Summary
Proteolytisk aktivering av den epiteliala natriumkanal (ENaC) heterologt uttryckta i Xenopus laevis-oocyter kan påvisas genom att kombinera strömmätningar med en biotinylering tillvägagångssätt för att undersöka förekomsten av jonkanal klyvningsprodukterna vid cellytan. Funktionellt viktiga klyvningsställen kan identifieras genom användning av riktad mutagenes.
Introduction
Proteaser är enzymer som är involverade i olika fysiologiska reaktioner som sträcker sig från den välkända proteolytiska nedbrytningen av proteiner, i samband med matsmältningen, till mycket avancerade proteas kaskader involverade i komplexa reglerande signalvägar. Proteaser indelas i sju grupper enligt deras katalytiskt aktiva stället: aspartat, asparagin, cystein, glutaminsyra, metallo, serin och treonin-proteaser. Olika proteaser rikta olika klyvningsställen som inte alltid är lätt att förutse från den primära strukturen av ett protein. Den Merops databas ( http://merops.sanger.ac.uk/ ) ger detaljerad information om en rad olika proteaser och deras förmånliga klyvningsställen. Funktionellt relevanta klyvningsställen kan identifieras med användning av ställesriktad mutagenes.
Det är väl etablerat att proteolytiska bearbetningen av ENaC är en viktig mekanism för aktivering av thär särskilt jonkanal 1,2. Intressant nog finns det bevis för att funktionen av den relaterade syra-sensing jonkanal 1a (ASIC1a) kan också modifieras genom proteaser 3-5. För närvarande är det fortfarande en öppen fråga om proteolytiska kanal klyvning spelar en relevant fysiologisk roll i regleringen av aktiviteten av andra jonkanaler eller transportörer. Det är emellertid välkänt att proteolytisk klyvning aktiverar en grupp av G-proteinkopplade receptorer, det proteasresistenta aktiverade receptorer (PARS) 6. Flera serinproteaser (t.ex. kanalaktiverande proteaser (CAP1-3), kymotrypsin, trypsin, furin, plasmin, neutrofilt elastas, och kallikrein) har visats att proteolytiskt aktivera ENaC 2. Förutom serinproteaser kan andra grupper av proteaser vara involverade i proteolytisk ENaC aktivering. I själva verket visar de senaste uppgifterna att den metalloproteinas meprin-β 7 och cystein proteas cathepsin-S 8 kan också activate ENaC. Men de (pato-) fysiologiskt relevanta proteaser för ENaC aktivering återstår att fastställa, och kan skilja sig från vävnad till vävnad.
Proteaser är kända för att företrädesvis klyva vid speciella ställen i aminosyrasekvensen. Till exempel visar serinproteaset kymotrypsin ett specifikt klyvningsmönster klyvning efter den aromatiska aminosyrarester fenylalanin och tyrosin. I motsats till detta serinproteas trypsin preferentiellt klyver efter grundresterna lysin eller arginin. Använda mutanta humana γENaC konstruktioner genererade av platsriktad mutagenes, kunde funktionellt relevanta klyvningsställen i ENaC heterologt uttryck i oocyt-expressionssystemet identifieras 8-13.
Genom att injicera cRNA för de tre ENaC subenheter (αβγ) i isolerade oocyter kan ENaC funktionellt uttryckas i dessa celler och aktiviteten för kanaler som är närvarande vid plasmamembranet kan mätas genommed hjälp av två elektroder spänning-clamp teknik. Genom att använda den diuretiska amilorid, en specifik ENaC hämmaren skall amilorid känsliga ENaC medierad helcells-strömkomponent (aI ^ ami) kan separeras från ospecifika läckströmmar eller strömmar som utförs av andra jonkanaler. Sålunda AI ami värden återspeglar total ENaC aktivitet och kan bestämmas genom att subtrahera helcells-strömmar som mäts i närvaro av amilorid från motsvarande helcells-strömmar som registrerats i avsaknad av amilorid. För att testa om ett proteas har en stimulerande effekt på ENaC, är AI ami mäts två gånger i samma äggcellen, det vill säga före och efter inkubation av äggcellen i ett proteas som innehåller lösning. En ökning av AI ami från den första till den andra mätningen indikerar proteolytisk ENaC aktivering. Kymotrypsin eller trypsin är kända för att maximalt stimulera ENaC i oocyt-expressionssystemet 2,14 och kan användas för att insynsrm som proteolytiska ENaC aktivering kan detekteras i en given sats av oocyter.
Parallellt med hel-cell strömmätningar, var en biotinylation strategi 9 används för att undersöka om ökningen av AI ami upptäcktes vid exponering av oocyter till proteaser korrelerar med utseendet på ENaC klyvning fragment vid cellytan. Proteiner vid cellytan är märkta med biotin och kan separeras från intracellulära proteiner genom bindning av de biotinylerade proteiner till neutravidin Märkta agarospärlor. De biotinylerade proteinerna kan analyseras med western blöt. γENaC klyvningsfragment vid cellytan kan detekteras med användning av en specifik antikropp riktad mot en epitop i den C-terminalen av γENaC. För att identifiera funktionellt relevanta klyvningsställe (n), förutsagda klyvningsställen kan muteras med hjälp av ställesriktad mutagenes. Vildtyp och muterade kanaler jämförs i parallella experiment med ägg från samn parti.
Med denna metodik visades för första gången att proteolytiska aktiveringen av ENaC-medierade hel-cellströmmar korrelerar med den tidsberoende utseende ENaC klyvning fragment vid cellytan. Dessa resultat tyder på ett orsakssamband mellan kanal klyvning och kanalaktivering. Dessutom, med hjälp av ställesriktad mutagenes av förmodade klyvningsställen i kombination med två-elektrodspänning-clamp-tekniken, funktionellt relevanta klyvningsställen för plasmin, kymotrypsin 13 och katepsin-S-8 identifierades.
Protocol
1. Isolering av Xenopus oocyter och mikroinjektion av cRNA
- Skaffa ägg från vuxna kvinnliga Xenopus laevis. Bedöva djur i 0,2% MS222 och resekera äggstock lober genom ett litet buksnitt.
- Isolera ägg från äggstock lober genom enzymatisk spjälkning vid 19 ° C under 3-4 timmar med 600-700 U / ml av typ 2 kollagenas från Clostridium histolyticum lösta i kalcium fritt OR2 lösning (recept i tabell 1).
- För urval, placera defolliculated ägg i en petriskål under ett binokulärt mikroskop i en hög natriuminnehållande lösning (ND96: receptet i tabell 1).
- Välj scen V-VI äggceller och placera dem i en annan petriskål med en Pasteur-pipett. OBS: Blunt pasteurpipett genom flammande att förhindra äggcellen skada.
- Injicera oocyter med cRNA (t.ex. 0,2 ng per αβγENaC subenhet). Lös CRNAs i RNas-fritt vatten. OBS: Totaltvolym injiceras i varje äggcell är 46 nl.
- Store injicerade oocyterna vid 19 ° C i en låg natrium lösning för att förhindra natrium lastning av oocyterna (ND9: receptet i Tabell 1). Tillägg av lösningen med 100 U / ml natrium penicillin och 100 | ig / ml streptomycin sulfat för att förhindra bakterietillväxt. Noggrant hantera äggceller för att begränsa mängden av skadade eller döda ägg och behålla dem i enskilda små grupper i en 12-väl-plattbrunnar fyllda med bad lösning under de två dagar efter Crna injektionen.
2. Att utföra två-elektrodspänning-clamp Experiment
- Mät oocyter två dagar efter injektionen.
- Fyll en spruta med en gravitation utfodras perfusion systemet med ND96-lösning och en annan spruta med ND96-lösning innehållande amilorid (2 M). Mount sprutor 50 cm ovanför äggcellen badkammaren. OBS: Koncentrationen av ENaC hämmaren amilorid den valdes för att vara 20 gånger högre än IC 50
- Sätt på en 150 W halogen kall ljuskälla och anpassa den till 10 cm över äggcellen badkammaren möjliggör god visualisering med kikare mikroskop. Slå sedan på sug och justera sugröret i slutet av äggcellen badkammaren. Leta sugröret motsatt super tuber "adapter in i äggcellen badet. OBS: Sugeffekt måste vara tillräcklig för att stödja kontinuerligt flöde av lösningen superfusing äggcellen.
- Justera superhastighet av varje lösning till 3-5 ml / min med hjälp av iv gravitationsflödeskontroll-enhet. Anslut superrören med en adapter till äggcellen badkammaren.
- Dra glas kapillärer med en mikropipett avdragare för att få spetsdiametrar av <1 mikrometer. Fyll sedan kapillärer till ~ 1/4 med 3 M KCl. OBS: Se till att det klorerade delen av silvertråd i elektrodhållaren är nedsänkt i KCl-lösning. Kontrollera om det finns luftbubblor i spetsen på kapillären. Luftbubblor försämra mätrement genom ökande motstånd strökapacitans.
- Sätt kapillärerna in i elektrodhållare av den nuvarande och den spänningselektrod och placera dem i ND96 innehåller amilorid (2 M)-lösning med hjälp av mikro-manipulatorer.
3. Mätning av Amiloride känsliga Hel-cell Currents
- Noll elektrodpotentialen hos spänningselektrod (Vm) och den aktuella elektroden (V e) genom justering av Vm och V e offset knappar. OBSERVERA: Resistansen ska vara 1-2 Mohm för elektroden för att mäta V m och 0,5 -1 Mohm för den aktuella injektionselektrod.
- Placera oocyt i badet kammaren i omedelbar närhet till den spännings avkänningselektroden. OBSERVERA: Skada inte äggcellen under någon av dessa överföringssteg. Använd en Pasteur pipett överföra äggcellen. För att undvika skador på äggcellen kanterna på pipetten skall avtrubbas genom flambering.
- Impale oocyter försiktigt med båda mikroelektroder.
- Ställ hållpotential på förstärkaren till -60 mV och slår på kortskrivaren. Sätt på amilorid (2 M) som innehåller lösning. OBS: Strömmen bör vara ca 0 ± 0,5 iA. Större läckströmmar indikerar en läckande impalement. Därför bör dessa äggceller avvisas. Dessutom bör de läckströmmar som uppmätts i närvaro av amilorid (2 ^ M) vara liknande i αβγ-WT uttrycka oocyter till de som uppmätts i αβγ-mutant ENaC uttrycker oocyter. Detta tyder på att mutationerna inte påverkar amilorid-känsligheten för kanalen.
- Starta inspelningen. Vid behov justera förstärkningen.
- När den uppmätta strömmen når en stabil platå, byta till amilorid fria lösningen. OBSERVERA: Nedåtgående nuvarande nedtryckning för de aktuella spåren motsvarar aktiv strömmar, dvs flödet av positiv laddning (Na *) från det extracellulära sida in i cellen.
- After en strömplatå uppnåtts (efter ~ 60 sek), växla super tillbaka till amilorid lösningen. Efter den nuvarande av äggcellen når det initiala utgångsström, stäng av spänningsklämman och försiktigt dra tillbaka elektroderna.
- För att möjliggöra återförslutning av plasmamembranet vid platserna för impalement, placera ägget i en brunn på en 96-brunnar innehåller 100-150 pl proteas fri ND96-lösning.
- Efter 5 min, överföra oocyten till ett proteas som innehåller lösning eller till en kontrollösning utan proteas för en 30 min inkubation tid. OBS: Inkubationstiden beror på proteaset och den studerade kanal.
- Efter inkuberingssteget upprepa den aktuella mätningen (se 3.2 och följande). OBS: Det är möjligt att mäta> 90% av ägg efter inkubation i proteas-lösning.
4. Biotinylering analys
- Välj och kassera defekta ägg under binokulärt mikroskop. OBS: Använd injiceraed ägg från samma parti för strömmätning och för biotinylation experiment.
- Håll biotin vid RT under minst 20 min före användning i experimentet.
- Förbered lösningarna: ND96 och ND96 innehåller lämplig proteas. Förbered Pasteur pipetter genom att märka dem och genom att kort flammande sina tips för att undvika skador av oocyter. ANMÄRKNING: Här proteaset kymotrypsin 2 | ig / ml i ND96 användes. Behandla varje grupp med en separat pipett för att undvika korskontaminering av lösningar.
- Fyll varje brunn i en 6-brunnsplatta med 2,5 ml kontroll ND96 eller ND96 innehållande ett proteas vid RT. Deponera Därefter 30 oocyter per brunn och inkubera dem i 30 min vid RT. OBS: För de efterföljande förfaranden är det viktigt att hålla prover på is hela tiden. Alla centrifugeringssteg på utförs vid 4 ° C.
- Fyll varje brunn i en ny 6-brunnar med 2,5 ml ND96 (varje grupp behöver 3 brunnar för tvättsteg) och väga biotin. NOTERA: 2,5 mg biotin pER brunn (1 mg / ml) krävs. Upplös biotin i biotinylering buffert (dvs 25 mg biotin (för 10 grupper) i 25 ml biotinylering buffert (recept i tabell 1).
- Överför varje grupp av äggceller till en väl fylld med 2,5 ml ND96. Överför oocyter sekventiellt i ytterligare två brunnar med ND96 att tvätta bort eventuellt kvarvarande proteas. Inkubera ägg i 5 minuter i ND96.
- Överför oocyterna i en brunn innehållande 2,5 ml biotin-lösning och inkubera dem under försiktig omrörning (shaker) under 15 min. OBS: Minimera den överförda ND96 med pipetten för att undvika utspädning av biotin-lösning.
- Överför varje grupp av oocyter i en brunn innehållande 2,5 ml quench-buffert (recept i tabell 1) för att stoppa biotinylering reaktionen. Därefter överför varje grupp av oocyter in i en andra brunn som också innehåller 2,5 ml släcka buffert och inkubera under 5 min med försiktig omrörning.
- Ta bort skadade eller döda ägg. OBS!Välj samma antalet oocyter per grupp för följande förfarande.
- Överför varje grupp av oocyter till en 1,5 ml plast mikrocentrifugrör. OBS: Minimera mängden av dämpning buffert som överförs.
- Därefter lysera oocyter genom att passera dem genom en 27 G nål i 1 ml lysbuffert (recept se tabell 1) kompletterat med proteashämmare.
- Centrifugera lysaten under 10 min vid 1500 x g..
- Aspirera supernatanten och överför den till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande 0,5% Triton-X-100 och 0,5% NP40. Kassera den återstående pelleten. OBSERVERA: Supernatanten innehåller biotinylerade plasmamembranproteiner och icke-biotinylerade intracellulära proteiner.
- Inkubera mikrocentrifugrör under 20 min på is. Upprepade gånger vortex rören under denna period för att helt lösa upp proteinerna i NP40 och Triton-X-100.
- Centrifug 100 pl agarospärlor per äggcellen grupp för 3 min vid 1500 x g.. Efter det attcentrifugering avlägsna supernatanten från lösningen pärlorna och tvätta tre gånger med lysbuffert ekvilibrera pärlorna med buffert.
- Pipettera 100 | il av de tvättade pärlorna i varje mikrocentrifugrör innehållande den protein-detergent-lösning framställd i 4,13 för att medge bindning av de biotinylerade proteiner till pärlorna.
- Inkubera mikrocentrifugrör med overhead rotation O / N vid 4 ° C.
- Centrifugera mikrocentrifugrör för 3 min vid 1500 x g.. Sedan överföra supernatanten till ett nytt rör. OBSERVERA: Intracellulära proteiner är inte märkt med biotin. Supernatant kan lagras vid -20 ° C. Inte aspirera pärlorna.
5. Detektion av ENaC klyvningsfragment på cellytan genom Western blot-analys
- Tvätta pärlorna tre gånger med lyseringsbuffert och tillsätt 100 | il av 2x SDS-PAGE-provbuffert. NOTERA: Prov kan förvaras vid -20 ° C eller omedelbart förbereds för western blot-analys.
- Boil sempel på 5 min vid 95 ° C, och sedan placera rören på is.
- Centrifugera prover för 3 min vid 20000 x g och pipettera supernatanten till ett nytt mikrocentrifugrör. OBS: Denna supernatant innehåller de biotinylerade plasmamembranproteiner från cellytan av oocyten.
- Analysera 30 pl av denna supernatant genom western-blot för att undersöka klyvningsfragment på cellytan.
- Separera de biotinylerade proteinerna genom SDS-PAGE (natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores) användning av en lämplig gel (8%, 10%, 12%, beroende på molekylvikten för de klyvningsfragment som undersökts).
- Överför de proteiner till polyvinylidendifluorid (PVDF) membran genom halvtorr blotting.
- Probe membranet med en specifik antikropp mot human γENaC riktad mot en epitop i C-terminalen (se fig. 3 och 13).
- Använd pepparrotsperoxidas-märkt get-anti-kaninantikropp som sekundärt antikropp.
- Detect kemiluminiscenta signaler.
Representative Results
För att undersöka huruvida serinproteaset plasmin kan aktivera ENaC-medierade strömmar, var AI ami enskilda ENaC-uttryck oocyter bestämdes före och efter 30 min inkubation av oocyter i proteas-fri (kontroll) (figur 2A) eller plasmin innehållande lösning (Figur 2B) med användning av två-elektrodspänning-clamp-tekniken (se figur 1). Exponering för plasmin ökade AI ami i varje äggcell mätt. Däremot i kontrollexperiment 30 min inkubation av ENaC-uttryck oocyter i proteas-fri lösning hade en försumbar effekt (figur 2 C, D). Således, genom att använda denna metod en stimulering av ENaC medierad ström genom plasmin kan detekteras.
För att studera effekterna av att mutera förmodade klyvningsställen vid aktivering av ENaC-medierade strömmar, samt på kanal klyvning, var effekten av chymotrypsin på WT-ENaC jämfört med det påen mutant ENaC med muterad prostasin och plasminspjälkning platser (γ RKRK178AAAA, K189A). Tidsförloppet för kanalaktivering genom kymotrypsin samt utseende ENaC spjälkningsprodukter på cellytan undersöktes med hjälp av olika proteas inkuberingstider (Figur 4A). Det visades att de mutanta kanalfördröjningar och minskar aktiveringen av ENaC medierad ström genom kymotrypsin. Detta motsvaras av en fördröjd utseendet av en lägre molekylvikt γENaC klyvningsfragment av 67 kDa som motsvarar det helt kluvna subenheten. Cleavage fragmenten detekterades med användning av en γENaC antikropp riktad mot en epitop i C-terminalen (Figur 3). Denna metodik visar att tidsförloppet av proteolytiska aktivering av ENaC-medierade strömmar korrelerar med utseendet på en 67 kDa γENaC klyvningsprodukt vid cellytan (Figur 4 B, C). Detta stöder tanken på ettorsakssamband mellan proteolytiska kanal klyvning och kanalaktivering 13. Vidare genom att kombinera strömmätningar och för att upptäcka γENaC fragmenten på cellytan har det visats att de muterade klyvningsställen är funktionellt relevant för proteolytisk kanalaktivering.
Figur 1. Förfarande för bestämning av den stimulerande effekten av ett proteas på ENaC heterologt uttryckta i Xenopus laevis-oocyter. ENaC Aktiviteten uppskattas genom mätning av amilorid-känsliga helcell-spänningskomponenten AI ami.
Figur 2. Plasmin stimulerar ENaC-medie currents i oocyter uttryck ENaC. (AD) Oocyter uttrycker humant ENaC inkuberades under 30 min i proteas-fri lösning (kontroll) eller i lösning innehållande plasmin (10 | ig / ml). För att bestämma AI ami före (-) och efter (+) inkubation oocyter fastklämd vid en anläggning potential -60 mV (A, B) Fyra representativa hel-cell nuvarande spår från en sats av oocyter.. Amiloride (ami) var närvarande i badet lösningen att specifikt hämma ENaC som indikeras av svarta fält. (C) Datapunkter från en enskild äggcell är förbundna med en linje. (D) Sammanfattning av liknande experiment som visas i C. Kolumner representerar relativ stimulerande effekt på aI ami beräknas som förhållandet av AI ami mättes efter en 30 min inkubation (aI ^ ami 30 min) till den första AI ami (aI ^ ami initial) mätt före inkubering. Siffror inom kolumnerna angerantal enskilda oocyter mätta. N anger antalet olika partier av ägg. (Denna siffra har modifierats [Haerteis et al 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, doi:. 10.1085/jgp.201110763])
Figur 3. Modell av γENaC subenheten visar klyvningsställen för proteolytisk aktivering och bindningsstället för den antikropp som används. Proteolytisk klyvning genom Golgi-associerad konvertas furin är viktigt för ENaC mognad i den biosyntetiska vägen innan kanalen når plasmamembranet. Efter klyvning med furin ett fragment 76 kDa kan detekteras på cellytan med användning av ett biotinylerings tillvägagångssätt och en antikropp mot en epitop i den C-terminalen av γ-subenheten. Den pivotala sista steget i proteolytiska SVaC aktivering äger förmodligen rum vid plasmamembranet där γENaC klyvs av extracellulära proteaser (t.ex. plasmin eller kymotrypsin) i ett område distalt furinsätet resulterande i en 67 kDa-klyvningsfragment. (Denna siffra har modifierats [Haerteis et al 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, doi:. 10.1085/jgp.201110763])
Figur 4:. Mutera både plasmin (K189) och klyvningsstället prostasinliknande (RKRK178) fördröjer aktiveringen av ENaC-medieströmmar och uppträdandet av en 67 kDa klyvningsprodukt av kanalens γ-subenheten oocyter uttryck WT (ofyllda symboler) och γ RKRK178AAAA; K189A ENaC mutant kanal (fyllda symboler) inkuberades under 30 min i proteas-fri lösning (kontroll) eller efter 5, 30, eller 60 min i en lösning innehållande kymotrypsin (2 | ig / ml). (A) För att bestämma aI ^ ami före och efter inkubering oocyter fastklämd vid en hållpotential av -60 mV. Cirklar representerar förhållandet av AI ami uppmättes efter 5, 30, eller 60 min inkubation (aI ^ ami min) till den första AI ami (aI ^ ami initial) mätt före inkubering. Varje datapunkt representerar medelvärdet AI ami mätt i 22-24 enskilda oocyter av fyra olika satser. (BD) Parallellt med detekteringen av aI ^ ami, uttryck av biotinylerat γENaC vid cellytan analyserades genom SDS-PAGE. γENaC detekterades med en antikropp mot en epitop i den C-terminalen av humant γENaC. Representativa western blöts från en sats av oocyter visas. (CE) Densitometrisk analys av tre western blottar som liknar de som visas i B eller D. För varje bana, de signals upptäckts i regionerna 76 kD (öppna kolumner) och 67 kD (grå staplar) bestämdes och normaliserades med summan av den totala signal detekterats. N anger antalet olika partier av ägg. Klicka här för att visa en större bild.
Discussion
I detta manuskript en metodologisk ansats som framgångsrikt tillämpades för att studera mekanismerna bakom aktiveringen av ENaC av proteaser beskrivs 8,13. Den väletablerade Xenopus laevis oocyt expressionssystem användes för att funktionellt uttrycka ENaC. ENaC funktion bedömdes med den konventionella två-elektrodspänning-clamp teknik. Ställesriktad mutagenes användes för att identifiera funktionellt relevanta proteas-klyvningsställen. Biotinylation experiment som utförts parallellt med de elektrofysiologiska mätningar gjort det möjligt att korrelera uppkomsten av ENaC spjälkningsprodukter på cellytan med proteolytiska nuvarande aktivering. En korrelation mellan tidsförloppet av aktuell aktivering och uppkomsten av proteolytiska klyvningsfragment på cellytan stöder idén om proteolytiska kanalaktivering.
Två-elektrodspänning-clamp inspelningar kräver impalement av en oocyte med två mikroelektroder. Proceduren utförs vanligtvis endast en gång i ett enskilt äggcellen. Det var emellertid möjligt att avlägsna de mikroelektroder efter en initial hel-cell aktuella inspelningen utan uppenbar skada på oocyten. I själva verket tycks plasmamembranet vid ställena för impalements att återförsluta inom några få minuter. Alltså, efter att ha avslutat en första två-elektrodspänningsklämma mätning, är det möjligt att överföra äggcellen från den experimentella flödeskammaren i två-elektrodspänningsklämma inställning till ett mikrofugrör eller en brunn på en 96-hålsplatta fylld med en liten volym av test-eller kontrolllösningen. Efteråt kan samma äggcellen föras tillbaka till flödet kammaren och kan spetsas igen för att utföra en andra två-elektrodspänningsklämmätning. Remarkably lämnade ENaC-medierade strömmar inte variera mycket mellan de första och andra mätningen när oocyten bibehölls i kontrollösning. Däremot inkubation av oocyten i en proteas innehållande solution efter den första mätningen gav ökad ENaC medierad ström i den andra mätningen (Figur 2). Detta indikerar proteolytiska kanalaktivering.
Performing två separata strömmätningar i en enda oocyt erbjuder fördelen att oocyten kan exponeras för proteaser eller andra farmakologiska medel mellan de två mätningarna för en variabel tidslängd i en liten volym av testlösning. Detta är viktigt när man använder medel som är dyra och / eller otillgänglig i stora mängder, t.ex. renade proteas preparat. Den begränsade tillgången på medel kan göra det omöjligt (eller dyr) att använda dem i kontinuerlig två-elektrodspänning-clamp inspelningar på grund av de stora volymer av testlösning som krävs för att kontinuerligt superfusing oocyter med flöden från flera milliliter per minut. Vidare är kontinuerliga två-elektrodspänningsklämma mätningar begränsas av den välkända phenomEnon av spontan kanal genomgång beskrivs också för ENaC 15. Däremot exponera oocyterna för att testa lösningar mellan två separata mätningar i upp till en timme eller mer i allmänhet inte utgöra ett problem (se figur 4A). Slutligen två sekventiella mätningar som utförs i samma äggcellen tillåter parade observationer av läkemedelseffekter. Detta har en fördel jämfört oparade mätningar från två separata grupper av ägg (proteas-behandlade och fordon-behandlad), eftersom det minskar problemet med hög variabilitet mellan ägg, vanligen observerats i jonkanal uttryck. Med parade observationer och möjligheten att normalisera data till den första mätningen är färre oocyter behövs per experimentgrupp för att visa en signifikant effekt av ett farmakologiskt medel. Normalisering av data gör det också enkelt att sammanfatta data från olika partier av ägg med olika jonkanal uttrycksnivåer och därmed olika grundlinjeströmmar (Figur 2D). Självklart, kontrollförsök är nödvändiga för detta tillvägagångssätt för att visa att jonkanalaktiviteten av intresse är fortsatt stabil i fordonsbehandlade kontroll äggceller från den första till den andra mätningen (se figur 2).
För att demonstrera att proteolytisk aktuella aktiverings korrelerar med uppträdandet av ENaC klyvningsprodukterna vid cellytan, en biotinylering tillvägagångssätt som ursprungligen beskrivits av Harris et al. 9 kan användas. Detta förfarande (enligt beskrivningen i protokollenheten och visas i Figur 4) har anpassats för att demonstrera att exponering av kanaler att proteaser och efterföljande aktivering av ENaC-medierade strömmar är parallellt med den tidsberoende utseendet på klyvningsfragment. Den biotinylation Metoden gör det också möjligt att analysera en ökning eller minskning av membranproteiner på cellytan. Således är denna metod lämplig för att undersöka effekten av proteaser och andra farmamacological ombud när kanal insättning i plasmamembranet eller vid kanal hämtning. Dessutom tillåter western blot-analys av de biotinylerade plasmamembranproteiner detektering av proteinfragment (t.ex. proteolytiska ENaC fragment) eller förändringar i glykosyleringsmönstret som kan vara funktionellt relevanta.
Sammanfattningsvis, en kombination av metoder som används för att undersöka den stimulatoriska effekten av proteaser på ENaC-medierade helcell-strömmar och för att visa en korrelation med förekomsten av ENaC klyvningsprodukterna vid cellytan kan vara användbara för ett brett spektrum av tillämpningar. I synnerhet kan dessa metoder vara lämpliga att ta upp liknande frågor beträffande regleringen av andra jonkanaler, transportörer eller transmembranreceptorer (t.ex. proteas-aktiverade receptorer Pars).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Bath clamp headstage for OC-725C-V | Warner Instrument Corporation | ||
| Cold light source - Schott KL 1500 LCD | Schott | #SCOC150200EU | brightness 4; mechanical aperture: D; color temperature: 3,000 K |
| E Series electrode holder (Str, Vent, Ag Wire, 1.2 mm) | ADinstruments | #ESW-F10v | |
| Left micromanipulator; MM-33L | Warner Instrument Corporation | #64-0055 | |
| LIH 1600 - computer interface | HEKA | ||
| Magnetic valve system (ALA BPS-8) in combination with a TIB14 interface (HEKA) | ALA Scientific Instruments, HEKA | ||
| OC-725C amplifier for two-electrode voltage-clamp recordings | Warner Instrument Corporation | ||
| P-97 FLAMING/BROWN Micropipette Puller | Sutter Instruments | heat = 550; velocity = 22; time = 200 | |
| Right micromanipulator; MM-33R | Warner Instrument Corporation | #64-0056 | |
| Series electrode holder (45°, Vent, Handle, Ag Wire, 1.2 mm) | ADinstruments | #E45w-f10vh | |
| STAT 2 IV gravity flow controller | Conmed | #P-S2V-60 | |
| Vacuum generator ejector SEG - for suction to remove bath solution | Schmalz | ||
| INFUJECT 60 ml pump syringes for solutions | Braun | #22050 | |
| Injekt-F for lysing the oocytes | Braun | #9166033V | |
| Standard wall borosilicate tubing with filament | Sutter Instruments | #BF150-86-10 | outside diameter: 1.5 mm; inside diameter: 0.86 mm; length: 10 cm |
| Complete, Mini, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Applied Science | #11836170001 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | #21217 | |
| Horseradish peroxidase-labeled secondary goat anti-rabbit antibody | Santa Cruz Biotechnology | #sc-2004 | |
| NeutrAvidin Agarose | Thermo Scientific | #29200 | Neutravidin-labeled agarose beads |
| NP40 (Nonidet P-40) | Sigma-Aldrich | #I8896 | |
| Roti-Load 1 (2x SDS-PAGE sample buffer) | Carl Roth | #K929.2 | |
| SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate for detection of chemiluminescent signals | Thermo Scientific | #34095 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | #T8787 |
References
- Kleyman, T. R., Carattino, M. D., Hughey, R. P. ENaC at the cutting edge: regulation of epithelial sodium channels by proteases. The Journal of Biological Chemistry. 284, 20447-20451 (2009).
- Rossier, B. C., Stutts, M. J. Activation of the epithelial sodium channel (ENaC) by serine proteases. Annu Rev Physiol. 71, 361-379 (2009).
- Poirot, O., Vukicevic, M., Boesch, A., Kellenberger, S. Selective regulation of acid-sensing ion channel 1 by serine proteases. The Journal of Biological Chemistry. 279, 38448-38457 (2004).
- Vukicevic, M., Weder, G., Boillat, A., Boesch, A., Kellenberger, S. Trypsin cleaves acid-sensing ion channel 1a in a domain that is critical for channel gating. The Journal of Biological Chemistry. 281, 714-722 (2006).
- Clark, E. B., Jovov, B., Rooj, A. K., Fuller, C. M., Benos, D. J. Proteolytic cleavage of human acid-sensing ion channel 1 by the serine protease matriptase. The Journal of Biological Chemistry. 285, 27130-27143 (2010).
- Ossovskaya, V. S., Bunnett, N. W. Protease-activated receptors: contribution to physiology and disease. Physiological reviews. 84, 579-621 (2004).
- Garcia-Caballero, A., et al. Activation of the epithelial sodium channel by the metalloprotease meprin β-subunit. Channels (Austin. 5, 14-22 (2011).
- Haerteis, S., et al. Proteolytic activation of the epithelial sodium channel (ENaC) by the cysteine protease cathepsin-S. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 464, 353-365 (2012).
- Harris, M., Firsov, D., Vuagniaux, G., Stutts, M. J., Rossier, B. C. A novel neutrophil elastase inhibitor prevents elastase activation and surface cleavage of the epithelial sodium channel expressed in Xenopus laevis oocytes. The Journal of Biological Chemistry. 282, 58-64 (2007).
- Passero, C. J., Mueller, G. M., Rondon-Berrios, H., Tofovic, S. P., Hughey, R. P., Kleyman, T. R. Plasmin activates epithelial Na+ channels by cleaving the γ-subunit. The Journal of Biological Chemistry. 283, 36586-36591 (2008).
- Svenningsen, P., et al. Plasmin in nephrotic urine activates the epithelial sodium channel. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 20, 299-310 (2009).
- Patel, A. B., Chao, J., Palmer, L. G. Tissue kallikrein activation of the epithelial Na channel. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 303, (2012).
- Haerteis, S., Krappitz, M., Diakov, A., Krappitz, A., Rauh, R., Korbmacher, C. Plasmin and chymotrypsin have distinct preferences for channel activating cleavage sites in the γ-subunit of the human epithelial sodium channel. The Journal of General Physiology. 140, 375-389 (2012).
- Chraibi, A., Vallet, V., Firsov, D., Hess, S. K., Horisberger, J. D. Protease modulation of the activity of the epithelial sodium channel expressed in Xenopus oocytes. The Journal of General Physiology. 111, 127-138 (1998).
- Volk, T., Konstas, A. A., Bassalay, P., Ehmke, H., Korbmacher, C. Extracellular Na+ removal attenuates rundown of the epithelial Na+-channel (ENaC) by reducing the rate of channel retrieval. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 447, 884-894 (2004).
