Abstract
血红素作为辅基为多种已知作为血红素蛋白，例如血红蛋白，肌红蛋白和细胞色素蛋白。它参与各种分子和细胞过程，如基因转录，翻译，细胞分化和细胞增殖。血红素的生物合成水平在不同组织和细胞类型而变化，并改变在疾病状况如贫血，神经病变和癌症。这种技术使用[4- 14 C] 5-氨基乙酰丙酸（[14 C] 5-ALA），早期前体中的血红素生物合成途径来测量哺乳动物细胞血红素合成的级别中的一个。该测定涉及细胞与[14 C] 5-ALA进行萃取血红素结合到血红素的放射性的和测量的孵化。这个过程是准确，快速。该方法测量血红素生物合成的相对水平，而不是总血红素含量。为了证明使用该TECHN的神游血红素生物合成的水平测定几种哺乳动物细胞系。
Introduction
血红素，亚铁离子，原卟啉IX的络合物是中央分子用于运输和利用在几乎所有的活生物1-3氧。血红素的独特结构使其能够用作双原子气体和电子的载流子，以及执行各种其它功能1-5。例如，血红素结合氧血红蛋白和肌红蛋白对氧6,7的传输和存储。它也可以作为在细胞色素电子载体呼吸期间和充当用于通过细胞色素P450酶8,9-催化氧化还原反应的电子供体。之一的血红素的最显著特征是，它可以在细胞和分子过程，如基因转录，蛋白合成和微RNA的生物发生4发挥调节作用。例如，它通过控制哺乳动物转录阻遏BACH1的活性和哺乳动物核REC影响许多基因的转录eptor REV-erbα10-15。血红素调节血红素活化蛋白（HAP）1，它起着参与呼吸和控制氧化损伤的基因的活化中起重要作用，响应于血红素或氧气16的激活。血红素也调节基因转录在通 过神经生长因子（NGF）信令3,17-20神经元细胞。它还通过调节血红素调节eIF2α的激酶（HRI）21-24活性调节蛋白质合成在哺乳动物红系细胞。此外，血红素影响关键信号传导蛋白如酪氨酸激酶Jak2的和Src的，这对于适当的细胞功能和细胞生长4,20,25必需的活性。结果发现，在HeLa细胞中的血红素抑制导致细胞周期阻滞与衰老和凋亡26相关的标记物和活化。既血红素不足或血红素水平增加都与人类27严重的健康影响有关。最近的一个分子第二流行病学研究显示高血红素摄入正相关和疾病，如2型糖尿病，冠状动脉心脏疾病和多种癌症，包括肺癌，结肠直肠癌和胰腺癌27,28的风险增加。使用配对正常和癌症肺细胞作者的实验室已经发现，癌细胞已经耗氧量增加，血红素合成和参与血红素摄取和利用氧的蛋白质28的水平。有趣的是，抑制血红素合成减少耗氧量，增殖，迁移和集落形成的癌细胞28。因此，内源性血红素水平波动起着分子和细胞过程3,4,28,29的调节中起重要作用。
在哺乳动物中，血红素的生物合成发生在八个步骤，涉及位于线粒体和胞液4（ 图1）的酶。血红素生物合成论文中线粒体的基质开始与甘氨酸和琥珀酰辅酶A的缩合，以形成5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）的通过ALA合成酶（ALAS）4,31催化。这是速率限制步骤中nonerythroid细胞血红素生物合成。 5-ALA然后出口出来到接下来的四个步骤发生，以形成粪卟啉原III（CPgenIII），然后将其导入回线粒体，在那里它被转换成原卟啉IX（PPIX）的胞质溶胶中。最后，铁的一个分子掺入到原卟啉IX（PPIX）以产生血红素，通过铁螯合（FECH）2,4-催化的反应。
血红素生物合成的水平主要取决于ALAS酶被紧紧通过细胞内的铁和血红素4控制的水平。血红素的生物合成可受遗传缺陷，某些矿物质和维生素（ 例如，核黄素，锌），暴露于毒素（ 例如，铝，铅的可用性），某些类固醇（缺氧的，发烧和等级，例如雌激素）32-35。血红素合成的电平被改变的各种疾病状况。血红素下降合成可引起贫血和神经系统疾病3,36。可替换地，增加的血红素生物合成起着某些癌症28,37的发展中起重要作用。血红素已被证明是用于哺乳动物脂肪，红系和神经元细胞4,38-41的生长，分化和存活的关键。例如，血红素缺乏导致通过谷氨酸NMDA（N-甲基-D-天冬氨酸）受体17的抑制轴突损伤在原代小鼠皮质神经元。此外，抑制血红素合成引起程序性细胞死亡的上皮宫颈癌HeLa细胞26,41。因此，测量在不同条件下在各种细胞血红素生物合成水平是研究病因和progressi重要对许多疾病的。
在这里，我们描述了一种快速，灵敏的方法，使用[4- 14 C〕-5- aminolevulic酸来测量细胞内血红素合成的水平。这是一种替代方法，使用55 Fe或59的Fe的其他方法。我们喜欢使用14 C，因为它的辐射非常微弱。相反，需要用铁同位素工作有力的保障。此外，这种方法的目的是测量并以快速的方式在不同的细胞进行比较并行血红素合成。为了测量绝对血红素水平，人们可以使用的涉及使用的HPLC 42,43的先前建立的方法。
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Protocol
注意：当放射性物质的工作，采取适当的预防措施，以避免实验者和周围环境的污染。处理掉所有废物以下本地辐射安全指引。
1.准备细胞
- 种子细胞3.5厘米板，使得所述汇合上测定当天达到80％-90％。
- 需要注意的是接种汇合为细胞取决于细胞类型和它们的生长速率。当用试剂为一定天数的治疗的细胞，种子细胞，使该汇合是80％-90％的亚铁血红素测量的一天。如果从3.5厘米板获得的细胞的数量不足，则使用6厘米板用放射性的ALA相同量中的下一个步骤。
注意：使用单独的板的建议，因为它更容易处理各个板。
- 需要注意的是接种汇合为细胞取决于细胞类型和它们的生长速率。当用试剂为一定天数的治疗的细胞，种子细胞，使该汇合是80％-90％的亚铁血红素测量的一天。如果从3.5厘米板获得的细胞的数量不足，则使用6厘米板用放射性的ALA相同量中的下一个步骤。
- 血红素测量前一天，加0.1-0.3微居里[14 C] 5-ALA和ALA冷达成最后的Concentration的20μM的总的ALA到每个培养皿中的工作区适合与放射性材料的工作，并把板放回孵化器。理想的情况下，孵育用放射性ALA 16小时。
注意：放射性标记的5-ALA需要可能的细胞系之间变化。至少100每分钟（CPM）一种放射性计数，需要尽量减少与计数相关联的错误。最好是确定[14℃] 5-ALA的需要对所研究的细胞系的最低量。对于大多数实验0.1-0.3微居里足以获得良好的测量结果。加入冷的ALA是可选的。
2.提取血红素
- 放置细胞培养皿在冰上，并将其送往该区域适合放射性工作。
- 执行整个萃取和蒸发过程中的防爆罩。因为存储甲醚发生爆炸，使用小瓶子乙醚和蒸发任何剩余的液体，不要储存乙醚开口瓶中超过一个月。不要使用丙酮靠近明火和加热器，因为它是高度易燃。商店丙酮的试剂玻璃瓶，因为它溶解组织培养塑料。
- 抽吸掉使用移液管的介质。用1ml 1×冷PBS洗涤细胞一次。关闭吸PBS。
- 加入1毫升1×冷PBS到板和收集细胞在用橡皮板的底部。从各板传送所收集的细胞进行标记的预冷2毫升管。收集所有细胞的2ml管。
注：使用新的橡皮每个板各板刮细胞。对于每块板，你会需要四个2ml管，1.5ml试管和闪烁瓶中。 - 自旋以15,000 xg离心1分钟，在4℃。
- 取出PBS中使用吸液管，给短的自旋和除去残留的PBS中。重悬的细胞在100μl1×PBS中。涡旋重悬细胞，并保持在冰上。
- 就拿10＃956;升从步骤5和转移到1.5ml微量离心管中并储存在冰上以测量蛋白质浓度。
注：细胞裂解缓冲液应加入到细胞中，并保持在冰上存货来测量蛋白质浓度。 - 自旋从步骤5其余90微升在5000×g离心30秒，在4℃;完全用200μl枪头取出PBS。
- 加入300微升血红素提取缓冲液（见材料清单），以每管。然后涡旋15秒以混合雪藏了1分钟，重复此3倍。
- 添加血红素提取缓冲液（HEB）和涡管迅速重悬沉淀，做只有一个或两个管的时间，因为粒料应迅速再悬浮而不会留在HEB太久。一旦HEB被添加到所有的管子和沉淀重悬然后按照15秒的涡流和1分钟在冰上循环如在步骤8.注意粒料可能不会完全进入HEB如果颗粒被留在HEB缓冲器为一再时间，不会很快重悬。
- 添加1.2毫升乙醚到每个管，涡旋30秒。自旋以15,000×g离心5分钟，在4℃。
注：乙醚快用完了枪头。为了控制此，吸管乙醚上下一次或两次，这样做有助于保持在吸移管的乙醚。这是一个新的枪头是用来每次重复。 - 用1ml移液器转移顶部（醚）相到新的离心管中。加入0.5毫升2N盐酸，涡旋混合和自旋如步骤9。
注意：这是很难看到醚和HCl相之间的分离。因此，在实验过程中被使用，足以给它一个淡蓝色的颜色在2当量盐酸溶液中添加少量的锥虫蓝的。这将有助于区分这两个阶段。下层相将是蓝色和上部醚相将是无色的。上层无色醚相转移到新的试管，弃去下部的HCl（蓝色）相。 - 重复步骤两名10更多次，以用2当量盐酸洗涤乙醚相。只有顶部醚相转移到新管中每个重复期间，丢弃下层盐酸相。
- 第三次洗涤用HCl后，顶部相用1ml移液器转移到闪烁瓶中。由通过保持样品中的化学罩O / N蒸发乙醚干燥样品。
3.测量放射性
- 第二天，从步骤2.12加5毫升的闪烁流体向干燥的样品。
- 摇匀混合。通过使用闪烁计数器测量放射性。
4.计算
- 从步骤2.6用CelLytic M缓冲等量裂解的细胞（见材料列表）和自旋以14000×g离心5分钟，在4℃。
- 取上清液的等分试样，并使用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白质浓度。
蛋白以mg（TP）的合计量=（90微升*浓蛋白在81克/微升）/ 1000
血红素的合成水平（放射性/ TP）=蛋白质皮摩尔/毫克。
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Representative Results
该方法是用来比较在正常（HBEC30KT）血红素合成的水平与癌（HCC4017）肺细胞。 图2示出了血红素合成中的癌细胞（HCC4017）比正常肺细胞（HBEC30KT）的更高的水平。血红素合成的水平，也测量在正常细胞和癌细胞中的线粒体解偶联剂羰氰-3-氯苯（CCCP）的存在。用10微米的CCCP的血红素合成水平测量之前处理细胞24小时。正如所料，血红素合成的水平（ 图2）中的CCCP的在正常和肿瘤细胞的存在减少。已经表明先前血红素合成可通过琥珀酰丙酮（SA）被抑制，5-氨基乙酰丙酸脱水酶（ALAD），这是在血红素合成途径41的第二酶的有效的和特异性的抑制剂。使用这种方法，所述血红素合成水平测定在HeLa细胞中的存在和腹肌0.5mM的SA。 图3 EnCE的显示，血红素合成的水平的SA的存在减少了超过10倍。为了进一步证明利用这种技术，血红素合成的水平进行测量和比较在4癌和在HEK293T细胞系， 如图4。
图1.血红素生物合成途径在人类 ALAS，5-氨基乙酰丙酸合成酶。 5-ALA，5-氨基乙酰丙酸; ALAD，ALA脱水酶; PBG，胆色素原; HMBS，hydroxymethylbilane合酶; HMB，hydroxymethylbilane; UROS，尿卟啉原三合酶; UPgenIII，尿卟啉原III; UROD，尿卟啉原脱羧酶; CPgenIII，粪卟啉原III; CPOX，粪卟啉原III氧化酶; PPgenIX，原卟啉原IX; PPOX，原卟啉原IX氧化酶; PPIX，原卟啉IX; FECH，亚铁。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.血红素生物合成在正常（HBEC30KT）的水平与癌（HCC4017）细胞系，在不存在和10μM的线粒体解偶联剂的CCCP存在的背景水平类似于空白样品（单独闪烁液）的电平，并将其是控制不到2％。 请点击此处查看该图的放大版本。
图在HeLa细胞中的ABS 3.水平血红素生物合成EnCE的和存在0.5mM的血红素合成抑制剂琥珀酰丙酮（SA）。将细胞血红素测量前具有SA的处理3天。背景水平类似于空白样品（单独闪烁液）的水平，这是控制的不到2％。 请点击此处查看该图的放大版本。
血红素生物合成中4癌症和HEK293T细胞系中的水平的图4的比较。测定法进行具体根据协议。 HCC4017生长于ACL4媒体，A549和H1395的RPMI1640补充有5％FBS，HEK293T和HeLa的DMEM补充有10％FBS中。进行统计分析，在癌细胞和HEK293T细胞的血红素合成的水平进行比较，在HCC40血红素合成水平17细胞，通过使用韦尔奇2-样本t检验。 **，P值<0.005。背景水平类似于空白样品（单独闪烁液）的水平，这是控制的不到2％。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
血红素起着经由呼吸26在细胞能量的产生的关键作用。改变血红素代谢是已知的各种疾病，包括癌症28,41相关联。血红素合成的抑制已知会导致细胞周期阻滞和凋亡的Hela细胞26,41。它已经表明，高血红素合成水平与肺癌细胞28的进展有关。因此，这将是非常重要的测量在不同条件下的细胞血红素生物合成的水平。这里讨论不量化血红素的总量因此该方法，但它不提供血红素存在于细胞中的绝对值。有很多种的比色方法和试剂盒可用于测量在细胞中的总量血红素。例如，血红素可以从细胞和线粒体中提取的丙酮和HCl的混合物中，并用50％（体积/体积）乙腈混合。然后该混合物可以应用到3.9×300毫米的C18 Bondclone色谱柱接着血红素洗脱的乙腈含0.05％（体积/体积）三氟乙酸，并确定血红素化合物的梯度在400nm 44,45。
在此之前，以测量血红素生物合成的水平在哺乳动物组织和细胞提取物[14 C]甘氨酸和[14 C] - 5-ALA被用来46,47。尽管标记的甘氨酸进入血红素合成途径在第一个步骤，但它是由导致其有限掺入血红素其他代谢途径排出。甘氨酸不是血红素生物合成途径48的特定代谢物。另一方面，标记为5-ALA是特定于血红素生物合成途径。这个特性赋予使用5-ALA在甘氨酸46,48,49的数量上的优势。因此，使用放射性5-ALA的是测量和比较血红素生物合成的水平的更具体的和精确的方法。
在大多数Critical步骤获得一致的结果是：1）确保细胞汇合不走高于100％，并在各种条件下不低于70％; 2）放射性的每板加入量应该是相同的，因为这种方法是非常敏感的; 3）血红素提取液不宜旧，建议使新鲜每次。每板所需放射性的体积非常小，并且很难保持相同量穿过样品。因此，建议使一个工作储备溶液在培养基中，如果使用同样的培养基对所有样品，其他的PBS（磷酸盐缓冲盐水）都可以使用。工作原液可以以这样的方式，每板分配的体积是在10微升制备。此外，为了更准确，从重复样品为一个条件的介质，可以取出在50ml管和放射性的适当的量可以从工作原液加入，然后分配回ëQUAL量介质板的。如果细胞的数量是有限的，如在原代培养物，12孔或24孔板可用于培养细胞，并降低放射性每孔比例的添加量。
该协议很简单，简单，并提供血红素合成的水平进行准确测量。有时，这可能很难再悬浮在血红素提取缓冲液（步骤2.8）完全细胞沉淀。为了避免这种情况是在步骤2.8快速，血红素加提取液，以1-2的样品的时间，涡流，并把它们放在冰上。确保血红素提取液是不是太旧。如果复制样本之间的标准差过高，要注意以下步骤：1）除去PBS彻底步骤2.7; 2）避免溅出的样品时，在乙醚阶段，按照提示步骤2.9; 3）确保每个平板的放射性，并且将重复样品的汇合是相同的。
28与癌症（肝癌）细胞，来自同一患者的发展。此处所描述的技术要求使用[14 C] 5-ALA，血红素生物合成途径的前体（ 图1）的，并且测量结合到血红素的放射性。在该技术中，卟啉，包括血红素，从细胞中提取的丙酮的混合物中，浓HCl和水50,51。血红素进一步从卟啉通过提取在乙醚和洗涤用2当量盐酸50,51醚相分离。然后，掺入血红素的放射性用闪烁计数器测定。结果可以通过蛋白质或细胞数的合计量进行归一化。血红素合成在HeLa细胞中被抑制通过使用琥珀酰丙酮（SA）和血红素合成的水平的降低，观察如图预viously 26（ 图3）。
该方法可用于合成血红素的在不同条件下或细胞系之间（ 图4）的电平的比较非常有用的。它需要少量的细胞，并提供具体的测量和血红素合成中不同细胞的水平进行比较。它不打算用于在细胞中绝对血红素水平的精确测量。最好是用来比较在细胞与不同的特性，例如不同的癌细胞血红素合成的水平。因为钴，代替铁，可掺入血红素在血红素合成的最后一步，可以提取51，这种方法可能不会产生血红素合成的精确比较，如果生长培养基含有不同程度的钴或其它金属离子。尽管如此，血红素合成途径由5-氨基乙酰丙酸对卟啉和血红素是非常具体的，测量整个p的磁通水平athway很可能是更大反射的相关与血红素代谢活动，而不管该金属离子。相比之下，使用59的Fe的方法检测结合的Fe形成血红素52的通路只有一部分。虽然这是更具体地，在显著金属离子的水平的情况下，所检测的血红素合成水平可能不能反映某些细胞如癌细胞的代谢潜能。此外，铁可以被隔离成其他细胞线粒体的位置旁边，使血红素。总的来说，我们认为，使用[4- 14 C〕5-ALA的是对于具有不同特性的比较不同细胞时测定血红素水平的更实用的方法。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
在HCC4017和HBEC30KT细胞系被好心医生约翰·明纳的实验室提供。这项工作是由塞西尔H.和艾达绿色基金李章博士的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma | 650501 | |
| Diethy ether | Sigma | 296082 | |
| HCl (Hydrochloric acid) | Fisher | A481-212 | |
| Liquid Scintillation cocktail | MP Biomedicals | 882470 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250 | |
| Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid | Perkin-Elmer life sciences | Store at -80 °C | |
| CelLytic M | Sigma | C2978 | Mammalian cell lysis reagent |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Specific reagent | Component | Dispense | |
| Heme extraction buffer: Acetone:HCl:Water (25:1.3:5) |
Acetone Concentrated HCl Water |
25 ml 1.3 ml 5 ml |
References
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