Summary
הפעלת מפרקי חלבונים של ערוץ אפיתל נתרן (ENaC) הביע heterologously בXenopus laevis ניתן להדגים ביציות על ידי שילוב של מדידות זרם עם גישת biotinylation לחקור את המראה של מוצרי מחשוף ערוץ יון על פני התא. ניתן לזהות אתרי מחשוף חשובים ופונקציונליים באמצעות מכוון mutagenesis אתר.
Introduction
פרוטאזות הן אנזימים שמעורבים בתגובות פיסיולוגיות שונות הנעות בין השפלה מפרקי חלבונים הידועה של חלבונים, בהקשר של מערכת העיכול, למפלי פרוטאז מתוחכמים המעורבים במסלולי איתות רגולציה מורכבים. פרוטאזות מסווגות לשבע קבוצות על פי האתר הפעיל הקטליטית שלהם: aspartate, asparagine, ציסטאין, חומצה גלוטמית, metallo, סרין, ופרוטאזות תראונין. פרוטאזות שונות למקד לאתרי מחשוף ברורים שהם לא תמיד קלים לחזות מהמבנה הראשוני של חלבון. מסד הנתונים Merops (http://merops.sanger.ac.uk/) מספק מידע מפורט על מגוון רחב של פרוטאזות ואתרי המחשוף המועדף שלהם. ניתן לזהות אתרי מחשוף רלוונטיים מבחינה תפקודית באמצעות מכוון mutagenesis אתר.
היא מבוססת היטב כי עיבוד מפרקי חלבונים של ENaC הוא מנגנון חשוב של הפעלה של ההוא 1,2 ערוץ יון מסוים. מעניין, יש ראיות לכך שהפונקציה של 1a חישת החומצה הקשור ערוץ יון (ASIC1a) יכולה גם להיות שונה על ידי פרוטאזות 3-5. נכון לעכשיו היא נשארת שאלה פתוחה אם מחשוף ערוץ מפרקי חלבונים ממלא תפקיד פיסיולוגי רלוונטי בהסדרת פעילותם של תעלות יונים אחרות או מובילים. עם זאת, הוא מבוסס היטב כי מחשוף מפרקי חלבונים מפעיל קבוצה של קולטני G-חלבון בשילוב, הקולטנים מופעל פרוטאז (PARS) 6. פרוטאזות סרין כמה (פרוטאזות למשל הפעלת ערוצים (CAP1-3), chymotrypsin, טריפסין, furin, plasmin, elastase נויטרופילים, וkallikrein) הוכחו להפעיל proteolytically ENaC 2. בנוסף לפרוטאזות סרין, קבוצות אחרות של פרוטאזות עשויות להיות מעורבות בהפעלת ENaC מפרקי חלבונים. ואכן, הנתונים אחרונים מראה כי פרוטאינאז meprin-β 7 ופרוטאז ציסטאין cathepsin-S 8 יכול גם Activate ENaC. עם זאת, פרוטאזות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית (פתים-) להפעלת ENaC להישאר שייקבעו ועשויות להיות שונות מהרקמה לרקמה.
פרוטאזות ידועות לדבוק מעדיפים באתרים מסוימים ברצף חומצות אמינו. לדוגמא, chymotrypsin פרוטאז סרין מציג דפוס מחשוף ספציפי ביקוע אחרי חומצה אמינית ארומטיים שאריות פנילאלנין וטירוזין. לעומת זאת, טריפסין פרוטאז סרין מעדיף דבק לאחר יזין השאריות הבסיסי או ארגינין. באמצעות בונה γENaC אדם מוטציה שנוצרה על ידי מכוון mutagenesis אתר, אתרי מחשוף רלוונטיים מבחינה תפקודית בENaC הביעו heterologously במערכת ביטוי הביצית יכולים להיות מזוהים 8-13.
על ידי הזרקת קרנה ליחידות משנת שלוש ENaC (αβγ) לתוך ביציות מבודדות, ENaC יכול לבוא לידי ביטוי מבחינה תפקודית בתאים אלה ופעילותם של ערוצים נוכחים בקרום הפלזמה ניתן למדוד על ידיבאמצעות טכניקת המתח-clamp שתי אלקטרודות. על ידי שימוש באמילוריד משתן, מעכב ENaC ספציפי, רכיב אמילוריד רגיש בתיווך ENaC כל התא הנוכחי (ΔI עמי) יכול להיות מופרד מזרמי דליפה נוקבים או מזרמים שנערכו על ידי תעלות יונים אחרות. לפיכך, ערכי ΔI עמי משקפים פעילות ENaC כללית ויכולים שייקבעו על ידי הפחתת כל תא זרמים נמדדים בנוכחות אמילוריד מכל תא הזרמים המקביל נרשמו בהעדר אמילוריד. כדי לבדוק אם פרוטאז יש השפעה ממריצה על ENaC, ΔI עמי נמדד פעמיים באותו הביצית, כלומר לפני ואחרי הדגירה של הביצית בתמיסה המכיל פרוטאז. גידול של ΔI עמי מהראשון למדידה השנייה מציין הפעלת ENaC מפרקי חלבונים. Chymotrypsin או טריפסין ידוע כדי לעורר מקסימאלי ENaC במערכת ביטוי הביצית 2,14 וניתן להשתמש בם לconfirm כי הפעלת ENaC מפרקי חלבונים ניתן לזהות באצווה מסוימת של ביציות.
במקביל למדידות זרם כל התא, גישת biotinylation 9 הייתה בשימוש כדי לחקור האם הגידול בΔI עמי מזוהה עם חשיפה של הביציות לפרוטאזות בקורלציה עם הופעתו של ENaC מחשוף שברים על פני התא. חלבונים בתא השטח מסומנים עם ביוטין ויכולים להיות מופרדים מחלבונים תאיים באמצעות קשירת חלבוני biotinylated לחרוזי agarose כותרת Neutravidin. ניתן לנתח חלבוני biotinylated על ידי כתם מערבי. שברי מחשוף γENaC על פני התא ניתן לאתרם באמצעות נוגדן ספציפי המכוון כנגד אפיטופ בC-הסופית של γENaC. כדי לזהות את האתר רלוונטי מבחינה תפקודית מחשוף (ים), שחזה יכולים להיות מוטציה אתרי מחשוף שימוש מכוון mutagenesis אתר. ערוצי wildtype והמוטציה הם בהשוואה בניסויים מקבילים באמצעות ביציות מהיםאצווה איימי.
עם גישה המתודולוגית זה הודגם לראשונה כי הפעלת מפרקי חלבונים של כל תא זרמים בתיווך ENaC קורלציה עם המראה תלוי הזמן של ENaC מחשוף שברים על פני התא. תוצאות אלו מצביעות על קשר סיבתי בין מחשוף ערוץ והפעלת ערוץ. יתר על כן, באמצעות מכוון mutagenesis אתר של אתרי מחשוף המשוערת בשילוב עם הטכניקה של שתי האלקטרודה המתח-clamp, אתרי מחשוף רלוונטיים מבחינה תפקודית לplasmin, chymotrypsin 13 וcathepsin-S 8 זוהו.
Protocol
1. בידוד של ביציות Xenopus וMicroinjection של קרנה
- השג ביציות מlaevis Xenopus נקבה בוגרת. לטשטש בעלי חיים בMS222 0.2%, ולכרות אונות השחלות דרך חתך בבטן קטן.
- לבודד את הביציות משחלות האונות על ידי עיכול אנזימטי ב19 מעלות צלזיוס במשך שעה 3-4 עם 600-700 U / ml מסוג 2 collagenase מhistolyticum Clostridium המומס בתמיסת סידן חופשי OR2 (מתכון בטבלה 1).
- לבחירה, הנח את ביציות defolliculated בצלחת פטרי תחת מיקרוסקופ משקפת בנתרן גבוה המכיל פתרון (ND96: מתכון בטבלה 1).
- בחר ביציות V-VI במה ומניח אותם בצלחת פטרי נוספת עם פיפטה פסטר. הערה: פיפטה בלאנט פסטר ידי בוער כדי למנוע פגיעת ביצית.
- הזרק ביציות עם קרנה (למשל 0.2 ng למקטע αβγENaC). ממיסים cRNAs במי RNase ללא. הערה: סך הכלנפח מוזרק לתוך כל ביצית הוא 46 NL.
- חנות הזריקו ביציות ב19 ° C בתמיסת נתרן נמוכה כדי למנוע העמסת נתרן של הביציות (ND9: מתכון בטבלה 1). להשלים את הפתרון עם פניצילין 100 נתרן U / ml ו100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין סולפט כדי למנוע התפתחות חיידקים. לטפל בזהירות את הביציות כדי להגביל את כמות ביציות פגומות או מתות ולשמור אותם בקבוצות קטנות בודדות בבארות 12 גם צלחת מלאה בפתרון אמבטיה בשני הימים לאחר הזרקת קרנה.
2. ביצוע ניסויי מתח מהדק שתי אלקטרודות
- מדוד את ביציות יומיים לאחר ההזרקה.
- מלא מזרק אחד של מערכת הכבידה האכילה זלוף עם פתרון ND96 ועוד מזרק עם פתרון ND96 מכיל אמילוריד (2 מיקרומטר). הר מזרקים 50 ס"מ מעל חדר האמבטיה ביצית. הערה: הריכוז של אמילוריד מעכב ENaC נבחר להיות גבוה יותר 20 פעמים מאשר IC 50
- הפעל מקור אור קר 150 הלוגן W ולהתאים אותו ל10 ס"מ מעל חדר האמבטיה ביצית המאפשר ויזואליזציה טובה עם מיקרוסקופ המשקפת. לאחר מכן הפעל את השאיבה ולהתאים את צינור היניקה בסוף של חדר האמבטיה ביצית. מתאם לאתר ההפך צינור יניקה לsuperfusion צינורות "נכנס לאמבטיה הביצית. הערה: כוח היניקה חייב להיות מספיק כדי לתמוך בזרימה רציפה של הפתרון superfusing הביצית.
- התאם את מהירות superfusion של כל פתרון ל3-5 מיליליטר / דקה על ידי שימוש במכשיר בקרת הזרימה הכבידה iv. חבר את צינורות superfusion עם מתאם לתא האמבטיה ביצית.
- משוך נימי זכוכית עם חולץ micropipette להשיג בקטרים קצה <1 מיקרומטר. ואז למלא נימים ל~ 1/4 עם 3 M KCl. הערה: ודא שחלק כלור של חוט הכסף של בעל אלקטרודה הוא שקוע בפתרון KCl. הגעה לבועות אוויר בקצה של הנימים. בועות אוויר פוגעות בצפחותrement ידי הגדלת קיבול תועה התנגדות.
- הכנס את הנימים לתוך מחזיקי אלקטרודה של הזרם ומתח האלקטרודה ולהכניס אותם לתוך אמילוריד ND96 מכיל פתרון (2 מיקרומטר) באמצעות מיקרו-מניפולטורים.
3. מדידה של כל תא זרמים אמילוריד רגישים
- אפס פוטנציאל אלקטרודה של האלקטרודה המתח (מ 'V) ואת האלקטרודה הנוכחית (ה V) על ידי התאמה מ' V ו-e V לקזז כפתורי הערה:. ההתנגדות צריכה להיות 1-2 MΩ לאלקטרודה למדידה מ 'V ו0.5 -1 MΩ לאלקטרודה ההזרקה הנוכחית.
- מניחים את הביצית אל תוך חדר האמבטיה בקרבת האלקטרודה חישת מתח. הערה: אל תפגע בביצית במהלך כל שלבי העברה אלה. השתמש פיפטה פסטר להעביר את הביצית. כדי למנוע נזק לביצית הקצוות של פיפטה יש הקהה ידי בוער.
- לדקור את oocytes בעדינות עם שני microelectrodes.
- הגדר את פוטנציאל ההחזקה במגבר ל-60 mV ולהפעיל את רשמקול התרשים. הפעל את אמילוריד (2 מיקרומטר) המכיל פתרון. הערה: הנוכחי צריך להיות על 0 ± 0.5 μA. זרמי דליפה גדולים יותר מצביעים impalement דולף. לכן, יש לדחות ביציות אלה. יתר על כן, זרמי הדליפה שנמדדו בנוכחות אמילוריד (2 מיקרומטר) צריכים להיות דומים בαβγ-WT להביע ביציות לאלה שנמדדו בENaC αβγ מוטנטי להביע ביציות. זה מצביע על כך המוטציות אינן משפיעות על אמילוריד הרגישות של הערוץ.
- להתחיל בהקלטה. אם יש צורך להתאים את הרווח.
- לאחר הזרם הנמדד מגיע לרמה יציבה, לשנות לפתרון ללא אמילוריד. הערה: סטיות הנוכחיות כלפי מטה את העקבות הנוכחיות מתאימות לזרמים פנימה, דהיינו תנועה של מטען חיובי (Na +) מהצד תאי אל תוך התא.
- After הוא הגיע לרמה נוכחית (לאחר ~ 60 שניות), לעבור superfusion חזרה לפתרון אמילוריד מכיל. אחרי הנוכחי של הביצית מגיעה לנקודת ההתחלה הראשונית נוכחית, כבה את מהדק המתח והעדינות למשוך את האלקטרודות.
- כדי לאפשר הודבק מכתבים מחדש של קרום הפלזמה באתרי impalement, הנח את הביצית לאחד טוב של צלחת 96 היטב המכילה 100-150 μl של פתרון ND96 פרוטאז בחינם.
- אחרי 5 דקות, להעביר ביצית לפרוטאז המכיל פתרון או לפתרון שליטה ללא פרוטאז לזמן דגירה 30 דקות. הערה: זמן הדגירה תלוי בפרוטאז והערוץ למד.
- לאחר שלב הדגירה לחזור על המדידה הנוכחית (ראה 3.2 ובאים). הערה: אפשר למדוד> 90% מהביציות לאחר הדגירה בפתרון פרוטאז.
4. Biotinylation Assay
- בחר וזורקים ביציות פגומות מתחת למיקרוסקופ המשקפת. הערה: השתמש להזריקed ביציות מאותה אצווה למדידות זרם ולניסויי biotinylation.
- שמור ביוטין ב RT לפחות 20 דקות לפני השימוש בו בניסוי.
- הכן את הפתרונות: ND96 וND96 מכילים פרוטאז המתאים. הכן טפטפות פסטר על ידי התיוג ועל ידי בוער בקצרה העצות שלהם, כדי למנוע פגיעה בביציות. הערה: כאן, נעשה שימוש במיקרוגרם / מיליליטר chymotrypsin פרוטאז 2 בND96. טיפול בכל אחת מקבוצות עם טפטפת נפרד כדי למנוע זיהום צולב של פתרונות.
- מלא היטב בכל צלחת 6 היטב עם 2.5 מיליליטר שליטה ND96 או ND96 מכילה פרוטאז ב RT. לאחר מכן להפקיד 30 ביציות לכל היטב דגירתם ל30 דקות ב RT. הערה: לנהלים הבאים זה חשוב לשמור על דגימות קרח בכל העת. כל צעדי צנטריפוגה מבוצעים בב 4 ° C.
- מלא היטב בכל צלחת 6 היטב חדשה עם 2.5 ND96 מיליליטר (כל קבוצה צריכה 3 בארות לשלבי הכביסה) ולשקול את ביוטין. הערה: p ביוטין 2.5 מ"גאה כן נדרש (1 מ"ג / מיליליטר). ממיסים את יוטין במאגר biotinylation (כלומר 25 יוטין מ"ג (ל10 קבוצות) ב25 חיץ biotinylation מיליליטר (מתכון בטבלה 1).
- העבר את כל קבוצה של ביציות למלאו היטב עם ND96 2.5 מיליליטר. העברת ביציות ברצף לשתי בארות נוספות עם ND96 כדי לשטוף את כל פרוטאז שנותר. דגירה הביציות במשך 5 דקות בND96.
- מעביר את הביציות לפתרון ביוטין המכיל גם 2.5 מיליליטר דגירה אותם עם תסיסה עדינה ('שייקר') ל15 דקות. הערה: מזעור ND96 הועבר עם פיפטה כדי למנוע דילול של פתרון ביוטין.
- העבר את כל קבוצה של ביציות ל2.5 מיליליטר חיץ להרוות המכיל גם (מתכון בטבלה 1) כדי לעצור את תגובת biotinylation. לאחר מכן, להעביר את כל קבוצה של ביציות לתוך באר שני המכיל גם 2.5 מיליליטר להרוות את חיץ דגירה במשך 5 דקות עם תסיסה עדינה.
- הסר ביציות פגומות או מתות. הערה:בחר את אותו מספר ביציות לכל קבוצה להליך הבא.
- העבר את כל קבוצה של ביציות לצינור microcentrifuge פלסטיק 1.5 מיליליטר. הערה: מזער את הכמות של חיץ להרוות שמועבר.
- בהמשך לכך, lyse הביציות על ידי העברתם באמצעות מחט 27 G במאגר תמוגה מיליליטר 1 (מתכון ראה טבלה 1) השלים עם מעכבי פרוטאז.
- צנטריפוגה lysates 10 דקות ב 1,500 x גרם.
- לשאוב supernatant ולהעביר אותו לצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge מכיל 0.5% Triton-X-100 וNP40 0.5%. זורק את הכדור שנותר. הערה: supernatant מכיל חלבוני קרום פלזמה biotinylated וחלבונים תאיים שאינו biotinylated.
- דגירה צינורות microcentrifuge עבור 20 דקות על קרח. שוב ושוב מערבולת הצינורות בתקופה זו כדי להמס לחלוטין את החלבונים בNP40 וTriton-X-100.
- של חרוזים agarose לכל קבוצת ביצית במשך 3 דקות צנטריפוגה 100 μl ב1,500 x גרם. לאחרצנטריפוגה להסיר supernatant מפתרון חרוזים ולשטוף שלוש פעמים עם חיץ תמוגה לאזן את החרוזים עם חיץ.
- של חרוזים נשטפו לתוך צינור אחד microcentrifuge המכיל את החלבון-חומר ניקוי, הפתרון מוכן ב4.13 לאפשר מחייב של חלבוני biotinylated לחרוזי פיפטה 100 μl.
- דגירה צינורות microcentrifuge עם O הסיבוב תקורה / N ב 4 ° C.
- צנטריפוגה צינורות microcentrifuge 3 דקות ב 1,500 x גרם. לאחר מכן להעביר את supernatant לתוך צינור חדש. הערה: חלבונים תאיים אינם מסומנים עם ביוטין. Supernatant יכול להיות מאוחסן ב -20 ° C. לא לשאוב את החרוזים.
5. איתור של ENaC מחשוף רסיסים על פני התא על ידי ניתוח הכתם המערבי
- שטוף את החרוזים שלוש פעמים עם חיץ תמוגה ולהוסיף של חיץ מדגם SDS-PAGE 2x 100 μl. הערה: דוגמאות ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס או מייד מוכנה לניתוח כתם מערבי.
- רתיחה שלamples למשך 5 דקות על 95 מעלות צלזיוס ולאחר מכן צינורות מניחים על קרח.
- צנטריפוגה דגימות במשך 3 דקות ב20,000 XG ו פיפטה את supernatant לתוך צינור microcentrifuge חדש. הערה: supernatant זה מכיל חלבוני קרום הפלזמה biotinylated מתא השטח של הביצית.
- נתח 30 μl של supernatant זאת על ידי כתם מערבי לחקור ברי מחשוף על פני התא.
- הפרד את חלבוני biotinylated ידי-SDS (אלקטרופורזה נתרן גופרתי dodecyl polyacrylamide ג'ל) באמצעות ג'ל מתאים (8%, 10%, 12% בהתאם למשקל המולקולרי של שברי המחשוף נחקרו).
- מעביר את החלבונים לdifluoride polyvinylidene קרומים (PVDF) על ידי סופג חצי יבש.
- לחקור את הממברנה עם נוגדנים ספציפיים נגד γENaC האנושי המכוונים נגד אפיטופ בC-הסופית (ראה איור 3 ו13).
- השתמש בנוגדנים נגד ארנב עז שכותרת חזרת peroxidase כאנטי משנייםגוף.
- לזהות אותות chemiluminescent.
Representative Results
כדי לחקור האם plasmin פרוטאז סרין יכול להפעיל את הזרמים בתיווך ENaC, ΔI עמי של ביציות ENaC-להביע בודדות נקבע לפני ואחרי 30 דגירה דקות של הביציות בללא פרוטאז (שליטה) (איור 2 א) או בתמיסה המכיל plasmin (איור 2B) תוך שימוש בטכניקה של שתי האלקטרודה המתח-clamp (ראה איור 1). חשיפה לplasmin מוגברת ΔI עמי בכל ביצית שנמדדה. לעומת זאת, בניסויים שליטים, 30 דגירה דקות של ביציות ENaC-לבטא בפתרון נטול פרוטאז הייתה השפעה זניחה (איור 2 C, D). לכן, על ידי שימוש בשיטה זו של גירוי הנוכחי בתיווך ENaC ידי plasmin ניתן לאתרם.
כדי לחקור את ההשפעות של מוטציה אתרי מחשוף המשוערת על ההפעלה של זרמים בתיווך ENaC, כמו גם על מחשוף ערוץ, את ההשפעה של chymotrypsin על WT-ENaC הושוותה עם זה עלENaC מוטציה עם prostasin מוטציה ואתרי מחשוף plasmin (RKRK178AAAA γ; K189A). במהלך הפעלת ערוץ על ידי chymotrypsin כמו גם את המראה של ENaC מחשוף מוצרים על פני תא הזמן נחקר על ידי שימוש פעמים דגירה פרוטאז שונות (איור 4 א). זה היה הוכיח כי עיכובי ערוץ המוטציה ומפחיתים את ההפעלה הנוכחית בתיווך ENaC ידי chymotrypsin. זה הקביל להופעה מאוחרת של שבר נמוך מולקולרי γENaC משקל מחשוף של 67 kDa המתאימים למקטע ביקע באופן מלא. שברי מחשוף התגלו באמצעות נוגדן γENaC המכוון נגד אפיטופ בC-הסופית (איור 3). גישה המתודולוגית זה מוכיחה כי במהלך הפעלת מפרקי חלבונים של זרמים בתיווך ENaC הזמן בקורלציה עם הופעתו של מוצר מחשוף 67 kDa γENaC על פני התא (איור 4 ב ', ג'). זו תומכת ברעיון שלקשר סיבתי בין מחשוף ערוץ מפרקי חלבונים והפעלת ערוץ 13. יתר על כן, על ידי שילוב של מדידות זרם וזיהוי של שברי γENaC בתא השטח זה היה הוכיח כי אתרי מחשוף המוטציה הם מבחינה פונקציונלית רלוונטיים להפעלת ערוץ מפרקי חלבונים.
איור 1. נוהל קביעת האפקט של גירוי פרוטאז על ENaC הביע heterologously בXenopus laevis ביציות. פעילות ENaC מוערכת על ידי מדידת רכיב כל תא אמילוריד רגיש הנוכחי ΔI עמי.
איור 2. Plasmin מגרה curren תיווך ENaCts בביציות להביע ENaC. ביציות (AD) להביע ENaC אדם הודגרו למשך 30 דקות בתמיסה נטול פרוטאז (שליטה) או בתמיסה המכילה plasmin (10 מיקרוגרם / מיליליטר). כדי לקבוע ΔI עמי לפני (-) ואחרי דגירה (+), ביציות היו מהודקות בפוטנציאל החזקת -60 mV (A, B) ארבע עקבות הנוכחיות נציג כל התא מצרור אחד של ביציות.. אמילוריד (עמי) היה נוכח בפתרון האמבטיה לעכב באופן ספציפי ENaC כפי שצוין על ידי פסים שחורים. (C) נקודות נתונים שהתקבלו מביצית בודדת מחוברים על ידי קו. סיכום (ד ') של ניסויים דומים כפי שמוצגים בעמודות ג מייצגים אפקט של גירוי יחסי בΔI עמי מחושב כיחס בין ΔI עמי נמדד לאחר דגירה 30 דקות (ΔI עמי 30 דקות) לΔI עמי הראשוני (הראשוני ΔI עמי) נמדדה לפני הדגירה. מספרים בתוך העמודות מצביעיםמספר הביציות בודדות שנמדדו. N מציין את מספר קבוצות השונות של ביציות. (נתון זה שונה מ[ Haerteis אח' 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, doi:. 10.1085/jgp.201110763])
איור 3. דגם של אתרי מחשוף המקטע מראה γENaC להפעלת מפרקי חלבונים ואתר הקישור של הנוגדן בשימוש. מחשוף פרוטאוליטי ידי furin convertase קשור-Golgi הוא חשוב להתבגרות ENaC במסלול biosynthetic לפני הערוץ מגיע קרום הפלזמה. לאחר המחשוף ידי furin בר kDa 76 ניתן לאתרם בתא השטח באמצעות גישה biotinylation ונוגדנים נגד אפיטופ בC-הסופית של γ-למקטע. השלב הסופי המכריע בEN פרוטאוליטיהפעלת aC כנראה מתרחשת בקרום הפלזמה שבי γENaC הוא ביקע ידי פרוטאזות תאיים (למשל plasmin או chymotrypsin) באזור דיסטלי לאתר furin וכתוצאה מכך שבר מחשוף 67 kDa. (נתון זה שונה מ[ Haerteis אח' 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, doi:. 10.1085/jgp.201110763])
איור 4:. מוטציה שני plasmin (K189) ואתר prostasin מחשוף (RKRK178) מעכבת את ההפעלה של זרמים בתיווך ENaC והמראה של מוצר מחשוף 67 kDa של γ-למקטע של ערוץ ביציות להביע WT (סימנים פתוחים) ו γ RKRK178AAAA; ערוץ K189A ENaC מוטציה (סימנים סגורים) הודגרו למשך 30 דקות בתמיסה נטול פרוטאז (שליטה) או ל5, 30, או 60 דקות בתמיסה המכילה chymotrypsin (2 מיקרוגרם / מיליליטר). () כדי לקבוע ΔI עמי לפני ואחרי הדגירה, ביציות היו מהודקות בפוטנציאל החזקת -60 mV. עיגולים מייצגים את היחס של ΔI עמי נמדד לאחר 5, 30, או 60 דגירה דקות (דקות ΔI עמי) לΔI עמי הראשוני (הראשוני ΔI עמי) נמדד לפני הדגירה. כל נקודת נתונים מייצגת את ΔI עמי הממוצע שנמדד ב22-24 ביציות בודדות מארבע קבוצות שונות. (BD) במקביל לגילוי של ΔI עמי, ביטוי של γENaC biotinylated על פני התא נותח על ידי-SDS. γENaC זוהה עם נוגדנים נגד אפיטופ בC-הסופית של γENaC האנושי. ניתוח densitometric כתמים מערביים נציג מצרור אחד של ביציות מוצגים. (CE) של שלושה כתמים מערביים דומים לאלו המוצגות בB או ד לכל מסלול, יםignals זוהה באזורים של 76 KD (עמודות פתוחות) ו67 KD (עמודות אפורות) נקבעו ומנורמל לסכום של האות בסך הכל זוהתה. N מציין את מספר קבוצות השונות של ביציות. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Discussion
בכתב היד הזה גישה המתודולוגית שיושמה בהצלחה ללמוד את מנגנוני ההפעלה של ENaC ידי פרוטאזות מתוארת 8,13. המערכת המבוססת היטב Xenopus laevis ביצית הביטוי שימשה לENaC תפקודי המפורש. פונקצית ENaC הוערכה עם טכניקת המתח-clamp שתי אלקטרודות הקונבנציונלית. מכוון mutagenesis אתר הועסק כדי לזהות אתרי מחשוף פרוטאז רלוונטיים מבחינה תפקודית. ניסויי biotinylation בוצעו במקביל למדידות אלקטרו אפשרו לתאם את המראה של ENaC מחשוף מוצרים על פני התא עם הפעלה נוכחית מפרקי חלבונים. קורלציה בין מהלך הזמן של הפעלה הנוכחית ואת המראה של שברי מחשוף מפרקי חלבונים בתא השטח תומכת ברעיון של הפעלת ערוץ מפרקי חלבונים.
הקלטות המתח-clamp שתי אלקטרודות דורשות impalement של oocyte עם שני microelectrodes. הליך זה מבוצע בדרך כלל פעם אחת בלבד בביצית בודדת. עם זאת, זה היה אפשרי על מנת להסיר את microelectrodes לאחר הקלטה נוכחית כל תא ראשוני ללא נזק נראה לעין לביצית. ואכן, קרום הפלזמה באתרי impalements נראה לחתום מחדש תוך כמה דקות. לפיכך, לאחר שסיים את מדידת המתח-clamp שתי האלקטרודה ראשונה, זה אפשרי להעביר את הביצית מתא הזרימה הניסיונית של התקנת המתח-clamp שתי אלקטרודות לצינור microfuge או גם צלחת 96 היטב מלאה נפח קטן של פתרון מבחן או שליטה. לאחר מכן, באותה הביצית יכולה להיות מועברת חזרה לתא הזרימה והוא יכול להיות משופד שוב לבצע מדידת המתח-clamp שתי האלקטרודה שנייה. למרבה הפלא, זרמים בתיווך ENaC לא משתנים הרבה בין המדידה הראשונה ושנייה, כאשר הביצית נשמרה בפתרון שליטה. לעומת זאת, דגירה של הביצית בסול פרוטאז המכילution אחרי המדידה הראשונה הביא הנוכחי בתיווך ENaC המוגבר במדידה השנייה (איור 2). ממצא זה מצביע על הפעלת ערוץ מפרקי חלבונים.
ביצוע שתי מדידות זרם נפרדות בביצית אחת מציע את היתרון שהביצית יכולה להיות חשופה לפרוטאזות או סוכנים תרופתיים אחרים בין שתי המדידות לאורך זמן משתנה בנפח קטן של פתרון מבחן. זה חשוב כאשר משתמשים בסוכנים שהם יקרים ו / או לא זמינים בכמויות גדולות, למשל הכנות פרוטאז מטוהרים. הזמינות המוגבלת של סוכנים עשויה להפוך אותו לבלתי אפשרי (או מעבר להישג יד) כדי להשתמש בם בהקלטות המתח-clamp שתי אלקטרודה רציפות בגלל הכמויות הגדולות של פתרון מבחן הנדרש לרציפות superfusing הביציות עם ספיקות של כמה מיליליטר לדקה. יתר על כן, מדידות המתח-clamp שתי אלקטרודה רציפות מוגבלות על ידי Phenom הידועEnon של מוזנח ערוץ ספונטני גם תאר ל15 ENaC. לעומת זאת, חשיפת ביציות כדי לבדוק פתרונות בין שתי מדידות נפרדות לעד שעה או יותר בדרך כלל אינו מהווה בעיה (ראה איור 4 א). לבסוף, שתי מדידות רציפים שבוצעו באותה הביצית מאפשרות תצפיות לזווג של השפעות תרופה. זו יש יתרון על פני מדידות מזווגים משתי קבוצות נפרדות של ביציות (שטופלה פרוטאז ורכב שטופלה), משום שהיא מפחיתה את הבעיה של שונות גבוהות בין הביציות, בדרך כלל נצפו בביטוי ערוץ יון. עם תצפיות לזווג והאפשרות לנרמל את הנתונים למדידה הראשונה, פחות ביציות נדרשות לכל קבוצת ניסוי כדי להדגים אפקט משמעותי של סוכן תרופתי. נורמליזציה של נתונים גם עושה את זה קל לסכם נתונים מקבוצות שונות של ביציות עם רמות שונות ערוץ יון ביטוי וזרמים שונים ומכאן בסיס (איור 2). כמובן, ניסויי שליטה נחוצים לגישה זו על מנת להוכיח כי פעילות ערוץ יון של עניין נותרת יציבה בביציות שליטת רכב שטופלה מהראשונה למדידה השנייה (ראה איור 2).
על מנת להוכיח כי הפעלה נוכחית מפרקי חלבונים קושרים עם הופעתו של ENaC מחשוף מוצרים על פני התא, גישת biotinylation תוארה במקור על ידי האריס et al. 9 ניתן להשתמש. הליך זה (כמפורט בסעיף הפרוטוקול ומוצג באיור 4) הותאם להפגין חשיפת שערוצי פרוטאזות וההפעלה הבאה של זרמים בתיווך ENaC הקביל על ידי הופעתו תלויה בזמן של שברי מחשוף. שיטת biotinylation גם מאפשרת הניתוח של עלייה כללית או ירידה של חלבונים בממברנה על פני התא. לכן, שיטה זו מתאימה כדי לחקור את ההשפעה של פרוטאזות וPhar האחרסוכני macological על הכנסת ערוץ לתוך קרום הפלזמה או על שליפת ערוץ. יתר על כן, ניתוח כתם המערבי של חלבוני קרום הפלזמה biotinylated מאפשר זיהוי של שברי חלבון (לדוגמא: שברי ENaC מפרקי חלבונים) או שינויים בדפוס glycosylation אשר עשוי להיות רלוונטיות מבחינה תפקודית.
לסיכום, השילוב של שיטות המשמש כדי לחקור את ההשפעה של גירוי של פרוטאזות בכל תא זרמים בתיווך ENaC ולהפגין מתאם עם המופע של ENaC מחשוף מוצרים על פני התא עשוי להיות שימושי עבור מגוון רחב של יישומים. בפרט, שיטות אלו עשויות להיות מתאימות כדי לענות על שאלות דומות לגבי הרגולציה של ערוצים אחרים יון, מובילים או קולטנים הטרנסממברני (למשל הקולטנים מופעל פרוטאז PARS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Bath clamp headstage for OC-725C-V | Warner Instrument Corporation | ||
| Cold light source - Schott KL 1500 LCD | Schott | #SCOC150200EU | brightness 4; mechanical aperture: D; color temperature: 3,000 K |
| E Series electrode holder (Str, Vent, Ag Wire, 1.2 mm) | ADinstruments | #ESW-F10v | |
| Left micromanipulator; MM-33L | Warner Instrument Corporation | #64-0055 | |
| LIH 1600 - computer interface | HEKA | ||
| Magnetic valve system (ALA BPS-8) in combination with a TIB14 interface (HEKA) | ALA Scientific Instruments, HEKA | ||
| OC-725C amplifier for two-electrode voltage-clamp recordings | Warner Instrument Corporation | ||
| P-97 FLAMING/BROWN Micropipette Puller | Sutter Instruments | heat = 550; velocity = 22; time = 200 | |
| Right micromanipulator; MM-33R | Warner Instrument Corporation | #64-0056 | |
| Series electrode holder (45°, Vent, Handle, Ag Wire, 1.2 mm) | ADinstruments | #E45w-f10vh | |
| STAT 2 IV gravity flow controller | Conmed | #P-S2V-60 | |
| Vacuum generator ejector SEG - for suction to remove bath solution | Schmalz | ||
| INFUJECT 60 ml pump syringes for solutions | Braun | #22050 | |
| Injekt-F for lysing the oocytes | Braun | #9166033V | |
| Standard wall borosilicate tubing with filament | Sutter Instruments | #BF150-86-10 | outside diameter: 1.5 mm; inside diameter: 0.86 mm; length: 10 cm |
| Complete, Mini, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Applied Science | #11836170001 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | #21217 | |
| Horseradish peroxidase-labeled secondary goat anti-rabbit antibody | Santa Cruz Biotechnology | #sc-2004 | |
| NeutrAvidin Agarose | Thermo Scientific | #29200 | Neutravidin-labeled agarose beads |
| NP40 (Nonidet P-40) | Sigma-Aldrich | #I8896 | |
| Roti-Load 1 (2x SDS-PAGE sample buffer) | Carl Roth | #K929.2 | |
| SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate for detection of chemiluminescent signals | Thermo Scientific | #34095 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | #T8787 |
References
- Kleyman, T. R., Carattino, M. D., Hughey, R. P. ENaC at the cutting edge: regulation of epithelial sodium channels by proteases. The Journal of Biological Chemistry. 284, 20447-20451 (2009).
- Rossier, B. C., Stutts, M. J. Activation of the epithelial sodium channel (ENaC) by serine proteases. Annu Rev Physiol. 71, 361-379 (2009).
- Poirot, O., Vukicevic, M., Boesch, A., Kellenberger, S. Selective regulation of acid-sensing ion channel 1 by serine proteases. The Journal of Biological Chemistry. 279, 38448-38457 (2004).
- Vukicevic, M., Weder, G., Boillat, A., Boesch, A., Kellenberger, S. Trypsin cleaves acid-sensing ion channel 1a in a domain that is critical for channel gating. The Journal of Biological Chemistry. 281, 714-722 (2006).
- Clark, E. B., Jovov, B., Rooj, A. K., Fuller, C. M., Benos, D. J. Proteolytic cleavage of human acid-sensing ion channel 1 by the serine protease matriptase. The Journal of Biological Chemistry. 285, 27130-27143 (2010).
- Ossovskaya, V. S., Bunnett, N. W. Protease-activated receptors: contribution to physiology and disease. Physiological reviews. 84, 579-621 (2004).
- Garcia-Caballero, A., et al. Activation of the epithelial sodium channel by the metalloprotease meprin β-subunit. Channels (Austin. 5, 14-22 (2011).
- Haerteis, S., et al. Proteolytic activation of the epithelial sodium channel (ENaC) by the cysteine protease cathepsin-S. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 464, 353-365 (2012).
- Harris, M., Firsov, D., Vuagniaux, G., Stutts, M. J., Rossier, B. C. A novel neutrophil elastase inhibitor prevents elastase activation and surface cleavage of the epithelial sodium channel expressed in Xenopus laevis oocytes. The Journal of Biological Chemistry. 282, 58-64 (2007).
- Passero, C. J., Mueller, G. M., Rondon-Berrios, H., Tofovic, S. P., Hughey, R. P., Kleyman, T. R. Plasmin activates epithelial Na+ channels by cleaving the γ-subunit. The Journal of Biological Chemistry. 283, 36586-36591 (2008).
- Svenningsen, P., et al. Plasmin in nephrotic urine activates the epithelial sodium channel. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 20, 299-310 (2009).
- Patel, A. B., Chao, J., Palmer, L. G. Tissue kallikrein activation of the epithelial Na channel. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 303, (2012).
- Haerteis, S., Krappitz, M., Diakov, A., Krappitz, A., Rauh, R., Korbmacher, C. Plasmin and chymotrypsin have distinct preferences for channel activating cleavage sites in the γ-subunit of the human epithelial sodium channel. The Journal of General Physiology. 140, 375-389 (2012).
- Chraibi, A., Vallet, V., Firsov, D., Hess, S. K., Horisberger, J. D. Protease modulation of the activity of the epithelial sodium channel expressed in Xenopus oocytes. The Journal of General Physiology. 111, 127-138 (1998).
- Volk, T., Konstas, A. A., Bassalay, P., Ehmke, H., Korbmacher, C. Extracellular Na+ removal attenuates rundown of the epithelial Na+-channel (ENaC) by reducing the rate of channel retrieval. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 447, 884-894 (2004).
