Abstract
يخدم الهيم كمجموعة التعويضية لمجموعة واسعة من البروتينات المعروفة باسم hemoproteins، مثل الهيموغلوبين، والميوجلوبين cytochromes. وتشارك في مختلف العمليات الجزيئية والخلوية مثل النسخ الجيني والترجمة وتمايز الخلايا وتكاثر الخلايا. مستويات الحيوي من الهيم تختلف باختلاف الأنسجة المختلفة وأنواع الخلايا وغيرت في الحالات المرضية مثل فقر الدم واعتلال الأعصاب والسرطان. هذه التقنية تستخدم [4- 14 C] حمض 5-أمينوليفولنيك ([14 C] 5-ALA)، واحدة من السلائف في وقت مبكر من مسار الهيم الحيوي لقياس مستويات التوليف الهيم في خلايا الثدييات. هذا الاختبار يشمل حضانة الخلايا مع [14 C] 5-ALA تليها استخراج الهيم وقياس النشاط الإشعاعي إدراجها في الهيم. هذا الإجراء دقيق وسريع. يقيس هذا الأسلوب المستويات النسبية للالهيم الحيوي بدلا من المحتوى الكلي الهيم. للتدليل على استخدام هذا ميتاليكIQUE مستويات الهيم الحيوي قيست في العديد من خطوط الخلايا الثديية.
Introduction
الهيم، وهو مجمع الحديد الحديدية وبروتوبرفيرين IX هو جزيء المركزي لنقل واستخدام الأوكسجين في الكائنات الحية تقريبا كل 1-3. هيكل فريد من الهيم تمكنه من العمل باعتبارها الناقل من الغازات ثنائية الذرة والالكترونات، وكذلك لأداء مختلف الوظائف الأخرى 1-5. على سبيل المثال، الهيم بربط الأوكسجين في الهيموجلوبين والميوجلوبين لنقل وتخزين 6،7 الأوكسجين. كما أنها تعمل حاملة الإلكترون في cytochromes خلال التنفس وتعمل كجهة مانحة الإلكترون لتفاعلات الأكسدة والاختزال التي حفزتها الانزيمات السيتوكروم P450 8،9. واحدة من السمات الأكثر أهمية من الهيم غير ذلك، فإنه يمكن أن تلعب الأدوار التنظيمية في العمليات الخلوية والجزيئية مثل النسخ الجيني، تخليق البروتين والصغرى RNA نشوء حيوي 4. على سبيل المثال، فإنه يؤثر على نسخ من العديد من الجينات من خلال مراقبة نشاط من الثدييات النسخي كاظمة Bach1 وتفصيل النووي الثديياتeptor القس-erbα 10-15. الهيم ينظم تفعيل بروتين الهيم المنشط (هاب) (1) الذي يلعب دورا هاما في تفعيل الجينات المسؤولة عن التنفس والسيطرة على الضرر التأكسدي، ردا على الهيم أو الأكسجين 16. ينظم الهيم أيضا النسخ الجيني في الخلايا العصبية عن طريق عامل نمو الأعصاب (NGF) يشير 3،17-20. كما ينظم تخليق البروتين في الخلايا محمر الثدييات عن طريق تحوير نشاط التنظيم الهيم eIF2α كيناز (HRI) 21-24. وعلاوة على ذلك، يؤثر الهيم نشاط البروتينات الأساسية يشير مثل التيروزين كيناز JAK2 والهلال الأحمر السوداني، والتي تعتبر ضرورية لعمل الخلية سليم و4،20،25 نمو الخلايا. فقد وجد أن في هيلا خلايا الهيم تثبيط يسبب اعتقال دورة الخلية وتفعيل علامات الشيخوخة المرتبطة وموت الخلايا المبرمج 26. وترتبط كل من هيم نقص أو زيادة مستويات الهيم مع آثار صحية خطيرة في البشر 27. والجزيئي الزوارالثانية وقد أظهرت الدراسات الوبائية وجود علاقة إيجابية من السعرات الهيم عالية وزيادة خطر الأمراض، مثل مرض السكري من النوع 2 وأمراض القلب والشرايين والسرطانات عدة بما في ذلك سرطان الرئة وسرطان القولون والمستقيم وسرطان البنكرياس 27،28. باستخدام زوج متطابق من مختبر خلايا الرئة العادية وسرطان المؤلفين وجدت أن الخلايا السرطانية قد زادت من مستويات استهلاك الأوكسجين، والتوليف الهيم والبروتينات المشاركة في امتصاص الهيم والأكسجين استخدام 28. ومن المثير للاهتمام، وتثبيط تخليق الهيم انخفض استهلاك الأكسجين، والانتشار، وتشكيل الهجرة ومستعمرة من الخلايا السرطانية 28. وبالتالي، فإن التقلبات في مستويات الهيم الذاتية يلعب دورا هاما في تنظيم العمليات الجزيئية والخلوية 3،4،28،29.
في الثدييات، والتخليق الحيوي للالهيم يحدث في ثماني خطوات، تشمل الإنزيمات الموجودة في الميتوكوندريا والعصارة الخلوية 4 (الشكل 1). الهيم biosynأطروحة تبدأ في المصفوفة الميتوكوندريا مع التكثيف من الجلايسين وsuccinyl، لجنة الزراعة لتكوين حمض 5-أمينوليفولنيك (5-ALA)، يحفزه ALA سينسيز (ALAS) 4،31. هذا هو معدل الحد خطوة في التخليق الحيوي الهيم في الخلايا nonerythroid. 5-ALA ومن ثم تصديرها إلى العصارة الخلوية التي تحدث فيها الخطوات الأربع المقبلة لتشكيل مولد الكوبروبرفيرين III (CPgenIII)، وهو ما يتم استيرادها إلى الميتوكوندريا، حيث يتم تحويلها إلى بروتوبرفيرين التاسع (PPIX). وأخيرا، يتم تضمينها جزيء واحد من الحديد إلى بروتوبرفيرين التاسع (PPIX) لإنتاج الهيم، وهو رد فعل يحفزه فيروكيلاتاز (FECH) 2،4.
مستوى الهيم الحيوي يعتمد بالدرجة الأولى على مستوى ALAS الانزيم الذي يسيطر بإحكام من قبل الحديد داخل الخلايا والهيم (4). الحيوي من الهيم يمكن أن تتأثر عيوب وراثية، وتوافر بعض المعادن والفيتامينات (على سبيل المثال، الريبوفلافين والزنك)، والتعرض للسموم (مثل الألومنيوم والرصاص)، نقص الأكسجين، والحمى، ومستويات بعض المنشطات (على سبيل المثال، الاستروجين) 32-35. يتم تبديل مستوى تخليق الهيم في مختلف الحالات المرضية. انخفضت الحيوي الهيم يمكن أن يسبب فقر الدم وكذلك الأمراض العصبية 3،36. بدلا من ذلك، زيادة الحيوي الهيم يلعب دورا هاما في تطور بعض أنواع السرطان 28،37. وقد تبين الهيم أن تكون حاسمة لنمو والتميز وبقاء الدهنية الثدييات، محمر والخلايا العصبية 4،38-41. على سبيل المثال، نقص الهيم يؤدي إلى تلف محوار في الماوس الأساسي العصبونات القشرية عن طريق تثبيط الغلوتامات NMDA (N -methyl-D اسبارتاتي) مستقبلات 17. بالإضافة إلى ذلك، تثبيط تخليق الهيم يسبب موت الخلايا المبرمج في الإنسان الظهارية عنق الرحم سرطان خلايا هيلا 26،41. لذلك، وقياس مستويات الهيم الحيوي في خلايا مختلفة في ظل ظروف مختلفة المهم لدراسة المسببات وprogressiعلى العديد من الأمراض.
نحن هنا تصف طريقة سريعة وحساسة لقياس مستوى تخليق الهيم الخلايا باستخدام [4- 14 C] حمض 5-aminolevulic. هذا هو أسلوب بديل لأساليب أخرى باستخدام 55 أو الحديد 59 الحديد. نحن نفضل استخدام 14 C لإشعاعه ضعيف جدا. في المقابل، لا بد من حماية قوية للعمل مع نظائر الحديد. وعلاوة على ذلك، المقصود هذه الطريقة لقياس ومقارنة التوليف الهيم في خلايا مختلفة في موازاة ذلك بطريقة سريعة. من أجل قياس مستويات الهيم مطلقة، يمكن للمرء استخدام أسلوب المحددة سابقا التي تنطوي على استخدام HPLC 42،43.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تنبيه: بينما كان يعمل مع النشاط الإشعاعي، واتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب التلوث من المجرب والمناطق المحيطة بها. التخلص من جميع النفايات التالية إرشادات السلامة من الإشعاع المحلية.
1. إعداد الخلايا
- خلايا البذور في 3.5 سم لوحات من هذا القبيل أن confluency يصل 80٪ -90٪ في يوم الفحص.
- لاحظ أن بذر confluency للخلايا يتوقف على نوع من الخلايا ومعدل نموها. عند علاج الخلايا مع كاشف لعدد معين من الأيام، البذور الخلايا بحيث confluency 80٪ -90٪ في اليوم القياس الهيم. إذا كان عدد الخلايا التي تم الحصول عليها من 3.5 سم لوحات غير كاف، استخدم 6 سم لوحات مع نفس الكمية من ALA المشع كما في الخطوة التالية.
ملاحظة: يوصى باستخدام لوحات فردية لأنه من الأسهل على التعامل مع لوحات فردية.
- لاحظ أن بذر confluency للخلايا يتوقف على نوع من الخلايا ومعدل نموها. عند علاج الخلايا مع كاشف لعدد معين من الأيام، البذور الخلايا بحيث confluency 80٪ -90٪ في اليوم القياس الهيم. إذا كان عدد الخلايا التي تم الحصول عليها من 3.5 سم لوحات غير كاف، استخدم 6 سم لوحات مع نفس الكمية من ALA المشع كما في الخطوة التالية.
- وقبل يوم من قياس الهيم، إضافة 0،1-0،3 μCi [14 C] 5-ALA وALA البارد للوصول إلى ج النهائيةoncentration من 20 ميكرومتر من إجمالي ALA إلى كل طبق الثقافة في نوبة منطقة العمل للعمل مع المواد المشعة ووضع لوحات العودة إلى الحاضنة. من الناحية المثالية، واحتضان مع ALA الإشعاعي لمدة 16 ساعة.
ملاحظة: رديولبلد 5-ALA المطلوبة قد تختلف بين خطوط الخلايا. مطلوب العد الإشعاعي في الدقيقة (CPM) لا يقل عن 100 لتقليل الخطأ المرتبط العد. فإنه من المستحسن أن تحديد الحد الأدنى لل[14 C] 5-ALA اللازمة لخطوط الخلايا تحت الدراسة. بالنسبة لمعظم التجارب 0،1-0،3 μCi يكفي للحصول على قياس جيد. إضافة ALA البارد اختيارية.
2. استخراج هيم
- وضع أطباق زراعة الخلايا على الجليد ونقلهم الى تناسب المنطقة للعمل الإشعاعي.
- أداء استخراج كامل وعملية التبخر في غطاء محرك السيارة واقية من الانفجار. لأن الأثير المخزنة يمكن أن تنفجر، واستخدام الأثير في زجاجات صغيرة وتتبخر أي سوائل المتبقية، لا تقم بتخزين الأثير فيزجاجة مفتوحة لأكثر من شهر واحد. لا تستخدم الأسيتون بالقرب من اللهب المكشوف وسخانات كما هو شديدة الاشتعال. متجر الأسيتون التي تحتوي على المواد الكيميائية في عبوات زجاجية كما يذوب البلاستيك زراعة الأنسجة.
- نضح قبالة المتوسطة باستخدام ماصة. غسل خلايا مرة واحدة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة 1X. نضح قبالة PBS.
- إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة 1x إلى لوحات وجمع الخلايا في الجزء السفلي من لوحة باستخدام شرطي المطاط. نقل الخلايا التي تم جمعها من كل لوحة لوصفت قبل المبردة 2 مل أنبوب. جمع كل الخلايا في 2 مل أنابيب.
ملاحظة: استخدم شرطي المطاط جديدة لكل لوحة لكشط الخلايا من كل لوحة. لكل لوحة هل تحتاج إلى أربع 2 مل أنابيب، أنبوب 1.5 مل وقارورة التلألؤ. - تدور في 15000 x ج لمدة 1 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- إخراج PBS باستخدام ماصة، وإعطاء تدور القصير وإزالة PBS المتبقية. Resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X. دوامة ل resuspend الخلايا والحفاظ على الجليد.
- يستغرق 10 &# 956؛ ل من الخطوة 5 ونقل إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل وتخزينها على الجليد لقياس تركيز البروتين.
ملاحظة: يجب إضافة خلية العازلة تحلل للخلايا وأبقى على الجليد لقياس تركيز البروتين في وقت لاحق. - تدور 90 ميكرولتر المتبقية من الخطوة 5 في 5000 x ج لمدة 30 ثانية في 4 ° C؛ إزالة PBS تماما باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.
- إضافة 300 ميكرولتر من استخراج العازلة الهيم (انظر قائمة المواد) إلى كل أنبوب. ثم دوامة لمدة 15 ثانية لخلط وضعت على الجليد لمدة 1 دقيقة، كرر هذا 3 مرات.
- إضافة العازلة استخراج الهيم (عب) ودوامة الأنبوب بسرعة إلى resuspend الكرية، هل أنابيب واحد فقط أو اثنين في وقت واحد لأن بيليه يجب معلق بسرعة دون أن تترك في HEB لفترة طويلة جدا. مرة واحدة يضاف HEB لجميع الأنابيب ومعلق بيليه ثم اتبع دوامة 15 ثانية و 1 دقيقة على دورة الجليد كما في الخطوة 8. ملاحظة أن بيليه قد لا تذهب تماما في HEB إذا تم ترك بيليه في المخزن المؤقت HEB ل يعدالوقت وليس معلق بسرعة.
- إضافة 1.2 مل من ايثر إلى كل أنبوب ودوامة لمدة 30 ثانية. تدور في 15000 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: اثيل الأثير نفدت نصائح ماصة بسرعة. للسيطرة على هذا، ماصة إثيل الأثير صعودا وهبوطا مرة واحدة أو مرتين، وبذلك يساعد على عقد ايثر في ماصة. كرر هذه كل الوقت الذي يستخدم فيه طرف ماصة جديدة. - نقل العلوي (الأثير) المرحلة مع 1 مل ماصة لأنبوب microcentrifuge جديد. إضافة 0.5 مل من 2 N حمض الهيدروكلوريك، ودوامة لخلط وتدور كما في الخطوة 9.
ملاحظة: من الصعب أن نرى الفصل بين المراحل الأثير وحمض الهيدروكلوريك. لذلك، إضافة كميات صغيرة من التريبان الأزرق في 2 حل N حمض الهيدروكلوريك لاستخدامها أثناء التجربة، وهو ما يكفي لإعطائها اللون الأزرق الفاتح. وهذا سوف يساعد التمييز بين المرحلتين. ستكون المرحلة الدنيا الأزرق وستكون المرحلة الأثير العليا عديم اللون. نقل المرحلة الأثير عديم اللون العليا لأنبوب جديد والتخلص من حمض الهيدروكلوريك (الأزرق) المرحلة الدنيا. - كرر الخطوة 10 اثنينأكثر من مرة لغسل المرحلة الأثير مع 2 N حمض الهيدروكلوريك. نقل سوى المرحلة الأثير قصوى لأنبوب جديد خلال كل تكرار وتجاهل مرحلة حمض الهيدروكلوريك أقل.
- بعد غسل الثالث مع حمض الهيدروكلوريك، ونقل المرحلة العليا مع 1 مل ماصة إلى قارورة التلألؤ. تجفيف العينات عن طريق تبخير ايثر عن طريق الحفاظ على العينات في غطاء الكيميائية O / N.
3. قياس النشاط الإشعاعي
- وفي اليوم التالي، إضافة 5 مل من السائل التلألؤ للعينات مجففة من الخطوة 2.12.
- يهز جيدا لخلط. قياس النشاط الإشعاعي باستخدام عداد التلألؤ.
4. الحسابات
- ليز الخلايا من الخطوة 2.6 باستخدام كميات متساوية من CelLytic M عازلة (انظر المواد القائمة) وتدور في 14000 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- اتخاذ قسامة من طاف وقياس تركيز البروتين باستخدام BCA عدة البروتين مقايسة.
المبلغ الإجمالي للبروتين في ملغم (TP) = (90 ميكرولتر * اضرب. البروتين في81؛ ز / ميكرولتر) / 1000
الهيم مستوى التوليف (النشاط الإشعاعي / TP) = بمول / ملغ من البروتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد استخدم هذا الأسلوب لمقارنة مستويات التوليف الهيم في الحالات العادية (HBEC30KT) مقابل السرطان (HCC4017) خلايا الرئة الشكل 2 يوضح مستوى أعلى من التوليف الهيم في الخلايا السرطانية (HCC4017) من خلايا الرئة العادية (HBEC30KT). وقد تم قياس مستوى تخليق الهيم أيضا في الخلايا الطبيعية والسرطانية في وجود الميتوكوندريا uncoupler الكربونيل السيانيد 3-chlorophenylhydrazone (CCCP). تم علاج الخلايا مع 10 ميكرومتر CCCP لمدة 24 ساعة قبل قياس مستويات التوليف الهيم. كما هو متوقع، انخفضت مستويات التوليف الهيم (الشكل 2) في وجود CCCP في كل من الخلايا الطبيعية والسرطانية. وقد تبين أنه سبق أن تركيب الهيم يمكن تمنعها succinyl الأسيتون (SA)، المانع من امكانات ومحددة من 5 أمينوليفولنيك نازعة الماء حمض (الاد) وهو الانزيم الثاني في الهيم التخليق الحيوى المسار 41. باستخدام هذه الطريقة، تم قياس مستويات التوليف الهيم في خلايا هيلا في وجود وتقاسم المنافعسينعقد من 0.5 ملي SA. الشكل (3) يبين أن مستويات التوليف الهيم انخفضت بأكثر من 10 أضعاف في وجود SA. لمزيد من شرح استخدام هذه التقنية، تم قياس مستويات التوليف الهيم ومقارنة في 4 السرطان وخطوط الخلايا HEK293T كما هو مبين في الشكل (4).
الشكل 1. الحيوي مسار الهيم في البشر للأسف، 5-أمينوليفولنيك سينسيز حامض؛ 5-ALA، حمض 5-أمينوليفولنيك. الاد، نازعة الماء ALA. PBG، برفوبيلينوجين. HMBS، سينسيز hydroxymethylbilane. HMB، hydroxymethylbilane. أوروس، يوروفيرينوجين III سينسيز؛ UPgenIII، يوروفيرينوجين الثالث؛ UROD، يوروفيرينوجين كربوكسيل؛ CPgenIII، مولد الكوبروبرفيرين الثالث؛ CPOX، مولد الكوبروبرفيرين III أوكسيديز. PPgenIX، protoporphyrinogen التاسع؛ PPOX، protoporphyrinogen التاسع أوكسيديز. PPIX، بروتوبرفيرين التاسع؛ FECH، فيروكيلاتاز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. مستويات الهيم الحيوي في الحالات العادية (HBEC30KT) والسرطان (HCC4017) خلية خطوط، في غياب وجود 10 ميكرومتر الميتوكوندريا uncoupler CCCP. وكان مستوى الخلفية مماثل لمستوى عينة فارغة (السائل التلألؤ وحدها) وذلك كان أقل من 2٪ من عنصر التحكم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. مستويات الهيم الحيوي في خلايا هيلا في القيمة المطلقةسينعقد وجود 0.5 ملم من التوليف الهيم المانع succinyl الأسيتون (SA). تم علاج الخلايا مع SA لمدة 3 أيام قبل قياس الهيم. كان مستوى الخلفية مماثل لمستوى عينة فارغة (السائل التلألؤ وحدها)، وكان أقل من 2٪ من عنصر التحكم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
. تم تنفيذ الشكل 4. مقارنة بين مستويات الهيم الحيوي في 4 السرطان وHEK293T خطوط الخلايا الفحص وفقا للبروتوكول. كانت تزرع HCC4017 في ACL4 وسائل الإعلام، A549 وH1395 في RPMI1640 تستكمل مع 5٪ FBS، HEK293T وهيلا في DMEM تستكمل مع 10٪ FBS. للتحليل الإحصائي، وتمت مقارنة مستويات التوليف الهيم في الخلايا السرطانية والخلايا HEK293T إلى مستوى تخليق الهيم في HCC4017 الخلايا، باستخدام ولش 2-عينة اختبار t. **، ص قيمة <0.005. كان مستوى الخلفية مماثل لمستوى عينة فارغة (السائل التلألؤ وحدها)، وكان أقل من 2٪ من عنصر التحكم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الهيم يلعب دورا رئيسيا في توليد الطاقة الخلوية عن طريق التنفس 26. ومن المعروف غيرت الأيض الهيم أن تترافق مع أمراض مختلفة بما في ذلك السرطان 28،41. ومن المعروف تثبيط تخليق الهيم أن تسبب اعتقال دورة الخلية وموت الخلايا المبرمج في خلايا هيلا 26،41. وقد تبين أن الهيم ارتفاع مستوى التوليف ويرتبط مع تطور خلايا سرطان الرئة 28. ولذلك، فإنه سيكون من أهمية كبرى لقياس مستويات الهيم الحيوي في الخلايا تحت ظروف مختلفة. طريقة مناقشتها هنا لا تحديد المبلغ الإجمالي للالهيم وبالتالي، فإنه لا يوفر القيمة المطلقة للالهيم موجودة في الخلايا. وهناك مجموعة متنوعة من الأساليب اللونية ومجموعات المتاحة لقياس مجموع مبالغ الهيم في الخلايا. على سبيل المثال، الهيم يمكن استخراجها من الخلايا والميتوكوندريا في خليط من الأسيتون وحمض الهيدروكلوريك ومختلطة مع 50٪ (ت / ت) الأسيتونتريل. ثم الخليط يمكن تطبيقهاإلى 3.9 × 300 مم C18 Bondclone العمود تليها شطف من الهيم في التدرج من الأسيتونيتريل تحتوي على 0،05٪ (V / V) حمض trifluoroacetic وتحديد المركبات الهيم في 400 نانومتر 44،45.
سابقا، لقياس مستويات الهيم الحيوي في أنسجة الثدييات ومقتطفات خلية [14 C] -glycine واستخدمت [14 C] 5- ALA 46،47. على الرغم من الجلايسين وصفت يدخل الحيوي مسار الهيم في الخطوة الأولى ولكن يتم تصريف تشغيله بواسطة المسارات الأيضية الأخرى مما أدى إلى إدماج محدود لها في الهيم. الجلايسين ليس الأيض محدد لمسار الهيم الحيوي 48. من ناحية أخرى، وصفت 5-ALA غير محدد لمسار الهيم الحيوي. هذه الميزة تمنح ميزة الكمية للاستخدام 5-ALA على الجلايسين 46،48،49. لذلك، استخدام مشع 5-ALA هي طريقة أكثر تحديدا ودقة لقياس ومقارنة مستويات الهيم الحيوي.
معظم جخطوات ritical للحصول على نتائج متسقة فيما يلي: 1) تأكد من أن الخلية confluency لا تذهب أعلى من 100٪ وليس أقل من 70٪ في مختلف الظروف. 2) يجب أن يكون مقدار النشاط الإشعاعي وأضاف في لوحة متطابقة لأن هذا الأسلوب هو حساس جدا. 3) لا ينبغي أن يكون استخراج العازلة الهيم القديم، فمن المستحسن أن تجعل جديدة في كل مرة. حجم النشاط الإشعاعي المطلوبة لكل لوحة صغيرة جدا وأنه من الصعب للحفاظ على كميات مماثلة عبر العينات. ولذلك، فمن المستحسن لجعل حل الأسهم العاملة في مستنبت، إذا باستخدام نفس المتوسطة لجميع العينات، آخر PBS (الفوسفات مخزنة المالحة) يمكن استخدامها. العمل المحلول يمكن أن تكون على استعداد في مثل هذه الطريقة أن حجم الاستغناء في لوحة تحت 10 ميكرولتر. أيضا، لتكون أكثر دقة، والمتوسطة من عينات تكرار لحالة واحدة يمكن أن يؤخذ بها في أنبوب 50 مل والكميات المناسبة من النشاط الإشعاعي يمكن أن يضاف من المحلول العمل، ثم الاستغناء الظهر ه كميات التأهيلية من متوسطة إلى لوحات. وإذا كان عدد من الخلايا محدودة، كما هو الحال في الثقافات الأولية، 12-جيدا أو 24-جيدا لوحات يمكن استخدامها لثقافة الخلايا وتقلل من كمية النشاط الإشعاعي المضافة لكل جيدا نسبيا.
هذا البروتوكول هو واضحة وبسيطة، ويوفر مقاييس دقيقة لمستويات التوليف الهيم. في بعض الأحيان، قد يكون من الصعب resuspend الكرية خلية في استخراج العازلة الهيم (الخطوة 2.8) تماما. لتجنب هذا تكون سريعة في الخطوة 2.8، إضافة الهيم استخراج العازلة إلى 1-2 العينات في وقت واحد، دوامة ووضعها على الجليد. تأكد من استخراج العازلة الهيم ليست قديمة جدا. إذا كان الانحراف المعياري بين العينات تكرار مرتفع جدا، والانتباه إلى الخطوات التالية: 1) تمت إزالة PBS تماما في الخطوة 2.7. 2) تجنب إراقة عينة عندما تكون في مرحلة إثيل الأثير، اتبع طرف في الخطوة 2.9. 3) تأكد من إضافة النشاط الإشعاعي في لوحة وكانت confluency من العينات تكرار نفسه.
ق ق = "jove_content"> عن طريق المشع طريقة 5-ALA، وتمت مقارنة مستويات التوليف الهيم كما هو موضح سابقا 28 في العادي nonmalignant (HBEC) مقابل سرطان (HCC) الخلايا، وضعت من نفس المريض. تقنية الموضحة هنا يتطلب استخدام [14 C] 5-ALA، تمهيدا في طريق الهيم الحيوي (الشكل 1)، ويقيس النشاط الإشعاعي إدراجها في الهيم. في هذه التقنية، البروفيرين، بما في ذلك الهيم، استخرجت من الخلايا في خليط من الأسيتون، حمض الهيدروكلوريك المركز و50،51 المياه. تم فصل الهيم مزيد من البروفيرين عن طريق استخراج في ايثر وغسل المرحلة الأثير مع 2 N حمض الهيدروكلوريك 50،51. ثم، تم تحديد النشاط الإشعاعي إدراجها في الهيم باستخدام عداد التلألؤ. النتائج يمكن تطبيع من قبل المبلغ الإجمالي للبروتين أو عدد الخلايا. كانت تحول دون تركيب الهيم في خلايا هيلا باستخدام الأسيتون succinyl (SA) وانخفاض في مستوى تركيب الهيم لوحظ كما هو موضح مسبقاviously 26 (الشكل 3).
هذه الطريقة مفيدة جدا لمقارنة مستويات التوليف الهيم في ظل ظروف مختلفة أو بين خطوط الخلايا (الشكل 4). فإنه يتطلب عددا قليلا من الخلايا ويوفر القياس والمقارنة بين مستويات التوليف الهيم في خلايا مختلفة معين. وليس المقصود بها لقياس دقيق لمستويات الهيم المطلقة في الخلايا. يتم استخدام أفضل ما لمقارنة مستويات التوليف الهيم في الخلايا مع خصائص مختلفة، مثل الخلايا السرطانية المختلفة. لأن الكوبالت، بدلا من الحديد، يمكن إدراجها في الهيم في الخطوة الأخيرة من تركيب الهيم وسيتم استخراج 51، وهذه الطريقة قد لا تسفر مقارنة دقيقة من التوليف الهيم، وإذا كانت وسائل الإعلام نمو تحتوي على مستويات مختلفة من الكوبالت أو الأيونات المعدنية الأخرى. ومع ذلك، فإن مسار الهيم الاصطناعية من حمض 5-أمينوليفولنيك إلى البروفيرين والهيم محددة جدا، وقياس مستويات التدفق من ع كلهومن المرجح أن يكون أكثر تعبيرا عن الأنشطة الأيضية ذات الصلة الهيم، بغض النظر عن ايونات المعادن athway. في المقابل، فإن طريقة استخدام الحديد بالكشف عن 59 فقط من جانب الطريق دمج الحديد لتشكيل الهيم 52. على الرغم من أن هذا هو أكثر تحديدا، في وجود مستويات عالية من الأيونات المعدنية، قد لا يعكس مستويات التوليف الهيم الكشف عن إمكانات التمثيل الغذائي للخلايا معينة مثل الخلايا السرطانية. وعلاوة على ذلك، الحديد يمكن عزلها في أماكن الخلوية الأخرى بجانب الميتوكوندريا لجعل الهيم. وعلى وجه العموم، ونحن نعتقد أن استخدام [4- 14 C] 5-ALA هي طريقة أكثر عملية لقياس مستويات الهيم عند المقارنة بين خلايا مختلفة مع خصائص مختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
كانت خطوط الخلايا HCC4017 وHBEC30KT تفضلت التي تقدمها مختبر الدكتور جون مينا لل. وأيد هذا العمل من قبل أموال سيسيل H. وإيدا الأخضر للدكتور لى تشانغ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma | 650501 | |
| Diethy ether | Sigma | 296082 | |
| HCl (Hydrochloric acid) | Fisher | A481-212 | |
| Liquid Scintillation cocktail | MP Biomedicals | 882470 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250 | |
| Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid | Perkin-Elmer life sciences | Store at -80 °C | |
| CelLytic M | Sigma | C2978 | Mammalian cell lysis reagent |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Specific reagent | Component | Dispense | |
| Heme extraction buffer: Acetone:HCl:Water (25:1.3:5) |
Acetone Concentrated HCl Water |
25 ml 1.3 ml 5 ml |
References
- Furuyama, K., Kaneko, K., Vargas, P. D. Heme as a magnificent molecule with multiple missions: heme determines its own fate and governs cellular homeostasis. Tohoku J Exp Med. 213, 1-16 (2007).
- Hamza, I., Dailey, H. A. One ring to rule them all: trafficking of heme and heme synthesis intermediates in the metazoans. Biochim Biophys Acta. 1823, 1617-1632 (2012).
- Zhu, Y., Hon, T., Ye, W., Zhang, L. Heme deficiency interferes with the Ras-mitogen-activated protein kinase signaling pathway and expression of a subset of neuronal genes. Cell Growth Differ. 13, 431-439 (2002).
- Zhang, L. HEME BIOLOGY: The Secret Life of Heme in Regulating Diverse Biological Processes. Singapore: World Scientific Publishing Company. , (2011).
- Mense, S. M., Zhang, L. Heme: a versatile signaling molecule controlling the activities of diverse regulators ranging from transcription factors to MAP kinases. Cell Res. 16, 681-692 (2006).
- Ingram, D. J., Kendrew, J. C. Orientation of the haem group in myoglobin and its relation to the polypeptide chain direction. Nature. 178, 905-906 (1956).
- Perutz, M. F. X-ray analysis of hemoglobin. Science. 140, 863-869 (1963).
- Chance, B. The nature of electron transfer and energy coupling reactions. FEBS Lett. 23, 3-20 (1972).
- Guengerich, F. P., MacDonald, T. L. Mechanisms of cytochrome P-450 catalysis. Faseb J. 4, 2453-2459 (1990).
- Igarashi, K., et al. Multivalent DNA binding complex generated by small Maf and Bach1 as a possible biochemical basis for beta-globin locus control region complex. J Biol Chem. 273, 11783-11790 (1998).
- Ogawa, K., et al. Heme mediates derepression of Maf recognition element through direct binding to transcription repressor Bach1. Embo J. 20, 2835-2843 (2001).
- Oyake, T., et al. Bach proteins belong to a novel family of BTB-basic leucine zipper transcription factors that interact with MafK and regulate transcription through the NF-E2 site. Mol Cell Biol. 16, 6083-6095 (1996).
- Snyder, S. H., Jaffrey, S. R., Zakhary, R. Nitric oxide and carbon monoxide: parallel roles as neural messengers. Brain Res Brain Res Rev. 26, 167-175 (1998).
- Sun, J., et al. Hemoprotein Bach1 regulates enhancer availability of heme oxygenase-1 gene. Embo J. 21, 5216-5224 (2002).
- Zhang, L., Guarente, L. Heme binds to a short sequence that serves a regulatory function in diverse proteins. Embo J. 14, 313-320 (1995).
- Hon, T., Lee, H. C., Hu, Z., Iyer, V. R., Zhang, L. The heme activator protein Hap1 represses transcription by a heme-independent mechanism in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 169, 1343-1352 (2005).
- Chernova, T., et al. Neurite degeneration induced by heme deficiency mediated via inhibition of NMDA receptor-dependent extracellular signal-regulated kinase 1/2 activation. J Neurosci. 27, 8475-8485 (2007).
- Chernova, T., et al. Early failure of N-methyl-D-aspartate receptors and deficient spine formation induced by reduction of regulatory heme in neurons. Mol Pharmacol. 79, 844-854 (2011).
- Sengupta, A., Hon, T., Zhang, L. Heme deficiency suppresses the expression of key neuronal genes and causes neuronal cell death. Brain Res Mol Brain Res. 137, 23-30 (2005).
- Smith, A. G., Raven, E. L., Chernova, T. The regulatory role of heme in neurons. Metallomics. 3, 955-962 (2011).
- Raghuram, S., et al. Identification of heme as the ligand for the orphan nuclear receptors REV-ERBalpha and REV-ERBbeta. Nat Struct Mol Biol. 14, 1207-1213 (2007).
- Wu, N., Yin, L., Hanniman, E. A., Joshi, S., Lazar, M. A. Negative feedback maintenance of heme homeostasis by its receptor Rev-erbalpha. Genes Dev. 23, 2201-2209 (2009).
- Yin, L., et al. Rev-erbalpha, a heme sensor that coordinates metabolic and circadian pathways. Science. 318, 1786-1789 (2007).
- Zhu, Y., Hon, T., Zhang, L. Heme initiates changes in the expression of a wide array of genes during the early erythroid differentiation stage. Biochemical and biophysical research communications. 258, 87-93 (1999).
- Yao, X., Balamurugan, P., Arvey, A., Leslie, C., Zhang, L. Heme controls the regulation of protein tyrosine kinases Jak2 and Src. Biochemical and biophysical research communications. 402, 30-35 (2010).
- Ye, W., Zhang, L. Heme controls the expression of cell cycle regulators and cell growth in HeLa cells. Biochem and biophys res comm. 315, 546-554 (2004).
- Hooda, J., Shah, A., Zhang, L. Heme, an essential nutrient from dietary proteins, critically impacts diverse physiological and pathological processes. Nutrients. 6, 1080-1102 (2014).
- Hooda, J., et al. Enhanced heme function and mitochondrial respiration promote the progression of lung cancer cells. PloS one. 8, e63402 (2013).
- Atamna, H., Walter, P. B., Ames, B. N. The role of heme and iron-sulfur clusters in mitochondrial biogenesis, maintenance, and decay with age. Arch Biochem Biophys. 397, 345-353 (2002).
- Atamna, H., Killilea, D. W., Killilea, A. N., Ames, B. N. Heme deficiency may be a factor in the mitochondrial and neuronal decay of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14807-14812 (2002).
- Ponka, P. Cell biology of heme. Am J Med Sci. 318, 241-256 (1999).
- Brawer, J. R., Naftolin, F., Martin, J., Sonnenschein, C. Effects of a single injection of estradiol valerate on the hypothalamic arcuate nucleus and on reproductive function in the female rat. Endocrinol. 103, 501-512 (1978).
- Daniell, W. E., et al. Environmental chemical exposures and disturbances of heme synthesis. Environ Health Perspect. 105, Suppl 1. 37-53 (1997).
- Kihara, T., et al. Hepatic heme metabolism in rats with fever induced by interleukin 1beta. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 104, 115-126 (1999).
- Vijayasarathy, C., Damle, S., Prabu, S. K., Otto, C. M., Avadhani, N. G. Adaptive changes in the expression of nuclear and mitochondrial encoded subunits of cytochrome c oxidase and the catalytic activity during hypoxia. Eur J Biochem. 270, 871-879 (2003).
- Anderson, K. E. S. S., Bishop, D. F., Desnick, R. J. Disorders of heme biosynthesis: X-linked sideroblastic anemia and the porphyrias. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. , The McGraw-Hill Companies, Inc. New York. 1-53 (2009).
- Salvo, M. L., Contestabile, R., Paiardini, A., Maras, B. Glycine consumption and mitochondrial serine hydroxymethyltransferase in cancer cells: the heme connection. Med Hypotheses. 80, 633-636 (2013).
- Ishii, D. N., Maniatis, G. M. Haemin promotes rapid neurite outgrowth in cultured mouse neuroblastoma cells. Nature. 274, 372-374 (1978).
- Padmanaban, G., Venkateswar, V., Rangarajan, P. N. Haem as a multifunctional regulator. Trends Biochem Sci. 14, 492-496 (1989).
- Rutherford, T. R., Clegg, J. B., Weatherall, D. J. K562 human leukaemic cells synthesise embryonic haemoglobin in response to haemin. Nature. 280, 164-165 (1979).
- Ye, W., Zhang, L. Heme deficiency causes apoptosis but does not increase ROS generation in HeLa cells. Biochemical and biophysical research communications. 319, 1065-1071 (2004).
- Bonkovsky, H. L., et al. High-performance liquid chromatographic separation and quantitation of tetrapyrroles from biological materials. Anal Biochem. 155, 56-64 (1986).
- Sinclair, P. R., Gorman, N., Jacobs, J. M. Measurement of heme concentration. Curr Protoc Toxicol. 8, Unit 8.3 (2001).
- Barros, M. H., Carlson, C. G., Glerum, D. M., Tzagoloff, A. Involvement of mitochondrial ferredoxin and Cox15p in hydroxylation of heme O. FEBS Lett. 492, 133-138 (2001).
- Shinjyo, N., Kita, K. Up-regulation of heme biosynthesis during differentiation of Neuro2a cells. J Biochem. 139, 373-381 (2006).
- Israels, L. G., Yoda, B., Schacter, B. A. Heme binding and its possible significance in heme movement and availability in the cell. Ann N Y Acad Sci. 244, 651-661 (1975).
- Yannoni, C. Z., Robinson, S. H. Early-labelled haem in erythroid and hepatic cells. Nature. 258, 330-331 (1975).
- Robinson, S. H. Formation of bilirubin from erythroid and nonerythroid sources. Semin Hematol. 9, 43-53 (1972).
- Granick, S., Granick, D. Nucleolar necklaces in chick embryo myoblasts formed by lack of arginine. J Cell Biol. 51, 636-642 (1971).
- Morell, D. B., Barrett, J., Clezy, P. S. The prosthetic group of cytochrome oxidase. 1. Purification as porphyrin alpha and conversion into haemin alpha. Biochem J. 78, 793-797 (1961).
- Sinclair, P., Gibbs, A. H., Sinclair, J. F., de Matteis, F. Formation of cobalt protoporphyrin in the liver of rats. A mechanism for the inhibition of liver haem biosynthesis by inorganic cobalt. Biochem J. 178, 529-538 (1979).
- Chung, J., Haile, D. J., Wessling-Resnick, M. Copper-induced ferroportin-1 expression in J774 macrophages is associated with increased iron efflux. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 2700-2705 (2004).
