Abstract
Skelettmuskulatur är en unik vävnad på grund av dess struktur och funktion, vilket kräver specifika protokoll för vävnads insamling för att få optimala resultat från funktionella, cellulära, molekylära och patologiska utvärderingar. På grund av den subtila några patologiska avvikelser ses i medfödda muskelsjukdomar och potentialen för fixering störa erkännandet av dessa funktioner, är patologisk utvärdering av fryst muskel föredra framför fasta muskler vid utvärdering av skelettmuskulatur för medfödd muskelsjukdom. Dessutom, potential att producera allvarliga frysning artefakter i muskler kräver speciella försiktighetsåtgärder vid frysning skelettmuskel för histologisk undersökning som inte är vanligt förekommande vid frysning andra vävnader. Detta manuskript beskriver ett protokoll för snabb nedfrysning av skelettmuskulaturen med hjälp isopentan (2-metylbutan) kyld med flytande kväve för att bevara optimal skelettmuskulaturen morfologi. Detta förfarande är också effektivt för freezing vävnad avsedd för genetiska eller proteinexpressionsstudier. Dessutom har vi integrerat vår frysprotokoll i ett bredare förfarande som även beskriver vilka metoder för korttids triage av vävnad för (1) enda fiber funktionella studier och (2) myoblast cellodling, med fokus på den minsta ansträngning som krävs för att samla in vävnad och transportera det till specialiserade forsknings-eller referenslaboratorier för att slutföra studierna. Sammantaget ger detta manuskript en översikt över hur frisk vävnad kan fördelas effektivt för olika fenotypiska studier och därmed ger standardrutiner (SOP) för patologiska studier relaterade till medfödd muskelsjukdom.
Protocol
Märk behållare som skall användas för muskellagring med lämpliga identifierings för djuret och muskler skördas. Förkyla påsar / behållare och instrument för att förhindra frysning / upptining av vävnaden då den tillsätts.
1. Studie-Design Överväganden för muskelvävnad samling
- För små djur (murina) modeller av muskelsjukdom, använder en hel muskel för studien eftersom små djurmodeller ofta kräver utvärdering av en hel muskel att ge tillräcklig myofiber provtagning för patologiska undersökningar. För stora djur (hund) modeller av muskelsjukdom, använder muskel delar som är minst 0,3 x 0,3 cm eller mer i sin tvärgående (tvärsnitt) aspekt.
OBS: Kärn biopsier kan också användas, men kanske inte optimal för primära karakteriseringsstudier beror på urvalet frågor. - För studier med sarcomere kan den ultra mätning av sarcomere längd innehålla en kritisk endpoint och kan require specialiserade hantering. Det är oftast bara relevant i sjukdomar där delar av sarcomere show olämpliga längder, som i en del orsaker till nemalinmyopati. Vissa laboratorier föredrar att fixa muskel i sin icke-kontrakterade eller sträckt tillstånd, istället för att genomföra dessa mätningar på icke-spända eller icke-sträckt muskel.
- Om sarcomere längden inte kommer att mätas, fixa muskelvävnad utan försträck muskeln genom att placera den direkt till önskad EM fixativ (se reagenser).
- Om sarcomere längder kommer att mätas, kan flera tekniker för att i förväg sträcka muskeln (se Diskussion) användas:
- Använd en klämanordning för att hålla en muskel vid sin vilospänning medan den fortfarande är i djuret, utklippning muskeln runt utsidan av klämman och placera den direkt in i den önskade EM-fixativ (se Reagens).
- Sträck och nåla muskeln till en yta (t.ex. en bit kork) med en längd som liknar den som observerats
2. Under dela isolerade skelettmuskler i fragment som är lämpliga för den önskade studier (figur 1)
- För frysta muskel histologi:
- Ta med så mycket av en viss muskel som möjligt för att minimera provtagning bias (se steg 1.1), men prover bör vara <1,5 cm för att undvika frysning artefakter.
- Behandla alla muskler från samma studie på samma sätt för att förhindra artefaktuella skillnader i fiberstorlek på grund av skillnader i hanteringen.
- För elektronmikroskopi (EM):
- Skär ett ~ 0,5 x 0,2 x 0,2 cm remsa av muskel från provet, med den longitudinella axeln av provet parallellt med den längsgående axeln av den ursprungliga muskel.
OBS! Fixativ kommer inte tillräckligt penetrera tjockare bitar av vävnad, så att upprätthålla exemplar tjocklek på 2 mm eller mindre är avgörande för att få lämpliga resultat. Dessutomsom orientering av sådana små fragment av muskler är ofta svårt, är det lämpligt att använda ett fragment av vävnad som efterliknar den verkliga orienteringen av muskeln (det vill säga, är det längsta aspekten av de fasta provet längd orientering muskel / myofibers) till minimera hantering och förvirring under EM bearbetning.
- Skär ett ~ 0,5 x 0,2 x 0,2 cm remsa av muskel från provet, med den longitudinella axeln av provet parallellt med den längsgående axeln av den ursprungliga muskel.
- För cellkultur:
- Den önskade cellutbytet kan påverka mängden muskler som behövs för cellkultur anläggning. Enskilda muskler (eller delar av muskler) från små djur kan ge tillräckligt cell nummer att etablera cellkulturer, så om det är nödvändigt, pool vävnad från flera muskler.
3. Vävnads Fixering och Behandling för elektronmikroskopi (EM)
- Placera ett fragment av muskel som inte är större än 2 mm i sin tunnaste dimension direkt in i den önskade EM-fixativ (se Reagens).
- Placera muskeln i EM fixeringsbuffert (se reagenser) efter 2-48 timmar av fixatividare. Förlängd fixering (veckor eller månader) kan resultera i förlust av ultra detalj på EM-studier.
- Skicka till en EM-core anläggning för bearbetning.
4. Muskel Frysning för Histologisk, Biokemiska och molekylära studier
- Ta bort överdriven fukt i provet genom att grundligt läsk förlagan med en pappershandduk tills vävnaden är något vidhäftande till handduken. Fukt kommer att ge betydande frysning artefakter i muskeln.
OBSERVERA: Tissue kan torkas ytterligare genom att rulla den i babypuder. Detta steg är i allmänhet inte nödvändigt för muskler om de inte har varit i en alltför fuktig miljö. - Placera oktober (eller ett liknande bindemedel, såsom dragantgummi) i botten av en grund cryomold eller på kork, med endast tillräckligt oktober att ge en grund för den orienterade muskel (figur 2C). Inmatning av korken eller cryomold före frysning kan vara användbara för preparat spårning.
- Carefully placera muskeln in i formen i den önskade orienteringen, med majoriteten av muskeln som skjuter ut från oktober så att sektionerad muskler är inte i kontakt med oktober (figur 2C).
- Lägg isopentan till en metallkopp tills den når ett djup av ca 3-4 cm.
- Sätt på termiska skyddshandskar och ta bort locket på Dewar.
- Placera eller hålla metallkopp i kontakt med flytande kväve, så att nivån av flytande kväve på utsidan av koppen är ovanför nivån för den isopentan på insidan av koppen. Strategier för att ordna dessa behållare visas i figur 2.
- Låt inte flytande kväve för att komma in i metallkopp, eftersom det ger en bubblande skum som kan vara besvärligt att arbeta med (och är också tillräckligt kallt för frysning).
- Beakta isopentan för att bestämma när den har nått den lämpliga temperaturen. Vid lämplig temperatur (optimalt mellan -140 till -149 ° C), sålock vita stenar fryst isopentan bildas (efter några minuter, och efter den inledande dimman har försvunnit ovanför isopentan) på botten av koppen, eller lösningen kommer i allmänhet att tjockna till konsistensen av melass. Frysning före detta skede kommer att ge frys atifacts.
- Om isopentan fryser helt fast, tina och kyla till frystemperaturer igen innan senare användning.
- Med hjälp av pre-kylda pincett, sänk provet och kork / mögel i isopentan för ca 10-20 sek.
- Placera det frusna provet till en i förväg kyld behållare.
- Förvara provet och behållare på torr is hela tiden tills överföring till en -80 ° C frys.
5. Om frysning Artefakt är Närvarande i redan fryst vävnad, är det möjligt att förbättra graden av frysning Artifact ut till följande "Thaw och Frys fast" Tillvägagångssätt
- Ta block ut ur frysen, en i taget, Och hålla dem på torris. Tidpunkten för detta protokoll är kritisk. Endast tina och refreeze ett block i taget.
- Flytta prov från torris till RT.
- Om provet har inbäddade i oktober, ta bort den omgivande oktober så fullständigt som möjligt med hjälp av en skalpell.
- Tillåt provet att tina vid rumstemperatur till den punkt där den är smält fullständigt, men inte till den punkt där den torkar ut.
- Prod försiktigt provet med en pincett för att säkerställa att provet är helt tinat innan du fortsätter till nästa steg.
- Frys muskeln som anges i steg från 4,1 till 4,10.
6. Beredning av muskler för Skinned Single Fiber Funktionell testning
- Förfarandet för muskel lagring beror på när muskeln / fiber som används för experiment.
- För användning inom några veckor, placera muskeln i en lösning av 50% glycerol/50% avkopplande lösning (se reagenser), och förvara vid -20 ° C.
- För användning akteruter några veckor, placera muskeln i en lösning av 75% glycerol/25% avkopplande lösning (se reagenser), och förvara vid -80 ° C.
- Alternativt, låt muskel torka, stift till kork, och butik på kiselgranulat vid -80 ° C. Dessa dehydratiserade muskler kan användas i flera år.
7. Beredning av frisk muskel för frakt av cellodling av utomstående laboratorier
Protokoll för etablering av cellkulturer har väl beskrivna på annan plats 4-7.
- Fyll ett 50 ml sterilt koniskt rör med sterilt komplett tillväxtmedium.
- Lägg muskelvävnaden till röret med hjälp av en steril pincett, helt sänka ned vävnaden i media.
- Fyll resten av röret med media för att förhindra uttorkning under transporten.
- Lägg is förpackningar till frigolitlåda och placera den koniska röret nära flera is förpackningar.
- Observera att endast is förpackningar (och inte torr is) bör användasatt förhindra skador från frysning av vätskan och vävnaden.
- Ship paket O / N, men vävnader kan pågå 2 dagar under dessa förhållanden.
Representative Results
För att ge exempel på de artefakter som ses med felaktig frysning har flera mus quadriceps muskler fryst med olika tekniker (Figur 3) för att replikera gemensamt stött fel. Såsom visas i figur 3A visar ett lämpligt fryst skelettmuskel en tät apposition av myofibers på omgivande vävnad (vanligen andra muskelfibrer, men ibland endomysial utrymmet mellan myofibers fylls med fibros eller inflammatoriska celler i en mängd olika sjukdomar eller skadeprocesser) och en väl synlig cytoplasma fack. För patologisk analys, är förmågan att se det intracellulära utrymmet ofta viktigare än den endomysial facket, eftersom det vanligtvis är viktigt att tydligt identifiera förekomst av degenerativa förändringar, regenerativa förändringar eller andra patognomona fynd (centrala kärnor, intracellulära inneslutningar) i detta utrymme. Sålunda skapar närvaron av iskristaller i det intracellulära utrymmet representerar amajor problem i den patologiska bedömningen av muskeln.
Korrekt frysning av muskelvävnad kräver både tillräckligt kalla temperaturer och en tillräcklig hastighet för frysning för att undvika bildning av iskristaller. Även när redovisning av båda faktorerna, kan betydande frys artefakt fortfarande uppstå på grund av överdriven fukt i muskelvävnad. Det här problemet är vanligast förekommande i muskelvävnaden som tidigare hade nedsänkt i saltlösning och otillräckligt torkat eller när muskeln har varit i direkt kontakt med oktober montering media på platsen för sektionering (Figur 3B, 3E). Medan vissa kontakt med oktober är oftast oundviklig följd av monteringsprocessen, bör alla ansträngningar göras för att undvika kontakt mellan områden som kommer att histologiskt utvärderas och ULT som används för montering. Däremot prover frysta med hjälp av en -80 ° C frys (figur 3C) och flytande kväve (Figur 3D) ger exempels frys artefakt som produceras av suboptimal temperatur eller hastighet för frysning. Den långsamma frysningsprocess påträffas genom att placera vävnaden i en -80 ° C frys erbjuder ett extremt exempel på frysning artefakt. Vid användning av flytande kväve, är det största problemet att kontakt mellan flytande kväve och vävnaden orsakar en mantel av gasformigt kväve för att bilda åtmin den vävnadsvätskegränsytan, och denna gasformiga gränssnitt är inte tillräckligt kall för att åstadkomma snabb muskel frysning 1. Detta kan ge betydande frys artefakt nära ytan av provet, men interna områden av provet är mer benägna att flash-frysa vid en lämplig takt och kan vara helt förskonade frys artefakt. Även den enkla nedsänkning av muskelvävnad i flytande kväve är långt ifrån så bra som den isopentan-frysprocessen, kan det vara bra för frysning av stora muskelprover i situationer där isopentan inte är tillgänglig (t.ex. klinisk obduktion exemplar vid institutioner medkliniska muskelpatologilaboratorier). Resultat som använder denna strategi är i allmänhet bättre när man använder stora delar av vävnad (> 2 cm i flera dimensioner).
Medan undvikande av frysning artefakt ger optimala histologiska resultat, har en teknik som också utvecklats (och som beskrivs häri), som väsentligen reverserar frysning artefakter för att möjliggöra utvärdering av felaktigt fryst vävnad. Vävnad som felaktigt är frusen (figur 3E) kan tinas och frysas under noggrant kontrollerade förhållanden (Figur 3F) för att möjliggöra en omfördelning av vatten i fibrerna, och graden av morfologisk bevarande som kan erhållas kan vara utmärkt. Enligt vår erfarenhet, bevarar denna process den intracellulära morfologi av vävnaden till en anmärkningsvärd grad, men det ger ofta en artefaktuella separation av fibrer inom endomysial utrymme. Så många patologiska ändpunkter finns i det intracellulära utrymmet och de iden endomysial utrymmet ses bäst med hjälp av speciella fläckar (antingen för att markera fibros eller för att identifiera andra celltyper), är det osannolikt att verkligen försämra patologisk utvärdering av muskel dessa artefaktuella förändringar.
Figur 1. Triage av vävnad för strukturella, funktionella och cellulära studier av skelettmuskulaturen. Beroende på vilken typ av studier som önskas, kan samlas skelettmuskelvävnaden behandlas på en mängd olika sätt för bästa resultat. De protokoll som beskrivs i detta dokument beskriver metoder för triaging eller bearbetning av skelettmuskelprover för off-site studier för att optimera resultaten kan erhållas från expert core faciliteter.
Figur 2. Exempel på apparater som används för muskel frysning. Som beskrivs i protokollet, kräver optimal muskelfrys nedsänkning av muskelvävnad i isopentan som är som frystemperatur. Ett säkert och effektivt medel att erhålla iskall isopentan involverar användningen av en metallbehållare för isopentan som kyles i ett omgivande Dewar innehållande flytande kväve. Eftersom det ofta är bekvämt att ha båda händerna fria, är det möjligt att använda ett stag, såsom ett ringstativ (A) för att hålla isopentan behållaren i flytande kväve under förhindrande av blandning av de två vätskorna. Alternativt kan behållaren även hållas i flytande kväve manuellt (B). I båda fallen bör vävnaden inte släppas in i isopentan tills isopentan synligt frysning vid botten av behållaren (normalt som ogenomskinliga vita stenar) och sedan bör nedsänktes under 10 till 20 sek för att medge fullständig frysning. Isopentane vid frystemperatur ger minimal "dimma", (det vill säga, är temperaturen otillräckliga om betydande dimma förekommer). När vävnaden är frusen, placera den direkt i förväg kylda behållare (och sedan direkt in i en kylare eller frys) för att förhindra oavsiktlig upptining efter frysning. (C) Lämpligt monterade fryst muskel ska ha majoriteten av muskelvävnad som sticker ut från en bas av fryst oktober
Figur 3. Exempel på frys artefakt, och för effektiv upptining / omfrysning. Representativa bilder av (A) på lämpligt isopentan frysta muskler, (B) muskel fryses på lämpligt sätt i isopentan, men samtidigt i kontakt med oktober monteringsmedium, (C) muskel frysta i en -80 ° C frys, och (D (B), den höga vätskeinnehållet i oktober producerar betydande frys artefakt i muskler som är i kontakt med det, så bara minimalt med oktober krävs för montering bör användas, och muskeln för histologisk utvärdering bör vara "stående ut "från dess yta. Den långsamma frysprocessen med hjälp av en (C) -80 ° C frys eller (D) flytande kväve (i förhållande till hastigheten för frysning i iskall isopentan) kan leda till produktion av betydande frys artefakt. Paneler E och F visar muskler från samma prov som var (E) initialt suboptimalt fryst (på grund av överdriven kontakt med oktober) och (F) tinade och frysas med hjälp av den teknik som beskrivs häri. Samtidigt som man kan konstatera några artefaktuella separationen mellan fibrerna i refrozen prov, förbättringen in den intracellulära morfologi av muskelfibrer är uppenbart. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Skelettmuskulatur är en strukturellt och funktionellt unik vävnad, och specialiserade förberedelser är nödvändiga för att möjliggöra en optimal bedömning av strukturella och funktionella parametrar. Även en mängd olika vävnader vanligen frysas för patologiska undersökningar i kliniska och forskningssammanhang, frysning protokoll för icke-muskelvävnad brukar innebära den totala nedsänkning av vävnaden i oktober före frysning. Såsom visas i figur 3, är ett sådant protokoll är olämpliga för patologisk utvärdering av skelettmuskel och är tillräckligt lika för att det protokoll som beskrivs här att det är ett vanligt förekommande fel än. Målet med denna uppsats är att ge en enkel protokoll för en korrekt hantering av muskeln för att undvika frågor som denna. Råd har också sammanställts på korrekt hantering av muskler för off-site fysiologiska och cellulära studier i ett försök att underlätta förvärv av högkvalitativa uppgifter från utomstående kärn laboratorier i de fall where studier på plats inte är att föredra eller möjlig.
Som påpekas i detta protokoll, delar som är absolut nödvändiga i en korrekt behandling av muskel för patologiska studier inkluderar minimera vatteninnehållet i vävnaden, minskar den temperatur vid vilken muskeln är frusen, och öka den hastighet med vilken frysning uppnås. Fukt i vävnaden eller överdrivet långsamma frysprocessen (producerad av otillräckliga temperaturer eller av brist på direktkontakt mellan frysmedel och vävnaden, som påträffas med flytande kväve) kommer att leda till frysartefakter som kan försämra patologisk analys. Som oktober ger en ytterligare källa till vävnad fukt, många laboratorier använder andra lim som gummitragant som en inbäddning substrat. Även i de fall där frys är lämpligt utförs, bör försiktighet iakttas för att undvika senare misstag upptining exemplar genom kontakt med RT behållare eller instrument.Således kräver en framgångsrik frysprocess en grad av planering som innehåller en för-kylning av alla instrument och behållare som skall användas. När frys artefakter påträffas, det finns en metod som beskrivs här kan användas för återvinning av den vävnad som är tillräckligt för de flesta patologiska utvärderingar. Men denna frys / tö cykel inte erbjuda perfekt histologi och har potential att påverka andra molekylära eller enzymatiska studier av vävnaden (utöver den tid som krävs för att åter frysa vävnaden), så med hjälp av lämpliga initiala frysningsmetoder är vida att föredra . I de fall där frys artefakt som uppstått på pre-frusen vävnad kan emellertid den teknik som beskrivs häri att vara till stor nytta.
Fixering och bearbetning av vävnad för EM kan erbjuda särskilda tekniska utmaningar som kräver planering före vävnadssamling. Det vanligaste felet när man samlar in prover för EM innebär användning av vävnadsfragment som är för tjock för glutaraldehyde att penetrera. Som glutaraldehyd tränger endast ca 0,1 cm in i muskelvävnad från en given yta, försiktighet bör vidtas för att säkerställa att en dimension av de EM-proverna inte är tjockare än 0,2 cm. Dessutom, eftersom EM är ett utmärkt sätt att direkt utvärdera den kontraktila apparaten, har vissa forskare utvecklat strategier för att i förväg spänning eller pre-sträcka muskeln före fixering att möjliggöra mätning av kontraktila element på ett fysiologiskt relevant spänning. Det finns ingen standardprotokoll för förspänning, men två strategier beskrivs kortfattat i detta protokoll. Det bör noteras att försök att i förväg spänna muskeln kan producera oförutsägbara resultat om de inte görs på ett mycket specifikt sätt, och det kan vara bättre att fixa muskler i den slappa tillstånd för att förhindra artefaktuella förändringar i sarcomere längd genom en icke-standard förspänning förfarande 8,9. För muskler där sådana särskilda mätningar inte är nödvändiga (inklusive de flesta biopsies utförda för kliniska ändamål), är insatser för att pre-spänna muskeln i allmänhet inte gjort, och den huvudsakliga effekten på muskel morfologi är en icke-enhetlig mellanrum av sarkomerer i muskeln.
Detta dokument utgör den första i en serie för att ge standardrutiner för att genomföra tester i medfödd fält muskelsjukdom, och den representerar ansträngningar över 20 experter i medfödd muskelsjukdom fält som rutinmässigt utför cellulära, molekylära, funktionella, fysiologiska och patologisk forskning. En rad publicerade standardrutiner kommer att göras tillgängliga under det kommande året, och de nödvändiga protokoll och lämpliga publiceringsformat för varje diskuterades vid en medfödd muskelsjukdom Consortium workshop som hölls i april 2013 i Washington DC Målet med denna SOP insats är att ge en färdplan för nödvändiga tester och analyser av prover i medfödd muskelsjukdom fältet till 1) standardisera metoder och resultatmått som används i vårt område som mUCH som möjligt, och 2) ge instruktioner om standardiserade metoder för nya forskare inom vårt område. Vi tror att dessa resurser kommer att underlätta för nya utredare i vårt under studerade området och på så sätt förbättra omfattningen av forskningen som kan utföras. Dessutom kommer en standardisering av metoder vara till stor hjälp för att jämföra data över studier och identifiera slutpunkter vid planering och utförande av prekliniska och kliniska prövningar.
Medan fokus för denna artikel är relaterad till lämplig frysning och beredning av vävnad för olika studier, diskuterade vår samarbetsgrupp även de nyttiga endpoints för patologisk analys av muskelprover. För närvarande finns det ingen officiell enighet om strategin för att ta när du utför patologisk analys, och en mängd olika studier utförs för att relatera nya rön till tidigare publikationer för respektive sjukdom. Därför tyckte vi att det skulle vara bra attföreslå några allmänna riktlinjer för planering av patologiska endpoints i muskelpatologi karakterisering. Innan kvantifiera patologi i en studie, bör mycket tänkande tas i 1) metoden för fiberstorleksmätning, 2) möjligheten till fiber-typspecifika avvikelser eller behandlingseffekter, 3) möjligheten att avvikelser eller effekter som är begränsade till individuella muskler, och 4) en strategi för att kvantifiera patologiska fynd som är karakteristiska för sjukdomen som studeras. Fiberstorleken är en nödvändig slutpunkt för de flesta studier, och tyvärr finns det stor variation i hur det kvantifieras. Många studier rapporterar dessa resultat med hjälp av automatiserade kvantifieringsmetoderna tillhandahålls av proprietär bildbehandlingsprogram, men många av dessa program tar genvägar (som antar att fibrerna är cirklar eller ellipser) som kan återge dessa automatiserade mätningar felaktig. Det är nödvändigt att förstå hur dessa automatiserade program gör sina mätningar böre att ha förtroende för mätningarna, och vi uppmuntrar utredare att inkludera dessa uppgifter i pappersmetoder. Dessutom är den specifika mått som används för att beteckna fiberstorlek extremt varierande, och vissa mätningar är att föredra framför andra 10,11. Ett vanligt använt mått på fiberstorlek är fiber tvärsnittsarea (CSA), framför allt därför att utredare som utför fysiologiska studier standardisera sina resultat till CSA mätvärdena med hjälp av sina instrument. Tyvärr, medan CSA mätningar kan spegla fiberstorlek i perfekt tvärsektioner, de är i stor utsträckning beroende av fiberorientering (i den utsträckning som längsgående eller snett-sektionerade fibrer kommer att ha konstgjort höga mått CSA) och är därför inte idealiska mätningar för fiberstorlek. En föredragen mätning av fiberstorlek som är mindre beroende av fibertvärsnittsarean är det lägsta Ferets diameter (MinFeret diameter), som är måttet på the mindre diameter i muskelcellen 12. Denna mätning är endast svagt beroende av fiberorientering och är i allmänhet den kliniska guldstandard för mätning av fiber och undersökare uppmuntras att gå mot användning av denna teknik. Dessa mätningar kan ofta göras med samma programvara som genererar CSA mätningar 13, och är också lätt att mäta manuellt. När det gäller utvärdering av patologiska data enligt fiber typ, särskilt muskler, och i samband med patologiska fynd med anknytning till den specifika sjukdomen, dessa är mindre kontroversiella frågor som bara bör beaktas vid planeringen av en studie. Fibertyp kan utvärderas med hjälp av immunhistokemisk eller ATPas färgning, men det är lämpligt att överväga att specifika muskler och djurarter har specifika blandningar av dessa fibertyper (vilket nödvändiggör olika förväntningar och teststrategier). Muscle specifika patologiska engagemang eller behandlingseffektkan förekomma, och total muskelvikt jämfört med kontroller kan användas för att identifiera graden av heterogenitet sjukdom innan beslut fattas om musklerna till patologiskt utvärdera. Slutligen, är det väl känt att många muskelsjukdomar är förknippade med specifika patologiska avvikelser (såsom nemaline stavar i nemalinmyopati) 14,15, och så är det också lämpligt att undersöka om dessa avvikelser finns i en fiber-typ-eller muskel specifik fördelning när man utför analysen 16,17. Totalt sett, medan vi inte föreslå en stelbent uppsättning standarder för utvärdering av muskler, vi tror att dessa frågor bör övervägas innan föreställningen av patologiska studier i någon skelettmuskelsjukdomen.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For tissue freezing | |||
| Liquid nitrogen dewar with a liquid withdrawal device | Custom Biogenic Systems | Lab-5 Series | Any other liquid nitrogen dewar could substitute. |
| Cold-conductive container | Fisher | 02-583A | |
| Wide insulated container capable of holding liquid nitrogen | Nalgene | 4150-2000 | |
| Oakton Temp 10 Thermocouple Thermometer | Thomas Scientific | 1228Y01 | Optional, but can be very useful in identifying the point at which isopentane is freezing. |
| For single fiber functional testing | |||
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11 | |
| Sylgard coating | Ellsworth Adhesives | 3-6636 | |
| Dissection stereomicroscope | Harvard Apparatus | 693101 | Any other dissection microscope could substitute. |
| For cell culture | |||
| Sterile laminar flow hood | Thermo Scientific | 51022485 | Any other cell culture hood could substitute. |
| For tissue freezing | |||
| Plastic bags/containers | Nasco | B01009WA | |
| Thermal safety gloves | Denville | G4162 | |
| Face shield | Fisher Scientific | S47640 | |
| Long forceps | Fisher Scientific | 12-460-807 | |
| Marker | Staples | 125328 | |
| For cell culture | |||
| Sterile 50 ml conical tubes | Denville | C1060-P | |
| PES filter unit, 500 ml, 0.22 µm | Denville | F5227 | |
| Sterile forceps | Fisher Scientific | 644320 | |
| Ice packs | Fisher Scientific | NC9909223 | |
| Insulated styrofoam box | Polar Tech | 207F | |
| Packing tape | Staples | 795570 | |
| Tissue freezing | |||
| Liquid nitrogen | Airgas | NI NF160LT350 | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Isopentane (2-methylbutane) | Sigma | M32631-4L | Store Isopentane in a flammable materials cabinet. |
| EM fixative (choose one) | The buffers without fixative should also be available, as EM-fixed tissues should be transferred from fixative to buffer after several hours or days if they are not immediately processed for EM. | ||
| 2.5% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 16537-15 | |
| Karnovsky's fixative (3% glutaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0.1M phosphate buffer) | Electron Microscopy Sciences | 15732-10 | |
| For functional studies (if desired) | |||
| Relaxing solution, containing (in mmol/L) | |||
| 40 BES | Sigma | B9879 | |
| 10 EGTA | Sigma | E4378 | |
| 6.56 MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| 5.88 Na-ATP | Sigma | A3377 | |
| 1.0 DTT | RPI | D11000 | |
| 46.35 K-propionate | Make a solution by mixing proprionic acid (Sigma P1386) and KOH (Fisher P250) 1:1 | ||
| 15 creatine phosphate, pH 7.0 | Sigma | P7936 | |
| 0.4 leupeptin | Calbiochem | 10895 | |
| 0.1 PMSF | Sigma | P7676 | |
| Skinning solution, containing | |||
| Relaxing solution (See Above) | |||
| 0.5% Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Indicating silica granules | |||
| Flat pieces of cork (1 x 1 inch) | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| For cell culture (if desired) | |||
| Complete Growth Medium, containing (for 500 ml) | Sterilize by filtering the solution through a 500 ml 0.22 µm PES filter unit. Store at 4°C and use within 1 month. | ||
| 395 ml of high glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D5671 | |
| 100 ml of fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F6178 | |
| 5 ml of 100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG) | Sigma | G1146 | |
| See the materials safety data sheet (MSDS) for all other reagents for storage specifications |
References
- Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. 15, Elsevier. 407-442 (2007).
- Lawlor, M. W., et al. Enzyme replacement therapy rescues weakness and improves muscle pathology in mice with X-linked myotubular myopathy. Hum Mol Genet. 22, 1525-1538 (2013).
- Talmadge, R. J., Roy, R. R. Electrophoretic separation of rat skeletal muscle myosin heavy-chain isoforms. J Appl Physiol. 75, 2337-2340 (1993).
- Blau, H. M., et al. Differentiation properties of pure populations of human dystrophic muscle cells. Exp Cell Res. 144, 495-503 (1983).
- Lawlor, M. W., et al. Myotubularin-deficient myoblasts display increased apoptosis, delayed proliferation, and poor cell engraftment. Am J Pathol. 181, 961-968 (2012).
- Pavlath, G. K., Gussoni, E. Human myoblasts and muscle-derived SP cells. Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).
- Webster, C., Blau, H. M. Accelerated age-related decline in replicative life-span of Duchenne muscular dystrophy myoblasts: implications for cell and gene therapy. Somat Cell Mol Genet. 16, 557-565 (1990).
- Ottenheijm, C. A., et al. Thin filament length dysregulation contributes to muscle weakness in nemaline myopathy patients with nebulin deficiency. Hum Mol Genet. 18, 2359-2369 (2009).
- Witt, C. C., et al. Nebulin regulates thin filament length, contractility, and Z-disk structure in vivo. EMBO J. 25, 3843-3855 (2006).
- Garton, F., et al. Validation of an automated computational method for skeletal muscle fibre morphometry analysis. Neuromuscul Disord. 20, 540-547 (2010).
- Kim, Y. J., et al. Fully automated segmentation and morphometrical analysis of muscle fiber images. Cytometry A. 71, 8-15 (2007).
- Lawlor, M. W., et al. Inhibition of activin receptor type IIb increases strength and lifespan in myotubularin-deficient mice. Am J Pathol. 178, 784-793 (2011).
- Mula, J., et al. Automated image analysis of skeletal muscle fiber cross-sectional area. J Appl Physiol. 114, 148-155 (2013).
- Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. , Elsevier. 407-442 (2007).
- Nance, J. R., et al. Congenital myopathies: an update. Curr Neurol Neurosci Rep. 12, 165-174 (2012).
- Clarke, N. F., et al. Mutations in TPM3 are a common cause of congenital fiber type disproportion. Ann Neurol. 63, 329-337 (2008).
- Lawlor, M. W., et al. Mutations of tropomyosin 3 (TPM3) are common and associated with type 1 myofiber hypotrophy in congenital fiber type disproportion. Hum Mutat. 31, 176-183 (2010).
