上清を除去。ペレットを乱さないようにしてください。簡単に言うと、再びスピンし、200μlピペットで残りの上清を除去します。
- ペレットを再懸濁されるまで、940μlの0.2×冷たいSSC及び渦を追加します。このペレットを再懸濁することが非常に困難であり得るし、ボルテックス数ラウンドをとることができる。 sのときどき塊パーマは避けられない。
- 120μlのβ-メルカプトエタノール、100μlの10％SDS、20μlの0.5M EDTA、pHが8、および20μlのProteinase Kを（60ミリグラム/ mlの、新しく調製）を追加します。よく混合し、37℃で回転させながら一晩消化する。フェノール/クロロホルム抽出に進んでください。
3フェノール/クロロホルムカウダ精子からDNAの抽出
注：後期精子細胞および成熟精子の核DNAはプロタミンと複合体を形成されており、高度に体細胞のDNAと比較して、凝縮されているため、従来の核酸抽出方法には、仕事に突然変異試験のための十分な収率および純度のDNAを生成しません効率的。積極的な消化後の複数のフェノール-クロロホルム抽出を解放して（15から方法に基づく）精子DNAを精製するために必要とされる。
- 転送精子細胞を、15mlのポリプロピレンチューブにダイジェスト。
- フェノール2 mlを加え：クロロホルム混合物（1：1）。 22 rpmでチューブを回転させて3分間。
- 10分間1,600×gで遠心分離し、新鮮な15mlチューブにファジー界面層と一緒に水のトップ層を転送します。
- 繰り返します3.1.2と3.1.3 3回繰り返したが、それぞれ、3分、4分、6分まで回転時間を変更する。最後の繰り返しでは、「ファジー」界面層のいずれかを転送することは避けてください。
- イソアミルアルコール（24：1）4 回目の抽出後、3MのNaAc、pH5.2の1あたりの水性抽出物の溶解および2mlのクロロホルム70μlのを追加します。 12分間の22 rpmでチューブを回転させます。
- 10分間1,600×gで遠心分離し、新鮮な15mlチューブに水最上層を転送します。
- 無水エタノール2容量を追加し、静かに緩やかに揺り動かしながら横向きにチューブを回転させることによりDNAを沈殿。
- ヒートシールされた牧草ピペットのチップ上にスプーリングによりDNAを収集します。 5分間、70％エタノールと空気乾燥でピペットチップを回転させることによって、DNAをすすぐ。
- 100μlのトライ - 抽出した後、40にDNA沈殿物を溶解させS-EDTA緩衝液、4℃で8店舗。 DNAはlacZの突然変異試験に進む前に2日以上、4℃で溶解させる。溶解性の問題が発生した場合、DNAは、さらなる使用の前に15分間65℃で溶解させることができる。 260でspectrophotometreとDNAの濃度を決定し、溶解したDNAの濃度は200〜2,000 ngの/μlの間にあることを確認してください。
精細管からの生殖細胞の4離と消化
- 凍結した場合には、氷（約1時間）で精巣を解凍。転送はすりガラス板に精巣。
- ピンセットで精巣の一方の端を持ってください。精巣のもう一方の端には、鉗子の別のペアまたは解剖はさみ（ 図5A）を使用して、上皮カプセルに穴を穿刺。穿刺を通して精細管を圧迫し、上皮カプセル（ 図5B）を廃棄します。
- Addのカプセル化が解除精細管に室温のD-PBSを500μl。
- 角度組織ローラ（シリコーンゴムは強固に自由に回転する直径5mmのステンレス管、または同様の装置に嵌合さ）一端が5〜10°（ 図5C）のおおよその角度でプレートと接触するようになっている。任意の圧力を加えることなく、静かに彼らが平坦化されるまで、細管を横切って前後ローラーを移動し、D-PBSは、放出された細胞（約5〜10倍）で濁る。
- いくつかの追加回細管を介してD-PBSの別の500μLを加え、穏やかに細管をロールオーバー。
- 転送さ取り外さ細管（ 図5D）の量を最小限に抑えながら、1.5mlマイクロ遠心チューブに細胞懸濁液を転送する。
- 繰り返します、必要に応じてより多くの細胞を収集するために4.5から4.6を繰り返します。
- どんな誤って収集した細管をチューブの底に沈殿するための2分 - 1を許可します。 FRにD-PBSを転送落ち着いた細管（D-PBSの約100μl）を残して1.5ミリリットルチューブESH。この懸濁液の小アリコートを、細胞集団の組成を評価するために顕微鏡（位相差）の下で確認することができる。
- 30秒間11000×gで細胞をスピンダウン。慎重にペレットを乱すことなく、上清をデカントする。必要に応じて細胞ペレットは、この時点で-80℃で凍結することができる。
- 必要に応じて細胞を解凍する。溶解緩衝液5ml中の15mlのポリプロピレンチューブに再懸濁した細胞への転送（10mMトリスpH7.6の、10mMのEDTA、100mMのNaCl、1 mg / mlのプロテイナーゼK、1％SDS）。 37℃で一晩回転させながら培養器でのダイジェスト。
- フェノール/クロロホルム抽出に進んでください。
5。フェノール/精細管生殖細胞からのDNAのクロロホルム抽出
注：これらの細胞型は、まだnまで進行していないので、あまり積極的で抽出は、精細管の生殖細胞DNAを単離するために使用されているuclear結露。
- クロロホルム混合物（1：1）に一晩精細管細胞消化フェノールを5ml追加します。 20分間22rpmでチューブを回転させます。
- 10分間1,600×gで遠心分離し、新鮮な15mlチューブに、「ファジー」界面層を回避しながら、水性トップ層を転送します。
- （通常は5ミリリットルを回収する）の5M NaCl 5ミリリットルあたりの水性抽出物の100μLを加え
- イソアミルアルコール：クロロホルム5ml加える（24：1）。 12分間の22 rpmでチューブを回転させます。
- 10分間1,600×gで遠心分離し、新鮮な15mlチューブに水最上層を転送します。
- 無水エタノール2容量を追加し、穏やかにチューブを回転させ、反転させることによりDNAを沈殿さ。
- 封鎖牧草ピペットのチップ上にスプーリングによりDNAを収集します。 5分間、70％エタノールと空気乾燥でピペットチップを回転させることによって、DNAをすすぐ。
- 40-100μlのトリス-EDTA緩衝液、4℃で8ストアでDNAを溶解する。 DNAは2の最小4℃で溶解させる日のlacZ突然変異試験に進む前に（ステップ3.9を参照）。溶解性の問題が発生した場合、DNAは、さらなる使用の前に15分間65℃で溶解させることができる。 260でspectrophotometreでDNAの濃度を測定し、濃度が200〜2,000 ngの/μlの間にあることを確認してください。
6。 のLacZ突然変異試験
細菌または真菌汚染がパッケージング効率、ならびにプラークの増殖およびスコアを妨害する可能性がある。これは、パッケージング反応、宿主培養および増殖培地の汚染を防止するための適切な無菌の尺度を用いたlacZアッセイを行うことが重要である。
- アッセイ前日：ボトム寒天と一晩培養を準備する
- エイト各寒天8ミリリットルの底を含む（力価をカウントする突然変異体を獲得する4枚、4枚）のプレートをサンプルあたり必要とされる（ すなわち 、サンプルあたり64ミリリットル）。ボトム寒天は、両方に同じです突然変異体およびタイターカウントプレート。処理されているサンプルの数に対して十分なボトム寒天を準備します。無菌的に90ミリメートルペトリ皿（ディッシュあたり8ミリリットル）に注ぎ、寒天を固化することができます。 NOTE：ボトム寒天プレートを予め1週間まで製造することができる。
- 50mlチューブ中で、20％マルトース溶液を、25μlのアンピシリン（20 mg / ml）を、および20μlのカナマイシン（5 mg / ml）を、100μlの10mlのLBブロスを加える。 Eで接種する大腸菌遺伝子（lacZ - /のgalE - ）25と240 rpmで振盪しながら37℃で一晩成長する。
- 1日目：サブ培養細胞
- 新鮮なLB（抗生物質なし）中で一晩培養の1：100希釈を調製し、サブ培養細胞。サブカルチャーの8ミリリットルの容量は、サンプル毎に必要とされる。 OD 600 = 1になるまで約3.5時間、240rpmで振盪しながら37℃でインキュベートする。
- OD 600 = 1は、10のために15℃で1300×gで均等に50mlチューブ遠心分離に細胞懸濁液を分割した場合分。 （ すなわち 、サンプルあたり4 ml）を元の体積の半分に上清及び再懸濁細胞を除去LBを、10mMのMgSO 4を含有する。 [ステップ6.2.4.3]を必要になるまで脇に細胞を入れてください。
- 1日目：ラムダファージ粒子中のDNAをパッケージング
- 30℃に水浴をウォームアップ。
- 広口径10μlのピペットチップ、1.5mlチューブに移し4μlのDNAを用いて。注：このステップでは、準備時間を短縮するために、事前に日以上行うことができる。
- ファージパッケージング抽出キット（各2サンプルのための1管）から第一の管（赤）ウォームアップ。簡単に言えばチューブの底に抽出を収集するためにスピン。
- DNAサンプルの最初のチューブからパッケージング抽出物を4.8μLを移し、ピペットチップで穏やかに撹拌により混合する。簡単に言うと、チューブ内のサンプルをスピンダウン。 30℃の水浴中で1.5時間インキュベートする。
- 第二（青）パッケージング抽出チューブ（〜15のサンプルについて1管）ウォームアップ。簡単に述べると下部の抽出物を収集するためにスピンチューブの。
- DNAサンプルを第二の管からパッケージング抽出物を4.8μLを移し、穏やかに攪拌により混合する。簡単に言うと、チューブ内のサンプルをスピンダウン。 30℃の水浴中でさらに1.5時間インキュベートする。
- 500μlのSMバッファー中でパッケージされたファージ粒子を再懸濁し、20 rpmで30分間回転させて混合します。
- チューブの底にサンプルを収集する30秒間11000×gで、簡単に渦サンプルや遠心分離機を回転させた後。ファージ粒子は、感染[ステップ6.2.4]の準備ができている。
- 1日目：トップ寒天を準備
- タイタープレートおよび変異選択プレートに個別の上層寒天を準備します。各サンプルは4タイタープレート、および4変異型のプレートが必要です。各プレートは、8ミリリットルトップアガーを必要とします。唯一寒天突然変異体の選択トップに選択剤フェニル-β-D-ガラクトピ（P-GAL）を追加します。事前に（アッセイの日に）両方のトップ寒天を準備し、両方のトップ寒天に硫酸マグネシウムを加える前に50℃で維持し、PG突然変異体の選択寒天にアル。
- 1日目：パッケージ化されたファージとメッキが細胞に感染
- サンプルあたり2 50mlチューブにラベルを付ける：サンプルあたり1「変異型」チューブサンプルあたり1「力価」チューブ
- サンプルあたりラベル8寒天プレート：サンプルあたり4「変異体」プレートおよびサンプルあたり4「タイター」プレート
- 各チューブに分注し[ステップ6.2.1.2から]再懸濁した細胞の2ミリリットルを。
- （細胞を含む）を「変異体」50mlチューブに[ステップ6.2.2.8から]パッケージされたファージ粒子を500μlを追加。穏やかに混合し、ファージ粒子を室温で30分間、細胞に感染することを可能にする。
- 30分後、短時間ボルテックスして細胞を感染させ、（細胞を含む）を、適切な50ミリリットル、「力価」の管に感染した細胞を15μlを移す。
- プレート力価サンプルに、「力価」50mlチューブに（P-Galを含むNOT）温かい（50℃）「力価」トップアガー30mlのを追加します。すぐにDISTRIB4「タイター」プレート（プレート当たり〜8ミリリットル）の中uteの寒天/細胞混合物。トップアガーをピペットで冷却し、気泡を導入しないようにしようとしないように迅速に作業。
- 次の「変異体」のサンプルをプレート。 P-Galは「変異の選択」トップアガーに添加したことを確認。 「変異体」50mlチューブに（P-Galを含む）温かい「突然変異の選択」寒天の30ミリリットルを追加します。すぐに4「変異体」プレート（プレート当たり〜8ミリリットル）の中で寒天/細胞混合物を配布します。
- 次いで、プレートを（〜15分）固化し反転させ、37℃で一晩インキュベートすることを許可する。
- 2日目：カウントプラーク
- 一晩のインキュベーション後、突然変異体およびタイタープレート上のプラークの数を数える。プラークが多数の場合は、合計数を推定するために、プレートの一部のみをカウント（ 例えば 、多くの場合、¼タイタープレートの100〜200の間のプラークを持つことになります）。時COU 100プラークの最小値は、プレートごとにカウントされるべきであるプレートの一部をnting。
- 細胞の1μl当たりのプラーク形成単位（PFUで）の数を計算します。これは、（15μl）を播種した細胞の体積で「タイター」プレート上のプラークの数で割ることによって行われます。
- /μlの「変異体」プレート（のPFU /μlの*の上にプレートし、感染した細胞の総容量のPFUの総数を推定するためのPFUの数を使用します[2ミリリットル細胞+ 0.5ミリリットルパッケージ化されたファージ粒子 - タイタープレート用の15μLを] ）。
- 「タイター」プレートから決定し、感染した細胞の全体積のPFUの推定総数で4「変異体」プレート上で計数突然変異体のプラークの総数で割ることにより、MFを見積もります。
- それはMutaMouse生殖細胞について、OECDガイドラインは、動物あたり125000〜300000の非突然変異体のPFUの最小画面ことをお勧めしますように自発的なlacZの MFは、対照群では3×10 -5のオーダーであるとき信頼性の高いベースライン信号を得るために、突然変異のためのエド。他のトランスジェニックモデルでのPFUのより多くが必要とされる、その場合に低い自発MFを有していてもよい。統計的検出力試験は、所望の解像度を得るために必要なのPFUや動物の最小数を決定するために行うことができる。複数の反復からのデータは、この最小PFU要件を満たすためにプールされ、それらが著しく異なる変異周波数を生成しない設けてもよい。
7統計
分析のための実験単位はマウスである。このアッセイから生成されたデータは、一般的に正規分布していない。このように、データの分布特性に基づいて分析のための統計的方法を選択する。
注：適切なデータ変換がobservaの範囲にわたる応答の分散を等化するために適用される場合、標準パラメトリック分析（ 例えば 、ANOVA）を用いてもよいる。ポアソンや二項回帰分析は、多くの場合に適しています。ノンパラメトリック分析を使用することもできる。私たちは日常的に（ すなわち 、学会GENMOD）一般化線形モデル手順を使用してポアソン回帰を採用したSAS v.9.2（SASインスティチュート、ノースカロライナ州ケアリー）でレミューら 26によって記載されているように。
Representative Results
動物20万プラークの平均プラークカウントで、私たちは一般的に8つの独立したデータに基づいて、（私たちの対照群では1.7×10 -5の標準偏差が雄の生殖細胞において、約2.8×10 -5の平均バックグラウンドMFを観察実験）。はn = 5の動物と、このプラークカウント、バックグラウンドレベルと分散、用量群ではそれぞれがパワー> 0.8で、MFでの2倍の増加を検出するのに十分である。
結果は、一般的に、表2と図6は 0の単一の急性経口投与量、25、50にさらさMutaMouse男性の尾部精子（群当たりn = 5）からの代表的な結果を示す。表形式またはグラフ形式で報告され、100mg / kgのされている70日間のサンプリング時間に続いてN-エチル-N-ニトロソウレア（ENU）。この70日の期間は、露光時に精子幹細胞で精子に発生した突然変異事象（ 図3の測定を可能にする）。変異体およびタイタープレート上の典型的なプラーク密度を図7に示す。 表2および図6に示されるように、急性ENU曝露は精原幹細胞のMFでの有意な用量依存的増加を誘導した。低用量は、2.6×10 -5のベースラインMFを持っていたコントロールよりも大幅2.6倍の増加を誘導した。最大誘導は、対照より4.4倍の増加を誘発した高用量、発生しました。
このアッセイの例は、精細管の生殖細胞で行っダグラスら MFが50mg / kgのENUの5日間の反復腹腔内注射後のさまざまな時間間隔で尿細管生殖細胞において決定された文献 27に見出すことができる。その研究では、精細管細胞における変異頻度は、治療後15日目まで増加し、その後一定のままであった。
| 博覧会必ず養生法 | 採取した組織 | 収集された細胞型（標的細胞） | 露光の開始時に、標的セルの相 | 相は、露光中に渡さ |
| 急性+ 70 | 尾 | 成熟精子 | 幹細胞 | 幹細胞 |
| 14 + 21 | 尾 | 成熟精子 | 精原細胞 | 精子細胞 |
| 14 + 35 | 尾 | 成熟精子 | 幹細胞 | 精母細胞 |
| 28 + 3 | 尾 | 成熟精子 | 精母細胞 | 精母細胞 精子細胞 成熟精子 |
| 細管 | 幹細胞 | 幹細胞 | 幹細胞 | |
| 精原細胞 | Spはermatogonia | 精原細胞 | ||
| 精母細胞 | 精母細胞 | |||
| 精子細胞 | 精子細胞 | |||
| 28 + 49 | 尾 | 成熟精子 | ステム·セル画 | 幹細胞 |
| 細管 | 幹細胞 精原細胞 精母細胞 精子細胞 | 幹細胞 | 幹細胞 |
さまざまな実験デザインによるトランスジェニック齧歯類突然変異試験の標的とされている、表1の細胞型および精子形成の段階。
| 用量群 | 動物＃ | ミュータントPFU | 合計PFU | MF（X10 -5） | 平均MF（×10 -5） | 倍の変化 | p値 |
| コントロール | 1 | 5 | 180245 | 2.8 | 2.6 | 1.0 | - |
| 2 | 4 | 137835 | 2.9 | ||||
| 3 | 11 | 385672 | 2.9 | ||||
| 4 | 2 | 431396 | 0.5 | ||||
| 5 | 6 | 152413 | 3.9 | ||||
| 25ミリグラム/ kgの | 6 | 17 | 162353 | 10.5 | 6.9 | 2.6 | 0.0002 |
| 7 | 14 | 150094 | 9.3 | ||||
| 8 | 4 | 154401 | 2.6 | ||||
| 9 | 9 | 154401 | 5.8 | ||||
| 10 | 12 | 196978 | 6.1 | ||||
| 50mg / kgの | 11 | 17 | 155727 | 10.9 | 9.3 | 3.6 | <0.0001 |
| 12 | 11 | 135847 | 8.1 | ||||
| 13 | 25 | 193499 | 12.9 | ||||
| 14 | 12 | 133859 </ TD> | 9.0 | ||||
| 15 | 14 | 252807 | 5.5 | ||||
| 100mg / kgの | 16 | 26 | 170968 | 15.2 | 11.5 | 4.4 | <0.0001 |
| 17 | 28 | 234584 | 11.9 | ||||
| 18 | 10 | 145289 | 6.9 | ||||
| 19 | 35 | 292236 | 12.0 | ||||
| 20 | 22 | 190848 | 11.5 |
表2トランスジェニックオスmの尾部精子中のlacZ変異体頻度彼らは精子幹細胞（= 1日投与時間、サンプリング時間= 70日）だったとき氷がENUに急性暴露した。 PFUは、プラーク形成単位、MF =突然変異体頻度を=。
図1をλgt10ファージ構築物の略図。
図2トランスジェニック齧歯類生殖細胞突然変異試験の概要。
図3マウスにおける精子形成および細胞型およびPHAの模式図さまざまな実験デザインによるトランスジェニック齧歯類突然変異試験の標的とされているES注：卒業白いバーは、精細管から調製した細胞懸濁液中に存在する細胞の種類（ すなわち精子>精母>精原細胞>幹細胞）の相対的比率を表してください。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
マウスの精巣上体尾の4集図。 A））D。静かに精巣および精巣上体を引き出すために脂肪パッドを引っ張る）C。B）副睾丸脂肪パッドを特定します。陰嚢に向かって腹部の切開を作る精巣上体尾を見つけ、切除。
精細管からの生殖細胞の懸濁液の5。準備図。 A）切開は精細管を露出させ、精巣上皮カプセルで作られています。B）精細管がカプセルから絞り出されている。C）組織ローラーを穏やかに5〜10℃の角度で細管に通し、 。D内に含まれる生殖細胞）、生殖細胞懸濁液は、さらなる処理のために収集さを放出する。
図6 MutaMouse精子中のlacZ変異体頻度のグラフ表示ENUに幹細胞として急性暴露さ（n = 5）であった。各三角形は、一匹のMFを表す。* p <0.05のポアソン回帰によって決定される。
Eの芝生の上に形成されたプラークを有するトランスジェニック齧歯類突然変異試験から寒天プレート図7代表大腸菌宿主細菌。 A）「変異体」プレートは、特に時折、いくつかのプレートにゼロ斑を持つことになります対照用量群において、矢印でマークされた非常に少数のプラーク（）があります。B）」タイター」プレートは、プラークの数百を持つことができます。
Discussion
従来の方法と比較して、TGR生殖細胞突然変異アッセイは、 インビボで生殖細胞突然変異を誘発され定量化するより速く、より経済的で、かつより高感度な手段を提供する。子孫とは対照的に精子を直接導入遺伝子MFを評価することによって、動物の数は、任意の単一化合物の生殖細胞変異原性を評価するために必要な時間およびリソースが大幅に低減される。感度の点では、用量群ごとに5匹の動物を用いて、25mg / kgののENUへの曝露後の精原幹細胞MFが大幅に2.6倍の増加を検出することができた。これとは対照的に、特定の遺伝子座アッセイは、使用してこの同じ用量で、MFに有意な変化を検出することができませんでした>曝露群における3000マウス>50万対照マウス28。
両方の機構的および規制調査のための適性に加えて、この方法は、体細胞および生殖系列mutati間の比較研究のための機会を提供率に。最近の証拠は、いくつかの薬剤のための生殖細胞変異は体細胞変異のために必要とされるよりも低い濃度で誘導され得ることを示唆している。例えば、N-ヒドロキシメチルアクリルアミドへの長期暴露は、食品の発癌物質アクリルアミド12の代謝産物は、赤血球中の小核頻度、体細胞遺伝学的損傷13の伝統的な尺度に影響を与えることなく、マウスにおける優性致死生殖細胞変異の頻度を増大させる。さらに、両方の主流と副流タバコ煙に対するマウスの曝露は、血液小核頻度14を増加させない用量での精子におけるタンデムリピートのDNA座で上昇した変異頻度が発生します。これらの知見は、体細胞遺伝毒性試験は常に生殖細胞系の保護的であるという仮定に挑戦し、生殖細胞変異頻度を定量化するためのより効率的で費用効果的な手段の需要を強化する。しかし、優先的な生殖細胞変異原性の証拠はまだ弱いです、主に体細胞および生殖細胞組織に突然変異率を比較するための利用可能なデータが不足しているため。 TGRの突然変異試験は、並列テストと同じ導入遺伝子を使用して、複数の組織における誘発突然変異率の比較を可能にする。したがって、TGRアッセイを用いた比較突然変異検査は、優先生殖細胞効果の可能性を取り囲むデータギャップを埋めるために役立つだろう。
規制試験のための体細胞および生殖細胞変異の同時評価はまた、必要な動物の数を減らすことにより効率を改善するであろう。体細胞変異のためのOECDガイドラインは、3日間のサンプリング時間（+ 3 28）に続いて、28日の管理時間を推奨しています。それは精子形成の精母細胞と精細胞相（ 図3）の間、主に曝露された細胞を標的とするので、尾部精子の分析は、この時点で貧弱な感度を提供することがあります。これらの段階の細胞はDNAを合成し、漸進的にDNA修復のための6能力を失うことはありません</ SUP>。さらに、この時点でのサンプリング尾精子は精原幹細胞に存在する変異を検出するために失敗していました。このように、28 +3設計への統合のために、OECDガイドラインは、精細管から生殖細胞を採取することをお勧めします。この混合集団は、DNA合成および幹細胞を含む修復熟練した細胞型由来の細胞を含み、精子形成の段階の大部分にわたって露出している。しかし、これらの細胞の混合性質のために、精細管の細胞分析は、相固有の情報を提供していません。また、非標的細胞の存在が観察されたMFに影響を与えることができることが懸念される（ 例えばによるDNA修復欠損の生殖細胞から変異した生殖細胞シグナルの突然変異した体細胞の汚染、または希釈に偽陽性の生殖細胞変異呼び出し） 。現在、28 + 3申し出同じ感度と特異性aにおける精細管細胞からの結果かどうかを結論付けるには不十分なデータが存在する後の時点でのS尾部精子。当研究室では現在、この点に対処するために、さまざまなサンプリング時間後に収集精細管細胞及び尾部精子における誘導のMFを比較している。私たちは、OECDガイドラインがゆっくりなども生殖細胞分析に適している可能性がある肝臓のような組織を分割するための28日間の代替的なサンプリング時間を示唆していることに注意してください。それにもかかわらず、利用可能なデータはまだ不十分であり、当社は現在、規制テスト用のTGRの突然変異アッセイを用いて、体細胞および生殖細胞の同時分析のための1つの実験計画をお勧めすることはできません。
注目すべきであるこのアッセイの一つの特徴は、変異事象は、非マウスのトランスジーンで評価されていることである。しかし、導入遺伝子が内因性遺伝子20と同様の方法で、環境変異原に応答することを示唆する十分な証拠がある。さらに、独立した突然変異事象の正確な起源はすることは困難であるため、解決し、結果は、一般に、（変異頻度とは対照的に）変異頻度として報告される。結果はクローン拡大のために補正されている場合は、実際の変異頻度を解消することができる（ すなわち 、導入遺伝子変異体の観察された頻度に寄与することができる単一の変異細胞の分裂および乗算）DNA配列決定によってを。変異体遺伝子の配列決定は、lacZの変異を特徴付けるために行われ、これは、分析の時間とコストを大幅に追加されたが、クローン性増殖事象に由来することができる変異体を同定することができる。短い（294 3021塩基対lacZの対塩基、 図1）および29の配列決定が容易になり、λ のcII遺伝子の変異体：lacZ遺伝子に加えて、theλgt10トランスジェニックベクターは、代替的な温度依存性の変異レポーター遺伝子を保有する。配列決定はまたmutatioへの洞察を提供し、誘導された突然変異スペクトルの解析を可能にする問題の化合物の内部メカニズム。クローン性増殖の極端な例では、「ジャックポット」の突然変異の発生である（ すなわち 、劇的に上昇したMFに貢献臓器の開発の非常に早い段階で、導入遺伝子変異、時には何百背景よりも大きい数千倍まで）。 「ジャックポット」変異を有する動物または組織は、分析から削除する必要があります。
私たちが説明したアッセイは、例えば、（20に総説）、同様の変異レポーターベクターを保有するこれらの全てはBigBlueマウスおよびラット、およびlacZプラスミドマウスなどの他のTGRのモデルに広く適用可能である。同様の方法を採用して今日までに行われ、生殖細胞の研究の大部分は、そのようなENUおよび（30に概説される）放射線とほぼ独占的に上のよく特徴付け変異原を当てている。これは、TGRのアッセイのためのOECDテストガイドラインの最近のリリースで、このアッセイはなることが予想される化学スクリーニングおよび規制評価のためにますます人気。規制テストバッテリーにTGR生殖細胞突然変異試験の組み込みは、生殖細胞11における突然変異誘発の効率的な評価を可能にすることにより、既存のギャップを埋める。さらに、このアッセイは、同一の遺伝的エンドポイントでの環境因子による突然変異の誘発に体細胞および生殖細胞の相対感度を比較するための適切な手段を提供し、実質的に任意の組織においてMFを測定するために使用することができる。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MutaMouse | Covance | - | |
| E. coli (lacZ-/galE-) | Covance | - | See reference 25 in manuscript |
| Chloroform | Caledon | 3001-2-40 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (D-PBS) | Gibco | 14190-250 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5 M, pH 8 | Sigma-Aldrich | 03690 FLUKA | |
| Isoamyl alcohol | Caledon | 2/10/7900 | |
| Lennon LB broth base | Invitrogen | 12780-029 | |
| Stainless steel mesh filter | Sigma-Aldrich | S3770 | |
| Transpack packaging extract | Agilent Technologies | 200220 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Ethyl alcohol, anhydrous (EtOH) | Commercial Alcohols | - | |
| Ampicilin | Gibco | 11593-027 | prepare 20 mg/ml in dH2O |
| Kanamycin | Gibco | 11815-024 | prepare 5 mg/ml in dH2O |
| Phenol | Invitrogen | 15509-097 | Saturate in 0.1 M Tris-HCl as per manufacturers direction |
| Phenyl-β-D-galactopyranoside (P-Gal) | Sigma-Aldrich | P6501 | dissolve 3 g per 10 ml of dimethylformamide |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530-031 | prepare 60 mg/ml solution dH2O just before use, 20 µl per sample |
| Sodium acetate (NaAc) | Fisher Scientific | BP333-500 | prepare 3 M solutution, pH 5.2 |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L4390 | prepare 10% solution in dH2O |
| 1 M MgSO4 | 24.6 g MgSO4·7H2O per 100 ml dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year | ||
| LB Broth | 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl per 1 L dH2O. Autoclave and cool | ||
| Saline sodium citrate (SSC) | 150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate, pH 7.0 | ||
| SM Buffer | 5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4·7H2O, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 5.0 ml of gelatin (2% w/v), per 1 L dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year | ||
| TE buffer | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8 |
References
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