Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Измерение уровней Гем синтез в клетках млекопитающих

Published: July 9, 2015 doi: 10.3791/51579
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular and Cell Biology, Center for Systems Biology, University of Texas at Dallas

Abstract

Гем служит простетической группы для широкого спектра белков, известных как гемопротеинов, таких как гемоглобин, миоглобин и цитохромы. Он участвует в различных молекулярных и клеточных процессах, таких как генной транскрипции, трансляции, клеточной дифференцировке и пролиферации клеток. Уровни биосинтеза гема варьироваться в зависимости от различных тканей и типов клеток и изменяется в болезненных состояниях, таких как анемия, невропатии и рака. Эта методика использует [4- 14С] 5-аминолевулиновой кислоты ([14С] 5-АЛК), один из ранних предшественников в пути биосинтеза гема, чтобы измерить уровни синтеза гема в клетках млекопитающих. Этот анализ включает в себя инкубации клеток с [14 C] 5-ALA с последующим экстрагированием гема и измерения радиоактивности, включенного в гема. Эта процедура является точной и быстрой. Этот метод измеряет относительные уровни гем биосинтеза, а не общее содержание гема. Чтобы продемонстрировать использование этого технIQUE уровни биосинтеза гема были измерены в нескольких клеточных линий млекопитающих.

Introduction

Гем, комплекс двухвалентного железа и протопорфирина IX является центральным молекула для транспортировки и использования кислорода практически во всех живых организмах 1-3. Уникальная структура гема позволяет ему функционировать в качестве носителя двухатомных газов и электронов, а также для выполнения других функций 1-5. Например, гем связывается с кислородом гемоглобина и миоглобина для передачи и хранения кислорода 6,7. Она также работает в качестве носителя электронов в цитохромов при дыхании и действует в качестве донора электронов для окислительно-восстановительных реакций, катализируемых ферментов цитохрома P450 8,9. Одним из наиболее важных особенностей является то, что гема, он может играть регуляторную роль в клеточных и молекулярных процессов, таких как транскрипции генов, синтез белка и РНК микро-биогенезе 4. Например, он влияет на транскрипцию многих генов, контролируя активность млекопитающих репрессор транскрипции Bach1 и млекопитающих ядерного RECeptor Rev-erbα 10-15. Гем регулирует активацию гема активатора протеина (НАР) 1, который играет важную роль в активации генов, участвующих в дыхании и контроля окислительного повреждения, в ответ на гема или кислорода 16. Гем также регулирует транскрипцию генов в нервных клетках через фактор роста нервов (ФРН) сигнализации 3,17-20. Он также регулирует синтез белка в эритроидных клетках млекопитающих путем модулирования активности гема регулируется eIF2α киназы (HRI) 21-24. Кроме того, гем влияет на активность ключевых сигнальных белков, таких как тирозин-киназы Jak2 и Src, которые имеют важное значение для нормального функционирования клеток и роста клеток 4,20,25. Было обнаружено, что в клетках HeLa клетки ингибирования гема вызывает остановку клеточного цикла и активацию маркеров, связанных со старением и апоптозом 26. И дефицит Гем или повышенные уровни гема связаны с тяжелыми последствиями для здоровья человека в 27. Последние молекулярнойй эпидемиологические исследования показали положительную ассоциацию высоким потреблением гема и повышенный риск заболеваний, таких как сахарный диабет 2-го типа, ишемической болезни сердца и некоторых форм рака, включая рак легких, колоректальный рак и рак поджелудочной железы 27,28. Используя согласованную пару лаборатории нормальными и раковыми клетками легких авторов показали, что раковые клетки имеют повышенный уровень потребления кислорода, синтеза гема и белков, участвующих в поглощения гема и кислорода утилизации 28. Интересно, что ингибирование синтеза гема уменьшилось потребление кислорода, пролиферацию, миграцию и образование колоний раковых клеток 28. Таким образом, колебание уровней эндогенного гема играет важную роль в регуляции молекулярных и клеточных процессов 3,4,28,29.

У млекопитающих, биосинтез гема происходит в восьми шагов, с участием ферментов, расположенных в митохондриях и цитозоле 4 (рисунок 1). Гем Биосинетезис начинается в матрице митохондрий с конденсацией глицина и сукцинил-КоА с образованием 5-аминолевулиновой кислоты (5-АЛК), катализируемой ALA-синтетазы (увы) 4,31. Это скорость шаг в гем биосинтеза в клетках nonerythroid ограничения. 5-АЛК затем экспортируется в цитозоль, где в ближайшие четыре шага произойти, чтобы сформировать coproporphyrinogen III (CPgenIII), который затем импортировать обратно в митохондрии, где он превращается в протопорфирина IX (PPIX). Наконец, одна молекула железа включена в протопорфирина IX (PPIX) для получения гем, реакции, катализируемой феррохелатазы (FECH) 2,4.

Уровень биосинтеза гема, зависит прежде всего от уровня ALAS фермента, который жестко контролируется внутриклеточного железа гема и 4. Биосинтез гема могут быть затронуты генетических дефектов, наличие определенных витаминов и минералов (например, рибофлавин, цинк), воздействие токсинов (например, алюминия, свинца), Аноксии, лихорадка, и уровни некоторых стероидов (например, эстроген) 32-35. Уровень синтеза гема изменяется в различных болезненных состояниях. Снижение гем биосинтеза может привести к анемии, а также неврологических заболеваний 3,36. Кроме того, увеличилась гема биосинтеза играет важную роль в прогрессировании некоторых видов рака 28,37. Гем было показано, является критическим для роста, дифференцировки и выживания жировой млекопитающих, эритроидных и нервных клеток 4,38-41. Например, дефицит гема приводит к повреждению нейритов в первичной мыши корковых нейронов через ингибирование глутамата NMDA (N-метил-D-аспартат) рецепторов 17. Кроме того, ингибирование синтеза гема вызывает запрограммированную гибель клеток в человеческой эпителиальной карциномы шейки HeLa клетки 26,41. Таким образом, измерение уровней гема биосинтеза в различных клетках при различных условиях является важным для изучения этиологии и progressiна многих заболеваний.

Здесь мы опишем быстрый и чувствительный метод для измерения уровня внутриклеточного синтеза гема с помощью [4- 14 C] 5-aminolevulic кислоты. Это альтернативный метод с другими методами с использованием 55 или 59 Fe Fe. Мы предпочитаем использовать 14 C, потому что его излучение очень слабое. В отличие от этого, сильная защита требуется для работы с Fe изотопов. Кроме того, этот метод предназначен для измерения и сравнения синтез гема в разных клетках параллельно в быстрой манере. Для того чтобы измерить абсолютные уровни гема, можно использовать ранее установленную способ, включающий использование ВЭЖХ 42,43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ВНИМАНИЕ: При работе с радиоактивностью, принять соответствующие меры предосторожности, чтобы избежать загрязнения экспериментатора и окрестностях. Утилизировать все отходы от следующей местными правилами радиационной безопасности.

1. Подготовка клеток

  1. Семенной клеток в 3,5 см пластинах таким образом, что конфлюентности достигает 80% -90% в день анализа.
    1. Следует отметить, что посев слияния для клеток зависит от типа клеток и скорости их роста. При лечении клеток с реагентом в течение определенного количества дней, семена клетки таким образом, что конфлюентности в 80% -90% в день измерения гема. Если количество клеток, полученных из пластин 3,5 см недостаточна, используют 6 см пластины с таким же количеством радиоактивного ALA, как в следующем шаге.
      Примечание: Использование отдельных пластин рекомендуется, потому что это проще в обращении отдельных пластин.
  2. Накануне измерения гема, добавить 0,1-0,3 мкКи [14 C] 5-ALA и холодной ALA, чтобы достичь окончательного грoncentration 20 мкМ общего ALA к каждой культуре блюдо в рабочей области, пригодный для работы с радиоактивными материалами и поставить пластины обратно в инкубатор. В идеале, инкубировать с радиоактивным ALA в течение 16 часов.
    Примечание: с радиоактивной 5-АЛК необходимости может варьироваться от клеточных линий. Радиоактивный значение в минуту (CPM) по меньшей мере 100 требуется, чтобы свести к минимуму ошибку, связанную с подсчетом. Желательно, чтобы определить минимальное количество [14 C] 5-АЛК, необходимое для клеточных линий при исследовании. Для большинства экспериментов 0,1-0,3 мкКи достаточно, чтобы получить хорошее измерение. Добавление холодного ALA является обязательным.

2. Гем Добыча

  1. Поместите культуры клеток блюда на льду и принять их в район, пригодный для работы радиоактивности.
    1. Выполните всю добычу и процесс испарения в взрывозащищенном капотом. Потому что хранится эфир может взорваться, использовать эфир в бутылочках и испарится оставшиеся жидкостей, не храните эфир воткрытая бутылка для более чем одного месяца. Не используйте ацетон вблизи открытого огня и нагревательных как это является легковоспламеняющимся. Магазин ацетон, содержащий реагенты в стеклянных бутылках, как она растворяется культуры ткани пластмасс.
  2. Аспирируйте от среды с использованием пипетки. Вымойте клеток один раз 1 мл PBS 1x холодной. Аспирируйте от PBS.
  3. Добавить 1 мл холодного PBS 1x на пластины и сбора клеток в нижней части пластины с помощью резинового шпателя. Передача собранных клеток из каждой пластины с меченым предварительно охлажденные 2 мл пробирку. Собирают все клетки в 2 мл пробирки.
    Примечание: Используйте свежий резиновый полицейский для каждой пластины для соскабливания клеток из каждой пластины. Для каждой пластины вам потребуется четыре 2 мл пробирки, 1,5 мл трубки и сцинтилляционный флакон.
  4. Спин при 15000 х г в течение 1 мин при 4 ° С.
  5. Выньте PBS с помощью пипетки, дать краткий спина и удаления остатков PBS. Ресуспендируют клеток в 100 мкл 1х PBS. Вихрь ресуспендировать клетки и держать на льду.
  6. Возьмите 10 &# 956; л из стадии 5 и переносят в 1,5 мл микроцентрифужных трубки и хранить на льду для измерения концентрации белка.
    Примечание: Сотовый буфера для лизиса должны быть добавлены к клеткам и выдерживали на льду для измерения концентрации белка позже.
  7. Спин оставшиеся 90 мкл шаг 5 при 5000 х г в течение 30 сек при 4 ° С; удалить PBS полностью используя пипетки 200 мкл.
  8. Добавить 300 мкл буфера для экстракции гема (см список материалов) в каждую пробирку. Затем вихрь в течение 15 сек, чтобы смешать и поставить на льду в течение 1 мин, повторить это 3 раза.
    1. Добавить буфер для экстракции гема (Евр) и вихрь трубку быстро ресуспендируют осадок, сделать только один или два тюбика на время, потому что осадок должен быть быстро ресуспендировали без слева в СЭП слишком долго. После Древнеевр добавляется всех труб и осадок ресуспендировали затем следуйте 15 сек вихрь и 1 мин на цикл льда, как на стадии 8. Обратите внимание, что осадок не может полностью перейти в СЭП, если осадок остается в буфере ВЭП для дольшевремя и не ресуспендировали быстро.
  9. Добавить 1,2 мл диэтилового эфира в каждую пробирку и вихря в течение 30 сек. Спин при 15000 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
    Примечание: диэтиловый эфир заканчивается наконечники пипеток быстро. Для управления этим, пипетки диэтиловый эфир вверх и вниз один или два раза, это помогает держать диэтиловый эфир в пипетку. Повторите это каждый раз свежий пипетки используется.
  10. Перевести верхний (эфир) фазы с 1 мл пипетки на новый микроцентрифужных трубки. Добавить 0,5 мл 2 N HCl, вихря, чтобы смешивать и спина, как в шаге 9.
    Примечание: Это трудно увидеть разделение между эфиром и HCl фаз. Поэтому, добавьте небольшое количество трипанового синего в 2 раствора HCl, чтобы использовать во время эксперимента, достаточно, чтобы дать ему бледно-голубой цвет. Это поможет различать две фазы. Нижняя фаза будет синим, а фаза верхнего эфир будет бесцветным. Передача верхний бесцветный эфирную фазу в новую пробирку и отбросить нижнюю HCl (синий) фазу.
  11. Повторите шаг 10 дванесколько раз, чтобы промыть эфирную фазу с помощью 2N HCl. Передача только верхний эфирную фазу в новую пробирку при каждом повторении и выбросить нижнюю фазу HCl.
  12. После третьей промывки HCl, передавать верхнюю фазу с 1 мл пипетки в сцинтилляционный флакон. Высушите образцы путем испарения диэтилового эфира, сохраняя образцов в химической капот O / N.

3. Измерение радиоактивности

  1. На следующий день, добавить 5 мл сцинтилляционной жидкости для высушенных образцов, начиная с шага 2.12.
  2. Хорошо встряхните, чтобы перемешать. Измерение радиоактивности с помощью сцинтилляционного счетчика.

4. Расчеты

  1. Лизировать клетки, полученные на стадии 2.6, используя равные количества CelLytic М буфера (см Материалы список) и спина при 14000 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.
  2. Возьмем аликвоту супернатанта и измерить концентрацию белка использованием BCA комплект для анализа белка.
    Общее количество белка в мг (TP) = (90 мкл * конц. Белка в81 г / мкл) / 1000
    Уровень синтеза Гем (радиоактивность / TP) = пмоль / мг белка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Этот метод был использован для сравнения уровней синтеза гема в нормальном (HBEC30KT) против раковых (HCC4017) легочных клеток. Рисунок 2 показывает более высокий уровень синтеза гема в раковых клетках (HCC4017), чем нормальные клетки легких (HBEC30KT). Уровень синтеза гема также измеряли в нормальных и раковых клеток в присутствии митохондрий разобщитель карбонилцианид 3-хлорфенилгидразона (СССР). Клетки обрабатывали 10 мкМ CCCP в течение 24 часов перед измерением уровней синтеза гема. Как и ожидалось, уровни синтеза гема (Рисунок 2) уменьшается в присутствии CCCP в нормальных, так и раковых клеток. Было показано, что ранее синтеза гема может быть ингибирован сукцинил ацетона (SA), мощный и специфический ингибитор дегидратазе 5-аминолевулиновой кислоты (ALAD), который является вторым ферментом биосинтеза гема 41. С помощью этого метода, уровни синтеза гема были измерены в HeLa клетками в присутствии и абсENCE 0,5 мм SA. Рисунок 3 показывает, что уровни синтеза гема сократились более чем на 10-складок в присутствии SA. Для дальнейшей демонстрации использования этой техники, уровни синтеза гема были измерены и сравнены в 4 рака и в клеточных линиях HEK293T, как показано на рисунке 4.

Фигура 1
Рисунок 1. гем биосинтеза в организме человека, увы, 5-аминолевулиновой кислоты синтазы. 5-АЛК, 5-аминолевулиновой кислоты; ДАЛК АЛК дегидратазы; PBG, порфобилиногена; HMBS, гидроксиметилбилан синтазы; HMB, гидроксиметилбилан; UROS, uroporphyrinogen III синтазы; UPgenIII, uroporphyrinogen III; УБОД, uroporphyrinogen декарбоксилазы; CPgenIII, coproporphyrinogen III; CPOX, coproporphyrinogen III оксидазы; PPgenIX, протопорфириноген IX; PPOX, протопорфириноген IX оксидазы; PPIX, протопорфирин IX; FECH, Феррохелатазы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Уровни гема биосинтеза в обычном (HBEC30KT) и рак (HCC4017) клеточные линии, в отсутствие и в присутствии 10 мкМ митохондриальной разобщающий CCCP. Фоновый уровень был похож на уровне пустой образца (сцинтилляционный жидкости в одиночку), и это было меньше, чем 2% от контроля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Уровни гема биосинтеза в клетках HeLa в абсENCE и присутствии 0,5 мМ ингибитора синтеза гема сукцинил ацетона (SA). Клетки обрабатывали SA в течение 3 дней перед измерением гема. Фоновый уровень был похож на уровне пустой образца (сцинтилляционный жидкости в одиночку), и это было меньше, чем 2% от контроля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Сравнение уровней биосинтеза гема в 4 рака и HEK293T клеточных линий. Анализ проводили в соответствии с протоколом. HCC4017 выращивали в ACL4 медиа, А549 и H1395 в RPMI1640 с добавлением 5% FBS, HEK293T и HeLa в DMEM с добавлением 10% FBS. Для статистического анализа, уровни синтеза гема в раковых клетках и клетках HEK293T были по сравнению с уровнем синтеза гема в HCC4017 клетки, используя Welch 2-образец Т-тест. ** Значение р <0,005. Фоновый уровень был похож на уровне пустой образца (сцинтилляционный жидкости в одиночку), и это было меньше, чем 2% от контроля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Гем играет ключевую роль в генерации клеточной энергии через дыхание 26. Altered метаболизма гема, как известно, связаны с различными заболеваниями, включая рак 28,41. Ингибирование синтеза гема, как известно, вызывают остановку клеточного цикла и апоптоз клеток HeLa в 26,41. Было показано, что уровень синтеза гема высокой связан с прогрессированием клеток рака легких 28. Таким образом, было бы большое значение для измерения уровней гема биосинтеза в клетках при различных условиях. Способ обсуждаться здесь не количественно общее количество гема, следовательно, она не обеспечивает абсолютную величину гема в клетках. Существуют различные колориметрических методов и комплектов, доступных для измерения общей суммы гема в клетках. Например, гем могут быть извлечены из клеток и митохондрий в смеси ацетона и НСl и смешивают с 50% (об / об) ацетонитрила. Затем смесь может быть примененв 3,9 х 300 мм колонку С18 Bondclone последующим элюированием гема в градиенте ацетонитрила, содержащего 0,05% (об / об) трифторуксусной кислоты и идентификации соединений гема при 400 нм 44,45.

Раньше, чтобы измерить уровни гем биосинтеза в тканях млекопитающих и клеточных экстрактов [14 С] глицина и [14 С] 5- АЛК были использованы 46,47. Хотя помечены глицин входит в путь биосинтеза гема на первом этапе, но сливают другими метаболическими путями, в результате его включения в ограниченном гема. Глицин не конкретных метаболит для биосинтеза гема 48. С другой стороны, помечены 5-АЛК является специфическим для биосинтеза гема. Эта функция дает количественную преимущество, используя 5-ALA через глицина 46,48,49. Таким образом, использование радиоактивного 5-АЛК является более конкретным и точным методом для измерения и сравнения уровней гема биосинтеза.

Самые Critical шаги, чтобы получить достоверные результаты, являются: 1) убедитесь, что ячейки конфлюентности не пойти выше, чем 100% и не ниже 70% всей различных условиях; 2) количество радиоактивности добавляют на пластины должны быть одинаковыми, так как этот способ очень чувствителен; 3) экстракционный буфер гем не должно быть старым, это рекомендуется делать каждый раз свежий. Объем радиоактивности, необходимого на пластине очень мала, и трудно поддерживать одинаковое количество поперек образцов. Поэтому, рекомендуется, чтобы рабочий маточного раствора в культуральной среде, при использовании же среду для всех образцов, то PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор) может быть использован. Работа маточный раствор можно приготовить таким образом, что объем обойтись в пластина до 10 мкл. Кроме того, чтобы быть более точным, среда из одинаковых образцов для одного состояния может быть вынут в 50 мл пробирку и соответствующие количества радиоактивности могут быть добавлены из рабочего раствора, а затем снова выдавать еQual количество средних и пластин. Если количество клеток ограничено, например, в первичных культурах, 12-а и 24-луночные планшеты могут быть использованы для культуры клеток и уменьшить количество радиоактивности на лунку пропорционально.

Этот протокол является простым, простым и обеспечивает точные меры уровней синтеза гема. Иногда это может быть трудно ресуспендируют осадок клеток в буфере для экстракции гема (шаг 2,8), полностью. Чтобы избежать этого быть быстрым на этапе 2.8, добавить гем буфер для экстракции до 1-2 образцов на времени, вихря и положить их на льду. Убедитесь, что экстракционный буфер гем не слишком старый. Если стандартное отклонение среди образцов повторных слишком высокая, обратите внимание на следующие шаги: 1) PBS, был полностью удалены на стадии 2.7; 2) избежать разлива образец, когда в диэтиловый эфир фазе, выполните кончик в шаге 2.9; 3) убедитесь, что радиоактивность добавил в тарелку и конфлюентности из повторных проб были одинаковыми.

28 в нормальном незлокачественной (HBEC) против рака (HCC) клеток, разработанные из того же пациента. Техника, описанная здесь требуется использование [14 C] 5-АЛК, предшественника гема в пути биосинтеза (рис 1), и измеряет радиоактивность, включенную в гем. В этой технике, порфирины, в том числе гема, были извлечены из клеток, в смеси ацетона, концентрированной НСl и водой 50,51. Гем был дополнительно отделен от порфиринов путем извлечения в диэтиловом эфире и промывки эфирную фазу с помощью 2N HCl 50,51. Затем радиоактивность, включенную в гем определяли с помощью сцинтилляционного счетчика. Результаты могут быть нормализованы на общее количество белка или количества клеток. Синтез Гем в HeLa клеток ингибируется с помощью сукцинил ацетона (SA) и снижение уровня синтеза гема наблюдалось предварительно, как показаноviously 26 (Рисунок 3).

Этот метод является очень полезным для сравнения уровней синтеза гема в разных условиях или между клеточными линиями (рис 4). Это требует небольшого количества клеток и обеспечивает определенную измерение и сравнение уровней синтеза гема в разных клетках. Она не предназначена для точного измерения абсолютных уровней гема в клетках. Лучше всего использовать для сравнения уровней синтеза гема в клетках с различными свойствами, такими как различные раковые клетки. Из кобальта, а не из железа, могут быть включены в гем на последней стадии синтеза гема и извлечь 51, этот метод не может дать точное сравнение синтеза гема, если средства роста содержат различные уровни кобальта или других ионов металлов. Тем не менее, гем путь синтеза из 5-аминолевулиновой кислоты, чтобы порфиринов и гема очень специфична, измерения потока уровни всей рathway, вероятно, будет более отражающей метаболических мероприятий, связанных с гема, независимо от ионов металлов. В противоположность этому, метод с использованием 59 Fe обнаруживает только часть пути, включающего Fe, чтобы сформировать гем 52. Хотя это более конкретно, в присутствии значительных количеств ионов металлов, обнаруженные уровни синтеза гема, возможно, не отражают метаболический потенциал определенных клеток, таких как раковые клетки. Кроме того, Fe может быть наложен арест в других клеточных митохондрий местах рядом, чтобы гем. По большому счету, мы считаем, что использование [4- 14 C] 5-АЛК является более практичным способом для измерения уровня гема при сравнении различных клеток с изменяющимися свойствами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Мы не имеем ничего раскрывать.

Acknowledgments

Клеточные линии HCC4017 и HBEC30KT были любезно предоставлены лаборатории доктора Джона Минны. Эта работа была поддержана за счет средств Сесил Х. и Ида Зеленые доктору Ли Чжан.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Sigma 650501
Diethy ether Sigma 296082
HCl (Hydrochloric acid) Fisher A481-212
Liquid Scintillation cocktail  MP Biomedicals 882470
Trypan blue Gibco 15250
Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid Perkin-Elmer life sciences Store at -80 °C
CelLytic M Sigma C2978 Mammalian cell lysis reagent
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Scientific 23227
Specific reagent Component Dispense
Heme extraction buffer:
Acetone:HCl:Water (25:1.3:5)		 Acetone
Concentrated HCl
Water		 25 ml
1.3 ml
5 ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Furuyama, K., Kaneko, K., Vargas, P. D. Heme as a magnificent molecule with multiple missions: heme determines its own fate and governs cellular homeostasis. Tohoku J Exp Med. 213, 1-16 (2007).
  2. Hamza, I., Dailey, H. A. One ring to rule them all: trafficking of heme and heme synthesis intermediates in the metazoans. Biochim Biophys Acta. 1823, 1617-1632 (2012).
  3. Zhu, Y., Hon, T., Ye, W., Zhang, L. Heme deficiency interferes with the Ras-mitogen-activated protein kinase signaling pathway and expression of a subset of neuronal genes. Cell Growth Differ. 13, 431-439 (2002).
  4. Zhang, L. HEME BIOLOGY: The Secret Life of Heme in Regulating Diverse Biological Processes. Singapore: World Scientific Publishing Company. , (2011).
  5. Mense, S. M., Zhang, L. Heme: a versatile signaling molecule controlling the activities of diverse regulators ranging from transcription factors to MAP kinases. Cell Res. 16, 681-692 (2006).
  6. Ingram, D. J., Kendrew, J. C. Orientation of the haem group in myoglobin and its relation to the polypeptide chain direction. Nature. 178, 905-906 (1956).
  7. Perutz, M. F. X-ray analysis of hemoglobin. Science. 140, 863-869 (1963).
  8. Chance, B. The nature of electron transfer and energy coupling reactions. FEBS Lett. 23, 3-20 (1972).
  9. Guengerich, F. P., MacDonald, T. L. Mechanisms of cytochrome P-450 catalysis. Faseb J. 4, 2453-2459 (1990).
  10. Igarashi, K., et al. Multivalent DNA binding complex generated by small Maf and Bach1 as a possible biochemical basis for beta-globin locus control region complex. J Biol Chem. 273, 11783-11790 (1998).
  11. Ogawa, K., et al. Heme mediates derepression of Maf recognition element through direct binding to transcription repressor Bach1. Embo J. 20, 2835-2843 (2001).
  12. Oyake, T., et al. Bach proteins belong to a novel family of BTB-basic leucine zipper transcription factors that interact with MafK and regulate transcription through the NF-E2 site. Mol Cell Biol. 16, 6083-6095 (1996).
  13. Snyder, S. H., Jaffrey, S. R., Zakhary, R. Nitric oxide and carbon monoxide: parallel roles as neural messengers. Brain Res Brain Res Rev. 26, 167-175 (1998).
  14. Sun, J., et al. Hemoprotein Bach1 regulates enhancer availability of heme oxygenase-1 gene. Embo J. 21, 5216-5224 (2002).
  15. Zhang, L., Guarente, L. Heme binds to a short sequence that serves a regulatory function in diverse proteins. Embo J. 14, 313-320 (1995).
  16. Hon, T., Lee, H. C., Hu, Z., Iyer, V. R., Zhang, L. The heme activator protein Hap1 represses transcription by a heme-independent mechanism in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 169, 1343-1352 (2005).
  17. Chernova, T., et al. Neurite degeneration induced by heme deficiency mediated via inhibition of NMDA receptor-dependent extracellular signal-regulated kinase 1/2 activation. J Neurosci. 27, 8475-8485 (2007).
  18. Chernova, T., et al. Early failure of N-methyl-D-aspartate receptors and deficient spine formation induced by reduction of regulatory heme in neurons. Mol Pharmacol. 79, 844-854 (2011).
  19. Sengupta, A., Hon, T., Zhang, L. Heme deficiency suppresses the expression of key neuronal genes and causes neuronal cell death. Brain Res Mol Brain Res. 137, 23-30 (2005).
  20. Smith, A. G., Raven, E. L., Chernova, T. The regulatory role of heme in neurons. Metallomics. 3, 955-962 (2011).
  21. Raghuram, S., et al. Identification of heme as the ligand for the orphan nuclear receptors REV-ERBalpha and REV-ERBbeta. Nat Struct Mol Biol. 14, 1207-1213 (2007).
  22. Wu, N., Yin, L., Hanniman, E. A., Joshi, S., Lazar, M. A. Negative feedback maintenance of heme homeostasis by its receptor Rev-erbalpha. Genes Dev. 23, 2201-2209 (2009).
  23. Yin, L., et al. Rev-erbalpha, a heme sensor that coordinates metabolic and circadian pathways. Science. 318, 1786-1789 (2007).
  24. Zhu, Y., Hon, T., Zhang, L. Heme initiates changes in the expression of a wide array of genes during the early erythroid differentiation stage. Biochemical and biophysical research communications. 258, 87-93 (1999).
  25. Yao, X., Balamurugan, P., Arvey, A., Leslie, C., Zhang, L. Heme controls the regulation of protein tyrosine kinases Jak2 and Src. Biochemical and biophysical research communications. 402, 30-35 (2010).
  26. Ye, W., Zhang, L. Heme controls the expression of cell cycle regulators and cell growth in HeLa cells. Biochem and biophys res comm. 315, 546-554 (2004).
  27. Hooda, J., Shah, A., Zhang, L. Heme, an essential nutrient from dietary proteins, critically impacts diverse physiological and pathological processes. Nutrients. 6, 1080-1102 (2014).
  28. Hooda, J., et al. Enhanced heme function and mitochondrial respiration promote the progression of lung cancer cells. PloS one. 8, e63402 (2013).
  29. Atamna, H., Walter, P. B., Ames, B. N. The role of heme and iron-sulfur clusters in mitochondrial biogenesis, maintenance, and decay with age. Arch Biochem Biophys. 397, 345-353 (2002).
  30. Atamna, H., Killilea, D. W., Killilea, A. N., Ames, B. N. Heme deficiency may be a factor in the mitochondrial and neuronal decay of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14807-14812 (2002).
  31. Ponka, P. Cell biology of heme. Am J Med Sci. 318, 241-256 (1999).
  32. Brawer, J. R., Naftolin, F., Martin, J., Sonnenschein, C. Effects of a single injection of estradiol valerate on the hypothalamic arcuate nucleus and on reproductive function in the female rat. Endocrinol. 103, 501-512 (1978).
  33. Daniell, W. E., et al. Environmental chemical exposures and disturbances of heme synthesis. Environ Health Perspect. 105, Suppl 1. 37-53 (1997).
  34. Kihara, T., et al. Hepatic heme metabolism in rats with fever induced by interleukin 1beta. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 104, 115-126 (1999).
  35. Vijayasarathy, C., Damle, S., Prabu, S. K., Otto, C. M., Avadhani, N. G. Adaptive changes in the expression of nuclear and mitochondrial encoded subunits of cytochrome c oxidase and the catalytic activity during hypoxia. Eur J Biochem. 270, 871-879 (2003).
  36. Anderson, K. E. S. S., Bishop, D. F., Desnick, R. J. Disorders of heme biosynthesis: X-linked sideroblastic anemia and the porphyrias. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. , The McGraw-Hill Companies, Inc. New York. 1-53 (2009).
  37. Salvo, M. L., Contestabile, R., Paiardini, A., Maras, B. Glycine consumption and mitochondrial serine hydroxymethyltransferase in cancer cells: the heme connection. Med Hypotheses. 80, 633-636 (2013).
  38. Ishii, D. N., Maniatis, G. M. Haemin promotes rapid neurite outgrowth in cultured mouse neuroblastoma cells. Nature. 274, 372-374 (1978).
  39. Padmanaban, G., Venkateswar, V., Rangarajan, P. N. Haem as a multifunctional regulator. Trends Biochem Sci. 14, 492-496 (1989).
  40. Rutherford, T. R., Clegg, J. B., Weatherall, D. J. K562 human leukaemic cells synthesise embryonic haemoglobin in response to haemin. Nature. 280, 164-165 (1979).
  41. Ye, W., Zhang, L. Heme deficiency causes apoptosis but does not increase ROS generation in HeLa cells. Biochemical and biophysical research communications. 319, 1065-1071 (2004).
  42. Bonkovsky, H. L., et al. High-performance liquid chromatographic separation and quantitation of tetrapyrroles from biological materials. Anal Biochem. 155, 56-64 (1986).
  43. Sinclair, P. R., Gorman, N., Jacobs, J. M. Measurement of heme concentration. Curr Protoc Toxicol. 8, Unit 8.3 (2001).
  44. Barros, M. H., Carlson, C. G., Glerum, D. M., Tzagoloff, A. Involvement of mitochondrial ferredoxin and Cox15p in hydroxylation of heme O. FEBS Lett. 492, 133-138 (2001).
  45. Shinjyo, N., Kita, K. Up-regulation of heme biosynthesis during differentiation of Neuro2a cells. J Biochem. 139, 373-381 (2006).
  46. Israels, L. G., Yoda, B., Schacter, B. A. Heme binding and its possible significance in heme movement and availability in the cell. Ann N Y Acad Sci. 244, 651-661 (1975).
  47. Yannoni, C. Z., Robinson, S. H. Early-labelled haem in erythroid and hepatic cells. Nature. 258, 330-331 (1975).
  48. Robinson, S. H. Formation of bilirubin from erythroid and nonerythroid sources. Semin Hematol. 9, 43-53 (1972).
  49. Granick, S., Granick, D. Nucleolar necklaces in chick embryo myoblasts formed by lack of arginine. J Cell Biol. 51, 636-642 (1971).
  50. Morell, D. B., Barrett, J., Clezy, P. S. The prosthetic group of cytochrome oxidase. 1. Purification as porphyrin alpha and conversion into haemin alpha. Biochem J. 78, 793-797 (1961).
  51. Sinclair, P., Gibbs, A. H., Sinclair, J. F., de Matteis, F. Formation of cobalt protoporphyrin in the liver of rats. A mechanism for the inhibition of liver haem biosynthesis by inorganic cobalt. Biochem J. 178, 529-538 (1979).
  52. Chung, J., Haile, D. J., Wessling-Resnick, M. Copper-induced ferroportin-1 expression in J774 macrophages is associated with increased iron efflux. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 2700-2705 (2004).

Tags

Молекулярная биология выпуск 101 Гем уровень синтеза гема клетки млекопитающих [4- рак
Измерение уровней Гем синтез в клетках млекопитающих
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hooda, J., Alam, M., Zhang, L.… More

Hooda, J., Alam, M., Zhang, L. Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (101), e51579, doi:10.3791/51579 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter