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Biology

स्तनधारी कोशिकाओं में हीम संश्लेषण स्तर की माप

Published: July 9, 2015 doi: 10.3791/51579
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular and Cell Biology, Center for Systems Biology, University of Texas at Dallas

Abstract

हीम ऐसे हीमोग्लोबिन, मायोग्लोबिन और cytochromes के रूप में hemoproteins, के रूप में जाना प्रोटीन की एक विस्तृत विविधता के लिए कृत्रिम समूह के रूप में कार्य करता है। यह इस तरह के जीन प्रतिलेखन, अनुवाद, सेल भेदभाव और सेल प्रसार के रूप में विभिन्न आणविक और सेलुलर प्रक्रियाओं में शामिल है। हीम के जैवसंश्लेषण स्तरों विभिन्न ऊतकों और सेल प्रकार भर में भिन्न है और इस तरह से एनीमिया, न्यूरोपैथी और कैंसर के रूप में कोढ़ की स्थिति में बदल दिया है। इस तकनीक का उपयोग करता है [4- 14 सी] 5-aminolevulinic एसिड ([14 सी] 5-पक्षक), स्तनधारी कोशिकाओं में हीम संश्लेषण के स्तर को मापने के लिए हीम जैवसंश्लेषण मार्ग में जल्दी व्यापारियों में से एक। यह परख हीम में शामिल रेडियोधर्मिता का हीम और माप की निकासी के द्वारा पीछा [14 सी] 5-Ala के साथ कोशिकाओं के ऊष्मायन शामिल है। यह प्रक्रिया सही है और जल्दी है। इस विधि हीम जैवसंश्लेषण के सापेक्ष स्तरों के बजाय कुल हीम सामग्री के उपाय। इस techn के उपयोग के प्रदर्शन करने के लिएहीम जैवसंश्लेषण के स्तर Ique कई स्तनधारी सेल लाइनों में मापा गया।

Introduction

हीम, लौह लोहा और protoporphyrin नौवीं की एक जटिल परिवहन और लगभग सभी जीवित जीवों 1-3 में ऑक्सीजन का उपयोग करने के लिए एक केंद्रीय अणु है। हीम की अनोखी संरचना यह द्विपरमाणुक गैसों और इलेक्ट्रॉनों का एक वाहक के रूप में कार्य करने के लिए, साथ ही विभिन्न अन्य कार्यों के 1-5 प्रदर्शन करने के लिए सक्षम बनाता है। उदाहरण के लिए, हीम ऑक्सीजन 6,7 के हस्तांतरण और भंडारण के लिए हीमोग्लोबिन और मायोग्लोबिन में ऑक्सीजन को बांधता है। यह भी श्वसन के दौरान cytochromes में एक इलेक्ट्रॉन वाहक के रूप में काम करता है और साइटोक्रोम P450 एंजाइमों 8,9 द्वारा उत्प्रेरित redox प्रतिक्रियाओं के लिए एक इलेक्ट्रॉन दाता के रूप में कार्य करता है। हीम का सबसे महत्वपूर्ण सुविधाओं में से एक यह इस तरह के जीन प्रतिलेखन, प्रोटीन संश्लेषण और माइक्रो आरएनए जीवजनन 4 के रूप में सेलुलर और आणविक प्रक्रियाओं में नियामक भूमिका निभा सकते हैं, कि है। उदाहरण के लिए, यह स्तनधारी ट्रांसक्रिप्शनल repressor Bach1 की गतिविधि और स्तनधारी परमाणु आरईसी को नियंत्रित करने से कई जीनों के प्रतिलेखन को प्रभावित करता हैeptor रेव erbα 10-15। हीम हीम या ऑक्सीजन 16 के जवाब में, श्वसन और oxidative नुकसान को नियंत्रित करने में शामिल जीनों की सक्रियता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है जो हीम उत्प्रेरक प्रोटीन (पड़ना) 1 की सक्रियता को नियंत्रित करता है। हीम भी 3,17-20 संकेत तंत्रिका वृद्धि कारक (NGF) के माध्यम से neuronal कोशिकाओं में जीन प्रतिलेखन को नियंत्रित करता है। यह भी हीम विनियमित eIF2α काइनेज (HRI) 21-24 की गतिविधि modulating द्वारा स्तनधारी एर्य्थ्रोइद कोशिकाओं में प्रोटीन संश्लेषण को नियंत्रित करता है। इसके अलावा, हीम उचित सेल कामकाज और सेल के विकास 4,20,25 के लिए आवश्यक हैं जो इस तरह के टाइरोसीन काइनेज Jak2 और एसआरसी के रूप में महत्वपूर्ण संकेत प्रोटीन की गतिविधि को प्रभावित करता है। यह HeLa में कोशिकाओं हीम निषेध वार्धक्य और apoptosis 26 के साथ जुड़े मार्करों के सेल चक्र गिरफ्तारी और सक्रियण का कारण बनता है कि पाया गया था। हीम की कमी या हीम के स्तर में वृद्धि दोनों मानव 27 में गंभीर स्वास्थ्य प्रभाव के साथ जुड़े रहे हैं। हाल ही में आणविक एकएन डी महामारी विज्ञान के अध्ययन के लिए एक उच्च हीम सेवन का सकारात्मक सहयोग और इस तरह के टाइप -2 मधुमेह, हृदय रोग और फेफड़ों के कैंसर, कोलोरेक्टल कैंसर और अग्नाशय के कैंसर 27,28 सहित कई तरह के कैंसर जैसे रोगों का खतरा बढ़ के दिखाया है। सामान्य और कैंसर फेफड़ों की कोशिकाओं लेखक 'प्रयोगशाला की एक मिलान जोड़ी का उपयोग कैंसर की कोशिकाओं को ऑक्सीजन की खपत, हीम संश्लेषण और हीम तेज और ऑक्सीजन के उपयोग में 28 में शामिल प्रोटीन के स्तर में वृद्धि हुई है कि मिल गया है। दिलचस्प है, हीम संश्लेषण के निषेध ऑक्सीजन की खपत, प्रसार, कैंसर की कोशिकाओं को 28 के प्रवास और कॉलोनी के गठन की कमी हुई। इस प्रकार, अंतर्जात हीम के स्तर में उतार-चढ़ाव आणविक और सेलुलर प्रक्रियाओं 3,4,28,29 के नियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

स्तनधारियों में, हीम के जैवसंश्लेषण माइटोकांड्रिया और साइटोसॉल 4 (चित्रा 1) में स्थित एंजाइमों शामिल आठ चरणों में होता है। हीम बायोसिनथीसिस पक्षक सिन्थेज़ (अफसोस) 4,31 द्वारा उत्प्रेरित 5-aminolevulinic एसिड (5-पक्षक) के लिए फार्म ग्लाइसिन और succinyl-कोए का संक्षेपण, साथ माइटोकॉन्ड्रिया के मैट्रिक्स में शुरू होता है। इस nonerythroid कोशिकाओं में हीम जैवसंश्लेषण में कदम सीमित दर है। 5-Ala तो अगले चार चरणों फिर इसे वापस protoporphyrin नौवीं (PPIX) में बदल जाता है, जहां माइटोकॉन्ड्रिया, करने के लिए आयात किया जाता है, जो coproporphyrinogen तृतीय (CPgenIII), फार्म के लिए होते हैं, जहां साइटोसॉल के लिए बाहर निर्यात किया जाता है। अंत में, लोहे के एक अणु हीम, ferrochelatase (FECH) 2,4 द्वारा उत्प्रेरित एक प्रतिक्रिया का उत्पादन करने के लिए protoporphyrin नौवीं (PPIX) को शामिल किया है।

हीम जैवसंश्लेषण के स्तर पर मुख्य रूप से कसकर इंट्रासेल्युलर लोहा और हीम 4 द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जो काश एंजाइम के स्तर पर निर्भर करता है। हीम के जैवसंश्लेषण आनुवंशिक दोष, कुछ खनिज और विटामिन (जैसे, राइबोफ्लेविन, जस्ता), विषाक्त पदार्थों (जैसे, एल्यूमिनियम, सीसा के लिए जोखिम की उपलब्धता से प्रभावित किया जा सकता है), कुछ स्टेरॉयड (के अनॉक्सिता, बुखार, और स्तरों जैसे, एस्ट्रोजन) 32-35। हीम संश्लेषण के स्तर पर विभिन्न रोगग्रस्त परिस्थितियों में बदल दिया है। कमी हीम जैवसंश्लेषण एनीमिया के साथ-साथ मस्तिष्क संबंधी बीमारियों 3,36 पैदा कर सकता है। वैकल्पिक रूप से वृद्धि हुई है, हीम जैवसंश्लेषण कुछ तरह के कैंसर 28,37 की प्रगति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हीम स्तनधारी वसा, एर्य्थ्रोइद और neuronal कोशिकाओं 4,38-41 के विकास, भेदभाव और अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण होने के लिए दिखाया गया है। उदाहरण के लिए, हीम कमी ग्लूटामेट NMDA (एन -methyl-डी-aspartate) रिसेप्टर 17 के निषेध के माध्यम से प्राथमिक माउस cortical न्यूरॉन्स में neurite नुकसान होता है। इसके अतिरिक्त, हीम संश्लेषण के निषेध मानव उपकला गर्भाशय ग्रीवा कार्सिनोमा HELA कोशिकाओं 26,41 में प्रोग्राम कोशिका मृत्यु का कारण बनता है। इसलिए, विभिन्न परिस्थितियों में विभिन्न कोशिकाओं में हीम जैवसंश्लेषण स्तर को मापने के एटियलजि और progressi के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण हैकई बीमारियों में से एक पर।

यहाँ हम [4- 14 सी] 5-aminolevulic एसिड का उपयोग करके इंट्रासेल्युलर हीम संश्लेषण के स्तर को मापने के लिए एक तेजी से और संवेदनशील विधि का वर्णन। यह 55 फ़े या 59 फ़े का उपयोग अन्य तरीकों के लिए एक वैकल्पिक तरीका है। इसके विकिरण बहुत कमजोर है क्योंकि हम 14 सी का उपयोग पसंद करते हैं। इसके विपरीत, मजबूत सुरक्षा फे आइसोटोप के साथ काम करने के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, इस विधि को मापने के लिए और एक त्वरित ढंग से समानांतर में विभिन्न कोशिकाओं में हीम संश्लेषण की तुलना करने का इरादा है। पूर्ण हीम के स्तर को मापने के लिए आदेश में, एक एचपीएलसी 42,43 के उपयोग से जुड़े पहले से स्थापित विधि का उपयोग कर सकते हैं।

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Protocol

चेतावनी: रेडियोधर्मिता के साथ काम करते हुए, प्रयोगकर्ता और आसपास के प्रदूषण से बचने के लिए उचित सावधानी बरतने। स्थानीय विकिरण सुरक्षा दिशा निर्देशों का पालन सब बेकार बंद निपटाने।

प्रकोष्ठों के 1. तैयारी

  1. Confluency परख के दिन पर 80% -90% तक पहुँच जाता है कि इस तरह की 3.5 सेमी प्लेटों में बीज कोशिकाओं।
    1. कोशिकाओं के लिए confluency बोने सेल के प्रकार और उनकी विकास दर पर निर्भर करता है कि ध्यान दें। दिनों की एक निश्चित संख्या के लिए एक अभिकर्मक के साथ कोशिकाओं के इलाज जब confluency हीम माप के दिन पर 80% -90% है, इसलिए है कि कोशिकाओं के बीज। 3.5 सेमी प्लेटों से प्राप्त कोशिकाओं की संख्या अपर्याप्त है, तो अगले चरण में के रूप में रेडियोधर्मी ALA के एक ही राशि के साथ 6 सेमी प्लेटों का उपयोग करें।
      नोट: यह व्यक्तिगत प्लेटों को संभालना आसान है, क्योंकि अलग-अलग प्लेटों के उपयोग की सिफारिश की है।
  2. हीम माप से एक दिन पहले एक अंतिम ग तक पहुँचने के लिए 0.1-0.3 μCi [14 सी] 5-Ala और ठंड पक्षक जोड़नेरेडियोधर्मी सामग्री के साथ काम करने के लिए एक कार्य क्षेत्र फिट में प्रत्येक संस्कृति डिश के लिए कुल ALA के 20 माइक्रोन की oncentration और वापस इनक्यूबेटर में प्लेटें डाल दिया। आदर्श रूप में, 16 घंटा के लिए रेडियोधर्मी पक्षक साथ सेते हैं।
    नोट: radiolabeled 5-Ala सेल लाइनों के बीच भिन्न हो सकते हैं की आवश्यकता है। कम से कम 100 मिनट (सीपीएम) के अनुसार एक रेडियोधर्मी गिनती गिनती के साथ जुड़े त्रुटि को कम करने के लिए आवश्यक है। यह अध्ययन के तहत सेल लाइनों के लिए आवश्यक [14 सी] 5-Ala की एक न्यूनतम राशि निर्धारित करने के लिए सलाह दी जाती है। सबसे प्रयोगों के लिए 0.1-0.3 μCi एक अच्छा माप प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है। ठंड ALA के अलावा वैकल्पिक है।

2. हीम एक्सट्रैक्शन

  1. बर्फ पर सेल संस्कृति व्यंजन प्लेस और रेडियोधर्मिता के काम के लिए क्षेत्र फिट करने के लिए उन्हें ले।
    1. एक विस्फोट प्रूफ हुड में पूरी निकासी और वाष्पीकरण की प्रक्रिया को पूरा करें। संग्रहीत आकाश में विस्फोट हो सकता है, क्योंकि में आकाश की दुकान नहीं है, छोटे बोतलों में ईथर का उपयोग करें और किसी भी शेष तरल पदार्थ लुप्त हो जानाअधिक से अधिक एक महीने के लिए एक खुली बोतल। यह अत्यधिक ज्वलनशील है के रूप में खुली आग और हीटर के पास एसीटोन का प्रयोग न करें। यह टिशू कल्चर प्लास्टिक घुल के रूप में कांच की बोतलों में अभिकर्मकों युक्त स्टोर एसीटोन।
  2. एक विंदुक का उपयोग मध्यम बंद महाप्राण। 1x ठंड पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को एक बार धो लें। पीबीएस बंद महाप्राण।
  3. एक रबर पुलिसकर्मी का उपयोग कर प्लेट के नीचे स्थित कोशिकाओं प्लेटों के लिए 1x ठंड पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ें और इकट्ठा। एक लेबल पूर्व ठंडा 2 मिलीलीटर ट्यूब के लिए एक थाली से एकत्र की कोशिकाओं स्थानांतरण। 2 मिलीलीटर ट्यूब में सभी कोशिकाओं को इकट्ठा।
    नोट: प्रत्येक थाली से कोशिकाओं को स्क्रैप के लिए एक थाली के लिए एक ताजा रबर पुलिसकर्मी का प्रयोग करें। प्रत्येक थाली के लिए आप चार 2 मिलीलीटर ट्यूब, एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब और एक जगमगाहट शीशी की आवश्यकता होगी।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 15,000 XG पर स्पिन।
  5. एक पिपेट का उपयोग पीबीएस बाहर ले जाओ एक छोटी स्पिन दे और अवशिष्ट पीबीएस को हटा दें। 1x पीबीएस के 100 μl में Resuspend कोशिकाओं। भंवर कोशिकाओं resuspend और बर्फ पर रखने के लिए।
  6. लो 10 &# 956; एल बर्फ पर एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब और स्टोर करने के लिए चरण 5 और हस्तांतरण से प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए।
    नोट: सेल बफर कोशिकाओं को जोड़ा और बाद में प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए बर्फ पर रखा जाना चाहिए।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के लिए 5,000 XG पर 5 कदम से शेष 90 μl स्पिन; पूरी तरह से एक 200 μl विंदुक टिप का उपयोग पीबीएस को हटा दें।
  8. हीम निकासी बफर के 300 μl जोड़ें प्रत्येक ट्यूब (सामग्री की सूची देखें)। फिर 15 सेकंड के लिए भंवर मिश्रण और 1 मिनट के लिए बर्फ पर रखा, इस 3 बार दोहराने के लिए।
    1. हीम निष्कर्षण बफर (एचईबी) जोड़ें और गोली resuspend करने के लिए जल्दी ट्यूब भंवर, गोली भी लंबे समय के लिए एचईबी में छोड़ा जा रहा है बिना जल्दी resuspended किया जाना चाहिए, क्योंकि एक समय में केवल एक या दो ट्यूबों करते हैं। एचईबी सभी ट्यूबों में जोड़ा जाता है और गोली तो resuspended है एक बार गोली एक के लिए एचईबी बफर में छोड़ दिया जाता है, तो गोली एचईबी में पूरी तरह से नहीं जा सकता है कि चरण 8 नोट के रूप में बर्फ चक्र पर 15 सेकंड के भंवर और 1 मिनट का पालन करें लंबे समय तकसमय और जल्दी से resuspended नहीं।
  9. 30 सेकंड के लिए प्रत्येक ट्यूब और भंवर Diethyl ईथर के 1.2 मिलीलीटर जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 15,000 XG पर स्पिन।
    नोट: Diethyl ईथर जल्दी पिपेट सुझावों के बाहर चलाता है। नीचे एक या दो बार इस, पिपेट Diethyl ईथर ऊपर और नियंत्रित करने के लिए, ऐसा करने से पिपेट में Diethyl ईथर पकड़ में मदद करता है। एक ताजा विंदुक टिप प्रयोग किया जाता है यह हर बार दोहराएँ।
  10. एक नया microcentrifuge ट्यूब 1 मिलीलीटर विंदुक के साथ शीर्ष (आकाश) चरण हस्तांतरण। चरण 9 में के रूप में 2 एन एचसीएल, मिश्रण करने के भंवर और स्पिन के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें।
    नोट: यह आकाश और एचसीएल चरणों के बीच अलगाव को देखने के लिए मुश्किल है। इसलिए, यह एक हल्के नीले रंग देने के लिए, प्रयोग के दौरान काफी इस्तेमाल किया जा करने के लिए 2 एन एचसीएल समाधान में Trypan नीले रंग की छोटी मात्रा में जोड़ें। यह दो चरणों में भेद करने में मदद करेगा। कम चरण नीला हो जाएगा और ऊपरी आकाश चरण बेरंग हो जाएगा। एक नया ट्यूब ऊपरी बेरंग ईथर चरण हस्तांतरण और कम एचसीएल (नीला) चरण त्यागें।
  11. दोहराएँ चरण 10 दोअधिक बार 2 एन एचसीएल के साथ आकाश चरण धोने के लिए। प्रत्येक पुनरावृत्ति के दौरान एक नया ट्यूब केवल शीर्ष ईथर चरण हस्तांतरण और कम एचसीएल चरण त्यागें।
  12. एचसीएल के साथ तीसरे धोने के बाद, एक जगमगाहट शीशी के लिए 1 मिलीलीटर विंदुक के साथ शीर्ष चरण हस्तांतरण। रासायनिक हुड हे / एन में नमूने रखने के द्वारा Diethyl ईथर वाष्पन द्वारा नमूने सूखी।

रेडियोधर्मिता का 3. मापन

  1. अगले दिन, कदम 2.12 से सूखे नमूने के जगमगाहट तरल पदार्थ के 5 मिलीलीटर जोड़ें।
  2. मिश्रण को अच्छी तरह से हिलाएँ। एक जगमगाहट काउंटर का उपयोग करके रेडियोधर्मिता मापने।

4. गणना

  1. CelLytic एम बफर के बराबर राशि का उपयोग कर कदम 2.6 से Lyse कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 14,000 XG पर और स्पिन (सामग्री की सूची देखें)।
  2. सतह पर तैरनेवाला के एक विभाज्य लो और बीसीए प्रोटीन परख किट का उपयोग प्रोटीन एकाग्रता को मापने।
    मिलीग्राम (टीपी) में प्रोटीन की कुल राशि = (90 μl * सान्द्र। प्रोटीन की में81, ग्राम / μl) / 1,000
    हीम संश्लेषण स्तर (रेडियोधर्मिता / टी.पी.) = प्रोटीन की pmol / मिलीग्राम।

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Representative Results

यह विधि कैंसर (HCC4017) फेफड़ों की कोशिकाओं बनाम सामान्य (HBEC30KT) में हीम संश्लेषण के स्तर की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। 2 सामान्य फेफड़ों की कोशिकाओं (HBEC30KT) की तुलना में कैंसर की कोशिकाओं (HCC4017) में हीम संश्लेषण के एक उच्च स्तर से पता चलता है। हीम संश्लेषण का स्तर भी माइटोकॉन्ड्रियल uncoupler कार्बोनिल साइनाइड 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) की उपस्थिति में सामान्य और कैंसर की कोशिकाओं में मापा गया था। प्रकोष्ठों हीम संश्लेषण के स्तर की माप से पहले 24 घंटे के लिए 10 माइक्रोन CCCP के साथ इलाज किया गया। जैसी कि उम्मीद थी, हीम संश्लेषण का स्तर (चित्रा 2) सामान्य और कैंसर की कोशिकाओं को दोनों में CCCP की उपस्थिति में कमी आई है। यह हीम संश्लेषण succinyl एसीटोन (एसए) से हिचकते जा सकता है कि पहले 5-aminolevulinic एसिड dehydratase हीम biosynthetic मार्ग 41 में दूसरा एंजाइम है जो (ALAD) के एक शक्तिशाली और विशिष्ट अवरोध करनेवाला दिखाया गया है। इस विधि का प्रयोग, हीम संश्लेषण का स्तर उपस्थिति और पेट में HELA कोशिकाओं में मापा गया0.5 मिमी एसए। चित्रा 3 खिलाडि़यों से पता चलता है कि दक्षिण अफ्रीका की उपस्थिति में 10 से अधिक सिलवटों की कमी हुई हीम संश्लेषण का स्तर। आगे इस तकनीक के उपयोग के प्रदर्शन करने के लिए, हीम संश्लेषण के स्तर को मापा और चित्रा 4 में दिखाया गया के रूप में 4 कैंसर में और HEK293T सेल लाइनों में तुलना की गई।

चित्र 1
चित्रा 1. मानव में हीम जैवसंश्लेषण मार्ग काश, 5-aminolevulinic एसिड सिन्थेज़। 5-Ala, 5-aminolevulinic एसिड; ALAD, पक्षक dehydratase; पीबीजी, porphobilinogen; HMBS, hydroxymethylbilane सिन्थेज़; HMB, hydroxymethylbilane; Uros, तृतीय सिन्थेज़ uroporphyrinogen; UPgenIII, uroporphyrinogen तृतीय; UROD, decarboxylase uroporphyrinogen; CPgenIII, coproporphyrinogen तृतीय; CPOX, coproporphyrinogen तृतीय ओक्सीडेस; PPgenIX, protoporphyrinogen नौवीं; PPOX, protoporphyrinogen नौवीं ओक्सीडेस; PPIX, नौवीं protoporphyrin; FECH, Ferrochelatase। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. सामान्य (HBEC30KT) में हीम जैवसंश्लेषण का स्तर और कैंसर (HCC4017) सेल अभाव और 10 माइक्रोन माइटोकॉन्ड्रियल uncoupler CCCP की उपस्थिति में, लाइनों। पृष्ठभूमि स्तर खाली नमूना (अकेले जगमगाहट तरल पदार्थ) के स्तर पर भी इसी तरह का था और यह नियंत्रण के कम से कम 2% थी। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
पेट में HELA कोशिकाओं में हीम जैवसंश्लेषण 3. स्तर चित्राखिलाडि़यों और प्रकोष्ठों हीम माप से पहले 3 दिनों के लिए एसए के साथ इलाज किया गया हीम संश्लेषण अवरोध करनेवाला succinyl एसीटोन का 0.5 मिमी (एसए)। की उपस्थिति। पृष्ठभूमि स्तर खाली नमूना (अकेले जगमगाहट तरल पदार्थ) के स्तर पर भी इसी तरह का था और यह। नियंत्रण के कम से कम 2% थी इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
4 कैंसर और HEK293T सेल लाइनों में हीम जैवसंश्लेषण के स्तरों के चित्रा 4. तुलना करें। परख प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन किया था। HCC4017 5% FBS के, 10% FBS के साथ पूरक DMEM में HEK293T और HeLa के साथ पूरक RPMI1640 में ACL4 मीडिया, A549 और H1395 में बड़े हो रहे थे। सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, कैंसर की कोशिकाओं और HEK293T कोशिकाओं में हीम संश्लेषण का स्तर HCC40 में हीम संश्लेषण स्तर की तुलना में थेवेल्च 2-नमूना टी परीक्षण का उपयोग करके 17 कोशिकाओं,। **, पी मूल्य <0,005। पृष्ठभूमि स्तर खाली नमूना (अकेले जगमगाहट तरल पदार्थ) के स्तर पर भी इसी तरह का था और यह। नियंत्रण के कम से कम 2% थी इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हीम श्वसन 26 के माध्यम से सेलुलर ऊर्जा के उत्पादन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। बदल हीम चयापचय कैंसर 28,41 सहित विभिन्न रोगों के साथ जुड़े होने के लिए जाना जाता है। हीम संश्लेषण के निषेध हेला कोशिकाओं 26,41 में सेल चक्र गिरफ्तारी और apoptosis पैदा करने के लिए जाना जाता है। यह उच्च हीम संश्लेषण स्तर फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं को 28 की प्रगति के साथ जुड़ा हुआ है कि दिखाया गया है। इसलिए, यह अलग अलग परिस्थितियों में कोशिकाओं में हीम जैवसंश्लेषण के स्तर को मापने के लिए बहुत महत्व का होगा। इसलिए हीम की कुल राशि यों नहीं करता है यहाँ पर चर्चा की विधि, यह कोशिकाओं में मौजूद हीम के निरपेक्ष मूल्य प्रदान नहीं करता है। कोशिकाओं में हीम की कुल मात्रा को मापने के लिए उपलब्ध वर्णमिति तरीकों और किट की एक किस्म है। उदाहरण के लिए, हीम एसीटोन और एचसीएल का एक मिश्रण में कोशिकाओं और माइटोकांड्रिया से निकाला जा सकता है और 50% (वी / वी) acetonitrile के साथ मिलाया। फिर मिश्रण लागू किया जा सकता400 एनएम 44,45 में 0.05% युक्त acetonitrile (वी / वी) trifluoroacetic एसिड और हीम यौगिकों की पहचान करने के लिए एक ढाल में हीम की क्षालन द्वारा पीछा एक 3.9 x 300 मिमी C18 Bondclone स्तंभ के लिए।

इससे पहले, स्तनधारी ऊतकों और सेल के अर्क [14 सी] -glycine और [14 सी] 5- पक्षक 46,47 इस्तेमाल किया गया में हीम जैवसंश्लेषण के स्तर को मापने के लिए। लेबल वाले ग्लाइसिन पहला कदम पर हीम जैवसंश्लेषण मार्ग में प्रवेश करती है, लेकिन हालांकि यह हीम में अपने सीमित समावेश में जिसके परिणामस्वरूप अन्य चयापचय मार्ग द्वारा बंद सूखा है। ग्लाइसिन हीम जैवसंश्लेषण मार्ग 48 के लिए एक विशिष्ट मेटाबोलाइट नहीं है। दूसरी ओर, 5-Ala हीम जैवसंश्लेषण मार्ग के लिए विशिष्ट है लेबल। यह सुविधा ग्लाइसिन 46,48,49 से अधिक 5-Ala का उपयोग करने का एक मात्रात्मक लाभ प्रदान करता है। इसलिए, रेडियोधर्मी 5-Ala के उपयोग को मापने और हीम जैवसंश्लेषण के स्तर की तुलना करने के लिए एक अधिक विशिष्ट और सटीक तरीका है।

सबसे गअनुरूप परिणाम प्राप्त करने के लिए ritical कदम हैं: 1) यकीन है कि 100% से अधिक और विभिन्न परिस्थितियों के पार नहीं नीचे 70% जाना नहीं है सेल confluency; इस पद्धति बहुत ही संवेदनशील है, क्योंकि 2) प्रति प्लेट जोड़ा रेडियोधर्मिता की मात्रा को समान होना चाहिए; 3) हीम निष्कर्षण बफर पुराना नहीं होना चाहिए, यह ताजा हर बार बनाने के लिए सिफारिश की है। प्लेट प्रति आवश्यक रेडियोधर्मिता की मात्रा बहुत छोटा है और यह नमूने भर में समान मात्रा में बनाए रखने के लिए मुश्किल है। इसलिए, यह सभी नमूनों के लिए एक ही माध्यम का प्रयोग करते हैं, तो संस्कृति के माध्यम में काम कर रहे एक शेयर समाधान बनाने के लिए सिफारिश की है, और पीबीएस (फॉस्फेट बफर खारा) का इस्तेमाल किया जा सकता है। कार्य शेयर समाधान प्लेट प्रति तिरस्कृत मात्रा 10 μl के अंतर्गत है कि इस तरह से तैयार किया जा सकता। इसके अलावा, अधिक सटीक होना, एक शर्त के लिए दोहराने के नमूनों से मध्यम तो ई वापस बांटना, एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में बाहर ले जाया जा सकता है और रेडियोधर्मिता का उचित मात्रा में काम कर रहे शेयर समाधान से जोड़ा जा सकता हैप्लेटों के लिए माध्यम की योग्यता को सीधे मात्रा में। कोशिकाओं की संख्या में इस तरह के प्राथमिक संस्कृतियों में, के रूप में सीमित कर रहे हैं, तो 12 अच्छी तरह से या 24 अच्छी तरह प्लेटें संस्कृति के लिए कोशिकाओं का इस्तेमाल किया है और अच्छी तरह अनुपात में प्रति जोड़ा रेडियोधर्मिता की मात्रा को कम किया जा सकता है।

यह प्रोटोकॉल, सीधा सरल है, और हीम संश्लेषण के स्तर का सटीक उपाय प्रदान करता है। कभी कभी, यह पूरी तरह से हीम निष्कर्षण बफर (2.8 कदम) में सेल गोली resuspend करने के लिए मुश्किल हो सकता है। इस कदम 2.8 में जल्दी हो सकता है से बचने के लिए, एक समय, भंवर में 1-2 नमूने के हीम निष्कर्षण बफर जोड़ने और बर्फ पर डाल दिया। हीम निष्कर्षण बफर बहुत पुराना नहीं है सुनिश्चित करें। दोहराने के नमूनों के बीच मानक विचलन बहुत अधिक है, तो निम्न चरणों के लिए ध्यान देना: पीबीएस पूरी तरह से कदम 2.7 में हटा दिया गया था 1); 2) Diethyl ईथर चरण में कदम 2.9 में टिप का पालन करें जब नमूना spilling से बचने के; 3) रेडियोधर्मिता प्लेट प्रति जोड़ा और दोहराने के नमूनों की confluency ही थे सुनिश्चित करें।

28 के रूप में दिखाया रेडियोधर्मी 5-Ala विधि का प्रयोग एस एस = "jove_content">, हीम संश्लेषण के स्तर की तुलना में थे। यहाँ वर्णित तकनीक [14 सी] 5-Ala, हीम जैवसंश्लेषण मार्ग में एक अग्रदूत (चित्रा 1) के उपयोग की आवश्यकता है, और हीम में शामिल रेडियोधर्मिता के उपाय। इस तकनीक में, हीम सहित porphyrins, एसीटोन का एक मिश्रण में कोशिकाओं से निकाले गए थे, एचसीएल और पानी 50,51 ध्यान केंद्रित किया। हीम आगे Diethyl ईथर में निकालने और 2 एन एचसीएल 50,51 के साथ आकाश चरण धोने से porphyrins से अलग हो गया था। फिर, हीम में शामिल रेडियोधर्मिता एक जगमगाहट काउंटर का उपयोग निर्धारित किया गया था। परिणाम प्रोटीन या सेल नंबर की कुल राशि से सामान्यीकृत किया जा सकता है। HELA कोशिकाओं में हीम संश्लेषण succinyl एसीटोन (एसए) और हीम संश्लेषण के स्तर में कमी का उपयोग करके हिचकते किया गया था दिखाया पूर्व के रूप में मनाया गयाviously 26 (चित्रा 3)।

यह विधि (चित्रा 4) अलग अलग परिस्थितियों में या सेल लाइनों के बीच हीम संश्लेषण के स्तर की तुलना के लिए बहुत उपयोगी है। यह कोशिकाओं की एक छोटी संख्या की आवश्यकता है और विशिष्ट माप और विभिन्न कोशिकाओं में हीम संश्लेषण के स्तर की तुलना प्रदान करता है। यह कोशिकाओं में पूर्ण हीम के स्तर का सही माप के लिए इरादा नहीं है। यह सबसे अच्छा ऐसे विभिन्न कैंसर कोशिकाओं के रूप में विभिन्न गुणों के साथ कोशिकाओं में हीम संश्लेषण के स्तर की तुलना करने के लिए प्रयोग किया जाता है। कोबाल्ट, क्योंकि बजाय लोहे की, विकास मीडिया कोबाल्ट या अन्य धातु आयनों के विभिन्न स्तर होते हैं, तो इस विधि, हीम संश्लेषण की सटीक तुलना उपज नहीं हो सकता है, हीम संश्लेषण के अंतिम चरण में हीम में शामिल किया जा सकता है और 51 निकाला जा। बहरहाल, 5-aminolevulinic एसिड से porphyrins और हीम को हीम सिंथेटिक मार्ग पूरी पी के प्रवाह स्तर को मापने, बहुत विशिष्ट हैathway की परवाह किए बिना धातु आयनों की, हीम के लिए प्रासंगिक चयापचय गतिविधियों की अधिक चिंतनशील होने की संभावना है। इसके विपरीत, 59 फ़े का उपयोग कर विधि हीम 52 के लिए फार्म फ़े शामिल मार्ग का ही हिस्सा पता लगाता है। इस धातु आयनों के महत्वपूर्ण स्तर की उपस्थिति में अधिक विशिष्ट है, पता लगाया हीम संश्लेषण का स्तर इस तरह के कैंसर की कोशिकाओं के रूप में कुछ कोशिकाओं के चयापचय क्षमता को प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है। इसके अलावा, फे हीम बनाने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया के पास अन्य सेलुलर स्थानों में तनहा जा सकता है। कुल मिलाकर, हम [4- 14 सी] 5-Ala का उपयोग अलग-अलग गुण के साथ विभिन्न कोशिकाओं की तुलना करते समय हीम के स्तर को मापने के लिए एक और अधिक व्यावहारिक तरीका है कि विश्वास करते हैं।

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

HCC4017 और HBEC30KT सेल लाइनों कृपया डॉ जॉन मिन्ना प्रयोगशाला द्वारा प्रदान किया गया। इस काम के डॉ ली जांग को सेसिल एच और आईडीए ग्रीन धन के द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Sigma 650501
Diethy ether Sigma 296082
HCl (Hydrochloric acid) Fisher A481-212
Liquid Scintillation cocktail  MP Biomedicals 882470
Trypan blue Gibco 15250
Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid Perkin-Elmer life sciences Store at -80 °C
CelLytic M Sigma C2978 Mammalian cell lysis reagent
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Scientific 23227
Specific reagent Component Dispense
Heme extraction buffer:
Acetone:HCl:Water (25:1.3:5)		 Acetone
Concentrated HCl
Water		 25 ml
1.3 ml
5 ml

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 101 हीम हीम संश्लेषण स्तर स्तनधारी कोशिकाओं [4- कैंसर
स्तनधारी कोशिकाओं में हीम संश्लेषण स्तर की माप
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Hooda, J., Alam, M., Zhang, L.… More

Hooda, J., Alam, M., Zhang, L. Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (101), e51579, doi:10.3791/51579 (2015).

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