Abstract
El músculo esquelético es un tejido único debido a su estructura y función, que requiere protocolos específicos para la recogida de tejidos para obtener óptimos resultados de las evaluaciones funcionales, celulares, moleculares y patológicos. Debido a la sutileza de algunas anormalidades patológicas visto en los trastornos musculares congénitas y el potencial para la fijación a interferir con el reconocimiento de estas características, la evaluación patológica de músculo congelado es preferible muscular fija la hora de evaluar el músculo esquelético para la enfermedad muscular congénita. Además, el potencial de producir artefactos de congelación graves en el músculo requiere precauciones específicas al congelar el músculo esquelético para el examen histológico que no se utiliza comúnmente cuando se congelan otros tejidos. Este manuscrito describe un protocolo para la congelación rápida del músculo esquelético utilizando isopentano (2-metilbutano) enfriado con nitrógeno líquido para preservar la morfología óptima músculo esquelético. Este procedimiento también es eficaz para freezing tejidos destinados a los estudios de expresión genética o de proteínas. Además, hemos integrado nuestro protocolo de congelación en un procedimiento más amplio que también describe los métodos preferidos para la clasificación a corto plazo del tejido de (1) los estudios funcionales de fibra única y (2) el cultivo celular de mioblastos, con un enfoque en el esfuerzo mínimo necesario para recoger tejidos y transportarlo a la investigación o laboratorios especializados de referencia para completar estos estudios. En general, este manuscrito proporciona un resumen de cómo el tejido fresco se puede distribuir de manera efectiva para una variedad de estudios fenotípicos y de ese modo proporciona los procedimientos normalizados de trabajo (PNT) para estudios patológicos relacionados con la enfermedad muscular congénita.
Protocol
Etiquetar los recipientes que se utilizan para el almacenamiento de los músculos con identificadores apropiados para el animal y el músculo cosechado. Pre-enfriar las bolsas / contenedores e instrumentos para prevenir la congelación / descongelación del tejido cuando se agrega.
1. Consideraciones Estudio de diseño técnico de Muscle Tissue Collection
- Para los pequeños modelos animales (murinos) de la enfermedad muscular, utilizan un músculo entero para el estudio, ya que los modelos animales pequeños a menudo requieren evaluación de un músculo entero para proporcionar muestras miofibra suficiente para estudios patológicos. Para grandes animales (caninos) los modelos de enfermedad muscular, utilizan porciones musculares que son al menos 0.3 x 0.3 cm o más en la transversal (transversal) de aspecto.
NOTA: biopsias de núcleo también se pueden utilizar, pero puede ser subóptima para estudios de caracterización primarios debido a problemas de muestreo. - Para estudios que envuelve el sarcómero, la medición ultraestructural de la longitud del sarcómero puede comprender un punto final crítico y puede require especializada manipulación. Esto es por lo general sólo es relevante en enfermedades en las que los elementos de las longitudes de sarcómero muestran inadecuadas, como en algunas de las causas de miopatía nemalínica. Algunos laboratorios prefieren para fijar el músculo en su estado sin contracción o estirado, en lugar de realizar estas mediciones en el músculo no tensado o no estirado.
- Si no se medirá la longitud del sarcómero, fijar el tejido muscular sin pre-estiramiento del músculo al colocar directamente en el fijador EM deseada (véase Reactivos).
- Si se miden las longitudes del sarcómero, varias técnicas de pre-estirar el músculo (ver Discusión) se pueden usar:
- Utilice un dispositivo de sujeción para mantener el músculo en su tensión de reposo mientras está todavía en el animal, extirpar el músculo alrededor de la parte exterior de la pinza y colocarla directamente en el fijador EM deseada (ver Reactivos).
- Estirar y el pin el músculo a una superficie (tal como una pieza de corcho) a una longitud similar a la observada
2. Sub-dividir el músculo esquelético aislado en fragmentos que son apropiados para los estudios deseados (Figura 1)
- Para la histología muscular congeladas:
- Incluya la mayor cantidad de un determinado músculo como sea posible para minimizar el sesgo de muestreo (véase el paso 1.1), pero los especímenes deben ser <1,5 cm para evitar la congelación de los artefactos.
- Tratar a todos los músculos del mismo estudio similar para evitar diferencias de artefactos de tamaño de la fibra debido a diferencias en el manejo.
- Para la microscopía electrónica (EM):
- Corte un ~ 0,5 x 0,2 x 0,2 cm tira de músculo de la muestra, con el eje longitudinal de la muestra paralela al eje longitudinal de la original del músculo.
NOTA: El fijador no penetrará adecuadamente piezas más gruesas de tejido, por lo que el mantenimiento de espesor de la muestra a 2 mm o menos es crucial en la obtención de resultados adecuados. Además,como la orientación de tales pequeños fragmentos de músculo es a menudo difícil, es aconsejable el uso de un fragmento de tejido que imita la orientación real del músculo (es decir, el aspecto más largo de la muestra fijada es la orientación longitudinal de las miofibras musculares /) a minimizar la manipulación y la confusión durante el procesamiento EM.
- Corte un ~ 0,5 x 0,2 x 0,2 cm tira de músculo de la muestra, con el eje longitudinal de la muestra paralela al eje longitudinal de la original del músculo.
- Para el cultivo de células:
- El rendimiento celular deseada puede afectar a la cantidad de músculo requiere para el establecimiento de cultivo celular. Músculos individuales (o partes de los músculos) de los animales pequeños pueden proporcionar el número de células suficientes para establecer los cultivos celulares, por lo que si es necesario, el tejido de la piscina de varios músculos.
3. Fijación de Tejidos y Procesamiento de Microscopía Electrónica (EM)
- Coloque un fragmento de músculo no mayor de 2 mm en su dimensión más delgada directamente en el fijador EM deseada (véase Reactivos).
- Coloque el músculo en tampón fijador EM (ver Reactivos) después de 2-48 h de FIJACIÓNen. Fijación prolongada (semanas o meses) puede dar como resultado la pérdida de detalle ultraestructural en los estudios de EM.
- Enviar a un centro núcleo EM para su procesamiento.
4. Congelación del músculo por histológico, bioquímico y Estudios Moleculares
- Eliminar el exceso de humedad en la muestra mediante secado a fondo la muestra con una toalla de papel hasta que el tejido es ligeramente adherente a la toalla. La humedad excesiva producirá artefactos de congelación significativos en el músculo.
NOTA: tejido puede secarse adicionalmente haciéndola rodar en el polvo de bebé. Este paso no es generalmente necesario para los músculos a menos que hayan estado en un ambiente excesivamente húmedo. - Coloque (OCT o un adhesivo similar tal como goma tragacanto) en la parte inferior de un criomolde poco profunda o en el corcho, con sólo lo suficiente OCT para proporcionar una base para el músculo orientado (Figura 2C). Etiquetado del corcho o criomolde antes de la congelación puede ser útil para el seguimiento de la muestra.
- Carefully colocar el músculo en el molde en la orientación deseada, con la mayoría del músculo que sobresale de los PTU para que el músculo en sección no está en contacto por OCT (Figura 2C).
- Añadir isopentano a una taza de metal hasta que se alcanza una profundidad de aproximadamente 3-4 cm.
- Póngase los guantes de seguridad térmica y retire la tapa de Dewar.
- Coloque o sostener la taza de metal en contacto con el nitrógeno líquido, de modo que el nivel de nitrógeno líquido en la parte exterior de la copa está por encima del nivel de la isopentano en el interior de la copa. Estrategias para organizar estos contenedores se muestran en la Figura 2.
- No permita que el nitrógeno líquido para entrar en la copa de metal, ya que produce una espuma burbujeante que puede ser incómodo para trabajar con (y también es lo suficientemente frío para congelar).
- Observe el isopentano para determinar cuando se ha alcanzado la temperatura apropiada. A la temperatura apropiada (de manera óptima entre -140 a -149 ° C), por lotapa blancos guijarros de isopentano congelado formarán (después de unos minutos, y después de la niebla inicial ha desaparecido por encima del isopentano) en el fondo de la taza, o la solución generalmente espese a la consistencia de la melaza. Congelar antes de esta etapa producirá atifacts congelación.
- Si el isopentano se congela completamente sólida, descongelar y enfriar a temperaturas bajo cero de nuevo antes de su uso posterior.
- Con unas pinzas previamente refrigeradas, baje el espécimen y corcho / molde en el isopentano durante aproximadamente 10-20 segundos.
- Coloque la muestra congelada en un recipiente previamente enfriado.
- Mantenga la muestra y el recipiente con hielo seco en todo momento hasta la transferencia a un -80 ° C congelador.
5. Si Artefacto congelación es presente en el tejido ya congelados, es posible mejorar el grado de artefactos de congelación utilizando la siguiente "Descongelar y Volver a congelar" Procedimiento
- Tome bloques del congelador, uno a la vezY mantenerlos en hielo seco. El calendario de este protocolo es fundamental. Sólo descongelar y volver a congelar un bloque a la vez.
- Mueva la muestra de hielo seco a temperatura ambiente.
- Si la muestra se embebió en OCT, eliminar los PTU que rodea lo más completamente posible el uso de un bisturí.
- Permitir que la muestra se descongele a temperatura ambiente hasta el punto de que esté completamente descongelado, pero no hasta el punto en el que se está secando.
- Prod suavemente la muestra con un fórceps para asegurar que la muestra está completamente descongelado antes de pasar al siguiente paso.
- Congelar el músculo como se especifica en los pasos 4.1 a 4.10.
6. Preparación de Muscle for Testing Funcional Skinned fibra del solo
- El procedimiento de almacenamiento para el músculo depende de cuando el músculo / fibra está siendo utilizado para los experimentos.
- Para su uso en unas pocas semanas, colocar el músculo en una solución de 50% glycerol/50% de solución de relax (ver Reactivos), y se almacena a -20 ° C.
- Para el uso de popaer un par de semanas, colocar el músculo en una solución de 75% glycerol/25% de solución de relax (ver Reactivos), y se almacena a -80 ° C.
- Por otra parte, dejar que el músculo seco, pines para el corcho, y almacenarlos en gránulos de sílice a -80 ° C. Estos músculos deshidratados se pueden usar para año.
7. Preparación de músculo fresco para el Transporte de cultivo celular a laboratorios externos
Protocolos para el establecimiento de cultivos de células han sido bien descrito en otros lugares 4-7.
- Llenar un tubo cónico estéril de 50 ml con medio de crecimiento completo estéril.
- Añadir el tejido muscular al tubo utilizando unas pinzas esterilizadas, sumergiendo completamente el tejido en los medios de comunicación.
- Llenar el resto del tubo con medios para prevenir el secado durante el envío.
- Añadir compresas de hielo en la caja de espuma de poliestireno y colocar el tubo cónico cerca de varias bolsas de hielo.
- Tenga en cuenta que sólo los paquetes de hielo (y no de hielo seco) se debe utilizarpara evitar daños por congelamiento del líquido y el tejido.
- Los paquetes se envían O / N, pero los tejidos pueden durar 2 días en estas condiciones.
Representative Results
Para dar ejemplos de los artefactos observados con la congelación inadecuada, varios músculos del cuadriceps de ratones fueron congelados utilizando diferentes técnicas (Figura 3) para replicar los errores encontrados comúnmente. Como se muestra en la Figura 3A, el músculo esquelético apropiadamente congelado muestra una aposición estrecha de miofibras en el tejido circundante (por lo general otras fibras musculares, pero a veces el espacio entre endomisio miofibras se llena con la fibrosis o células inflamatorias en una variedad de procesos de enfermedad o lesión) y un compartimiento citoplasmático claramente visible. Para el análisis patológico, la capacidad de ver el espacio intracelular es a menudo más importante que el compartimento endomisio, ya que suele ser crítico para identificar claramente la presencia de cambios degenerativos, cambios regenerativos, u otros hallazgos patognomónicos (núcleos centrales, inclusiones intracelulares) en este espacio. Por lo tanto, la presencia de cristales de hielo en el compartimento intracelular representa amAjor problema en la evaluación patológica de los músculos.
Congelación adecuada de tejido muscular requiere ambas temperaturas suficientemente frías y una velocidad suficiente de la congelación para evitar la formación de cristales de hielo. Incluso cuando la contabilidad de ambos factores, considerable de artefactos de congelación aún puede ocurrir debido a un exceso de humedad en el tejido muscular. Este problema se encuentra más comúnmente en el tejido muscular que había sido sumergida previamente en solución salina y se secó insuficientemente o cuando el músculo ha estado en contacto directo por OCT medios de montaje en el sitio de seccionamiento (Figura 3B, 3E). Mientras algún contacto con octubre suele ser inevitable, como consecuencia del proceso de montaje, se debe hacer todo lo posible para evitar el contacto entre las áreas que serán evaluados histológicamente y los PTU, destinados al montaje. En contraste, las muestras congeladas utilizando un -80 ° C congelador (Figura 3 C) y nitrógeno líquido (Figura 3D) proporcionan ejemplos de artefacto de congelación que se produce por la temperatura subóptima o la velocidad de congelación. El proceso de congelación lenta encontrado mediante la colocación de tejido en un congelador -80 ° C proporciona un ejemplo extremo de congelación artefacto. Cuando se utiliza nitrógeno líquido, el problema principal es que el contacto entre el nitrógeno líquido y el tejido provoca una vaina de nitrógeno gaseoso para formar en la interfaz tejido-líquido, y esta interfaz gaseosa no es lo suficientemente fría para producir muscular rápida congelación 1. Esto puede producir artefactos de congelación significativa cerca de la superficie de la muestra, pero las áreas internas de la muestra es más probable que el flash de congelación a una velocidad apropiada y puede ser totalmente a salvo de heladas artefacto. Mientras que el simple inmersión del tejido muscular en nitrógeno líquido no es tan útil como el proceso de isopentano de congelación, puede ser útil para la congelación de muestras de músculos grandes en situaciones en isopentano no está disponible (por ejemplo, muestras de autopsia clínica en las instituciones conlaboratorios de patología muscular clínicos fuera). Los resultados con esta estrategia son generalmente mejor cuando se utilizan grandes porciones de tejido (> 2 cm en varias dimensiones).
Si bien la evitación de artefacto de congelación proporciona resultados histológicos óptimas, una técnica también ha sido desarrollado (y descrito en el presente documento) que invierte sustancialmente la congelación artefactos para permitir la evaluación de tejido congelado de forma incorrecta. El tejido que se congela de forma incorrecta (Figura 3E) se puede descongelar y volver a congelar bajo condiciones estrictamente controladas (Figura 3F) para permitir que la redistribución del agua dentro de las fibras, y el grado de conservación morfológica que es obtenible puede ser excelente. En nuestra experiencia, este proceso preserva la morfología intracelular del tejido de manera muy notable, pero a menudo se produce una separación de artefactos de las fibras dentro del espacio endomisio. Como muchos puntos finales patológicos se encuentran en el espacio intracelular y aquellos en losel espacio endomisial se ve mejor utilizando tinciones especiales (ya sea para resaltar la fibrosis o para identificar otros tipos de células), se espera que alteren verdaderamente la evaluación patológica de los músculos de estos cambios de artefactos.
Figura 1. Triage de tejido para estudios estructurales, funcionales, y celulares de músculo esquelético. Dependiendo de los tipos de estudios deseados, tejido de músculo esquelético recogido se puede procesar en una variedad de maneras para obtener resultados óptimos. Los protocolos descritos en el presente documento se describen los métodos de triage o procesamiento de muestras de músculo esquelético para estudios fuera del sitio para optimizar los resultados que se pueden obtener a partir de unidades de apoyo de expertos.
Figura 2. Ejemplos de aparatos utilizados para la congelación del músculo. Como se describe en el protocolo, la congelación muscular óptimo requiere la inmersión del tejido muscular en isopentano que está en su temperatura de congelación. Un medio seguro y eficaz de obtención de isopentano enfriado con hielo implica el uso de un recipiente de metal para el isopentano que se enfría en un Dewar circundante que contiene nitrógeno líquido. Como a menudo es conveniente tener las dos manos libres, es posible utilizar un aparato ortopédico tales como un anillo de soporte (A) para mantener el recipiente isopentano en el nitrógeno líquido mientras que la prevención de la mezcla de los dos líquidos. Alternativamente, el recipiente también podría celebrarse en el nitrógeno líquido manualmente (B). En cualquier caso, el tejido no debe ser colocado en el isopentano hasta que el isopentano se visiblemente helada en la parte inferior del recipiente (por lo general como guijarros blancos opacos), y luego debe ser sumergido durante 10-20 segundos para permitir la congelación completa. Isopentane a temperatura de congelación produce "niebla" mínimo (es decir, la temperatura no es adecuada si considerable niebla está presente). Una vez que el tejido se congela, colocar directamente en los recipientes de pre-enfriada (y luego directamente en un refrigerador o congelador) para evitar la descongelación accidental después de la congelación. Músculo congelado (C) montado Apropiadamente-debe tener la mayoría del tejido muscular que sobresale de una base de congelado octubre
Figura 3. Ejemplos de congelación artefacto, y de eficaz descongelación / recongelación. Imágenes representativas de (A) músculo apropiadamente isopentano-congelado, (B) músculo congelaron en isopentano apropiadamente, pero mientras está en contacto con el medio de montaje PTU, (C) de músculo congelado en un congelador a -80 °, y (D (B), el alto contenido de líquido de octubre produce artefactos de congelación significativa en el músculo que está en contacto con él, se debe utilizar de modo que sólo la cantidad mínima de octubre requerido para el montaje y el músculo para la evaluación histológica debe ser "de pie fuera "de su superficie. La lentitud del proceso de congelación utilizando un (C) -80 ° C congelador o (D) de nitrógeno líquido (en relación con la velocidad de congelación en hielo isopentano frío) puede conducir a la producción de artefactos de congelación significativa. Paneles E y F muestran el músculo de la misma muestra que era (E) inicialmente subóptima congelada (debido a un contacto excesivo con OCT) y después (F) descongelado y vuelto a congelar utilizando la técnica descrita en este documento. Si bien se puede observar una cierta separación de artefactos entre las fibras en la muestra vuelto a congelar, la i mejoran la morfología intracelular de las fibras musculares es evidente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
El músculo esquelético es un tejido estructural y funcionalmente único, y procedimientos especializados de preparación son necesarios para poder realizar una evaluación óptima de los parámetros estructurales y funcionales. Aunque una variedad de tejidos se congelan comúnmente para estudios patológicos en contextos clínicos y de investigación, los protocolos de congelación de los tejidos no musculares generalmente implican la inmersión total del tejido en octubre antes de la congelación. Como se muestra en la Figura 3, un protocolo de este tipo no es adecuado para la evaluación patológica de los músculos esqueléticos y sin embargo es lo suficientemente similar al protocolo descrito aquí que se trata de un error de comúnmente encontrado. El objetivo de este trabajo es proporcionar un protocolo sencillo para el manejo adecuado de los músculos para evitar problemas como éste. Consejos También se ha recopilado en el manejo adecuado de los músculos para fisiológica fuera de sitio y los estudios celulares, en un esfuerzo para facilitar la adquisición de datos de alta calidad en los laboratorios centrales del exterior en los casos where los estudios in situ no son preferibles o posible.
Como se señala en este protocolo, los elementos que son absolutamente esenciales en el procesamiento adecuado de músculo para estudios patológicos incluyen minimizar el contenido de agua del tejido, la disminución de la temperatura a la que se congela el músculo, y el aumento de la velocidad a la que se logra la congelación. El exceso de humedad en el tejido o la lentitud excesiva del proceso de congelación (producido por temperaturas insuficientes o por la falta de contacto directo entre el agente de congelación y el tejido, como se encuentra con nitrógeno líquido) dará lugar a la congelación de los artefactos que pueden afectar el análisis patológico. Como PTU dispone una fuente adicional de la humedad del tejido, muchos laboratorios utilizan otros adhesivos como goma de tragacanto como un sustrato de la incrustación. Incluso en los casos en que la congelación se lleva a cabo adecuadamente, se debe tener cuidado para evitar especímenes posteriormente descongelación accidentalmente a través del contacto con recipientes o instrumentos RT.Por lo tanto, un proceso de congelación con éxito requiere un cierto grado de planificación que incluye un pre-enfriamiento de todos los instrumentos y contenedores que se utilizarán. Cuando se encuentran artefactos de congelación, hay un método descrito aquí para la recuperación del tejido que es suficiente para la mayoría de las evaluaciones patológicas. Sin embargo, este ciclo de congelación / descongelación no ofrecer la histología perfecta y tiene el potencial de afectar otros estudios moleculares o enzimática del tejido (además del tiempo necesario para volver a congelar el tejido), por lo que el uso de prácticas apropiadas de congelación inicial es mucho más preferible . En los casos en que se encontró artefacto de congelación en el tejido de pre-congelados, sin embargo, la técnica descrita en este documento puede ser extremadamente útil.
La fijación y el procesamiento de tejido para ME ofrece desafíos técnicos específicos que requieren una planificación previa a la recogida de tejidos. El error más común en la recogida de muestras para EM implica el uso de fragmentos de tejido que son demasiado gruesas para glutaraldehyde para penetrar. Como glutaraldehído sólo penetra aproximadamente 0,1 cm en el tejido muscular de una superficie determinada, se debe tener cuidado para asegurarse de que una de las dimensiones de las muestras EM es no más gruesa que 0,2 cm. Además, como EM es un medio excelente para evaluar directamente el aparato contráctil, algunos investigadores han desarrollado estrategias de pre-tensión o estiramiento previo del músculo antes de la fijación para permitir la medición de los elementos contráctiles a una tensión fisiológicamente relevante. No existe un protocolo estándar para la pre-tensado, pero dos estrategias se describen brevemente en este protocolo. Cabe señalar que los intentos de pre-tensar el músculo puede producir resultados impredecibles a menos que se llevan a cabo de una manera muy específica, y puede ser preferible fijar los músculos en el estado de holgura para evitar cambios de artefactos en la longitud del sarcómero a través de un no estándar procedimiento de pretensado 8,9. Para que los músculos en que este tipo de medidas específicas no son necesarias (incluyendo la mayor parte biopsies realizados con fines clínicos), generalmente no se realizan esfuerzos para pre-tensión del músculo, y el principal efecto de la morfología muscular es una separación no uniforme de sarcómeros en el músculo.
Este trabajo representa la primera de una serie para proporcionar los SOP para la realización de las pruebas en el campo de la enfermedad muscular congénita, y representa el esfuerzo de más de 20 expertos en el campo de la enfermedad muscular congénita que es rutinario realizar celular, molecular y funcional, fisiológica y la investigación patológica. Se pondrá a disposición una serie de procedimientos normalizados de trabajo publicados durante el próximo año, y los protocolos necesarios y todos los formatos adecuados para cada se discutieron en un músculo de la Enfermedad congénita Consorcio taller celebrado en abril de 2013 en Washington DC El objetivo de este esfuerzo SOP es proporcionar una hoja de ruta para las pruebas necesarias y el análisis de muestras en el campo de la enfermedad muscular congénita a 1) estandarizar las prácticas y los criterios de valoración utilizados en nuestro campo como much como sea posible, y 2) proporcionar instrucción sobre las prácticas estándar para los nuevos investigadores en nuestro campo. Creemos que estos recursos facilitarán la entrada de nuevos investigadores en nuestro campo bajo estudiada y así mejorar el alcance de la investigación que se puede realizar. Además, una estandarización de las prácticas será de gran utilidad para comparar los datos entre los estudios e identificar los puntos finales en la planificación y la realización de los ensayos preclínicos y clínicos.
Mientras que el foco principal de este artículo está relacionado con la congelación y preparación de tejido apropiado para una variedad de estudios, nuestro grupo de colaboración también discutió los puntos finales útiles para el análisis patológico de los especímenes musculares. En la actualidad, no existe un consenso oficial sobre el enfoque a adoptar cuando se realiza el análisis patológico, y una variedad de diferentes estudios se llevan a cabo para relacionar los nuevos conocimientos a las publicaciones anteriores para cada enfermedad respectiva. Por lo tanto, pensamos que sería útil paraproponer algunas directrices generales para la planificación de los extremos patológicos en la musculatura caracterización patología. Antes de la cuantificación de la patología en un estudio, el pensamiento considerable se debe poner en 1) el método de medición del tamaño de la fibra, 2) la posibilidad de anomalías de tipo de fibra específico o efectos del tratamiento, 3) la posibilidad de alteraciones o efectos que se limitan a los músculos individuales, y 4) una estrategia para la cuantificación de los hallazgos patológicos que son característicos de la enfermedad en estudio. Tamaño de fibra es un punto final necesario para la mayoría de los estudios, y por desgracia hay una extensa variación en la forma en que se cuantifica. Muchos estudios reportan estos resultados usando métodos de cuantificación automatizadas proporcionadas por el software de imágenes de propiedad, pero muchos de estos programas toman atajos (como el supuesto de que las fibras son círculos o elipses), que puede hacer estas mediciones automatizadas inexacta. Es necesario entender cómo estos programas automatizados hacen sus mediciones bntes de tener confianza en las mediciones, y animamos a los investigadores a incluir estos detalles en los métodos de papel. Además, la medición específica utilizada para denotar tamaño de la fibra es extremadamente variable, y algunas mediciones son preferibles a otros 10,11. Una medida comúnmente utilizada de tamaño de la fibra es el área de sección transversal de la fibra (CSA), en particular porque los investigadores que realizan estudios fisiológicos estandarizar sus resultados con las mediciones de CSA obtenidos usando sus instrumentos. Desafortunadamente, mientras que las mediciones de CSA pueden reflejar con precisión el tamaño de la fibra en las secciones transversales perfectos, que dependen en gran medida en orientación de la fibra (en la medida en que las fibras longitudinales u oblicuamente seccionadas-tendrán mediciones artificialmente altos CSA) y son por lo tanto las mediciones no ideales para el tamaño de la fibra. Una medida preferible de tamaño de la fibra que es menos dependiente de fibra de área de sección transversal es el diámetro de la Feret mínimo (diámetro MinFeret), que es la medición de the diámetro menor en la célula muscular 12. Esta medida es sólo ligeramente dependientes orientación de las fibras y generalmente es el estándar de oro para la medición clínica de la fibra, y se anima a los investigadores a avanzar hacia el uso de esta técnica. Estas mediciones a menudo se pueden hacer usando el mismo software que genera mediciones CSA 13, y también son fáciles de medir manualmente. Con respecto a la evaluación de los datos patológicos de acuerdo con el tipo de fibra, músculo específico, y en el contexto de los hallazgos patológicos relacionados con la enfermedad específica, estos son temas menos controversiales que sólo deben tenerse en cuenta durante la planificación de un estudio. Tipo de fibra puede ser evaluada utilizando tinción inmunohistoquímica o ATPasa, pero es útil tener en cuenta que los músculos específicos y especies animales tienen mezclas específicas de estos tipos de fibras (necesitando por lo tanto diferentes expectativas y las estrategias de ensayo). Implicación patológica específica muscular o la eficacia del tratamientopuede ocurrir, y el peso total del músculo en comparación con los controles se puede utilizar para identificar el grado de heterogeneidad de la enfermedad antes de decidir sobre los músculos para evaluar patológicamente. Por último, es bien sabido que muchas enfermedades musculares están asociados con anomalías patológicas específicas (tales como varillas nemaline en miopatía nemalínica) 14,15, y por lo que también es útil considerar si estas anomalías se encuentran en un músculo de tipo fibra o -específica de distribución cuando se realiza el análisis 16,17. En general, aunque no proponemos un conjunto inflexible de normas para la evaluación de los músculos, creemos que estos temas deben ser considerados antes de la realización de los estudios patológicos en cualquier enfermedad del músculo esquelético.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For tissue freezing | |||
| Liquid nitrogen dewar with a liquid withdrawal device | Custom Biogenic Systems | Lab-5 Series | Any other liquid nitrogen dewar could substitute. |
| Cold-conductive container | Fisher | 02-583A | |
| Wide insulated container capable of holding liquid nitrogen | Nalgene | 4150-2000 | |
| Oakton Temp 10 Thermocouple Thermometer | Thomas Scientific | 1228Y01 | Optional, but can be very useful in identifying the point at which isopentane is freezing. |
| For single fiber functional testing | |||
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11 | |
| Sylgard coating | Ellsworth Adhesives | 3-6636 | |
| Dissection stereomicroscope | Harvard Apparatus | 693101 | Any other dissection microscope could substitute. |
| For cell culture | |||
| Sterile laminar flow hood | Thermo Scientific | 51022485 | Any other cell culture hood could substitute. |
| For tissue freezing | |||
| Plastic bags/containers | Nasco | B01009WA | |
| Thermal safety gloves | Denville | G4162 | |
| Face shield | Fisher Scientific | S47640 | |
| Long forceps | Fisher Scientific | 12-460-807 | |
| Marker | Staples | 125328 | |
| For cell culture | |||
| Sterile 50 ml conical tubes | Denville | C1060-P | |
| PES filter unit, 500 ml, 0.22 µm | Denville | F5227 | |
| Sterile forceps | Fisher Scientific | 644320 | |
| Ice packs | Fisher Scientific | NC9909223 | |
| Insulated styrofoam box | Polar Tech | 207F | |
| Packing tape | Staples | 795570 | |
| Tissue freezing | |||
| Liquid nitrogen | Airgas | NI NF160LT350 | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Isopentane (2-methylbutane) | Sigma | M32631-4L | Store Isopentane in a flammable materials cabinet. |
| EM fixative (choose one) | The buffers without fixative should also be available, as EM-fixed tissues should be transferred from fixative to buffer after several hours or days if they are not immediately processed for EM. | ||
| 2.5% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 16537-15 | |
| Karnovsky's fixative (3% glutaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0.1M phosphate buffer) | Electron Microscopy Sciences | 15732-10 | |
| For functional studies (if desired) | |||
| Relaxing solution, containing (in mmol/L) | |||
| 40 BES | Sigma | B9879 | |
| 10 EGTA | Sigma | E4378 | |
| 6.56 MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| 5.88 Na-ATP | Sigma | A3377 | |
| 1.0 DTT | RPI | D11000 | |
| 46.35 K-propionate | Make a solution by mixing proprionic acid (Sigma P1386) and KOH (Fisher P250) 1:1 | ||
| 15 creatine phosphate, pH 7.0 | Sigma | P7936 | |
| 0.4 leupeptin | Calbiochem | 10895 | |
| 0.1 PMSF | Sigma | P7676 | |
| Skinning solution, containing | |||
| Relaxing solution (See Above) | |||
| 0.5% Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Indicating silica granules | |||
| Flat pieces of cork (1 x 1 inch) | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| For cell culture (if desired) | |||
| Complete Growth Medium, containing (for 500 ml) | Sterilize by filtering the solution through a 500 ml 0.22 µm PES filter unit. Store at 4°C and use within 1 month. | ||
| 395 ml of high glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D5671 | |
| 100 ml of fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F6178 | |
| 5 ml of 100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG) | Sigma | G1146 | |
| See the materials safety data sheet (MSDS) for all other reagents for storage specifications |
References
- Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. 15, Elsevier. 407-442 (2007).
- Lawlor, M. W., et al. Enzyme replacement therapy rescues weakness and improves muscle pathology in mice with X-linked myotubular myopathy. Hum Mol Genet. 22, 1525-1538 (2013).
- Talmadge, R. J., Roy, R. R. Electrophoretic separation of rat skeletal muscle myosin heavy-chain isoforms. J Appl Physiol. 75, 2337-2340 (1993).
- Blau, H. M., et al. Differentiation properties of pure populations of human dystrophic muscle cells. Exp Cell Res. 144, 495-503 (1983).
- Lawlor, M. W., et al. Myotubularin-deficient myoblasts display increased apoptosis, delayed proliferation, and poor cell engraftment. Am J Pathol. 181, 961-968 (2012).
- Pavlath, G. K., Gussoni, E. Human myoblasts and muscle-derived SP cells. Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).
- Webster, C., Blau, H. M. Accelerated age-related decline in replicative life-span of Duchenne muscular dystrophy myoblasts: implications for cell and gene therapy. Somat Cell Mol Genet. 16, 557-565 (1990).
- Ottenheijm, C. A., et al. Thin filament length dysregulation contributes to muscle weakness in nemaline myopathy patients with nebulin deficiency. Hum Mol Genet. 18, 2359-2369 (2009).
- Witt, C. C., et al. Nebulin regulates thin filament length, contractility, and Z-disk structure in vivo. EMBO J. 25, 3843-3855 (2006).
- Garton, F., et al. Validation of an automated computational method for skeletal muscle fibre morphometry analysis. Neuromuscul Disord. 20, 540-547 (2010).
- Kim, Y. J., et al. Fully automated segmentation and morphometrical analysis of muscle fiber images. Cytometry A. 71, 8-15 (2007).
- Lawlor, M. W., et al. Inhibition of activin receptor type IIb increases strength and lifespan in myotubularin-deficient mice. Am J Pathol. 178, 784-793 (2011).
- Mula, J., et al. Automated image analysis of skeletal muscle fiber cross-sectional area. J Appl Physiol. 114, 148-155 (2013).
- Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. , Elsevier. 407-442 (2007).
- Nance, J. R., et al. Congenital myopathies: an update. Curr Neurol Neurosci Rep. 12, 165-174 (2012).
- Clarke, N. F., et al. Mutations in TPM3 are a common cause of congenital fiber type disproportion. Ann Neurol. 63, 329-337 (2008).
- Lawlor, M. W., et al. Mutations of tropomyosin 3 (TPM3) are common and associated with type 1 myofiber hypotrophy in congenital fiber type disproportion. Hum Mutat. 31, 176-183 (2010).
