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Medicine

Voluntário Técnica de apneia para a Redução Coração Dose em Radioterapia mama esquerda

Published: July 3, 2014 doi: 10.3791/51578

Summary

A prioridade atual na radioterapia do câncer de mama é reduzir doses cardíacos sem comprometer a cobertura tecido alvo. A técnica de apneia voluntária aqui descrito é uma solução simples e barata para este problema e capaz de ser instituída amplamente, sem a necessidade de equipamentos especializados.

Abstract

Técnicas de interrupção respiratória reduzir a quantidade de radiação recebida pelo estruturas cardíacas durante tangencial campo mama esquerda radioterapia. Com essas técnicas, os pacientes segurar a respiração enquanto a radioterapia é entregue, empurrando o coração para baixo e longe do campo de radioterapia. Apesar dos benefícios de dosimetria claras, estas técnicas ainda não estão em uso generalizado. Uma razão para isso é que as soluções disponíveis no mercado exigem equipamento especializado, necessitando não só o investimento de capital significativo, mas muitas vezes também incorrer em custos em curso, como a necessidade de bocais descartáveis ​​diárias. A técnica de apneia voluntária descrito aqui não requer nenhum equipamento especializado adicional. Todas as técnicas de retenção de respiração requerem um substituto para monitorar a consistência de apneia e se apneia é mantida. Voluntário de apneia usa a distância percorrida pela anterior e marcas de referência laterais (tatuagens) longe dos lasers quarto tratamento em respiração-hold para monitorar a consistência na configuração CT-planejamento e tratamento. Campos luminosos são então utilizados para controlar a consistência de apneia, antes e durante a administração de radioterapia.

Introduction

O câncer é uma das principais causas de morte no mundo, sendo responsável por 7,6 milhões de mortes em 2008 1. De todos os cânceres, o câncer de mama é o mais comum, com uma incidência de mais de 13,8 milhões em todo o mundo, e esta incidência está a aumentar 1. No entanto, as melhorias no diagnóstico e tratamento do câncer de mama significa que o número de mulheres que sobrevivem a câncer de mama também está aumentando, e estima-se triplicar para 1,7 milhões em 2040 só no Reino Unido 2. Radioterapia mama constitui uma parte importante do tratamento de muitas mulheres o câncer de mama, reduzir para metade o risco de recorrência do câncer de mama e reduzir o risco de morte por câncer de mama em 3,8% 3. Com melhorias na sobrevivência de câncer de mama, os efeitos secundários a longo prazo causados ​​por tratamentos de câncer de mama são cada vez mais importante. Um espectador inocente em radioterapia da mama é o coração, o qual é exposto a radiação indesejada, como resultado da sua proximidade com os campos de radiação, especialmentedurante deixado a irradiação da mama. É esta dose indesejada para o coração que representa o aumento de 1% nas mortes por câncer de mama não-associada à radioterapia do peito 4. Evidências recentes sugerem que não existe uma dose limiar abaixo do qual os efeitos cardíacos tardios da radioterapia da mama não ocorrem 5, tornando-se essencial para a comunidade de oncologia para estabelecer técnicas que minimizem doses cardíacas sem comprometer a cobertura de tecido da mama. No entanto, uma vez que as contas de radioterapia de mama para aproximadamente 30% de todos os tratamentos de radioterapia 6, qualquer nova técnica deve ser simples e de baixo custo, a fim de ser sustentável e evitar um fardo inaceitável sobre os recursos de saúde.

Há uma série de técnicas que podem ser empregues para reduzir a dose do coração durante a radioterapia da mama. Multileaf colimação (MLC) é amplamente utilizado no Reino Unido [Royal College of Radiologists '(UK) auditoria 2012] e, apesar de eficaz na poupando o tecido cardíaco, Arrisca-se, simultaneamente, protegendo o tecido da mama. Inverse planejado intensidade modulada (IMRT) melhora alvo conformalidade tecido 7, mas também pode aumentar a irradiação de baixa dose do coração, pulmões e de mama contralateral 7,8. Um aumento na dose de irradiação de baixa o coração é indesejável, particularmente à luz dos dados de Darby et ai 5. Além disso, IMRT-de planeamento inverso é mais intensivo de recursos, exigindo maior física e garantia de qualidade (QA) tempo e experiência. Tratar as mulheres na posição prona (de face para baixo) pode reduzir doses cardíacas em mulheres maiores de peito 9, no entanto, questões permanecem sobre a reprodutibilidade posicional dessa técnica 10. Técnicas de interrupção respiratória, em que os pacientes prender a respiração durante o parto radioterapia, resultar no coração que está sendo empurrado para baixo e longe dos campos de radioterapia e pode minimizar a necessidade de um compromisso entre a cobertura de tecido-alvo e órgão em risco (OAR) poupadores (Figura 1) 11.

Existem atualmente duas técnicas principais de prender a respiração em uso clínico. A primeira consiste em um espirômetro digital anexada a uma válvula de balão. Pacientes respiram através de um bocal e um clipe é colocado em seu nariz para evitar a respiração nasal. O rastreio de espirometria é visualizado em um monitor, e inspiração interrompida e realizada em um volume pulmonar pré-determinado. O segundo método foi projetado principalmente para uso como um sistema de gating respiratório, embora também tem uma configuração de apneia embutido. Este sistema utiliza uma câmara de vídeo para registar o movimento de um marcador de um reflector de infravermelhos colocada sobre o peito do paciente. O movimento vertical do marcador é exibida em tempo real no monitor, e entrega do início do tratamento uma vez que o marcador se move para uma zona de limite pré-especificado. Ambos os sistemas marcadamente reduzir doses cardíacos em pacientes que receberam radioterapia peito esquerdo. A técnica signifi-base espirometriasignificativamente reduz o volume de miocárdio irradiado 12-14, bem como demonstrar comparável reprodutibilidade intra-e inter-fração em relação ao padrão supina radioterapia peito sem respirar 15. Da mesma forma, o tratamento utilizando os marcadores de infravermelhos que reflecte-se reduzir a dose significativo do coração por mais de 50% 11,16,17, mantendo ao mesmo tempo uma cobertura de tecido alvo 11. Tais economias de dosimetria são projetados para equivaler a uma redução de 10 vezes em mortes cardíacas 18.

Uma desvantagem destes sistemas, no entanto, e de uma barreira para uma ampla aplicação, é o seu custo. Ambos os sistemas exigem investimentos nos próprios dispositivos, no entanto, no caso do sistema de espirometria também há custos em curso, como os porta-vozes são descartáveis, que exigem um novo porta-voz para o planejamento-CT, bem como para cada fração de tratamento. Custo, juntamente com a falta de treinamento de pessoal, explica por que apenas 4% dos tratamentos de mama no Reino Unido foram realizadas utilizando-bReath-holding técnicas em 2012 [Royal College of (UK) auditoria Radiologistas ']. Técnicas de interrupção respiratória estão em uso mais difundido no resto da Europa, com 20% dos centros de usar estas técnicas, em 2010 19. Uma explicação para isso é o desenvolvimento e implementação de uma técnica de prender a respiração simples, barato e sem equipamentos, voluntária de apneia (VBH). Até recentemente, no entanto, os dados que faltava na reprodutibilidade da técnica VBH. Um estudo randomizado realizado no Royal Marsden Hospital (Sutton, UK), O Reino HeartSpare estudo, foi demonstrado que a reprodutibilidade inter fracções com a técnica VBH é comparável à que, com o dispositivo à base de espirometria. Além disso, a técnica VBH oferece uma vantagem de tempo no planejamento de CT e instalação de tratamento e é preferido pelos pacientes e radiographers iguais 20. A técnica VBH está sendo lançado para dez centros de radioterapia do Reino Unido para confirmar que a técnica é viável em um estudo multicêntrico setting e que o coração poupadores é mantido (HeartSpare II). Espera-se que isso irá pavimentar o caminho para o Reino Unido-larga absorção de poupadores coração radioterapia da mama, e é susceptível de conduzir a uma redução significativa em doenças cardíacas entre os britânicos sobreviventes de câncer de mama.

Protocol

O estudo através do qual este protocolo foi implementado foi aprovado pelo Comitê de Marsden Real para Pesquisa Clínica (Sutton, Reino Unido) e do Comitê de Ética em Pesquisa (Londres - Riverside, Reino Unido) (ISRCTN 53485935).

1. Clínica de Radioterapia

  1. Avaliar a adequação do paciente para a técnica de apneia voluntária na clínica: peito esquerdo ou radioterapia da parede torácica (sem irradiação nodal) recomendado pelo oncologista.
  2. Revisar o status do paciente desempenho e comorbidades (especialmente relacionados com o pulmão).
  3. Peça ao paciente para a prática prendendo a respiração em casa, enquanto deitado, inicialmente por 5 segundos, e construindo-se em intervalos de 5 seg a 20 seg.

2. Sessão de radioterapia Planejamento-CT

  1. Posicione o paciente no sofá CT na posição de tratamento padrão.
  2. Definir a posição de tatuagens e marcadores de lugar CT (cruzes) na linha média do paciente em free respiração, aproximadamente a meio caminho ao longo das arestas de campo prováveis. Adicionar marcadores laterais de cada lado do paciente em respiração livre, em conformidade com o marcador da linha média.
  3. Peça ao paciente para a prática de tomar uma respiração profunda e segurando-o, inicialmente por 5 segundos, antes de construir-se em intervalos de 5 seg a 20 seg. Instrua o paciente a respirar e expirar duas vezes antes de pedir-lhes para segurar a respiração por até 20 segundos. Isso relaxa o paciente, ajuda-os a se preparar para a apneia e ajuda a consistência de apneia.
  4. Registre a duração máxima para a qual o paciente pode confortavelmente prender a respiração.
  5. Repita a apneia e marcar a posição do anterior e tatuagens laterais em relação aos lasers em apneia para ajudar a estabelecer a reprodutibilidade. Registre a altura do tatuagem lateral acima do topo sofá durante apneia antes de prosseguir com a tomografia computadorizada.
  6. Dê as instruções em apneia padrão para o paciente e iniciar a digitalização é uma vezatisfied o paciente está em apneia.
  7. Uma vez que o TC tenha sido concluída, verificar e registrar a altura das tatuagens laterais na tomografia computadorizada para confirmar que a apneia consistente foi realizado. Se a altura da lateral do sofá difere por mais de 3 mm da altura inicial sofá, remensurar o anterior e pontos de referência laterais.

3. Radioterapia Plano de Tratamento

NOTA: O processo de planejamento de tratamento de radioterapia é o mesmo que para um paciente de mama padrão.

  1. Aplicar campos de radioterapia tangenciais acordo com o protocolo local.
  2. Produzir plano de tratamento radioterápico clínico que cumpre critérios ICRU.
  3. Registre o feixe da fonte-a-pele distância anterior (SSD), além de gravação de dados de planejamento de tratamento padrão (de acordo com o protocolo local). NOTA: O SSD feixe anterior é usado para verificar a configuração ântero-posterior na sala de tratamento.

4. RadiotInstalação de Tratamento herapy

  1. Alinhe as tatuagens em free-respiração. Mark posterior e medições inferiores do tatuagem lateral esquerdo ea linha média anterior tatuagem sobre a pele do paciente (a partir de informações registradas na sessão de planejamento-CT).
  2. Instrua o paciente a respirar dentro e para fora duas vezes antes de tomar uma respiração profunda e segurando. A marca de referência sobre a pele do paciente deve subir até ao nível do laser. Peça ao paciente para repetir o procedimento de apneia um par de vezes para confirmar a reprodutibilidade, antes de prosseguir com a configuração do paciente.
  3. Peça ao paciente para realizar uma pausa respiratória e alinhar a tatuagem da linha média para a posição do isocentro superior / inferior e ajustar a distância foco-superfície (FSD) na linha média.
  4. Em sem respirar, mover a cama lateralmente ao isocentro.
  5. Medir e marcar o medial e limites do campo lateral em free-respiração.
  6. Defina todos os outros parâmetros da máquina (por exemplo., O tamanho do campo e gantry, colimador, e ângulos de sofá) para o primeiro feixe (anterior oblíqua). Peça ao paciente para realizar uma apneia e verificar a borda medial alinha com marca feita no Passo 4.5.
  7. Marque a borda do campo (como definido pelo campo de luz) com uma caneta de cada fracção: isto ajuda a visualização de apneia do paciente.
  8. Repita os passos 4.6 e 4.7 para o feixe oblíquo posterior, e tratar de utilizar este feixe de primeira.
  9. Se a configuração paciente está fora da tolerância (de acordo com os níveis de tolerância local para uma radioterapia paciente mama standard), referem-se ao algoritmo de resolução de problemas (Figura 2).
  10. Se há câmeras suficientes para monitorar a borda campo, bem como a posição do pórtico relativa da sala de controle para o sofá, avaliam rotação do pórtico antes de deixar a sala de tratamento, a fim de evitar colisões.

5. Entrega Radioterapia

  1. Uma vez na sala de controle, ampliar a roo tratamentom câmaras de modo a que os limites de campo marcado na pele do doente são visíveis nos monitores dos quartos de controlo.
  2. Uma vez pronto para iniciar o tratamento, peça ao paciente para realizar uma apneia (conforme detalhado no item 4.2), através do sistema de interfone. Verifique o campo de luz se alinha de forma satisfatória com o limite de campo marcada e, em seguida, iniciar o tratamento (Figura 3).
  3. Monitorar apneia do paciente durante o parto tratamento. O tratamento deve ser interrompido se houver preocupação que tem havido uma mudança em profundidade de apneia.

Verificação Radioterapia 6.

  1. Executar verificação de imagem de posição do paciente (como com imagens portal eletrônico (EPI) ou cone-beam CT), seguindo os protocolos locais para tipo / freqüência de níveis de imagem e de tolerância.
  2. Corrija os erros sistemáticos com movimentos isocentro de acordo com os protocolos locais para os pacientes de radioterapia de mama padrão. Ajuste de marcas no paciente & #8217 s da pele não deve ser necessário.

Representative Results

Em tempo real imagens do portal eletrônico (EPI) foram pareados on-line para reconstruída digitalmente radiografias (DRRs) para 23 pacientes (172 frações de tratamento). Deslocamentos PAV foram analisadas para a anterior direita e esquerda vigas oblíquas posteriores na (u, v) plano (v-direção paralela ao eixo crânio-caudal e u-direção perpendicular a este) 21, e os erros de instalação para a técnica VBH estimado. População com base em EPI margem de erro sistemático (para cada feixe e em cada avião) foi 1,5-1,8 mm e margem de erro aleatório 1,7-2,5 mm.

Tabulares de dose-volume do histograma (DVH) de dados foi utilizado para derivar a média NTD (uma média ponderada de biologicamente dose total em tecido normalizado de fracções de 2 Gy utilizando um modelo quadrático linear padrão 22, α / = β 3Gy) para o coração, anterior esquerda artéria coronária descendente (LAD), ipsilateral, e os pulmões inteiros. Além disso, a dose máxima recebida pela ADA (LAD max) foi calculada. Ndoses de tecido Ormal são mostrados na Tabela 1.

Foram registrados tempos para sessão de planejamento-CT, a configuração do tratamento, tratamento e entrega total da sessão de tratamento, e são apresentados na Tabela 2. Os dados demonstram que o planejamento de CTs pode ser concluída dentro de 30 minutos de sessão padrão. Os tempos de tratamento de imagem incluem a TCCB, que foi realizada para cada terceira fracção. Instalação de tratamento e tempos totais de sessão são, por isso, deverá ser menor do que o relatado aqui para centros em que imagem CBCT não faz parte do tratamento padrão. No entanto, mesmo com a imagem CBCT, os tratamentos podem ser concluídas dentro de uma sessão de tratamento de 20 min.

Pacientes e radiologistas foram convidados a preencher questionários validados 23 em sua sessão de planejamento-CT, bem como duas vezes durante o seu tratamento. Foram analisadas sessenta e cinco questionários de pacientes e 64 questionários do técnico de radiologia. Os questionários foram resumidas como o conforto do pacientepontos (PCS) e os índices de satisfação radiologista (RSS) (de 9, maior pontuação = mais confortável / satisfatória). PCS média foi de 8 (intervalo interquartil 8-9) ea mediana foi RSS (intervalo interquartil 6-8) 7.

Figura 1
Figura 1. O efeito poupador de coração de VBH. Axial e cortes sagitais de TC do mesmo doente ao mesmo nível da parede torácica na respiração livre (A e C) e utilizando a técnica de VBH (B e D). Note-se que o coração (destacado em amarelo), foi empurrado para baixo e longe dos campos de radioterapia, utilizando a técnica VBH. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Verificação da consistência de apneia da sala de controle. Control Room CCTV stills que demonstram a posição do campo de luz em relação ao limite de campo marcado por um feixe de direito anterior oblíqua em free-respiração (A) eo alinhamento do campo de luz e borda campo marcado uma vez que o paciente está em apneia ( B).

<td> LAD NTD significa
Dose mediana (Gy) Dose mínima (Gy) Dose máxima (Gy)
VBH FB VBH FB VBH FB
Coração NTD significa 0,6 0,8 0,4 0,4 0,9 2.1
2,5 6 1.3 1.2 10.0 22,6
LAD max 28,6 43,7 9,7 4.6 41,8 51,3
Ipsilateral pulmão NTD significa 4.1 - 2.8 - 5.6 -
Pulmões inteiros média NTD 2.0 - 1.3 - 2,7 -

Tabela 1. Doses tecido normal para o voluntário de apneia (VBH) técnica. Mediana, mínimo e máximo NTD média (Gy) para o coração, LAD, ipsilateral e os pulmões inteiros são mostrados, assim como mediana, mínimo e máximo max LAD ( Gy). Além disso, mediana, mínimo, máximo e doses cardíacos para padrãocuspidores livre (FB) deixou radioterapia mama no nosso centro são mostrados para comparação.

Tempo (min)
Evento Mediana Mínimo Máximo
Sessão Planejamento-CT 22 14 44
Instalação de tratamento 9 6 15
Entrega Tratamento 7 5 12
Sessão total de tratamento 18 14 27

Tempos de sessão Tabela 2. Planejamento-CT e de tratamento para o voluntário técnica de apneia. Mediana, mínimo e máximo de planejamento-CT, a configuração do tratamento, a entrega do tratamento, e os tempos totais sessão de tratamento são mostrados (min).

Discussion

Etapas críticas do protocolo incluem: 1) a verificação de consistência de apneia no planejamento de CT e instalação de tratamento; 2) a verificação da altura sofá lateral, medido em CT é consistente com a medida pré-CT; 3) alinhar tatuagens em livre de respiração, mas a criação FSD em apneia; 4) Assegurar campo de luz se alinha com as fronteiras de campo marcados antes de iniciar o tratamento.

O número de ar de retenção necessário durante a entrega do tratamento varia de paciente para paciente, e é principalmente dependente do número de segmentos a ser entregues. Pontos de interrupção adequados durante o parto tratamento (para permitir que o paciente a relaxar antes de repetir uma apneia) deve ser determinada em uma base individual, dependendo do método de entrega. Gostaríamos de sugerir que para a implementação inicial da VBH que uma equipe consistente é usado. Isso permite que os envolvidos para se tornar competente mais rapidamente e ajuda a manter a qualidade do tratamento. Onde os problemas são encombatida durante a configuração do tratamento, o paciente pode ser solicitado a modificar sua apneia (mais profunda ou rasa, se necessário). Se isso não melhorar a configuração, o paciente deve ser criado novamente. Vector sofá movimentos devem ser utilizados como último recurso. Um algoritmo de resolução de problemas é mostrado na Figura 2.

Figura 2
Algoritmo Figura 2. Solução de problemas para a configuração técnica tratamento de apneia voluntária. Este algoritmo pode ser usado para ajudar a configuração do tratamento que os doentes não estão a criação de dentro da tolerância (de acordo com os níveis de tolerância local). Como exemplo, o nosso centro utiliza um nível de tolerância de 5 mm. O algoritmo deve ser seguido de cima para baixo. Na maioria dos casos, a configuração pode ser interposto no prazo de tolerância pedindo ao paciente para modificar a profundidade de apneia (mais profunda ou mais rasa comonecessário).

Erros de configuração tratamento sistemáticos e aleatórios da população são menos do que as observadas em free-respirando tangencial radioterapia campo mama 24, e consistente com outros dados publicados sobre técnicas de respiração segurando 25,26. VBH reduz doses de tecido normal medianos por 25-58% em comparação com respiração livre radioterapia padrão de mama no nosso centro (Tabela 1). Doses cardíaca com VBH são mais baixas do que as observadas em outros trabalhos publicados sobre técnicas de prender a respiração 11,16,17,26,27, embora os métodos de gravação de dados de doses variam entre esses estudos.

Conforme descrito na introdução, todas as técnicas de apneia usar um substituto para medir inter e intrafraction reprodutibilidade. A técnica utiliza VBH alinhamento do campo de luz com fronteiras de campo marcados para verificar a consistência antes de iniciar o tratamento e durante o parto tratamento. Embora ainda não formalmente comunicados, temos encontrado intrafracreprodutibilidade ção (medido usando intrafraction múltiplos IDA) para ser extremamente bom, com pouco, ou nenhum, movimento intrafraction. Isto é consistente com o trabalho publicado anteriormente 26. Dada a reprodutibilidade intrafraction consistente observado, os sistemas de radioterapia em que os campos de luz não permanecem em tratamento durante a entrega não precisa ser uma barreira para a implementação de VBH. Lasers no quarto pode ser usado como uma alternativa para os campos de luz para a verificação de que a apneia é mantido durante o fornecimento do tratamento. Além disso, o ponto de referência a partir do qual apneia reprodutibilidade é monitorizado pode ser adaptado; por exemplo, os centros que utilizam uma técnica de campo assimétrica pode desejar usar o limite de campo tangencial superior.

VBH oferece vantagens significativas sobre outras técnicas de poupadores de coração, alguns dos quais já foram alusão. Ele minimiza o trade-off entre o alvo e compromisso OAR muitas vezes necessária quando se utiliza MLC, reduz o i baixa doserradiation do coração e é muito menos intensivo em termos de recursos de IMRT, e é mais reprodutível do que a irradiação propenso mesmo tempo que beneficia de todas as mulheres tamanhos de peito. Com relação a outras técnicas de prender a respiração, VBH dá reprodutibilidade comparável e coração poupadores, sendo menos caro de implementar como nenhum equipamento especializado é necessário. O baixo custo da técnica significa que existe uma possibilidade muito real de que a beneficiar outros sistemas de cuidados de saúde, especialmente aqueles com recursos limitados.

Há trabalho já publicados demonstrando a viabilidade de apresentar irradiação nodal além de peito / tórax parede irradiação inteiro usando os marcadores de infravermelho-reflexo 17 e 14 sistemas baseados em espirometria. Nosso centro está agora a realização de mais trabalho para confirmar a viabilidade do uso VBH para irradiação nodal em pacientes com câncer de mama. IMRT Inverse planejada é provável que seja de benefício em pacientes selecionados, especialmente quando entregasrando um impulso integrado simultânea, bem como a viabilidade de usar VBH nestes doentes deve ser avaliada. Finalmente, técnicas de prender a respiração pode ser benéfica no tratamento de outros tumores, incluindo o pulmão 28, fígado 29, e gástricas 30 tipos de câncer. É necessário mais trabalho para avaliar a adequação do uso da técnica de VBH para tratar outras de mama sites.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brilliance CT big bore oncology Philips Other makes/models compatible with VBH technique
MT350 breastboard Med-Tec MT-350-N Other makes/models compatible with VBH technique
Dorado virtual simulation laser system LAP Laser Dorado CT-1-3-Wall Other makes/models compatible with VBH technique
Pinnacle3 radiation therapy planning system v9.2 Philips Other makes/models compatible with VBH technique
Synergy linear accelerator Elekta Other makes/models compatible with VBH technique
Intuity XVI Release 4.5.1  Elekta Other makes/models compatible with VBH technique
Iview Electronic Portal Imaging Release 3.4  Elekta Other makes/models compatible with VBH technique
Apollo room lasers LAP Laser Other makes/models compatible with VBH technique
Active breathing coordinator (ABC) Elekta Commercially available breath-hold system, not required for VBH technique
Real-time position management (RPM) system Varian Commercially available breath-hold system, not required for VBH technique

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Medicina Edição 89 de mama a radioterapia o coração a dose cardíaca apnéia
Voluntário Técnica de apneia para a Redução Coração Dose em Radioterapia mama esquerda
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Bartlett, F. R., Colgan, R. M., Donovan, E. M., Carr, K., Landeg, S., Clements, N., McNair, H. A., Locke, I., Evans, P. M., Haviland, J. S., Yarnold, J. R., Kirby, A. M. Voluntary Breath-hold Technique for Reducing Heart Dose in Left Breast Radiotherapy. J. Vis. Exp. (89), e51578, doi:10.3791/51578 (2014).

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