Demonstrasjon av Proteolytisk Aktivering av epithelial natriumkanalen (ENaC) ved å kombinere strømmålinger med Detection cleavage Fragments

Summary

Proteolytisk aktivering av epitelial natriumkanal (ENaC), heterologt uttrykt i Xenopus laevis oocytter kan demonstreres ved å kombinere strømmålinger med en biotinylering tilnærming for å undersøke forekomsten av ionekanal spaltningsproduktene på celleoverflaten. Funksjonelt viktige spaltningsseter kan identifiseres ved hjelp av seterettet mutagenese.

Introduction

Proteaser er enzymer som er involvert i forskjellige fysiologiske reaksjoner som strekker seg fra den kjente proteolytisk degradering av proteiner i forbindelse med fordøyelsen, til meget avanserte protease kaskader som er involvert i kompliserte reguleringssignalveier. Proteaser er klassifisert i syv grupper etter deres katalytisk aktive området: aspartat, asparagin, cystein, glutaminsyre, metallo, serin og treonin proteaser. Ulike proteaser målrette distinkte spaltningsseter som ikke alltid er lett å forutsi fra den primære strukturen av et protein. Den Merops database ( http://merops.sanger.ac.uk/ ) gir detaljert informasjon om et bredt spekter av proteaser og deres fortrinnsrett spaltningsseter. Funksjonelt relevante spaltningsseter kan identifiseres ved hjelp av seterettet mutagenese.

Det er vel etablert at proteolytisk prosessering av ENaC er en viktig mekanisme for aktivering av ther bestemt ionekanal ^1,2. Interessant er det bevis for at funksjonen til den relaterte syre-sensing ionekanal 1a (ASIC1a) kan også endres av proteaser ^3-5. I dag er det fortsatt et åpent spørsmål om proteolytisk kanal cleavage spiller en relevant fysiologisk rolle i å regulere aktiviteten til andre ionekanaler eller transportører. Imidlertid er det vel etablert at proteolytisk spaltning aktiverer en gruppe av G protein-koblede reseptorer, protease-aktiverte reseptorer (PARS) ^6. Flere av serinproteaser (f.eks kanal-aktiverende proteaser (CAP1-3), chymotrypsin, trypsin, Furin, plasmin, neutrofil elastase, og kallikrein) har blitt vist å aktivere proteolytisk ENaC ^2. I tillegg til serin-proteaser, kan andre grupper av proteaser involvert i proteolytisk ENaC aktivering. Faktisk viser nyere data at metalloproteinase meprin-β ⁷ og cystein protease cathepsin-S ⁸ kan også activate ENaC. Men de (patho-) fysiologisk relevante proteaser for ENaC aktivisering fortsatt å være bestemt og kan variere fra vev til vev.

Proteaser er kjent for å fortrinnsvis holde seg på bestemte steder i aminosyresekvensen. For eksempel, viser serinprotease chymotrypsin en spesifikk spalting mønster spalte etter at den aromatiske amino-syre-rester fenylalanin og tyrosin. I kontrast, serin protease trypsin preferensielt spalter etter den grunnleggende rester lysin eller arginin. Ved hjelp av mutant menneskelige γENaC konstruerer generert av seterettet mutagenese, kunne funksjonelt relevante spaltningsseter i ENaC heterologt uttrykt i eggcelle uttrykk system identifiseres ^8-13.

Ved å injisere cRNA for de tre ENaC-subenheter (αβγ) i isolerte oocytter kan ENaC være funksjonelt uttrykt i disse celler, og aktiviteten av kanaler til stede på plasmamembranen kan måles ved hjelpved hjelp av to-elektrodespenningsklemme teknikk. Ved å bruke den diuretiske amilorid, en spesifikk ENaC inhibitor, den amilorid-sensitive ENaC-mediert hel-cellestrømmen komponent (ΔI _ami) kan separeres fra uspesifikke lekkasjestrømmer eller strømmer utført av andre ionekanaler. Således ΔI _ami verdier reflekterer generelle ENaC-aktivitet, og kan bestemmes ved å trekke av hele celle-strømmer målt i nærvær av amilorid fra de tilsvarende hel-celle-strømmer som er tatt opp i fravær av amilorid. For å teste om en protease har en stimulerende effekt på ENaC er ΔI _ami målt to ganger i samme eggcelle, dvs. før og etter inkubering av oocytten i en protease inneholdende løsning. En økning av ΔI _ami fra den første til den andre målingen indikerer proteolytisk ENaC aktivering. Chymotrypsin eller trypsin er kjent for å stimulere maksimalt ENaC i oocytt ekspresjonssystem ^2,14, og kan brukes til å konfirm at proteolytisk ENaC aktivering er synlig i en gitt batch av ubefruktede egg.

Parallelt med hel-celle-strømmålinger ble en biotinylering tilnærming ⁹ brukes til å undersøke om økningen i ΔI _ami detekteres ved eksponering av oocyttene til proteaser korrelerer med fremkomsten av ENaC spaltningsenzymer fragmenter på celleoverflaten. Proteiner på celleoverflaten, er merket med biotin, og kan separeres fra intracellulære proteiner ved å binde det biotinylerte protein til NeutrAvidin merkede agarosekuler. De biotinylerte proteiner kan bli analysert ved western blot. γENaC cleavage fragmenter på celleoverflaten kan detekteres ved hjelp av et spesifikt antistoff rettet mot en epitop i C-terminus av γENaC. Å identifisere funksjonelt relevant cleavage (r), spådde spaltningsseter kan mutert bruker nettstedet rettet mutagenese. Villtype-og mutant-kanaler blir sammenlignet i parallelle eksperimenter med oocytter fra same batch.

Med denne Metodikken ble det påvist for første gang at proteolytisk aktivering av ENaC-medierte hel-celle strømmer korrelerer med den tidsavhengige opptreden av ENaC spaltningsenzymer fragmenter på celleoverflaten. Disse resultatene tyder på en årsakssammenheng mellom kanal cleavage og kanal aktivering. Videre ble ved bruk av seterettet mutagenese av antatte spaltningsseter i kombinasjon med de to-elektrodespenningsklemme teknikk, funksjonelt relevante spaltningsseter for plasmin, chymotrypsin ¹³ og katepsin-S ⁸ identifisert.

Protocol

En. Isolering av Xenopus Oocytter og Mikroinjeksjon av cRNA

1. Skaffe ubefruktede egg fra voksen hunn Xenopus laevis. Anaesthetize dyr i 0,2% MS222, og resect eggstokkene lapper gjennom en liten abdominal snitt.
2. Isoler oocytter fra eggstokkene fliker ved enzymatisk fordøyelse ved 19 ° C i 3-4 timer med 600 til 700 U / ml av type 2 kollagenase fra Clostridium histolyticum oppløst i kalsiumfritt OR2-oppløsning (oppskriften i tabell 1).
3. For valg, plasseres defolliculated oocytter i en petriskål under et binokulært mikroskop for i et høyt natriumholdig oppløsning (ND96: oppskriften i tabell 1).
4. Velg scene V-VI ubefruktede egg og legg dem i en annen petriskål med en Pasteur pipette. MERK: Blunt Pasteur pipette med flammende å hindre eggcelle skade.
5. Injisere ubefruktede egg med cRNA (f.eks 0,2 ng per αβγENaC underenhet). Oppløse CRNAs i RNase-fritt vann. MERK: Totalvolum injisert i hver eggcelle er 46 nl.
6. Lagres injiseres oocytter ved 19 ° C på en lav natrium-løsning for å forhindre natrium lasting av oocyttene (ND9: oppskriften i tabell 1). Supplement løsningen med 100 U / ml natrium-penicillin og 100 pg / ml streptomycin-sulfat for å forhindre bakterievekst. Nøye håndtere ubefruktede egg for å begrense mengden av skadede eller døde egg og vedlikeholde dem i enkelte små grupper i en 12-brønns-plate brønner fylt med badekar løsning i løpet av de to dagene etter cRNA injeksjon.

2. Utføre To-elektrode Spenning-klemme Eksperimenter

1. Mål oocytter to dager etter injeksjonen.
2. Fyll en sprøyte med en tyngdekraft matet perfusjon system med ND96 løsning og en annen sprøyte med ND96 løsning som inneholder amilorid (2 mm). Mount sprøyter 50 cm over eggcelle bad kammeret. MERK: Konsentrasjonen av ENaC inhibitor amilorid ble valgt til å være 20 ganger høyere enn IC ₅₀
3. Slå på en 150 W halogen kald lyskilde og juster den til 10 cm over eggcelle bad kammeret slik at god visualisering med kikkert mikroskop. Deretter slår på suge-og juster sugerøret ved utløpet av oocytten bad kammeret. Finn sugerøret motsatt super rør 'adapter inn eggcelle bad. MERK: Sugeeffekt må være tilstrekkelig til å støtte kontinuerlig strøm av løsningen superfusing eggcelle.
4. Juster superfusjonshastigheten av hver løsning på 3-5 ml / min ved hjelp av tyngdekraften iv strømningsstyringsinnretningen. Koble super rør med en adapter til eggcelle bad kammeret.
5. Trekk glasskapillærer med en mikropipette avtrekker for å få tips diameter på <1 mikrometer. Deretter fyller kapillærer til ~ 1/4 med 3 M KCl. MERK: Pass på at klorerte delen av sølvtråd av elektrodeholderen er nedsenket i KCl løsning. Kontroller for luftbobler i spissen av kapillarrøret. Luftbobler forringe flakongREMENT ved å øke motstanden spredt kapasitans.
6. Sett kapillærene inn i elektrode innehavere av den nåværende og spenningselektrode og plassere dem i ND96 inneholder amilorid (2 mm) løsning ved hjelp av mikro-manipulatorer.

Tre. Måling av Amilo-sensitive Whole-celle Currents

1. Null elektrodepotensialet til spenningselektrode (V _m) og strømelektrode (V _e) ved å justere V _m og V _e offset _{knapper NB.} Motstanden skal være 1-2 MΩ for elektroden for å måle V _m og 0,5 -1 MΩ for den aktuelle injeksjonselektrode.
2. Plasser eggcelle i badekaret kammeret i umiddelbar nærhet til den spenningsføleelektrode. MERK: Ikke skad eggcelle under noen av disse overføringsmåten. Bruk en Pasteur pipette til å overføre eggcelle. For å unngå å skade eggcelle kantene av pipetten bør avstumpet av flammende.
3. Spidde oocytes forsiktig med begge mikroelektroder.
4. Still holding potensial på forsterkeren til -60 mV og slå på kurveskriver. Slå på amilorid (2 mm) som inneholder løsning. MERK: Den nåværende bør være ca 0 ± 0,5 μA. Større lekkasje strømmer indikerer en lekk impalement. Derfor bør disse eggceller bli avvist. Videre bør de lekkasjestrømmer målt i nærvær av amilorid (2 mm) være lik i αβγ-WT uttrykke eggceller til de som er målt i αβγ-mutant ENaC uttrykke eggceller. Dette indikerer at mutasjoner ikke påvirker den amilorid-følsomhet av kanalen.
5. Starte opptak. Om nødvendig justere forsterkningen.
6. Etter den målte strøm når et stabilt platå, endre til amilorid-fri løsning. MERK: Nedover nåværende nedbøyninger i dagens spor tilsvarer dvs. bevegelse av positiv ladning (Na ⁺⁾ fra den ekstracellulære siden inn i cellen innover strømninger,.
7. After en strøm platå blir nådd (etter ~ 60 sek), bytte superfusjons tilbake til amilorid holdige løsning. Etter gjeldende av eggcelle når den innledende baseline strøm, slå av spenningsklemmen og forsiktig trekke elektrodene.
8. For å tillate forsegles av plasmamembranen på de steder av impalement, plasserer oocyte inn i en brønn av en 96-brønners plate inneholdende 100 til 150 mL av protease fri ND96 løsning.
9. Etter 5 min, overfører oocyte til en protease inneholdende løsning eller til en kontrolloppløsning uten protease for en 30 min inkubasjonstid. MERK: Inkubasjonstiden er avhengig av protease og undersøkt kanal.
10. Etter inkuberingstrinnet gjenta strømmåling (se punkt 3.2 og følgende). MERK: Det er mulig å måle> 90% av ubefruktede egg etter inkubasjon i protease løsning.

4. Biotinvlerina Assay

1. Velg og kast defekte eggceller under kikkert mikroskop. MERK: Bruk injected oocytter fra den samme batch for de strømmålinger og for biotinylering eksperimenter.
2. Hold biotin ved RT i minst 20 min før bruk i eksperimentet.
3. Forbered løsningene: ND96 og ND96 som inneholder den riktige protease. Forbered Pasteur pipetter ved å merke dem og etter en kort stund flammende sine tips for å unngå skade av ubefruktede egg. MERK: Her protease chymotrypsin 2 pg / ml i ND96 benyttes. Unn hver gruppe med en egen pipette for å unngå smitte av løsninger.
4. Fyll hver brønn i en 6-brønns plate med 2,5 ml kontroll ND96 eller ND96 inneholdende en protease ved RT. Deretter setter 30 oocytter pr brønn og inkuber dem i 30 minutter ved RT. NB: For de etterfølgende fremgangsmåter er det viktig å holde prøvene på is hele tiden. Alle sentrifugeringstrinnene ved utført ved 4 ° C.
5. Fyll hver brønn av en ny 6-brønn plate med 2,5 ml (ND96 hver gruppe må tre brønner for vasketrinnene) og veie biotin. MERK: 2,5 mg biotin peh brønn (1 mg / ml) er nødvendig. Oppløs biotin i biotinylering buffer (dvs. 25 mg biotin (for 10 grupper) i 25 ml biotinylering buffer (oppskriften i tabell 1).
6. Overfør hver gruppe av oocytter i en brønn fylt med 2,5 ml ND96. Transfer eggceller sekvensielt inn ytterligere to brønner med ND96 å vaske av eventuelle gjenværende protease. Inkuber ubefruktede egg for 5 min i ND96.
7. Overfør oocytter i en brønn inneholdende 2,5 ml biotin løsning og inkuber dem med forsiktig omrøring ("shaker") i 15 min. MERK: Minimer overført ND96 med pipetten for å unngå utvanning av biotin løsning.
8. Overfør hver gruppe av oocytter i en brønn inneholdende 2,5 ml quench buffer (oppskriften i tabell 1) for å stoppe reaksjonen biotinylering. Deretter overfører hver gruppe av oocytter i en andre brønn også inneholdende 2,5 ml slukke-buffer og inkuberes i 5 minutter med forsiktig omrøring.
9. Fjern skadede eller døde egg. MERK:Velg samme antall egg per gruppe for følgende prosedyre.
10. Overfør hver gruppe av oocytter til et 1,5 ml mikrosentrifuge plastrøret. MERK: Reduser mengden av quench buffer som blir overført.
11. Deretter lyserer oocyttene ved å føre dem gjennom en 27 G nål i 1 ml lyseringsbuffer (oppskrift se tabell 1) supplert med protease-inhibitorer.
12. Sentrifuger lysatene i 10 min ved 1500 x g.
13. Aspirer supernatant og overføre den til et 1,5 ml mikrosentrifugerør inneholdende 0,5% Triton-X-100 og 0,5% NP40. Kast den gjenværende pellet. MERK: Supernatanten inneholder biotinylert plasmamembranproteiner og ikke-biotinylerte intracellulære proteiner.
14. Inkuber mikrosentrifugerør i 20 min på is. Gjentatte vortex rørene i løpet av denne perioden for å løse opp proteinene i NP40 og Triton-X-100.
15. Sentrifuger 100 pl agarosekuler pr oocytten gruppe i 3 min ved 1500 x g. Ettersentrifugering fjerner supernatanten fra perlene løsningen og vask tre ganger med lyseringsbuffer for å stabilisere perlene med buffer.
16. Pipetter 100 ul av de vaskede kuler i hver mikrosentrifugerør inneholdende protein-vaskemiddel-oppløsning fremstilt på 4,13 for å tillate binding av biotinylerte proteiner til kulene.
17. Inkuber mikrosentrifugerør med overhead rotasjon O / N ved 4 ° C.
18. Sentrifuger mikrosentrifugerør for 3 min ved 1500 x g. Deretter overføres supernatanten til et nytt rør. MERK: Intracellulære proteiner er ikke merket med biotin. Supernatant kan lagres ved -20 ° C. Ikke aspirer perlene.

5. Påvisning av ENaC Cleavage Fragments på celleoverflaten av Western Blot analyse

1. Vask kulene tre ganger med lyseringsbuffer og tilsett 100 ul av 2 x SDS-PAGE prøvebuffer. MERK: Prøver kan oppbevares ved -20 ° C eller umiddelbart forberedt for western blot analyse.
2. Kok samples for 5 min ved 95 ° C og deretter plassere rørene på is.
3. Sentrifugere prøven 3 min ved 20 000 xg og pipetter supernatanten til et nytt mikrosentrifuge tube. MERK: Denne supernatanten inneholder biotinylerte plasma membran proteiner fra celleoverflaten av eggcelle.
4. Analyse 30 pl av denne supernatanten ved western blot å undersøke cleavage fragmenter på celleoverflaten.
5. Separer det biotinylerte protein ved SDS-PAGE (natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel-elektroforese) ved hjelp av en egnet gel (8%, 10%, 12%, avhengig av molekylvekten av spaltings-fragmenter som er undersøkt).
6. Overfør proteiner til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner av semi-tørr blotting.
7. Probe membran med et spesifikt antistoff mot human γENaC rettet mot en epitop i C-terminus (se figur 3 og ^13).
8. Bruk pepperrot-peroksydase-merket geit-anti-kanin-antistoff som sekundær antilegeme.
9. Detect kjemiluminescente signaler.

Representative Results

For å undersøke hvorvidt serinprotease plasmin kan aktivere ENaC-mediert strøm, ble ΔI _ami av individuelle ENaC-oocytter som uttrykker bestemmes før og etter 30 min inkubering av oocyttene i protease-fri (kontroll) (figur 2A), eller plasmin inneholdende oppløsning (figur 2B) ved hjelp av to-elektrodespenningsklemme-teknikk (se figur 1). Eksponering for plasmin økt ΔI _ami i hver eggcelle målt. I kontrast, i kontroll-eksperimenter, 30 min inkubasjon av ENaC-oocytter som uttrykker i protease-fri løsning hadde en neglisjerbar effekt (figur 2 C, D). Således, ved å bruke denne metoden en stimulering av ENaC-mediert strøm av plasmin kan oppdages.

For å studere effektene av muterende antatte spaltningsseter ved aktivering av ENaC-mediert strøm, så vel som ved kanal spalting, ble effekten av chymotrypsin i WT-ENaC sammenlignet med den ien mutant ENaC med mutert prostasin og plasmin spaltningsseter (γ _{RKRK178AAAA; K189A).} Tidsforløpet av kanalaktivering av chymotrypsin samt fremkomsten av ENaC spaltningsproduktene på celleoverflaten ble undersøkt ved bruk av ulike protease inkubasjonstider (figur 4A). Det ble demonstrert at de mutante kanal forsinkelser og reduserer aktivering av ENaC-mediert strøm av chymotrypsin. Denne er parallell med en forsinket opptreden av en lavere molekylvekt γENaC spalting fragment på 67 kDa som svarer til det fullt spaltet subenheten. Cleavage fragmenter ble påvist ved hjelp av en γENaC antistoff rettet mot en epitop i C-terminalen (Figur 3). Denne metodiske viser at tidsforløpet for proteolytisk aktivering av ENaC-mediert strøm, korrelerer med utseende av en 67 kDa γENaC spaltningsprodukt på celleoverflaten (figur 4 B, C). Dette støtter ideen om enårsakssammenheng mellom proteolytisk kanal cleavage og kanal aktivering ^13. Videre, ved å kombinere strømmålinger og påvisning av γENaC fragmenter på celleoverflaten ble det vist at de muterte spaltningsseter er funksjonelt relevant for kanalaktivering proteolytisk.

Figur 1. Prosedyre ved fastsettelsen av den stimulerende effekten av en protease på ENaC heterologt uttrykt i Xenopus laevis eggceller. ENaC aktiviteten er beregnet ved å måle amilorid-sensitive hel-celle nåværende komponent ΔI _ami.

Figur 2. Plasmin stimulerer ENaC-medierte vats i ubefruktede egg uttrykker ENaC. (AD) Oocytter som uttrykker human ENaC ble inkubert i 30 min i protease-fri oppløsning (kontroll) eller i løsning inneholdende plasmin (10 ug / ml). For å bestemme ΔI _ami før (-), og etter (+) inkubasjon ble oocyttene klemt fast på et holdepotensial på -60 mV (A, B) Fire representative hel-celle løpende spor fra en gruppe med oocytter.. Amilorid (ami) var til stede i badoppløsningen for å spesifikt hemme ENaC som angitt med svarte striper. (C) datapunkter oppnådd fra et individ oocytt er forbundet med en linje. (D) Oppsummering av tilsvarende forsøk, som vist i C. kolonner representerer relative stimulerende effekt på ΔI _ami beregnes som forholdet mellom ΔI _ami målt etter en 30 min inkubasjon (ΔI _ami 30 min) til den opprinnelige ΔI _ami (ΔI _ami innledende) målt før inkubasjon. Tall inne søylene angirantall individuelle oocytter målt. N angir antall ulike grupper av ubefruktede egg. (Dette tallet har blitt forandret fra [Haerteis et al 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, doi:. 10.1085/jgp.201110763])

Fig. 3. Modell av γENaC subenheten viser spaltningsseter for proteolytisk aktivering og bindingsstedet på antistoffet anvendes. Proteolytisk spalting av Golgi-assosiert konvertase Furin er viktig for ENaC modning i biosyntetiske vei før kanalen når plasmamembranen. Etter spalting av Furin en 76 kDa-fragment kan bli detektert på celleoverflaten ved hjelp av en biotinylering tilnærming og et antistoff mot en epitop i C-terminus av γ-subenheten. Den avgjørende siste trinnet i proteolytisk ENaC aktiveringen foregår sannsynligvis sted i plasmamembranen der γENaC spaltes ved ekstracellulære proteaser (for eksempel plasmin eller kymotrypsin) i et område distalt til Furin området som resulterer i en 67 kDa spalting fragment. (Dette tallet har blitt forandret fra [Haerteis et al 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, doi:. 10.1085/jgp.201110763])

Figur 4:. Mutere både plasmin (K189) og prostasin spaltningssete (RKRK178) forsinker aktivering av ENaC-mediert strøm, og fremkomsten av en 67 kDa spaltningsprodukt av kanalens γ-subenheten Oocytter uttrykker WT (åpne symboler) og γ _{RKRK178AAAA; K189A} ENaC mutant kanal (lukkede symboler) ble inkubert i 30 min i protease-fri oppløsning (kontroll) eller 5, 30, eller 60 min i en oppløsning inneholdende chymotrypsin (2 ug / ml). (A) For å bestemme ΔI _ami før og etter inkubasjon ble oocyttene klemt fast på et holdepotensial på -60 mV. Sirklene representerer forholdet mellom ΔI _ami målt etter 5, 30, eller 60 min inkubasjon (ΔI _ami min) til den opprinnelige ΔI _ami (ΔI _ami innledende) målt før inkubasjon. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittlig ΔI _ami målt i 22 til 24 individuelle oocytter av fire forskjellige grupper. (BD) i parallell med påvisning av ΔI _ami, ekspresjon av biotinylert γENaC på celleoverflaten ble analysert ved SDS-PAGE. γENaC ble detektert med et antistoff mot en epitop på C-terminalen av humant γENaC. Representative western blots fra ett parti av oocytter er vist. (CE) densitometrisk analyse av tre western blots tilsvarende de som er vist i B eller D. For hver bane, det signals oppdaget i regionene i 76 kD (åpne søyler) og 67 kD (grå søyler) ble bestemt og normalisert til summen av det totale signalet oppdaget. N angir antall ulike grupper av ubefruktede egg. Klikk her for å se større bilde.

Discussion

I dette manuskriptet en metodisk tilnærming som ble vellykket anvendt for å studere mekanismene bak aktiveringen av ENaC av proteaser er beskrevet ^8,13. Den godt etablerte Xenopus laevis eggcelle uttrykk systemet ble brukt til funksjonelt express ENaC. ENaC funksjon ble vurdert med vanlig to-elektrode spennings klemme teknikk. Seterettet mutagenese ble ansatt for å identifisere funksjonelt relevante protease spaltningsseter. Biotinylering eksperimenter utført i parallell med den elektrofysiologiske målinger gjort det mulig å korrelere fremkomsten av ENaC spaltningsproduktene på celleoverflaten med proteolytisk strømaktivering. En korrelasjon mellom tidsforløpet av strømaktivering, og fremkomsten av proteolytisk spaltning fragmenter på celleoverflaten støtter konseptet med kanalaktivering proteolytisk.

To-elektrode voltage-clamp opptak krever impalement av en oocyte med to mikroelektroder. Denne prosedyren utføres vanligvis bare en gang i et individuelt eggcelle. Imidlertid var det mulig å fjerne de mikroelektroder etter en innledende hel-celle aktuelle opptaket tilsynelatende uten skade på oocyte. Faktisk plasmamembranen på de steder av impalements synes å forsegle i løpet av få minutter. Således, etter å ha fullført et første to-elektrodespenningsklemme måling, er det mulig å overføre en oocytt fra den eksperimentelle strømningskammeret i to-elektrodespenningsklemme oppsett i et mikrosentrifugerør eller en brønn av en 96-brønns plate som er fylt med et lite volum av test-eller kontrolloppløsningen. Deretter kan den samme eggcelle bli overført tilbake til strømningskammeret, og kan være spiddet på nytt for å utføre en andre to-elektrodespenningsklemme måling. Bemerkelsesverdig ble ENaC-mediert strøm, ikke varierer mye mellom den første og andre målingen når oocytten ble opprettholdt i kontrolloppløsningen. I motsetning til dette inkubasjon av oocytten i en protease inneholdende solution etter den første måling resulterte i økt ENaC-mediert strøm i den andre målingen (fig. 2). Dette funnet indikerer kanal aktivering proteolytisk.

Utføre to separate strømmålinger i et enkelt oocytten har den fordelen at en oocytt kan bli utsatt for proteaser eller andre farmakologiske midler mellom de to målinger for et variabelt tidsrom i et lite volum av testoppløsningen. Dette er viktig ved bruk av midler som er kostbare og / eller ikke tilgjengelig i store mengder, f.eks rensede protease-preparater. Den begrensede tilgjengeligheten av agenter kan gjøre det umulig (eller uoverkommelig) å bruke dem i kontinuerlig to-elektrode voltage-clamp opptak på grunn av de store volumene av testløsning som kreves for kontinuerlig superfusing ubefruktede egg med hastighetsmåling av flere milliliter per minutt. Videre er kontinuerlig to-elektrode voltage-clamp målinger begrenset av den velkjente fenomenetEnon av spontan kanal trekk også beskrevet for ENaC ^15. I kontrast, utsette oocytter for å teste løsninger mellom to separate målinger for opptil en time eller mer ikke generelt utgjøre et problem (se figur 4A). Til slutt, to påfølgende målinger utført i samme eggcelle tillate sammenkoblede observasjoner av narkotika effekter. Dette har en fordel i forhold til uparede målinger fra to separate grupper av oocytter (protease-behandlede og bærer-behandlet), fordi det reduserer problemet med høy variabilitet mellom oocytter, vanligvis observert i ionekanal ekspresjon. Med sammenkoblede observasjoner og muligheten for å normalisere dataene til den første måling, er færre oocytter som trengs pr forsøksgruppe for å vise en signifikant effekt av et farmakologisk middel. Normalisering av data gjør det også enkelt å oppsummere data fra ulike grupper av ubefruktede egg med ulike ionekanal uttrykk nivåer og dermed ulike utgangsstrømmer (Figur 2D). Selvfølgelig kontrolleksperimenter som er nødvendige for denne fremgangsmåten for å vise at ionekanal aktiviteten av interesse forblir stabil i bærer-behandlede kontroll-oocytter fra den første til den andre målingen (se figur 2).

For å demonstrere at proteolytisk strømaktivering korrelerer med utseendet av ENaC spaltningsproduktene på celleoverflaten, en biotinylering metode som opprinnelig er beskrevet av Harris et al. ^Ni kan brukes. Denne fremgangsmåten (som beskrevet i protokollen delen og er vist i figur 4) er innrettet til å vise at eksponering av kanaler til proteaser og etterfølgende aktivering av ENaC-mediert strøm, er parallell med den tidsavhengige opptreden av spaltningsseter fragmenter. Den biotinylering fremgangsmåte gjør det også mulig å analysere en økning eller reduksjon av membranproteiner på celleoverflaten. Således er denne fremgangsmåte er egnet for å undersøke effekten av proteaser og andre akterisertfarmakologiske midler ved kanal innsetting inn i plasmamembranen, eller ved kanalinnhenting. Videre tillater western blot analyse av de biotinylerte plasmamembranproteiner påvisning av proteinfragmenter (f.eks proteolytiske ENaC-fragmenter) eller endringer i glykosyleringsmønster som kan være funksjonelt relevant.

Konklusjonen er at den kombinasjon av metoder som brukes for å undersøke den stimulerende effekt av proteaser på ENaC-medierte hel-celle-strømmer, og for å påvise en sammenheng med forekomsten av ENaC spaltningsproduktene på celleoverflaten, kan være nyttig for et bredt spekter av anvendelser. Særlig kan disse fremgangsmåter være egnet for å løse liknende art til regulering av andre ionekanaler, transportører eller transmembrane reseptorer (for eksempel protease-aktiverte reseptorer PARS).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Bath clamp headstage for OC-725C-V	Warner Instrument Corporation
Cold light source - Schott KL 1500 LCD	Schott	#SCOC150200EU	brightness 4; mechanical aperture: D; color temperature: 3,000 K
E Series electrode holder (Str, Vent, Ag Wire, 1.2 mm)	ADinstruments	#ESW-F10v
Left micromanipulator; MM-33L	Warner Instrument Corporation	#64-0055
LIH 1600 - computer interface	HEKA
Magnetic valve system (ALA BPS-8) in combination with a TIB14 interface (HEKA)	ALA Scientific Instruments, HEKA
OC-725C amplifier for two-electrode voltage-clamp recordings	Warner Instrument Corporation
P-97 FLAMING/BROWN Micropipette Puller	Sutter Instruments		heat = 550; velocity = 22; time = 200
Right micromanipulator; MM-33R	Warner Instrument Corporation	#64-0056
Series electrode holder (45°, Vent, Handle, Ag Wire, 1.2 mm)	ADinstruments	#E45w-f10vh
STAT 2 IV gravity flow controller	Conmed	#P-S2V-60
Vacuum generator ejector SEG - for suction to remove bath solution	Schmalz
INFUJECT 60 ml pump syringes for solutions	Braun	#22050
Injekt-F for lysing the oocytes	Braun	#9166033V
Standard wall borosilicate tubing with filament	Sutter Instruments	#BF150-86-10	outside diameter: 1.5 mm; inside diameter: 0.86 mm; length: 10 cm
Complete, Mini, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets	Roche Applied Science	#11836170001
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin	Thermo Scientific	#21217
Horseradish peroxidase-labeled secondary goat anti-rabbit antibody	Santa Cruz Biotechnology	#sc-2004
NeutrAvidin Agarose	Thermo Scientific	#29200	Neutravidin-labeled agarose beads
NP40 (Nonidet P-40)	Sigma-Aldrich	#I8896
Roti-Load 1 (2x SDS-PAGE sample buffer)	Carl Roth	#K929.2
SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate for detection of chemiluminescent signals	Thermo Scientific	#34095
Triton-X-100	Sigma-Aldrich	#T8787