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Biology

विखंडन टुकड़े का पता लगाने के साथ वर्तमान माप के संयोजन से उपकला सोडियम चैनल (ENaC) के proteolytic सक्रियण के प्रदर्शन

Published: July 5, 2014 doi: 10.3791/51582
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institut für Zelluläre und Molekulare Physiologie, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)

Summary

Heterologously Xenopus में व्यक्त उपकला सोडियम चैनल (ENaC) के proteolytic सक्रियण oocytes कोशिका की सतह पर आयन चैनल दरार उत्पादों की उपस्थिति की जांच के लिए एक biotinylation दृष्टिकोण के साथ वर्तमान माप के संयोजन के द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता laevis. कार्यात्मक महत्वपूर्ण दरार साइटों साइट निर्देशित mutagenesis का उपयोग करके पहचाना जा सकता है.

Introduction

Proteases जटिल विनियामक संकेत दे रास्ते में शामिल अत्यधिक परिष्कृत प्रोटीज Cascades करने, पाचन के संदर्भ में, प्रोटीन की प्रसिद्ध proteolytic गिरावट से लेकर विभिन्न शारीरिक प्रतिक्रियाओं में शामिल कर रहे हैं कि एंजाइमों हैं. Proteases उनके उत्प्रेरक सक्रिय साइट के अनुसार सात समूहों में वर्गीकृत कर रहे हैं: एस्पार्टेट, asparagine, सिस्टीन, glutamic एसिड, metallo, सेरीन, और threonine proteases. विभिन्न proteases हमेशा एक प्रोटीन की प्राथमिक संरचना से भविष्यवाणी करने के लिए आसान नहीं हैं जो अलग दरार साइटों को लक्षित. मेरोप्स डेटाबेस ( http://merops.sanger.ac.uk/ ) proteases और उनके तरजीही दरार साइटों की एक विस्तृत श्रृंखला के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान करता है. कार्यात्मक प्रासंगिक दरार साइटों साइट निर्देशित mutagenesis का उपयोग कर पहचाना जा सकता है.

यह अच्छी तरह से ENaC के proteolytic प्रसंस्करण वीं की सक्रियता का एक महत्वपूर्ण तंत्र है कि स्थापित हैविशेष आयन चैनल 1,2 है. दिलचस्प है, संबंधित एसिड संवेदन आयन चैनल 1 ए (ASIC1a) के समारोह में भी proteases 3-5 से संशोधित किया जा सकता है कि सबूत है. वर्तमान में यह प्रोटियोलिटिक चैनल दरार अन्य आयन चैनल या ट्रांसपोर्टरों की गतिविधि को विनियमित करने में एक प्रासंगिक शारीरिक भूमिका निभाता है एक खुला प्रश्न बना हुआ है. हालांकि, यह अच्छी तरह से proteolytic दरार जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स, प्रोटीज सक्रिय रिसेप्टर्स (PARs) के एक समूह को सक्रिय करता है कि स्थापित है 6. कई सेरीन proteases (जैसे चैनल को सक्रिय proteases (CAP1 -3), काइमोट्रिप्सिन, trypsin, furin, plasmin, न्युट्रोफिल इलास्टेज, और kallikrein) proteolytically ENaC 2 को सक्रिय करने के लिए दिखाया गया है. सेरीन proteases के अलावा, proteases के अन्य समूहों प्रोटियोलिटिक ENaC सक्रियण में शामिल हो सकता है. दरअसल, हाल के आंकड़ों से पता चलता है कि metalloproteinase meprin-β 7 और सिस्टीन प्रोटीज cathepsin-S 8 भी कर सकते हैं ACTIVAते ENaC. हालांकि, ENaC सक्रियण के लिए (patho-) physiologically प्रासंगिक proteases निर्धारित किया जा रह है और ऊतकों को ऊतक से अलग हो सकता.

Proteases preferentially अमीनो एसिड अनुक्रम में विशेष स्थलों पर फोड़ना जाना जाता है. उदाहरण के लिए, सेरीन प्रोटीज काइमोट्रिप्सिन खुशबूदार एमिनो एसिड फेनिलएलनिन और tyrosine अवशेषों के बाद cleaving एक विशिष्ट दरार पैटर्न से पता चलता है. बुनियादी अवशेषों लाइसिन या arginine के बाद इसके विपरीत, सेरीन प्रोटीज trypsin preferentially cleaves. साइट निर्देशित mutagenesis के द्वारा उत्पन्न उत्परिवर्ती मानव γENaC निर्माणों का प्रयोग, heterologously oocyte अभिव्यक्ति प्रणाली में व्यक्त ENaC में कार्यात्मक प्रासंगिक दरार साइटों 8-13 पहचाना जा सकता है.

पृथक oocytes में तीन ENaC सब यूनिटों (αβγ) के लिए क्रेना इंजेक्शन लगाने के द्वारा, ENaC कार्यात्मक इन कोशिकाओं में व्यक्त किया जा सकता है और प्लाज्मा झिल्ली में मौजूद चैनलों की गतिविधि से मापा जा सकता हैदो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना तकनीक का उपयोग कर. मूत्रवर्धक amiloride, एक विशिष्ट ENaC अवरोध करनेवाला, amiloride संवेदनशील ENaC की मध्यस्थता पूरे सेल वर्तमान घटक (ΔI एमी) का उपयोग करके unspecific रिसाव धाराओं से या अन्य आयन चैनल द्वारा आयोजित धाराओं से अलग किया जा सकता है. इस प्रकार, ΔI एमी मूल्यों समग्र ENaC गतिविधि प्रतिबिंबित और amiloride के अभाव में दर्ज की इसी पूरे सेल धाराओं से amiloride की उपस्थिति में मापा पूरे सेल धाराओं घटाकर द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. एक प्रोटीज ENaC पर एक उत्तेजक प्रभाव है कि क्या परीक्षण करने के लिए, ΔI एमी यानी पहले और एक प्रोटीज युक्त समाधान में oocyte के ऊष्मायन के बाद, एक ही oocyte में दो बार मापा जाता है. दूसरा माप के लिए पहले से ΔI एमी की वृद्धि हुई है प्रोटियोलिटिक ENaC सक्रियण इंगित करता है. काइमोट्रिप्सिन या trypsin ज़्यादा से ज़्यादा oocyte अभिव्यक्ति प्रणाली 2,14 में ENaC को प्रोत्साहित करने के लिए जाना जाता है और आत्मविश्वास के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैआरएम कि प्रोटियोलिटिक ENaC सक्रियण oocytes की एक दिया बैच में detectable है.

पूरे सेल वर्तमान मापन के लिए समानांतर में, एक biotinylation दृष्टिकोण 9 ENaC की उपस्थिति के साथ संबद्ध कोशिका की सतह पर टुकड़े दरार ΔI एमी में वृद्धि proteases को oocytes के जोखिम पर पता चला है कि क्या जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. कोशिका की सतह पर प्रोटीन बायोटिन साथ लेबल रहे हैं और Neutravidin लेबल agarose मोती को biotinylated प्रोटीन बंधन से intracellular प्रोटीन से अलग किया जा सकता है. biotinylated प्रोटीन वेस्टर्न ब्लॉट से विश्लेषण किया जा सकता है. कोशिका की सतह पर γENaC दरार टुकड़े γENaC की सी टर्मिनस में एक मिलान के खिलाफ निर्देशित एक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है. कार्यात्मक प्रासंगिक दरार साइट (ओं) की पहचान करने के लिए, दरार साइटों साइट निर्देशित mutagenesis का उपयोग उत्परिवर्तित हो सकता है की भविष्यवाणी की. Wildtype और उत्परिवर्ती चैनल एस से oocytes का उपयोग समानांतर प्रयोगों में तुलना कर रहे हैंएएमई बैच.

इस पद्धति दृष्टिकोण के साथ यह ENaC की मध्यस्थता पूरे सेल धाराओं के proteolytic सक्रियण कोशिका की सतह पर टुकड़े दरार ENaC के समय पर निर्भर उपस्थिति के साथ संबद्ध है कि पहली बार के लिए प्रदर्शन किया गया. इन परिणामों चैनल दरार और चैनल सक्रियण के बीच एक कारण लिंक का सुझाव. इसके अलावा, दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना तकनीक, plasmin के लिए कार्यात्मक प्रासंगिक दरार साइटों, 13 काइमोट्रिप्सिन और cathepsin-S 8 के साथ संयोजन में ख्यात दरार साइटों की साइट निर्देशित mutagenesis के उपयोग पहचान की गई.

Protocol

Xenopus oocytes और क्रेना के microinjection के 1. अलगाव

  1. वयस्क महिला Xenopus laevis से oocytes प्राप्त करते हैं. 0.2% MS222 में जानवरों बेहोश करना, और एक छोटे से पेट चीरा के माध्यम से डिम्बग्रंथि पालियों बांटना.
  2. कैल्शियम मुक्त OR2 समाधान (तालिका 1 में नुस्खा) में भंग क्लोस्ट्रीडियम histolyticum से टाइप 2 collagenase के 600-700 यू / मिलीलीटर के साथ 3-4 घंटे के लिए 19 डिग्री सेल्सियस पर enzymatic पाचन द्वारा डिम्बग्रंथि पालियों से oocytes अलग.
  3. चयन के लिए, समाधान युक्त एक उच्च सोडियम में एक दूरबीन खुर्दबीन के नीचे एक पेट्री डिश में defolliculated oocytes जगह (ND96: नुस्खा तालिका 1 में).
  4. चरण वी छठी oocytes का चयन करें और एक पाश्चर विंदुक के साथ एक और पेट्री डिश में उन्हें जगह है. नोट: ब्लंट पाश्चर पिपेट oocyte चोट को रोकने के लिए ज्वलंत द्वारा.
  5. क्रेना (जैसे 0.2 एनजी प्रति αβγENaC सबयूनिट) के साथ oocytes इंजेक्षन. RNase मुक्त पानी में CRNAs भंग. नोट: कुलप्रत्येक oocyte में इंजेक्शन की मात्रा 46 NL है.
  6. (: तालिका 1 में नुस्खा ND9) स्टोर oocytes की सोडियम लोडिंग को रोकने के लिए एक कम सोडियम समाधान में 19 डिग्री सेल्सियस पर oocytes इंजेक्शन. जीवाणु वृद्धि को रोकने के लिए 100 यू / एमएल सोडियम पेनिसिलिन और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट के साथ समाधान के पूरक है. ध्यान से क्षतिग्रस्त या मृत oocytes की राशि की सीमा और क्रेना इंजेक्शन के बाद दो दिनों के दौरान स्नान समाधान के साथ भरा एक 12 अच्छी तरह से थाली के कुओं में व्यक्तिगत छोटे समूहों में उन्हें बनाए रखने के लिए oocytes संभाल.

2. दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना प्रयोगों प्रदर्शन

  1. दो दिनों के बाद इंजेक्शन oocytes उपाय.
  2. ND96 समाधान के साथ एक गुरुत्वाकर्षण खिलाया छिड़काव प्रणाली और amiloride (2 माइक्रोन) युक्त ND96 समाधान के साथ एक और सिरिंज की एक सिरिंज भरें. माउंट 50 सेमी oocyte स्नान कक्ष ऊपर सीरिंज. नोट: ENaC अवरोध करनेवाला amiloride की एकाग्रता इसकी आईसी 50 से 20 गुना ज्यादा होने के लिए चुना गया था
  3. एक 150 डब्ल्यू हलोजन ठंड प्रकाश स्रोत पर बारी और द्विनेत्री माइक्रोस्कोप के साथ अच्छा दृश्य की अनुमति oocyte स्नान कक्ष के ऊपर 10 सेमी करने के लिए इसे समायोजित. तब चूषण पर बारी और oocyte स्नान कक्ष के अंत में सक्शन ट्यूब समायोजित करें. ट्यूब superfusion के लिए सक्शन ट्यूब विपरीत स्थिति जानें 'अनुकूलक oocyte स्नान में प्रवेश. नोट: सक्शन बिजली oocyte superfusing समाधान के सतत प्रवाह का समर्थन करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए.
  4. चतुर्थ गुरुत्वाकर्षण प्रवाह नियंत्रण उपकरण का उपयोग करके 3-5 मिलीग्राम / मिनट के लिए प्रत्येक समाधान के superfusion गति को समायोजित करें. Oocyte स्नान चैम्बर के लिए एक एडाप्टर के साथ superfusion ट्यूब कनेक्ट करें.
  5. <1 माइक्रोन की नोक व्यास प्राप्त करने के लिए एक micropipette खींचने के साथ कांच capillaries खींचो. फिर 3 एम KCl साथ ~ 1/4 केशिकाओं भरें. नोट: इलेक्ट्रोड धारक के चांदी के तार से क्लोरीनयुक्त हिस्सा KCl समाधान में डूब जाता है कि सुनिश्चित करें. केशिका की नोक में हवाई बुलबुले के लिए जाँच करें. एयर बुलबुले measu ख़राबप्रतिरोध आवारा समाई वृद्धि से rement.
  6. वर्तमान में इलेक्ट्रोड धारकों और वोल्टेज इलेक्ट्रोड में केशिकाओं डालें और सूक्ष्म manipulators का उपयोग ND96 युक्त amiloride (2 माइक्रोन) समाधान में उन्हें जगह है.

Amiloride संवेदनशील पूरे सेल धाराओं के 3. मापन

  1. शून्य वी एम और वी ई समायोजन करके वोल्टेज इलेक्ट्रोड (वी एम) और वर्तमान इलेक्ट्रोड (वी ई) के इलेक्ट्रोड संभावित बटन ऑफसेट. नोट: प्रतिरोध वी मीटर और 0.5 मापने के लिए इलेक्ट्रोड के लिए 1-2 MΩ होना चाहिए वर्तमान इंजेक्शन इलेक्ट्रोड के लिए -1 MΩ.
  2. वोल्टेज संवेदन इलेक्ट्रोड के पास नहाने के चेंबर में oocyte रखें. नोट: ये स्थानांतरण के किसी भी चरण के दौरान oocyte नुकसान नहीं है. Oocyte हस्तांतरण करने के लिए एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करें. Oocyte पिपेट के किनारों हानिकारक से बचने के ज्वलंत द्वारा पा लिया जाना चाहिए.
  3. ऊ कोंचनादोनों microelectrodes साथ धीरे cytes.
  4. -60 एम वी एम्पलीफायर पर होल्डिंग क्षमता सेट और चार्ट रिकॉर्डर पर बारी. समाधान युक्त amiloride (2 माइक्रोन) को चालू करें. नोट: वर्तमान के बारे में 0 ± 0.5 μA होना चाहिए. बड़ा रिसाव धाराओं एक टपका हुआ कोंचना संकेत मिलता है. इसलिए, इन oocytes को खारिज कर दिया जाना चाहिए. इसके अलावा, amiloride (2 माइक्रोन) की उपस्थिति में मापा रिसाव धाराओं αβγ-WT oocytes व्यक्त αβγ उत्परिवर्ती ENaC में मापा उन लोगों के लिए oocytes व्यक्त करने में समान होना चाहिए. इस उत्परिवर्तन चैनल के amiloride संवेदनशीलता को प्रभावित नहीं करते कि इंगित करता है.
  5. रिकॉर्डिंग शुरू करें. यदि आवश्यक हो तो लाभ को समायोजित.
  6. वर्तमान मापा एक स्थिर पठार पर पहुँचने के बाद, amiloride मुक्त समाधान के लिए बदल जाते हैं. नोट: वर्तमान निशान में नीचे वर्तमान deflections आवक धाराओं, सेल में कोशिकी ओर से सकारात्मक चार्ज यानी आंदोलन (ना +) के अनुरूप हैं.
  7. वायु सेनाएक मौजूदा पठार (के बाद ~ 60 सेकंड) पर पहुंच गया है आतंकवाद, वापस amiloride युक्त समाधान के लिए superfusion स्विच. Oocyte की वर्तमान प्रारंभिक आधारभूत वर्तमान पहुँचने के बाद, वोल्टेज दबाना बंद कर देते हैं और धीरे इलेक्ट्रोड वापस ले लें.
  8. , कोंचना की साइटों पर प्लाज्मा झिल्ली की resealing की अनुमति प्रोटीज मुक्त ND96 समाधान के 100-150 μl युक्त एक 96 अच्छी तरह से थाली में से एक कुएं में oocyte रखने के लिए.
  9. 5 मिनट के बाद एक 30 मिनट ऊष्मायन समय के लिए समाधान युक्त एक प्रोटीज को या प्रोटीज बिना किसी नियंत्रण के समाधान के लिए oocyte हस्तांतरण. नोट: ऊष्मायन समय प्रोटीज और अध्ययन चैनल पर निर्भर करता है.
  10. ऊष्मायन कदम वर्तमान माप दोहराने के बाद (3.2 और निम्न देखें). नोट: यह प्रोटीज समाधान में ऊष्मायन के बाद oocytes की> 90% को मापने के लिए संभव है.

4. Biotinylation परख

  1. चुने और दूरबीन खुर्दबीन के नीचे दोषपूर्ण oocytes त्यागें. नोट: सुई का प्रयोग करेंएड वर्तमान माप के लिए और biotinylation प्रयोगों के लिए एक ही बैच से oocytes.
  2. प्रयोग में इसके उपयोग से पहले कम से कम 20 मिनट के लिए आरटी पर बायोटिन रखें.
  3. समाधान तैयार: ND96 और ND96 उपयुक्त प्रोटीज युक्त. उन्हें लेबलिंग से और संक्षेप में oocytes की चोट से बचने के लिए उनके सुझावों ज्वलंत द्वारा पाश्चर pipettes तैयार करें. नोट: यहाँ, ND96 में प्रोटीज काइमोट्रिप्सिन 2 ग्राम / एमएल प्रयोग किया जाता है. समाधान के पार संक्रमण से बचने के लिए एक अलग पिपेट साथ प्रत्येक समूह समझो.
  4. आरटी पर एक प्रोटीज युक्त 2.5 मिलीलीटर नियंत्रण ND96 या ND96 साथ 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से भरें. फिर अच्छी तरह से प्रति 30 oocytes जमा और आरटी पर 30 मिनट के लिए उन्हें सेते हैं. नोट: बाद में प्रक्रियाओं के लिए यह सब समय पर बर्फ पर नमूने रखने के लिए महत्वपूर्ण है. सभी centrifugation कदम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन कर रहे हैं
  5. 2.5 मिलीलीटर ND96 (प्रत्येक समूह धोने कदम के लिए 3 कुओं की जरूरत है) के साथ एक नई 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से भरें और बायोटिन तौलना. नोट: 2.5 मिलीग्राम बायोटिन पीएर अच्छी तरह से (1 मिलीग्राम / एमएल) की आवश्यकता है. 25 मिलीलीटर biotinylation बफर तालिका 1 में (नुस्खा) में biotinylation बफर 10 समूहों के लिए (यानी 25 मिलीग्राम बायोटिन () में बायोटिन भंग.
  6. एक अच्छी तरह से 2.5 मिलीलीटर ND96 से भरा करने के लिए oocytes के प्रत्येक समूह के स्थानांतरण. स्थानांतरण किसी भी शेष प्रोटीज से धो ND96 साथ दो अतिरिक्त कुओं में क्रमिक रूप से oocytes. ND96 में 5 मिनट के लिए oocytes सेते हैं.
  7. एक अच्छी तरह से युक्त 2.5 मिलीलीटर बायोटिन समाधान में oocytes स्थानांतरण और 15 मिनट के लिए कोमल आंदोलन '(एक प्रकार के बरतन') के साथ उन्हें सेते हैं. नोट: बायोटिन समाधान के कमजोर पड़ने से बचने के लिए विंदुक के साथ स्थानांतरित ND96 न्यूनतम.
  8. Biotinylation प्रतिक्रिया को रोकने के लिए एक अच्छी तरह से युक्त 2.5 मिलीलीटर बुझाना बफर (तालिका 1 में नुस्खा) में oocytes के प्रत्येक समूह के स्थानांतरण. फिर, यह भी 2.5 एमएल बफर बुझाने और कोमल आंदोलन के साथ 5 मिनट के लिए सेते युक्त एक दूसरे कुएं में oocytes के प्रत्येक समूह के हस्तांतरण.
  9. क्षतिग्रस्त या मृत oocytes निकालें. नोट:निम्नलिखित प्रक्रिया के लिए समूह प्रति oocytes की एक ही नंबर चुनें.
  10. एक 1.5 मिलीलीटर की प्लास्टिक microcentrifuge ट्यूब oocytes के प्रत्येक समूह के स्थानांतरण. नोट: स्थानांतरित किया है कि बुझाना बफर की मात्रा कम करें.
  11. बाद में, protease inhibitors के साथ पूरक (नुस्खा 1 टेबल देखें) 1 मिलीलीटर lysis बफर में एक 27 जी सुई के माध्यम से उन्हें पारित करके oocytes lyse.
  12. 1500 x जी पर 10 मिनट के लिए lysates अपकेंद्रित्र.
  13. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और 0.5% ट्राइटन-X-100 और 0.5% NP40 युक्त एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरण. शेष गोली त्यागें. नोट: सतह पर तैरनेवाला biotinylated प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन और गैर biotinylated intracellular प्रोटीन होता है.
  14. बर्फ पर 20 मिनट के लिए microcentrifuge ट्यूब सेते हैं. बार बार भंवर इस अवधि के दौरान ट्यूब पूरी तरह से NP40 और ट्राइटन-X-100 में प्रोटीन भंग करने के लिए.
  15. 1500 x जी पर 3 मिनट के लिए oocyte समूह प्रति agarose मोती की अपकेंद्रित्र 100 μl. के बादCentrifugation के मोती समाधान से सतह पर तैरनेवाला हटाने और बफर के साथ मोती संतुलित करने के लिए lysis बफर के साथ तीन बार धोएं.
  16. मोती को biotinylated प्रोटीन के बंधन अनुमति देने के लिए 4.13 में तैयार प्रोटीन डिटर्जेंट समाधान युक्त प्रत्येक microcentrifuge ट्यूब में धोया मोतियों की पिपेट 100 μl.
  17. 4 डिग्री सेल्सियस पर उपरि रोटेशन हे / एन के साथ microcentrifuge ट्यूब सेते
  18. 1500 x जी पर 3 मिनट के लिए microcentrifuge ट्यूबों अपकेंद्रित्र. फिर एक नया ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण. नोट: intracellular प्रोटीन बायोटिन साथ लेबल नहीं हैं. सतह पर तैरनेवाला -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता मोती महाप्राण मत करो.

पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा कोशिका की सतह पर ENaC विखंडन टुकड़े के 5. जांच

  1. Lysis बफर के साथ मोती तीन बार धोएं और 2x एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर के 100 μl जोड़ें. नोट: नमूने -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत या तुरंत पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए तैयार किया जा सकता है.
  2. फोड़ा है5 से 95 डिग्री सेल्सियस पर मिनट और बर्फ पर तो जगह ट्यूब के लिए amples.
  3. 3 20,000 XG पर मिनट और एक नया microcentrifuge ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला पिपेट के लिए नमूने अपकेंद्रित्र. नोट: इस सतह पर तैरनेवाला oocyte की कोशिका की सतह से biotinylated प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन होता है.
  4. कोशिका की सतह पर दरार टुकड़े की जांच के लिए वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा इस सतह पर तैरनेवाला के 30 μl का विश्लेषण करें.
  5. एक उपयुक्त जेल (8%, 10%, 12% की जांच की दरार टुकड़े की आणविक वजन पर निर्भर करता है) का उपयोग करते हुए एसडीएस पृष्ठ (सोडियम सल्फेट dodecyl polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन) द्वारा biotinylated प्रोटीन अलग करें.
  6. अर्द्ध शुष्क सोख्ता द्वारा polyvinylidene difluoride (PVDF) झिल्ली प्रोटीन स्थानांतरण.
  7. (चित्रा 3 और 13 देखें) सी टर्मिनस में एक मिलान के खिलाफ निर्देशित मानव γENaC के खिलाफ एक विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ झिल्ली जांच.
  8. माध्यमिक विरोधी के रूप में हॉर्सरैडिश peroxidase लेबल बकरी विरोधी खरगोश एंटीबॉडी का प्रयोग करेंशरीर.
  9. Chemiluminescent संकेतों का पता लगाने.

Representative Results

सेरीन प्रोटीज plasmin ENaC की मध्यस्थता धाराओं सक्रिय कर सकते हैं कि क्या जांच करने के लिए, व्यक्तिगत ENaC व्यक्त oocytes की ΔI एमी प्रोटीज मुक्त (नियंत्रण) में oocytes की 30 मिनट ऊष्मायन (2A चित्रा) या plasmin युक्त समाधान (चित्रा पहले और बाद में निर्धारित किया गया था 2 बी) दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना तकनीक (चित्रा 1 देखें) का उपयोग कर. Plasmin के संपर्क में मापा हर oocyte में ΔI एमी वृद्धि हुई है. इसके विपरीत, नियंत्रण प्रयोगों में, प्रोटीज मुक्त समाधान में ENaC व्यक्त oocytes की 30 मिनट ऊष्मायन एक नगण्य प्रभाव (चित्रा 2 सी, डी) था. इस प्रकार, इस विधि का उपयोग कर plasmin द्वारा ENaC की मध्यस्थता वर्तमान की एक उत्तेजना का पता लगाया जा सकता है.

ENaC की मध्यस्थता धाराओं के सक्रियण, साथ ही पर ख्यात दरार साइटों परिवर्तनशील के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए चैनल दरार पर, WT-ENaC पर काइमोट्रिप्सिन का प्रभाव उस पर साथ तुलना में थाउत्परिवर्तित prostasin और plasmin दरार साइटों के साथ एक उत्परिवर्ती ENaC (γ RKRK178AAAA; K189A). चैनल काइमोट्रिप्सिन द्वारा सक्रियण के साथ ही ENaC की उपस्थिति कोशिका की सतह पर उत्पादों की दरार का समय बेशक अलग प्रोटीज ऊष्मायन बार (चित्रा -4 ए) का उपयोग कर जांच की गई. यह उत्परिवर्ती चैनल देरी और काइमोट्रिप्सिन द्वारा ENaC की मध्यस्थता वर्तमान की सक्रियता कम कर देता है कि प्रदर्शन किया गया. यह पूरी तरह से cleaved सबयूनिट को इसी 67 केडीए के एक कम आणविक वजन γENaC दरार टुकड़ा का एक देरी उपस्थिति द्वारा paralleled है. विखंडन टुकड़े सी टर्मिनस में एक मिलान (चित्रा 3) के खिलाफ निर्देशित एक γENaC एंटीबॉडी का उपयोग पाया गया. इस पद्धति दृष्टिकोण ENaC की मध्यस्थता धाराओं के proteolytic सक्रियण के समय के पाठ्यक्रम कोशिका की सतह पर एक 67 केडीए γENaC दरार उत्पाद की उपस्थिति (चित्रा 4 बी, सी) के साथ संबद्ध है कि यह दर्शाता है. यह एक की अवधारणा का समर्थन करता हैproteolytic चैनल दरार और चैनल सक्रियण 13 के बीच कारण लिंक. इसके अलावा, कोशिका की सतह पर वर्तमान माप और γENaC टुकड़े का पता लगाने के संयोजन के द्वारा यह उत्परिवर्तित दरार साइटों प्रोटियोलिटिक चैनल सक्रियण के लिए कार्यात्मक प्रासंगिक हैं कि प्रदर्शन किया गया.

चित्रा 1
चित्रा 1. Heterologously Xenopus में व्यक्त ENaC पर एक प्रोटीज की stimulatory प्रभाव का निर्धारण करने की प्रक्रिया oocytes laevis. ENaC गतिविधि amiloride संवेदनशील पूरे सेल वर्तमान घटक ΔI एमी को मापने के द्वारा अनुमान लगाया गया है.

चित्रा 2
चित्रा 2. Plasmin ENaC की मध्यस्थता कुरेन को उत्तेजित करता हैENaC व्यक्त oocytes में टीएस. मानव ENaC व्यक्त (ई.) Oocytes प्रोटीज मुक्त समाधान (नियंत्रण) में या plasmin (10 माइक्रोग्राम / एमएल) युक्त समाधान में 30 मिनट के लिए incubated रहे थे. (-) से पहले ΔI एमी निर्धारित करने के लिए और बाद में (+) ऊष्मायन, oocytes -60 एम वी के एक होल्डिंग क्षमता पर clamped थे (ए, बी) oocytes के एक बैच से चार प्रतिनिधि पूरे सेल वर्तमान निशान.. Amiloride (एमी) ​​काली सलाखों से संकेत के रूप में विशेष रूप से ENaC को बाधित करने के लिए स्नान समाधान में मौजूद थे. (सी) एक व्यक्ति oocyte से प्राप्त आंकड़ों के अंक एक लाइन से जुड़े हुए हैं. (डी) इसी तरह के प्रयोगों का सारांश सी. स्तंभ के रूप में दिखाया प्रतिनिधित्व ΔI एमी पर रिश्तेदार stimulatory प्रभाव ऊष्मायन से पहले मापा प्रारंभिक ΔI एमी (ΔI एमी प्रारंभिक) के लिए एक 30 मिनट ऊष्मायन (ΔI एमी 30 मिनट) के बाद मापा ΔI एमी के अनुपात के रूप में गणना की. कॉलम के अंदर नंबर का संकेतमापा व्यक्तिगत oocytes की संख्या. एन oocytes के विभिन्न बैचों की संख्या को इंगित करता है. (यह आंकड़ा से संशोधित किया गया है [Haerteis एट अल 2012 जम्मू जनरल Physiol 140, 375-389, doi:. 10.1085/jgp.201110763])

चित्रा 3
चैनल प्लाज्मा झिल्ली तक पहुंचने से पहले Golgi जुड़े convertase furin द्वारा proteolytic सक्रियण और इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के बंधन साइट के लिए γENaC सबयूनिट दिखा दरार साइटों के चित्रा 3. मॉडल. Proteolytic दरार biosynthetic मार्ग में ENaC परिपक्वता के लिए महत्वपूर्ण है. एक 76 केडीए टुकड़ा furin द्वारा दरार γ सबयूनिट की सी टर्मिनस में एक मिलान के खिलाफ एक biotinylation दृष्टिकोण और एक एंटीबॉडी का उपयोग कोशिका की सतह पर पाया जा सकता है के बाद. proteolytic एन में निर्णायक अंतिम चरणएसी सक्रियण शायद γENaC एक 67 केडीए दरार टुकड़ा में जिसके परिणामस्वरूप furin साइट के लिए एक क्षेत्र डिस्टल में बाह्य proteases (जैसे plasmin या काइमोट्रिप्सिन) द्वारा cleaved है जहां प्लाज्मा झिल्ली में जगह लेता है. (यह आंकड़ा से संशोधित किया गया है [Haerteis एट अल 2012 जम्मू जनरल Physiol 140, 375-389, doi:. 10.1085/jgp.201110763])

चित्रा 4
चित्रा 4:. Plasmin (K189) और prostasin दरार साइट (RKRK178) दोनों परिवर्तनशील ENaC की मध्यस्थता धाराओं के सक्रियण और चैनल के γ सबयूनिट की एक 67 केडीए दरार उत्पाद की उपस्थिति में देरी Oocytes गुम्मट व्यक्त (खुला चिह्न) और γ RKRK178AAAA; K189A ENaC उत्परिवर्ती चैनल (बंद प्रतीक) प्रोटीज मुक्त समाधान (नियंत्रण) में 30 मिनट के लिए या 5, 3 के लिए incubated रहे थेकाइमोट्रिप्सिन (2 ग्राम / एमएल) युक्त समाधान में 0, या 60 मिनट. (ए) ऊष्मायन से पहले और बाद ΔI एमी निर्धारित करने के लिए, oocytes -60 एम वी के एक होल्डिंग क्षमता पर clamped थे. सर्किलों ऊष्मायन से पहले मापा प्रारंभिक ΔI एमी (ΔI एमी प्रारंभिक) को 5 के बाद मापा ΔI एमी का अनुपात, 30, या 60 मिनट ऊष्मायन (ΔI एमी मिनट) का प्रतिनिधित्व करते हैं. प्रत्येक डेटा बिंदु चार अलग बैचों के 22-24 व्यक्ति oocytes में मापा मतलब ΔI एमी का प्रतिनिधित्व करता है. (बी) ΔI एमी, कोशिका की सतह पर biotinylated γENaC की अभिव्यक्ति एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण किया गया था का पता लगाने के लिए समानांतर में. γENaC मानव γENaC की सी टर्मिनस में एक मिलान के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ पकड़ा गया था. प्रत्येक लेन के लिए बी या डी में दिखाया गया है उन लोगों के लिए इसी तरह के तीन पश्चिमी blots, एस के oocytes के एक बैच से प्रतिनिधि पश्चिमी blots दिखाए जाते हैं. (सीई) densitometric विश्लेषण76 केडी (खुला स्तंभों) और 67 केडी (ग्रे स्तंभों) के क्षेत्रों में पाया ignals निर्धारित और पता लगाया कुल संकेत की राशि के लिए सामान्यीकृत थे. एन oocytes के विभिन्न बैचों की संख्या को इंगित करता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

इस पांडुलिपि में सफलतापूर्वक proteases से ENaC की सक्रियता अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया था, जो एक methodological दृष्टिकोण 8,13 वर्णित है. अच्छी तरह से स्थापित Xenopus laevis oocyte अभिव्यक्ति प्रणाली कार्यात्मक एक्सप्रेस ENaC के लिए इस्तेमाल किया गया था. ENaC समारोह परंपरागत दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना तकनीक के साथ मूल्यांकन किया गया था. साइट निर्देशित mutagenesis के कार्यात्मक प्रासंगिक प्रोटीज दरार साइटों की पहचान करने के लिए नियुक्त किया गया था. Electrophysiological माप के साथ समानांतर में प्रदर्शन Biotinylation प्रयोगों यह संभव ENaC की उपस्थिति प्रोटियोलिटिक वर्तमान सक्रियण के साथ कोशिका की सतह पर उत्पादों दरार सहसंबंधी कर दिया. वर्तमान सक्रियण के समय के पाठ्यक्रम और कोशिका की सतह पर proteolytic दरार टुकड़े की उपस्थिति के बीच एक संबंध प्रोटियोलिटिक चैनल सक्रियण की अवधारणा का समर्थन करता है.

दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग एक हे की कोंचना आवश्यकतादो microelectrodes साथ ocyte. यह प्रक्रिया आम तौर पर एक व्यक्ति oocyte में केवल एक बार किया जाता है. हालांकि, यह oocyte को स्पष्ट क्षति के बिना एक प्रारंभिक पूरे सेल वर्तमान रिकॉर्डिंग के बाद microelectrodes दूर करने के लिए संभव था. दरअसल, impalements की साइटों पर प्लाज्मा झिल्ली कुछ ही मिनटों के भीतर reseal करने के लिए प्रकट होता है. इस प्रकार, एक पहले दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना माप पूरा करने के बाद, यह एक microfuge ट्यूब या से भरा एक 96 अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से करने के लिए दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना सेटअप की प्रयोगात्मक प्रवाह चैम्बर से oocyte स्थानांतरित करना संभव है परीक्षण या नियंत्रण समाधान की एक छोटी मात्रा. बाद में, एक ही oocyte प्रवाह चैम्बर वापस स्थानांतरित किया जा सकता है और एक दूसरे से दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना माप प्रदर्शन करने के लिए फिर से impaled जा सकता है. उल्लेखनीय है, ENaC की मध्यस्थता धाराओं oocyte नियंत्रण समाधान में बनाए रखा गया था जब पहले और दूसरे माप के बीच बहुत भिन्न नहीं था. एक प्रोटीज युक्त प में oocyte के विपरीत, ऊष्मायन मेंपहली माप के बाद ution दूसरा माप में वृद्धि ENaC की मध्यस्थता वर्तमान चित्रा (2) में हुई. यह निष्कर्ष प्रोटियोलिटिक चैनल सक्रियण इंगित करता है.

एक एकल oocyte में दो अलग वर्तमान माप प्रदर्शन oocyte परीक्षण समाधान की एक छोटी मात्रा में समय की एक चर लंबाई के लिए दो माप के बीच proteases या अन्य औषधीय एजेंटों के संपर्क में किया जा सकता है कि लाभ प्रदान करता है. बड़ी मात्रा में महंगी और / या उपलब्ध नहीं हैं जो एजेंटों, जैसे शुद्ध प्रोटीज तैयारियों का उपयोग करते समय यह महत्वपूर्ण है. एजेंटों की सीमित उपलब्धता की वजह से लगातार प्रति मिनट कई मिलीलीटर के प्रवाह की दर के साथ oocytes superfusing के लिए आवश्यक परीक्षण समाधान की बड़ी मात्रा के लिए यह असंभव है (या unaffordable) निरंतर दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग में उन्हें इस्तेमाल करने के लिए कर सकते हैं. इसके अलावा, लगातार दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना माप प्रसिद्ध Phenom द्वारा सीमित हैंसहज चैनल ठहरनेवाला के Enon भी ENaC 15 के लिए वर्णित है. इसके विपरीत, एक घंटे या उससे अधिक के लिए के लिए दो अलग माप के बीच समाधान का परीक्षण करने के oocytes उजागर नहीं आम तौर पर (चित्रा -4 ए देखें) एक समस्या खड़ी करता है. अंत में, एक ही oocyte में प्रदर्शन दो अनुक्रमिक माप दवा प्रभाव की बनती टिप्पणियों अनुमति देते हैं. यह आमतौर पर आयन चैनल अभिव्यक्ति में मनाया oocytes के बीच उच्च परिवर्तनशीलता की समस्या को कम करता है, क्योंकि यह oocytes (प्रोटीज का इलाज और वाहन का इलाज) के दो अलग अलग समूहों से unpaired माप पर एक फायदा है. बनती टिप्पणियों और पहली माप के लिए डेटा मानक के अनुसार करने की संभावना के साथ, कम oocytes एक औषधीय एजेंट के एक महत्वपूर्ण प्रभाव का प्रदर्शन करने के लिए प्रयोगात्मक समूह प्रति की जरूरत है. डेटा को सामान्य बनाने के लिए भी यह आसान विभिन्न आयन चैनल अभिव्यक्ति के स्तर और इसलिए विभिन्न आधारभूत धाराओं (चित्रा 2 डी के साथ oocytes के विभिन्न बैचों से डेटा का सारांश करने के लिए बनाता है). इस दृष्टिकोण के हित के आयन चैनल गतिविधि (देखें चित्र 2) दूसरा माप के लिए पहले से वाहन का इलाज नियंत्रण oocytes में स्थिर बनी हुई है कि प्रदर्शित करने के लिए जाहिर है, नियंत्रण प्रयोगों के लिए आवश्यक हैं.

Proteolytic वर्तमान सक्रियण कोशिका की सतह पर उत्पादों दरार ENaC की उपस्थिति के साथ संबद्ध दिखाना है कि, एक biotinylation दृष्टिकोण मूल रूप से हैरिस एट अल द्वारा वर्णित. 9 इस्तेमाल किया जा सकता है. यह प्रक्रिया (प्रोटोकॉल अनुभाग में विस्तृत और 4 चित्र में दिखाया गया है) proteases और ENaC की मध्यस्थता धाराओं के बाद सक्रियण दरार टुकड़े के समय पर निर्भर उपस्थिति द्वारा paralleled है करने के लिए चैनलों की है कि जोखिम को प्रदर्शित करने के लिए अनुकूलित किया गया था. biotinylation विधि भी कोशिका की सतह पर एक समग्र वृद्धि या झिल्ली प्रोटीन की कमी के विश्लेषण की अनुमति देता है. इस प्रकार, इस विधि proteases और अन्य Phar के प्रभाव की जांच करने के लिए उपयुक्त हैप्लाज्मा झिल्ली में या चैनल पुनर्प्राप्ति पर चैनल प्रविष्टि पर macological एजेंटों. इसके अलावा, biotinylated प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण की अनुमति देता प्रोटीन टुकड़े (जैसे प्रोटियोलिटिक ENaC टुकड़े) या कार्यात्मक प्रासंगिक हो सकता है जो ग्लाइकोसिलेशन पैटर्न में परिवर्तन का पता लगाने.

अंत में, विधियों के संयोजन ENaC की मध्यस्थता पूरे सेल धाराओं पर proteases की stimulatory प्रभाव की जांच के लिए और आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयोगी हो सकता है ENaC की घटना के साथ एक संबंध कोशिका की सतह पर उत्पादों की दरार का प्रदर्शन किया. विशेष रूप से, इन तरीकों अन्य आयन चैनल, ट्रांसपोर्टरों या transmembrane रिसेप्टर्स (जैसे प्रोटीज सक्रिय रिसेप्टर्स PARs) के नियमन के बारे में इसी तरह के सवालों का पता करने के लिए उपयुक्त हो सकता है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Bath clamp headstage for OC-725C-V Warner Instrument Corporation
Cold light source - Schott KL 1500 LCD Schott #SCOC150200EU brightness 4; mechanical aperture: D; color temperature: 3,000 K
E Series electrode holder (Str, Vent, Ag Wire, 1.2 mm) ADinstruments #ESW-F10v
Left micromanipulator; MM-33L Warner Instrument Corporation #64-0055
LIH 1600 - computer interface HEKA
Magnetic valve system (ALA BPS-8) in combination with a TIB14 interface (HEKA) ALA Scientific Instruments, HEKA
OC-725C amplifier for two-electrode voltage-clamp recordings Warner Instrument Corporation
P-97 FLAMING/BROWN Micropipette Puller Sutter Instruments heat = 550; velocity = 22; time = 200
Right micromanipulator; MM-33R Warner Instrument Corporation #64-0056
Series electrode holder (45°, Vent, Handle, Ag Wire, 1.2 mm) ADinstruments #E45w-f10vh
STAT 2 IV gravity flow controller Conmed #P-S2V-60
Vacuum generator ejector SEG - for suction to remove bath solution Schmalz
INFUJECT 60 ml pump syringes for solutions Braun #22050
Injekt-F for lysing the oocytes Braun #9166033V
Standard wall borosilicate tubing with filament Sutter Instruments #BF150-86-10 outside diameter: 1.5 mm; inside diameter: 0.86 mm; length: 10 cm
Complete, Mini, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche Applied Science #11836170001
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin Thermo Scientific #21217
Horseradish peroxidase-labeled secondary goat anti-rabbit antibody Santa Cruz Biotechnology #sc-2004
NeutrAvidin Agarose Thermo Scientific #29200 Neutravidin-labeled agarose beads
NP40 (Nonidet P-40) Sigma-Aldrich #I8896
Roti-Load 1 (2x SDS-PAGE sample buffer) Carl Roth #K929.2
SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate for detection of chemiluminescent signals Thermo Scientific #34095
Triton-X-100 Sigma-Aldrich #T8787

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References

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बायोकैमिस्ट्री अंक 89 दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी biotinylation, उपकला सोडियम चैनल ENaC proteases proteolytic चैनल सक्रियण आयन चैनल दरार साइटों दरार टुकड़े
विखंडन टुकड़े का पता लगाने के साथ वर्तमान माप के संयोजन से उपकला सोडियम चैनल (ENaC) के proteolytic सक्रियण के प्रदर्शन
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Krappitz, M., Korbmacher, C., Haerteis, S. Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments. J. Vis. Exp. (89), e51582, doi:10.3791/51582 (2014).

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