Abstract
Heme tjänar som prostetisk grupp för ett stort antal olika proteiner som kallas hemoproteiner, såsom hemoglobin, myoglobin och cytokrom. Den är involverad i olika molekylära och cellulära processer såsom gen transkription, translation, celldifferentiering och cellproliferation. Biosyntesen nivåer hem varierar mellan olika vävnader och celltyper och förändras i sjukdomstillstånd såsom anemi, neuropati och cancer. Denna teknik använder [4- 14 C] 5-aminolevulinsyra ([14 C] 5-ALA), en av de tidiga prekursorer i heme biosyntesvägen för att mäta nivåerna av hemsyntesen i däggdjursceller. Denna analys innefattar inkubering av celler med [14 C] 5-ALA, följt av extraktion av hem och mätning av radioaktiviteten inkorporeras i heme. Detta förfarande är korrekt och snabb. Denna metod mäter de relativa nivåerna av hembiosyntes snarare än den totala hem innehållet. För att demonstrera användningen av denna TechnIQUE nivåerna av hembiosyntes mättes i flera däggdjurscellinjer.
Introduction
Heme, är ett komplex av ferrojärn och protoporfyrin IX en central molekyl för att transportera och utnyttja syre i så gott som alla levande organismer 1-3. Den unika strukturen av hem gör att den kan fungera som en bärare av diatomic gaser och elektroner, liksom att utföra olika andra funktioner 1-5. Till exempel, binder hem till syre i hemoglobin och myoglobin för överföring och lagring av syre 6,7. Den fungerar också som en elektronbärare i cytokrom under andning och fungerar som en elektrondonator för redoxreaktioner katalyserade av cytokrom P450-enzymer 8,9. En av de viktigaste funktionerna i hem är att det kan spela regulatoriska roller i cellulära och molekylära processer såsom gentranskription, proteinsyntes och mikro RNA biogenes 4. Till exempel, det påverkar transkriptionen av många gener genom att styra aktiviteten hos däggdjurs transkriptionsrepressor Bach1 och däggdjurs nukleära receptor Rev-erbα 10-15. Heme reglerar aktiveringen av heme aktivatorprotein (Hap) en som spelar en viktig roll i aktiveringen av gener involverade i andning och styrning av oxidativ skada, som svar på heme eller syre 16. Heme reglerar också gentranskription i nervceller via nervtillväxtfaktor (NGF) signalering 3,17-20. Det reglerar också proteinsyntes i däggdjurs erytroidceller genom att modulera aktiviteten hos heme-reglerade eIF2α kinas (HRI) 21-24. Dessutom påverkar hem aktiviteten av viktiga signalproteiner såsom tyrosinkinas JAK2 och Src, som är nödvändiga för korrekt cell fungerar och celltillväxt 4,20,25. Det visade sig att i HeLa-celler heme hämning orsakar cellcykelstopp och aktivering av markörer associerade med senescens och apoptos 26. Både Heme brist eller ökade nivåer av hem är förknippade med allvarliga hälsoeffekter hos människor 27. Senaste molekyl ennd epidemiologiska studier har visat ett positivt samband med hög hem intag och ökad risk för sjukdomar, såsom typ-2-diabetes, hjärt-kärlsjukdomar och flera cancerformer, inklusive lungcancer, tjock- och ändtarmscancer och pankreascancer 27,28. Med hjälp av ett matchat par av normala och cancerlungceller författarnas laboratorium har funnit att cancerceller har ökade nivåer av syreförbrukning, hemsyntesen och proteiner involverade i hem upptag och syre utnyttjande 28. Intressant, minskade hämningar av hemsyntesen syreförbrukning, spridning, migration och kolonibildning av cancerceller 28. Således variationer i nivåerna av endogen hem spelar en viktig roll i regleringen av molekylära och cellulära processer 3,4,28,29.
I däggdjur sker biosyntesen av heme i åtta steg, som involverar enzymer lokaliserade i mitokondrierna och cytosolen 4 (fig 1). Heme Biosynavhandlingen börjar i matrisen av mitokondrier med kondensering av glycin och succinyl-CoA för att bilda 5-aminolevulinsyra (5-ALA), katalyserad av ALA-syntas (ALAS) 4,31. Detta är det hastighetsbegränsande steget i hembiosyntes i nonerythroid celler. 5-ALA sedan exporteras ut till cytosolen där de nästa fyra steg inträffa för att bilda coproporphyrinogen III (CPgenIII), som sedan importeras tillbaka till mitokondrierna, där den omvandlas till protoporfyrin IX (PPIX). Slutligen är en molekyl av järn införlivas till protoporfyrin IX (PPIX) för framställning av heme, en reaktion som katalyseras av ferrokelatas (FECH) 2,4.
Nivån på hembiosyntes beror främst på graden av ALAS enzym som tätt styres av intracellulärt järn och heme 4. Biosyntesen av hem kan påverkas av genetiska defekter, tillgänglighet av vissa mineraler och vitaminer (t.ex., riboflavin, zink), exponering för toxiner (t.ex. aluminium, bly), Anoxi, feber, och nivåerna av vissa steroider (t.ex. östrogen) 32-35. Nivån på hemsyntesen förändras hos olika sjukdomstillstånd. Minskad biosyntesen hem kan orsaka blodbrist samt neurologiska sjukdomar 3,36. Alternativt spelar ökad biosyntes hem en viktig roll i utvecklingen av vissa cancerformer 28,37. Heme har visat sig vara avgörande för tillväxten, differentieringen och överlevnaden av däggdjur fettvävnad, erytroida och nervceller 4,38-41. Exempelvis leder heme-brist till neurite skada i primära mus kortikala neuroner via inhibition av glutamat NMDA (N-metyl-D-aspartat) -receptor 17. Dessutom, hämning av hemsyntesen orsakar programmerad celldöd i människans epitel cervix carcinoma HeLa-celler 26,41. Därför är det viktigt för att studera etiologi och progressi mäta hembiosyntes nivåer i olika celler under olika betingelserpå många sjukdomar.
Här beskriver vi en snabb och känslig metod för att mäta nivån av intracellulär hemsyntesen genom användning av [4- 14 C] 5-aminolevulic syra. Detta är en alternativ metod för att andra metoder som använder 55 Fe eller 59 Fe. Vi föredrar att använda 14 C, eftersom dess strålning är mycket svag. Däremot krävs ett starkt skydd för att arbeta med Fe isotoper. Dessutom är denna metod till syfte att mäta och jämföra hemsyntesen i olika celler parallellt på ett snabbt sätt. För att mäta absoluta heme nivåer, kan man använda den tidigare etablerad metod som omfattar användning av HPLC 42,43.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
VARNING: När du arbetar med radioaktivitet, vidta lämpliga åtgärder för att undvika kontaminering av försöksledaren och omgivningen. Släng bort allt avfall efter lokala strålskydds riktlinjer.
1. Framställning av celler
- Seed-celler i 3,5 cm plattor så att konfluens når 80% -90% på dagen för analysen.
- Notera att ympning konfluens för celler beror på celltyp och deras tillväxthastighet. Vid behandling av celler med ett reagens för ett visst antal dagar, utsäde celler så att konfluens är 80% -90% på dagen för heme mätning. Om antalet celler erhölls från 3,5 cm plattor är otillräcklig, använd 6 cm plattor med samma mängd radioaktivt ALA såsom i nästa steg.
Obs: Användning av individuella plattor rekommenderas eftersom det är lättare att hantera individuella plattor.
- Notera att ympning konfluens för celler beror på celltyp och deras tillväxthastighet. Vid behandling av celler med ett reagens för ett visst antal dagar, utsäde celler så att konfluens är 80% -90% på dagen för heme mätning. Om antalet celler erhölls från 3,5 cm plattor är otillräcklig, använd 6 cm plattor med samma mängd radioaktivt ALA såsom i nästa steg.
- En dag före hem mätning, tillsätt 0,1-0,3 iCi [14 C] 5-ALA och kallt ALA att nå en slutlig concentration av 20 pM av den totala ALA till varje odlingsskål i ett arbetsområde passform för att arbeta med radioaktivt material och sätta plattorna tillbaka i inkubatorn. Helst inkubera med radioaktivt ALA under 16 timmar.
Obs: Radioaktivt märkt 5-ALA krävs kan variera mellan cellinjer. En radioaktiv talet per minut (cpm) av minst 100 krävs för att minimera felet i samband med att räkna. Det är lämpligt att fastställa ett minimibelopp av [14 C] 5-ALA krävs för cellinjer som studeras. För de flesta försöken 0,1-0,3 xCi är tillräckligt för att få ett bra mått. Tillsats av kall ALA är valfri.
2. Heme Extraktion
- Placera cellodlingsskålar på is och ta dem till området passar för radioaktivitet arbete.
- Utför hela extraktion och indunstning processen i en explosionssäker huva. Eftersom den lagrade eter kan explodera, använda etern i små flaskor och avdunsta eventuella kvarvarande vätska, inte lagra eteren öppen flaska i mer än en månad. Använd inte aceton nära öppen eld och värmare eftersom det är mycket brandfarligt. Butiks aceton innehållande reagens i glasflaskor som det löser vävnadsodlings plast.
- Sug bort mediet med användning av en pipett. Tvätta cellerna en gång med 1 ml 1x kall PBS. Sug bort PBS.
- Tillsätt 1 ml 1x kall PBS till plattorna och samla upp cellerna på botten av plattan med användning av en gummiskrapa. Överför de uppsamlade cellerna från varje platta till en märkt i förväg kyld 2 ml rör. Samla alla celler i 2 ml rör.
Obs: Använd en ny gummiskrapa för varje platta för att skrapa celler från varje platta. För varje platta du skulle kräva fyra 2 ml rör, ett 1,5 ml rör och en scintillationsflaska. - Snurra vid 15.000 xg under 1 min vid 4 ° C.
- Ta ut PBS med hjälp av en pipett, ge en kort centrifugering och ta bort kvarvarande PBS. Resuspendera cellerna i 100 ^ il 1 x PBS. Vortex att resuspendera cellerna och hålla på is.
- Ta 10 &# 956; l från steg 5 och överföring till en 1,5 ml mikrocentrifugrör och förvara på is för att mäta proteinkoncentration.
Obs: Cell lysbuffert bör läggas till cellerna och hölls på is för att mäta proteinkoncentration senare. - Snurra de återstående 90 ^ il från steg 5 vid 5000 xg under 30 sek vid 4 ° C; ta bort PBS helt med en 200 mikroliter pipettspets.
- Tillsätt 300 pl hem extraktionsbuffert (se Material List) till varje rör. Då virvel under 15 sekunder för att blanda och sätta på is under 1 minut, upprepa detta 3 gånger.
- Lägg till hem extraktionsbuffert (HEB) och skaka röret snabbt att suspendera pelleten, gör bara en eller två rör vid en tid eftersom pellets bör suspenderas snabbt utan att hamna i HEB för länge. När HEB tillkommer på alla rören och återsuspenderas sedan följa 15 sek vortex och 1 min på is cykel som i steg 8. Observera att pellets inte kan gå helt i HEB om pelleten kvar i HEB buffert för en längretid och inte suspenderades snabbt.
- Lägg 1,2 ml dietyleter till varje rör och vortexblanda i 30 sek. Snurra vid 15.000 xg under 5 min vid 4 ° C.
Anmärkning: Dietyleter får slut på pipettspetsar snabbt. För att kontrollera detta, pipett dietyleter upp och ned en eller två gånger, att göra så hjälper till att hålla dietyleter i pipetten. Upprepa detta varje gång en ny pipettspets används. - Överför topp (eter) fas med 1 ml pipett till en ny mikrocentrifugrör. Lägg 0,5 ml 2 N HCl, virvel för att blanda och snurra som i steg 9.
Obs: Det är svårt att se separationen mellan eter och HCl faser. Därför, tillsätta små mängder av trypanblått i 2 N HCl-lösning för att användas under försöket, tillräckligt för att ge det en blek blå färg. Detta kommer att hjälpa särskilja de två faserna. Den undre fasen kommer att vara blå och den övre eterfasen blir färglös. Överför den övre färglösa eterfasen till ett nytt rör och kassera lägre HCI (blå) fasen. - Upprepa steg 10 tvåflera gånger för att tvätta eterfasen med 2 N HCl. Ta bara den övre eterfasen till ett nytt rör under varje repetition och kassera den undre HCI fasen.
- Efter den tredje tvättningen med HCl, överföra den övre fasen med en ml pipett till en scintillationsflaska. Torka proven genom att indunsta dietyleter genom att hålla proven i den kemiska huven O / N.
3. Mätning av radioaktivitet
- Nästa dag, tillsätt 5 ml scintillationsvätska till de torkade proverna från steg 2,12.
- Skaka väl för att blanda. Mät radioaktivitet genom användning av en scintillationsräknare.
4. Beräkningar
- Lyserar cellerna från steg 2,6 med användning av lika mängder av CelLytic M buffert (se Material listan) och snurra vid 14.000 xg under 5 min vid 4 ° C.
- Tag en alikvot av supernatanten och mäta proteinkoncentration med användning av BCA-proteinanalyssats.
Totala mängden protein i mg (TP) = (90 | j, l * konc. Av protein i81, g / l) / 1000
Hemsyntesen nivå (radioaktivitet / TP) = pmol / mg protein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna metod användes för att jämföra nivåerna av hemsyntesen i normalt (HBEC30KT) vs cancer (HCC4017) lungceller. Figur 2 visar en högre nivå av hemsyntesen i cancerceller (HCC4017) än normala lungceller (HBEC30KT). Nivån på hemsyntesen mättes också i normala celler och cancerceller i närvaro av mitokondriell kopplare karbonyl cyanid 3-chlorophenylhydrazone (CCCP). Celler behandlades med 10 pM CCCP för 24 h före mätningen av heme syntesnivåer. Som väntat halterna av hemsyntesen (Figur 2) minskade i närvaro av CCCP i både normala och cancerceller. Det har tidigare visats att hemsyntesen kan inhiberas genom succinyl aceton (SA), en potent och specifik inhibitor av 5-aminolevulinsyra (ALAD), som är det andra enzymet i heme-biosyntesvägen 41. Med användning av denna metod var de hemsyntesen nivåer mätt i HeLa-celler i närvaro och abshet av 0,5 mM SA. Figur 3 visar att nivåerna av hemsyntesen minskade med mer än 10-veck i närvaro av SA. För att ytterligare demonstrera användningen av denna teknik, var nivåerna av hemsyntesen mäts och jämförs i 4 cancer och i HEK293T cellinjer såsom visas i fig 4.
Figur 1. heme biosyntesvägen hos människa ALAS, 5-aminolevulinsyra-syntas.; 5-ALA, 5-aminolevulinsyra; ALAD, dehydratas ALA; PBG, porfobilinogen; HMBS, hydroxymethylbilane syntas; HMB, hydroxymethylbilane; UROS, uroporphyrinogen III syntas; UPgenIII, uroporphyrinogen III; UROD, uroporfyrinogendekarboxylas; CPgenIII, coproporphyrinogen III; CPOX, coproporphyrinogen III oxidas; PPgenIX, protoporfyrinogen IX; PPOX, protoporfyrinogen IX oxidas; PPIX, protoporfyrin IX; FECH, Ferrokelatas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Halterna av hembiosyntes i normal (HBEC30KT) och cancer (HCC4017) cellinjer, i frånvaro och närvaro av 10 | iM mitokondriell frikopplare CCCP. Bakgrundsnivån var liknande nivå av blankprov (ensam scintillationsvätska) och det var mindre än 2% av kontrollen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Halter av hembiosyntes i HeLa-celler i abshet och närvaro av 0,5 mM hemsyntesen hämmare succinyl aceton (SA). Cellerna behandlades med SA för tre dagar innan heme mätning. Bakgrundsnivån liknade nivån av blankprov (ensam scintillationsvätska) och det var mindre än 2% av kontrollen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Jämförelse av halterna av hembiosyntes i 4 cancer och HEK293T cellinjer. Analys utfördes enligt protokollet. HCC4017 odlades i ACL4 medier, A549 och H1395 i RPMI1640 supplementerat med 5% FBS, HEK293T och HeLa i DMEM kompletterat med 10% FBS. För statistisk analys, ades hemsyntesen nivåer i cancerceller och HEK293T celler jämfört med hemsyntesen nivån i HCC4017-celler, genom att använda Welch 2-prov t-test. **, P-värde <0,005. Bakgrundsnivån liknade nivån av blankprov (ensam scintillationsvätska) och det var mindre än 2% av kontrollen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Heme spelar en nyckelroll i uppkomsten av cell energi via andning 26. Förändrad hem ämnesomsättning är känd för att vara förknippade med olika sjukdomar, bland annat cancer 28,41. Inhibering av hemsyntesen är känt för att orsaka cellcykelstopp och apoptos i Hela-celler 26,41. Det har visats att hög hemsyntesen nivå är förknippad med utvecklingen av lungcancerceller 28. Därför skulle det vara av stor betydelse för att mäta nivåerna av hembiosyntes i celler under olika betingelser. Förfarandet diskuteras här inte kvantifierar den totala mängden av hem därför ger den inte det absoluta värdet av hem föreligger i cellerna. Det finns en mängd olika kolorimetriska metoder och kit som finns för att mäta de totala beloppen för hem i cellerna. Exempelvis kan heme extraheras från celler och mitokondrier i en blandning av aceton och HCl och blandades med 50% (volym / volym) acetonitril. Då kan tillämpas blandningentill en 3,9 x 300 mm C18 Bondclone kolonn följt av eluering av hem i en gradient av acetonitril innehållande 0,05% (volym / volym) trifluoroättiksyra och identifiera heme föreningar vid 400 nm 44,45.
Tidigare att mäta nivåerna av hembiosyntes i däggdjursvävnader och cellextrakt [14 C] -glycin och [14 C] 5- ALA användes 46,47. Även märkt glycin in i hembiosyntes vägen vid det första steget, men det är rinna före andra metabola vägar som leder till dess begränsade inkorporering i hem. Glycin är inte en specifik metabolit för hembiosyntes väg 48. Å andra sidan, märkt 5-ALA är specifik för heme biosyntesvägen. Den här funktionen ger en kvantitativ fördel med att använda 5-ALA över glycin 46,48,49. Därför är användningen av radioaktivt 5-ALA en mer specifik och exakt metod för att mäta och jämföra nivåerna av hembiosyntes.
De flesta critical åtgärder för att få konsekventa resultat är: 1) Se till att cellen confluency inte gå högre än 100% och inte understiger 70% över olika förhållanden; 2) mängden radioaktivitet sätts per platta bör vara identiska, eftersom denna metod är mycket känslig; 3) hem extraktionsbuffert bör inte vara gammal, är det rekommenderat att göra färsk varje gång. Volymen av radioaktivitet som krävs per platta är mycket liten och det är svårt att bibehålla de identiska mängder över proverna. Därför rekommenderas det att göra en arbetsstamlösning i odlingsmediet, om användning av samma medium för alla prover, kan användas annanstans PBS (fosfatbuffrad saltlösning). Arbetsstamlösning kan framställas på ett sådant sätt att volymen fördelas per platta är under 10 l. Dessutom, för att vara mer exakt, kan mediet från replikatprover för ett villkor tas ut i en 50 ml rör och lämpliga mängder radioaktivitet kan tillsättas från arbetsstamlösning, sedan fördela tillbaka eQual mängder medium till plattorna. Om antalet celler är begränsade, såsom i primära kulturer, kan 12-brunnars eller 24-brunnars plattor används för att odla cellerna och minska mängden radioaktivitet per brunn proportionellt.
Detta protokoll är enkel, enkel, och ger noggranna mått på halterna av hemsyntesen. Ibland kan det vara svårt att återsuspendera cellpelleten i heme extraktionsbuffert (steg 2,8) helt. För att undvika detta vara snabb i steg 2,8, tillsätt hem extraktionsbuffert till 1-2 prover åt gången, virvel och lägg dem på is. Se till heme extraktionsbuffert inte är för gammal. Om standardavvikelsen mellan de replikatprover är för hög, uppmärksamma följande steg: 1) PBS togs bort helt i steg 2,7; 2) undvika att spilla prov när i dietyleter fas följer spetsen i steg 2,9; 3) se till att radioaktiviteten tillsattes per platta och confluency av replikatprover var desamma.
28 i normal icke-malign (HBEC) vs cancer (HCC) celler, som utvecklats från samma patient. Den teknik som beskrivs här kräver användning av [14 C] 5-ALA, en föregångare i heme biosyntesvägen (fig 1), och mäter radioaktiviteten inkorporeras i heme. I denna teknik, porfyriner, inklusive hem, extraherades från cellerna i en blandning av aceton, koncentrerad HCl och vatten 50,51. Heme separerades ytterligare från porfyriner genom extrahering i dietyleter och tvättning av eterfasen med 2 N HCl 50,51. Sedan tillsattes radioaktiviteten inkorporeras i heme bestämdes med användning av en scintillationsräknare. Resultat kan normaliseras med den totala mängden protein eller cellantalet. Hemsyntesen i HeLa-celler inhiberades genom användning av succinyl aceton (SA) och en minskning i nivån av hemsyntesen observerades såsom visas pregare 26 (fig 3).
Denna metod är mycket användbar för jämförelse av nivåerna av hemsyntesen under olika förhållanden eller mellan cellinjer (figur 4). Det kräver ett litet antal celler och åstadkommer specifik mätning och jämförelse av nivåerna av hemsyntesen i olika celler. Den är inte avsedd för noggrann mätning av absoluta heme nivåer i cellerna. Det är bäst används för att jämföra nivåerna av hemsyntesen i celler med olika egenskaper, såsom olika cancerceller. Eftersom kobolt i stället för järn, kan införlivas i heme i det sista steget av heme-syntesen och extraheras 51, denna metod kan inte ge noggrann jämförelse av hemsyntesen, om tillväxtmedier innehåller olika nivåer av kobolt eller andra metalljoner. Icke desto mindre är heme syntesvägen från 5-aminolevulinsyra till porfyriner och heme mycket specifik, mäta flödesnivåerna hela pathway kommer sannolikt att vara mer reflekterande av metaboliska aktiviteter som är relevanta för hem, oberoende av metalljoner. I motsats, den metod som använder 59 Fe detekterar endast den del av vägen som innefattar Fe bildar hem 52. Även om detta är mer specifik, i närvaro av betydande nivåer av metalljoner, kan de detekterade hemsyntesen nivåer inte speglar den metaboliska potentialen hos vissa celler, såsom cancerceller. Dessutom kan Fe sekvestreras i andra cellulära platser bredvid mitokondrier att göra hem. På det hela taget tror vi att användningen av [4- 14 C] 5-ALA är en mer praktisk metod för att mäta heme nivåer när man jämför olika celler med olika egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
De HCC4017 och HBEC30KT cellinjer tillhandahölls vänligen av Dr John Minna labb. Detta arbete stöddes av Cecil H. och Ida Gröna medel till Li Zhang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma | 650501 | |
| Diethy ether | Sigma | 296082 | |
| HCl (Hydrochloric acid) | Fisher | A481-212 | |
| Liquid Scintillation cocktail | MP Biomedicals | 882470 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250 | |
| Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid | Perkin-Elmer life sciences | Store at -80 °C | |
| CelLytic M | Sigma | C2978 | Mammalian cell lysis reagent |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Specific reagent | Component | Dispense | |
| Heme extraction buffer: Acetone:HCl:Water (25:1.3:5) |
Acetone Concentrated HCl Water |
25 ml 1.3 ml 5 ml |
References
- Furuyama, K., Kaneko, K., Vargas, P. D. Heme as a magnificent molecule with multiple missions: heme determines its own fate and governs cellular homeostasis. Tohoku J Exp Med. 213, 1-16 (2007).
- Hamza, I., Dailey, H. A. One ring to rule them all: trafficking of heme and heme synthesis intermediates in the metazoans. Biochim Biophys Acta. 1823, 1617-1632 (2012).
- Zhu, Y., Hon, T., Ye, W., Zhang, L. Heme deficiency interferes with the Ras-mitogen-activated protein kinase signaling pathway and expression of a subset of neuronal genes. Cell Growth Differ. 13, 431-439 (2002).
- Zhang, L. HEME BIOLOGY: The Secret Life of Heme in Regulating Diverse Biological Processes. Singapore: World Scientific Publishing Company. , (2011).
- Mense, S. M., Zhang, L. Heme: a versatile signaling molecule controlling the activities of diverse regulators ranging from transcription factors to MAP kinases. Cell Res. 16, 681-692 (2006).
- Ingram, D. J., Kendrew, J. C. Orientation of the haem group in myoglobin and its relation to the polypeptide chain direction. Nature. 178, 905-906 (1956).
- Perutz, M. F. X-ray analysis of hemoglobin. Science. 140, 863-869 (1963).
- Chance, B. The nature of electron transfer and energy coupling reactions. FEBS Lett. 23, 3-20 (1972).
- Guengerich, F. P., MacDonald, T. L. Mechanisms of cytochrome P-450 catalysis. Faseb J. 4, 2453-2459 (1990).
- Igarashi, K., et al. Multivalent DNA binding complex generated by small Maf and Bach1 as a possible biochemical basis for beta-globin locus control region complex. J Biol Chem. 273, 11783-11790 (1998).
- Ogawa, K., et al. Heme mediates derepression of Maf recognition element through direct binding to transcription repressor Bach1. Embo J. 20, 2835-2843 (2001).
- Oyake, T., et al. Bach proteins belong to a novel family of BTB-basic leucine zipper transcription factors that interact with MafK and regulate transcription through the NF-E2 site. Mol Cell Biol. 16, 6083-6095 (1996).
- Snyder, S. H., Jaffrey, S. R., Zakhary, R. Nitric oxide and carbon monoxide: parallel roles as neural messengers. Brain Res Brain Res Rev. 26, 167-175 (1998).
- Sun, J., et al. Hemoprotein Bach1 regulates enhancer availability of heme oxygenase-1 gene. Embo J. 21, 5216-5224 (2002).
- Zhang, L., Guarente, L. Heme binds to a short sequence that serves a regulatory function in diverse proteins. Embo J. 14, 313-320 (1995).
- Hon, T., Lee, H. C., Hu, Z., Iyer, V. R., Zhang, L. The heme activator protein Hap1 represses transcription by a heme-independent mechanism in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 169, 1343-1352 (2005).
- Chernova, T., et al. Neurite degeneration induced by heme deficiency mediated via inhibition of NMDA receptor-dependent extracellular signal-regulated kinase 1/2 activation. J Neurosci. 27, 8475-8485 (2007).
- Chernova, T., et al. Early failure of N-methyl-D-aspartate receptors and deficient spine formation induced by reduction of regulatory heme in neurons. Mol Pharmacol. 79, 844-854 (2011).
- Sengupta, A., Hon, T., Zhang, L. Heme deficiency suppresses the expression of key neuronal genes and causes neuronal cell death. Brain Res Mol Brain Res. 137, 23-30 (2005).
- Smith, A. G., Raven, E. L., Chernova, T. The regulatory role of heme in neurons. Metallomics. 3, 955-962 (2011).
- Raghuram, S., et al. Identification of heme as the ligand for the orphan nuclear receptors REV-ERBalpha and REV-ERBbeta. Nat Struct Mol Biol. 14, 1207-1213 (2007).
- Wu, N., Yin, L., Hanniman, E. A., Joshi, S., Lazar, M. A. Negative feedback maintenance of heme homeostasis by its receptor Rev-erbalpha. Genes Dev. 23, 2201-2209 (2009).
- Yin, L., et al. Rev-erbalpha, a heme sensor that coordinates metabolic and circadian pathways. Science. 318, 1786-1789 (2007).
- Zhu, Y., Hon, T., Zhang, L. Heme initiates changes in the expression of a wide array of genes during the early erythroid differentiation stage. Biochemical and biophysical research communications. 258, 87-93 (1999).
- Yao, X., Balamurugan, P., Arvey, A., Leslie, C., Zhang, L. Heme controls the regulation of protein tyrosine kinases Jak2 and Src. Biochemical and biophysical research communications. 402, 30-35 (2010).
- Ye, W., Zhang, L. Heme controls the expression of cell cycle regulators and cell growth in HeLa cells. Biochem and biophys res comm. 315, 546-554 (2004).
- Hooda, J., Shah, A., Zhang, L. Heme, an essential nutrient from dietary proteins, critically impacts diverse physiological and pathological processes. Nutrients. 6, 1080-1102 (2014).
- Hooda, J., et al. Enhanced heme function and mitochondrial respiration promote the progression of lung cancer cells. PloS one. 8, e63402 (2013).
- Atamna, H., Walter, P. B., Ames, B. N. The role of heme and iron-sulfur clusters in mitochondrial biogenesis, maintenance, and decay with age. Arch Biochem Biophys. 397, 345-353 (2002).
- Atamna, H., Killilea, D. W., Killilea, A. N., Ames, B. N. Heme deficiency may be a factor in the mitochondrial and neuronal decay of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14807-14812 (2002).
- Ponka, P. Cell biology of heme. Am J Med Sci. 318, 241-256 (1999).
- Brawer, J. R., Naftolin, F., Martin, J., Sonnenschein, C. Effects of a single injection of estradiol valerate on the hypothalamic arcuate nucleus and on reproductive function in the female rat. Endocrinol. 103, 501-512 (1978).
- Daniell, W. E., et al. Environmental chemical exposures and disturbances of heme synthesis. Environ Health Perspect. 105, Suppl 1. 37-53 (1997).
- Kihara, T., et al. Hepatic heme metabolism in rats with fever induced by interleukin 1beta. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 104, 115-126 (1999).
- Vijayasarathy, C., Damle, S., Prabu, S. K., Otto, C. M., Avadhani, N. G. Adaptive changes in the expression of nuclear and mitochondrial encoded subunits of cytochrome c oxidase and the catalytic activity during hypoxia. Eur J Biochem. 270, 871-879 (2003).
- Anderson, K. E. S. S., Bishop, D. F., Desnick, R. J. Disorders of heme biosynthesis: X-linked sideroblastic anemia and the porphyrias. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. , The McGraw-Hill Companies, Inc. New York. 1-53 (2009).
- Salvo, M. L., Contestabile, R., Paiardini, A., Maras, B. Glycine consumption and mitochondrial serine hydroxymethyltransferase in cancer cells: the heme connection. Med Hypotheses. 80, 633-636 (2013).
- Ishii, D. N., Maniatis, G. M. Haemin promotes rapid neurite outgrowth in cultured mouse neuroblastoma cells. Nature. 274, 372-374 (1978).
- Padmanaban, G., Venkateswar, V., Rangarajan, P. N. Haem as a multifunctional regulator. Trends Biochem Sci. 14, 492-496 (1989).
- Rutherford, T. R., Clegg, J. B., Weatherall, D. J. K562 human leukaemic cells synthesise embryonic haemoglobin in response to haemin. Nature. 280, 164-165 (1979).
- Ye, W., Zhang, L. Heme deficiency causes apoptosis but does not increase ROS generation in HeLa cells. Biochemical and biophysical research communications. 319, 1065-1071 (2004).
- Bonkovsky, H. L., et al. High-performance liquid chromatographic separation and quantitation of tetrapyrroles from biological materials. Anal Biochem. 155, 56-64 (1986).
- Sinclair, P. R., Gorman, N., Jacobs, J. M. Measurement of heme concentration. Curr Protoc Toxicol. 8, Unit 8.3 (2001).
- Barros, M. H., Carlson, C. G., Glerum, D. M., Tzagoloff, A. Involvement of mitochondrial ferredoxin and Cox15p in hydroxylation of heme O. FEBS Lett. 492, 133-138 (2001).
- Shinjyo, N., Kita, K. Up-regulation of heme biosynthesis during differentiation of Neuro2a cells. J Biochem. 139, 373-381 (2006).
- Israels, L. G., Yoda, B., Schacter, B. A. Heme binding and its possible significance in heme movement and availability in the cell. Ann N Y Acad Sci. 244, 651-661 (1975).
- Yannoni, C. Z., Robinson, S. H. Early-labelled haem in erythroid and hepatic cells. Nature. 258, 330-331 (1975).
- Robinson, S. H. Formation of bilirubin from erythroid and nonerythroid sources. Semin Hematol. 9, 43-53 (1972).
- Granick, S., Granick, D. Nucleolar necklaces in chick embryo myoblasts formed by lack of arginine. J Cell Biol. 51, 636-642 (1971).
- Morell, D. B., Barrett, J., Clezy, P. S. The prosthetic group of cytochrome oxidase. 1. Purification as porphyrin alpha and conversion into haemin alpha. Biochem J. 78, 793-797 (1961).
- Sinclair, P., Gibbs, A. H., Sinclair, J. F., de Matteis, F. Formation of cobalt protoporphyrin in the liver of rats. A mechanism for the inhibition of liver haem biosynthesis by inorganic cobalt. Biochem J. 178, 529-538 (1979).
- Chung, J., Haile, D. J., Wessling-Resnick, M. Copper-induced ferroportin-1 expression in J774 macrophages is associated with increased iron efflux. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 2700-2705 (2004).
