Summary
마이크로 RNA (miRNA의) 인간 유도 만능 줄기 (IPS) 세포 (IPS-RPE) 태아 RPE에서 파생 된 인간 유도 만능 줄기의 프로파일 (IPS) 세포, 망막 색소 상피 (RPE)를, 비교 하였다.
Abstract
이 보고서의 목적은 마이크로 RNA (miRNA의) 인간 iPS 세포 (IPS-RPE)에서 파생 된 인간 유도 만능 줄기 (IPS) 세포, 망막 색소 상피 (RPE) 태아 RPE의 프로파일을 비교하기위한 프로토콜을 설명하는 것입니다. 프로토콜은 마이크로 어레이로 분석 RNA의 수집 및 차동 세 종류의 세포 사이에 표현의 miRNAs를 확인하는 마이크로 어레이 데이터의 분석을 포함한다. iPS 세포와 태아의 망막 색소 상피의 문화에 대한 방법이 설명되어 있습니다. 인간의 IPS에서 RPE의 차별화를 위해 사용되는 프로토콜은 설명한다. 우리가 설명 RNA 추출 기술은 miRNA의 마이크로 어레이에 사용하기위한 매우 작은 RNA의 최대 복구를 허용하도록 선택되었다. 마지막으로, 셀룰러 통로 및 마이크로 어레이 데이터의 네트워크 분석을 설명한다. 이러한 기술은 세 가지 서로 다른 유형의 세포의 miRNA 프로파일의 비교를 용이하게 할 것이다.
Introduction
줄기 세포는 한계 및 체세포 형태로 분화 할 가능성없이 복제하는 능력이있다. 개인 조직 재생의 출현은 수평선 1에 그대로 만능 줄기 세포로 체세포를 재 프로그램하는 기술의 개발, 지역 사회 연구와 임상의 사이에 큰 흥분을 유발하고있다. 줄이고 ESCs와 관련된 윤리적 딜레마를 회피하면서 유도 만능 줄기 (IPS) 세포 (ES) 세포 배아 줄기으로 무제한 증식하는 잠재력과 능성의 동일한 기능을 나타낸다. 또, 환자 유래의 줄기 세포는 매우 성공적인 치료 응용 2-3의 확률을 증가, 면역 반응을 자극하지 않을 것이다. 특정 배양 조건에서, iPS 세포는 심근, 신경 세포, 췌장 베타 세포, 간세포, 망막 색소 상피 세포 (RP 등의 체외에서 여러 가지 다른 종류의 세포로 분화하는 것으로 나타났다E) 4-12.
RPE는 생산 전문 같은 감광체 외측 세그먼트 미광, 식균의 흡수와 같은 카메라 기능과 건강에 필수적인 여러 가지 기능을 수행 망막의 뒤쪽에 위치하고 색소 상피 세포의 층 및 레티노이드 가공 발색단의. 연령 관련 황반 변성 (AMD), 스타 르가 르트 병, 및 망막 색소 상피 변성증 (RP)와 같은 기본 RPE 병리의 결과 눈부신 질병에 의해 입증 손상 또는 질병에 RPE의 장애 뿌리깊은 광 수용체의 건강과 시각 기능에 영향을 미치는 13. 비전을 복원 할 수 있습니다 참으로 효과적인 치료법이 달성되지 않은, 건강한 RPE와 병에 걸린 RPE의 교체는 비전 14-15의 손실을 방지하는 가장 좋은 옵션이 될 수 있습니다. 의 IPS (IPS-RPE)에서 파생 된 RPE는 손상된 RPE를 대체하는 세포의 가능한 소스입니다. IPS-RPE는 비슷한 특징을 표현TIC RPE 단백질 LRAT, CRALBP, PEDF 및 RPE65; 고전 높은 색칠 육각 RPE의 형태를 표시합니다; CIS 망막 5,16 -와 같은 식균 작용, 레티노이드 처리, 및도 11의 분비와 같은 RPE 기능을 수행한다. IPS-RPE는 치료를 사용하기 전에 그러나, IPS-RPE 철저을 특징으로합니다. RPE의 분화를 제어하는 요인을 이해하는 것은 임상 응용에 사용되는 세포의 수율 및 순도를 향상시킬 필요가있다.
세포 분화는 고도로 조절 유전자 발현의 결과이다. 전사 인자의 게놈과 조정의 성적인 리모델링은 차별화 및 개발 (17) 중에 발생하는 세포의 운명 결정에 필요합니다. 마이크로 RNA (miRNA의)에 의해 메시지 RNA (mRNA의) 번역의 규정은 세포의 운명 1에 영향을 미치는 규제의 또 다른 레벨을 제공합니다. 의 miRNAs는 짧은 ~ 22 NT, 뉴클레오티드의 길이가 억제 번역에 의해 하나의 mRNA의 3 'UTR에 결합 또는 변형의 mRNA를 표적으로한다. 의 miRNAs는 거의 모든 조직에서 검출 된 현재까지 2,000 개 이상의 독특한 인간 마이크로 RNA는 miRBase 데이터베이스에 등록되었습니다. 즉, 하나의 mRNA는 여러 가지의 miRNA 대상이 될 수있는 miRNA 대상의 mRNA에 결합하는 부분적인 보완을 요구하기 때문에, 하나의 miRNA의 가능성이 수십 또는 수백 개의 대상, 그 반대에 바인딩 할 수 있습니다. 이러한 무차별 결합 특성이 극적으로 규제의 복잡성 수준뿐만 아니라 개인의 miRNAs의 기능을 결정 난이도와 역할 세포 기능 18-21에서 각 플레이를 증가시킨다. 그럼에도 불구하고, 연구의 miRNA는 DNA 메틸화 상태 (17)에 영향을 미치는로 분화시 유전자 발현을 정련하는 것으로 나타났습니다. RPE에 대한보다 구체적인 연구에서 miR-204/211은 RPE (22)의 상피 표현형을 촉진하기 위해 표시했다. 다른 그룹은 miRNA의 프로파일을 분석RPE의 ES 세포로부터 분화시와의 miRNA의 독특한 세트를 밝혔다는 분화 과정 23시 표현된다. 사실, miRNA의 프로파일은 명확 ES 세포, 전구 세포, 그리고 말단 분화 세포 24,25 포함한 세포 유형을 구분할 수있다. 250의 miRNAs는 망막로 표현된다. 이러한 연구에 기초하여, 우리의 miRNA가 IP의 망막 색소 상피의 분화 과정에 중요한 역할을한다는 가설을 세웠다.
이 보고서의 목적은 IMR90-4 IP의 RPE의 차별화를위한 프로토콜을 설명하는 것입니다 세포, 마이크로 어레이로 분석 RNA의 수집 및 차동 세 종류의 세포 사이에 표현의 miRNAs, iPS 세포를 식별하는 마이크로 어레이 데이터의 분석 , IPS-RPE 및 태아 RPE. 전체 RNA는 각 세포 유형의 배양으로부터 추출하고 1,205 인간의 miRNAs 144 바이러스의 miRNAs 특정 프로브를 함유하는 miRNA의 마이크로 어레이에 혼성화시켰다. 마이크로 어레이 결과를 비교 하였다의 miRNA가 차별적으로 다른 종류의 세포들로 표현 된 결정 D. 2 배 또는 식의 큰 배 변화의 miRNAs는 추가 분석을 위해 선택되었다. miRNA의 분석 소프트웨어 프로그램은 차등 발현 된 miRNAs의 잠재적 표적을 식별하고 선택의 miRNAs 의해 규제 셀룰러 네트워크를 생성하기 위해 사용되었다.
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Protocol
문화 시약 및 문화 플레이트 1. 준비
- mTeSR1 미디어 : 제조업체의 지시에 따라 mTeSR1 미디어를 준비합니다. 밤새 4 ℃에서 mTeSR1 배 보충 100 ㎖를 해동 mTeSR1 기초 미디어 400 ㎖에 mTeSR1 배 보충의 100 mL를 넣고 잘 섞는다. 이 매체는 최대 2 주 동안 4 ° C에서 6 개월 -20 ° C에서 안정적이다.
- 차별화 미디어 : 10 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신 0.1 ㎜의 β-머 캅토 에탄올, 0.1 mM의 비 필수 아미노산, 2.0 밀리미터 L-글루타민, 10 % 녹아웃 혈청 등을 산출하기 DMEM/F12에서 차별화 미디어를 준비합니다.
- IPS-RPE 미디어 : 1X N1 보충, 0.1 mM의 비 필수 아미노산, 250 ㎍ / ㎖의 타우린, 13 NG / ML 트리 요오도-L-티 로닌 나트륨 염, 20 NG / ML의 하이드로 코티손, 5 μg을 산출하는 MEM에서 IPS-RPE 미디어를 준비 / ml의 겐타 마이신, 및 15 % FBS (26).
- 트리 요오도-L-티 로닌 나트륨 염 원액. 스톡 용액을 제조 트리 요오도-L-티 로닌 1.0 MG 녹여온화 소용돌이 1 N 수산화 나트륨 중의 나트륨 염. 다음 트리 요오도-L-티 로닌 나트륨 소금의 20 ㎍ / ㎖의 50.0 ㎖로 만들어베이스 미디어의 49.0 ML을 추가합니다. 분취 량을 준비하고 필요할 때까지 -20 ° C에서 동결. 최종 배양 배지에 원하는 농도를 달성하기 위해 적절한 볼륨을 사용합니다.
- 하이드로 코티손 원액 : 하이드로 주식 솔루션을 준비 부드러운 교반 무수 에탄올 1 ㎖에 하이드로 코티손의 1 밀리그램을 용해합니다. 다음 50 ㎍ / ㎖를 20 ㎖의 하이드로 코티손 원액에 대한 기본 미디어의 19.0 ML을 추가합니다. -20 ° C에서 나누어지는 동결 필요할 때까지. 최종 배양 배지에서 원하는 농도를 달성하기 위해 적절한 볼륨을 사용합니다.
- 태아 RPE 성장 배지. FBS를 제외하고 제조 업체의 지시에 따라, 기초 미디어 RTEGM 키트의 모든 시약을 혼합하여 성장 미디어를 준비합니다.
- 태아 RPE 도금 미디어. 무균 용기로 성장 배지의 소량을 전송함으로써 도금 매체를 준비2 %의 최종 농도 DD 형식 FBS.
- 디스 파제 : DMEM/F12 1 ㎎ / ㎖의 디스 파제의 작업 솔루션을 준비합니다.
- 리겔 코팅 플레이트 : 0.08 ㎎ / ㎖로 DMEM/F12에 리겔을 준비합니다.
- 코트 각 마트 리겔 솔루션의 1.0 ML과 6 잘 플레이트 잘.
- 1.0 시간 동안 실온에서 코팅 된 플레이트를 배양한다.
- 1.0 시간 배양 한 후, 초과 DMEM/F12를 대기음.
- 건조를 방지하기 위해 mTeSR1 매체의 0.5 ML을 추가합니다. 리겔 코팅 된 플레이트를 사용할 준비가되어 있습니다.
2. 만능 문화
- 유도 만능 줄기 세포 파종하기 전에 모든 튜브, 실내 온도에 따뜻한 mTESR1 미디어, 준비 리겔 코팅 플레이트가 있습니다.
- 빠르게 37 ° C의 물을 욕조에 IMR90-4 iPS 세포를 해동. 그 후 수조에서 cryovial을 제거하고 70 % 에탄올을 이용하여 살균.
- 세포 집합체의 파괴를 최소화하기 위해 2 ㎖ 피펫을 사용하여 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다.
- 드롭 현명한 주 5 ㎖를 추가RM 부드럽게 mTeSR1의 세포 미디어와 혼합. 상온에서 5 분 300 XG에서 세포를 원심 분리기 및 뜨는을 제거합니다.
- 조심스럽게 mTeSR1 미디어 2 ㎖의 세포 집합체를 재현 탁하고 여섯 잘 플레이트 잘 하나에 세포를 씨앗.
- 5 % CO 2, 95 %의 습도가 37 ° C의 배양기와 문화에 접시를 놓습니다.
- 매일 만능 줄기 세포 배양 매체를 변경합니다. 미분화 식민지 5-7 일 파종 한 후 나타납니다. 통로 (조밀 센터와 식민지)에 대한 준비가되어 획일적 인 식민지를 확인합니다.
iPS 세포의 3.과 Passaging
- 종래 통로 처음 IPS 세포가 모두 튜브, 디스 파제 용액 DMEM/F12와 mTERS1 미디어 실온으로 가온하였으며, 마트 리겔은 판이 준비 코팅.
- iPS 세포를 계대하기 전에 지역을 긁고 미디어를 흡입하여 차별화의 영역을 제거합니다. 차별화에 대한 높은 웰의 20 % 미만으로 유지해야한다양질의 문화. 조심스럽게 유도 만능 줄기 세포 함유 아니라 2 ML의 DMEM/F12를 세척하고 각 웰에 1 ㎎ / ㎖ 디스 파제 1 ㎖를 추가합니다.
- 7 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 디스 파제를 대기음 부드럽게 두 번 DMEM/F12 2 ㎖의 세포 식민지를 씻어.
- 세척 한 후, 각 웰에 mTSER1 2 ㎖를 추가합니다.
- 5 ㎖ 피펫을 사용하여 부드럽게 집계를 형성하기 위해 판의 식민지를 다 쳤어요.
- 15 ML 원뿔 관에 분리 된 식민지를 전송합니다. 세포의 다음 구절을 배정하는 충분한 mTeSR1 미디어를 추가합니다.
IPS-RPE에 iPS 세포 4. 차별화
- mTESR1 미디어에서 새로 코팅 된 플레이트에 iPS 세포를 접시.
- 유도 만능 줄기 세포 식민지 문화에 4 ~ 5 일 확장 할 수 있습니다.
- 4 ML 차별화 미디어 대체 mTeSR1 미디어. 3 일마다 미디어의 절반을 변경합니다.
- 색소 초점은 (40~50일) 수동으로 문화 밖으로 해부 할 수있을만큼 커질 수 있습니다.
- 을 사용하여200 μL 피펫 팁 주변에 잘라 색소 식민지를 들어 올립니다.
- 수집하고 15 ML 원뿔 관에 해부 식민지를 풀.
- 그런 다음 두 번 5 분 300 XG에 풀링 된 RPE 세포와 원심 분리기에 DMEM/F12 5 ㎖를 추가합니다.
- 0.25 % 트립신 EDTA와 풀링 된 IPS-RPE를 배양하여 단일 세포의 솔루션을 준비합니다.
- IPS-RPE 매체와 IPS-RPE 세포를 씻어에 수집 된 세포를 접시 신선한 리겔 코팅 IPS-RPE 미디어의 4 ㎖에 잘.
- 문화 이전의 통로에 3 주 동안 세포. 3 일마다 미디어를 변경합니다. 실험의 경우, 플레이트 IPS-RPE / ㎠ 100,000 세포에서. 일 17 일에 세포를 수집합니다. 일 0으로 파종의 날을 계산합니다.
5. 시료 채취
- 유도 만능 줄기 세포 컬렉션
- 문화 iPS 세포 분화 식민지가 중앙에 밀집 것으로 관찰 될 때까지.
- DMEM/F12에 식민지를 씻어.
- accutas를 사용하여 단일 세포로 해리 전자. 5 분 300 XG에 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기로 세포를 수집합니다. 기음 뜨는. DMEM/F12 2 ㎖에 재현 탁.
- 태아 RPE 컬렉션
- DMEM/F12와 태아의 망막 색소 상피 세포 배양을 씻어 0.25 % 트립신 EDTA를 사용하여 단일 세포로 해리.
- 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 수집합니다. 5 분 300 XG에 원심 분리기. 기음 뜨는. DMEM/F12 2 ㎖에 재현 탁.
- IPS-RPE 세포 컬렉션
- IPS-RPE는 통로 (3)과 통로 (5)에 도달하면 통과 후 17 일째에 세포를 수집합니다. 두 번 PBS에서 IPS-RPE를 씻어 1.0 ㎖를 0.25 % 트립신과 배양하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다.
- 차가운 얼음 IPS-RPE 미디어 2 ㎖와 트립신을 중화.
- 5 분 300 XG에 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에있는 세포를 수집합니다. 기음 뜨는.
- 마이크로 비드 키트에서 염색 완충액 3 ml의 세포 현탁액을 재현 탁.
- 사용할 때까지 4 ° C에서 모든 시약을 유지하지만 얼음에 작동하지 않습니다. 5 분 300 XG에 단계 5.3.4에서 원심 분리기 세포 현탁액. 기음 뜨는.
- 2 × 10 6 세포 당 마이크로 비드 키트에서 염색 버퍼 100 μL의 세포를 Resuspend.
- 2 × 10 6 세포 당 안티-TRA-1-60-PE 항체의 10 μl를 추가합니다.
- 잘 섞어서 10 분 동안 4 ° C에서 알을 품다.
- 2 × 10 6 세포 당 버퍼의 1-2 ml의 세포를 씻으십시오. 300 X g에서 10 분 원심 분리기. 기음 뜨는.
- 2 × 10 6 세포 당 염색 버퍼 80 μL의 세포를 Resuspend. 2 × 10 6 세포 당 방지 PE 표지 마이크로 비즈 20 ㎕ (키트)를 추가합니다. 잘 섞는다. 4 ℃에서 15 분 동안 품어
- 2 × 10 6 세포 당 버퍼를 얼룩의 1-2 ML을 추가합니다. 300 X g에서 10 분 원심 분리기. 기음 뜨는.
- 500 & # 세포를 재현 탁956, 염색 버퍼의 L.
- 자기 세포 분리 :
- 자기 세포 분류기에 열을 놓습니다. 염색 버퍼의 3 ㎖로 컬럼을 씻어.
- 칼럼에 6.8에서 세포 현탁액을 적용합니다.
- TRA-1-60 음성 세포를 수집하는 부정적인 포트에 튜브를 놓습니다.
7. 총 RNA 추출
- 를 Lyse 핵산 minipreps 위해 고안된 시판의 microcentrifuge 균질 소형 스핀 칼럼을 통해 샘플을 실행하여 셀.
- iPS 세포, IPS-RPE, 작은 RNA 분자 (27)를 유지하도록 설계 시판되는 RNA 추출 키트와 태아의 망막 색소 상피에서 총 RNA를 추출합니다.
- Nanodrop 분광 광도계를 사용하여 총 RNA의 농도를 결정합니다.
8. Bioanalyzer 및 마이크로 어레이 분석
- 상업적으로 이용 가능한 RNA 품질 키트와 함께 Bioanalyzer와 RNA의 무결성을 확인합니다.
- 100 NG의를 품어30 분 동안 37 ° C에서 송아지 장 포스와 총 RNA
- 5 분 동안 100 ° C에서 100 % DMSO를 사용하여 RNA를 변성.
- PCP-Cy3에 1 시간 동안 16 ° C에서 배양 T4 리가 아제를 사용하여 함께 샘플을 레이블.
- 8_x_15K 형식 인간 miRNA의 배열에 하이브리드.
- 제조업체의 지침에 따라 배열을 세척하고 스캐너를 사용하여 5 ㎛의 해상도로 스캔 할 수 있습니다.
- 의 miRNA 마이크로 어레이와 호환 마이크로 어레이 피쳐 추출 소프트웨어를 사용하여 데이터를 획득.
- 각 샘플의 발현의 상대적 수준을 결정하는 miRNA의 신호를 처리한다.
- 샘플 그룹 사이에 각각의 miRNA의 발현 수준을 비교합니다. 추가 분석을 위해 적어도 두 가지 차등 식의 miRNA를 선택합니다.
- 차별적 표현의 miRNA (28)의 시각화를위한 히트 맵을 생성하는 지침에 따라, 데이터 분석을위한 상용 소프트웨어를 사용하여.
9. 경로 분석
- 엑셀 형식으로 8.9 선택의 miRNAs의 데이터를 저장합니다.
- 온라인 RNA 경로 분석 프로그램에 로그인합니다. Excel 파일을 업로드 할 수 있습니다. 파일 형식에 대한 "유연한 포맷"을 선택하고 식별자 유형 드롭 다운 목록에서 "애질런트"를 선택합니다.
- 원시 데이터의 제목 아래, ID 열을 조사하는 "ID"를 지정하고 "관측 1"을 지정하고 로그 배급 열에 "비율을 기록". 다른 모든 열은 "무시"를 선택합니다.
- 다음과 같은 분석을위한 매개 변수를 선택 : 신뢰 : 실험적으로 만 관찰; 직접 및 간접 관계를 포함한다; 내인성 화학 물질을 포함한다; 기준 세트로 독창성 기술 자료를 선택합니다. 모든 종에서 데이터, 모든 세포주 및 조직, 모든 돌연변이를 포함 참조 분자의 데이터베이스를 선택.
- 실행 네트워크와 경로 분석.
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Representative Results
iPS 세포 (그림 1A)는 IPS-RPE 세포로 분화를 유도하는 분화 조건에서 성장했다. IPS-RPE는 육각형의 색소 세포 형태 태아 RPE (그림 1C)과 유사 (그림 1B)의 고전 RPE 표현형을 나타내었다.
나은의 miRNA는 IP의 IPS-RPE로 분화하는 과정 중에 재생할 수 역할을 이해하기 위해서는, miRNA의 발현 마이크로 어레이 분석을 실시 하였다. 총 RNA는 iPS 세포, 태아 RPE, 작은 RNA를의 최대 보존을 보장하기 위해 mirVana miRNA의 분리 키트를 사용하여 IPS-RPE에서 수집되었다. RNA는 마이크로 어레이 labchip에 하이브리드 전에 정량 및 순도 시험 하였다. 1205, 144 인간 바이러스의 miRNAs를 나타내는 프로브는 각 샘플 세트로부터 miRNA의 발현을 분석하기 위해 사용되었다. 신호는 각각의 샘플에서의 각각의 miRNA의 발현의 상대적 수준을 결정하기 위해 분석 하였다. 데이터는 miRNA의 지점과 비교하기 위해 사용되었다 IPS의 태아 RPE에 IPS-RPE의 XPRESSION 프로필. 열지도는 그룹 (그림 2A) 사이의 차이 miRNA의 표현의 시각화를 가능하게하기 위해 생성되었다. 차등의 IPS로 표현 된 83의 miRNAs는 47 IPS-RPE에 비해 IPS의 상향 조절의 miRNAs, 그리고 만능 줄기 (그림 2B)의 하향 조절 (36), IPS-RPE에 비해. (110)의 miRNA가 차등 FRPE 상향 조절 61의 miRNAs으로, IPS-RPE에 비해 태아의 망막 색소 상피에서 발현, 49은 IPS-RPE (그림 2C)에 비해 FRPE에서 하향 조절되었다. 재간 IPA 소프트웨어 경로 분석은 세포 개발, 성장, 증식 및 생존, 세포주기 및 세포 이동에 관련된 유전자에 대한 차별적 표현의 miRNA 목표 성적을 나타냈다. 의 miRNAs를 생체 내에서 안구 조직에서 발현은 IPS의 (도 3 및 4)에 비해 IPS-RPE 및 태아 RPE 풍부한 것으로 밝혀졌다.
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그림 1.의 IPS, 태아 RPE 및 IPS-RPE의 명 시야 이미지. 이전의 분화, 태아 RPE 및 IP의 파생 RPE에 iPS 세포의 명 시야 이미지 (100X). 태아 RPE 및 IPS-RPE는 모두 육각형 모양과 색소 침착의 고전 RPE의 형태를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
IPS-RPE에서 그림 2.의 miRNA 발현 프로파일의 IPS와 태아의 망막 색소 상피에 비해.) 열 맵의 miRNA의 차등 발현의 상대적 정도를 묘사. 색상스케일 (빨강) 위와 아래의 miRNA (녹색)의 발현 수준을 나타냅니다, 또는 iPS 세포의. C) 비교에 IPS-RPE의 miRNA의 프로필의 모든 샘플에 걸쳐 발현 (검은 색)을 의미한다. B에서) 비교 태아 RPE에 IPS-RPE의 miRNA의 프로파일. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
IPS-파생 된 RPE 대 부모의 iPS 세포의 miRNA의 발현 프로파일의 그림 3.) 네트워크 분석. 4 대 네트워크는 별도로 표시 (왼쪽)와 (센터) 차별적 표현의 miRNAs의. B) 통로 분석을 병합됩니다. Ple는ASE이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
IPS-파생 된 RPE 대 태아의 망막 색소 상피의 miRNA의 발현 프로파일의 그림 4.) 네트워크 분석. 상위 7 개 네트워크가 별도로 표시 (왼쪽)와 차동 표현의 miRNAs의. B) 통로 분석 (센터) 병합됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
결론적으로,이 보고서는 문화 iPS 세포를 사용하는 방법, IPS-RPE, 태아 RPE에 대해 설명합니다. 만능 줄기에서 파생 된 RPE는 형태 학적 및 기능적으로 태아의 망막 색소 상피와 비슷합니다. IPS-RPE는 RPE65, CRALBP, PEDF 및 LRAT 16 등의 특성 RPE 유전자를 표현한다. 추가로 이들 세포를 특성화하기 위해, RNA를 추출하고 차분 miRNA의 발현을 확인하기 위해 마이크로 어레이 분석을 수행하는 데 사용되었다. 신호 강도의 분석은 차별적 표현의 miRNA의 가장 큰 수는 IPS-RPE는 더 성숙 될 수 있습니다 제안, IPS-RPE 비교 대 태아 RPE에서 검출 된 것으로 나타났다. 미래 연구는 RT-PCR 이러한 결과의 유효성을 검사 할 예정이다.
신중하게 정확한 데이터의 분석 및 취득의 성공을 보장하기 위해 수행해야하는이 실험을하는 동안 몇 가지 중요한 포인트가 있습니다. 첫 번째 중요한 단계는 iPS 세포의 배양 중에 발생합니다. iPS 세포는 PLU에 남아 있어야그들의 stemness를 유지하는 상태를 ripotent. 세포는 신중하게 분화의 흔적을 매일 검사해야합니다. 미분화 iPS 세포는 컴팩트 한 다세포 식민지로 성장한다. 세포는 세포질 비율 및 현저한 핵소체로 높은 핵을 가져야한다. IPS의 식민지가 중앙 세포의 여러 계층으로, 별개의 국경을 특징으로한다. 분화의 징후가 정의 식민지 경계, 비 균일 한 세포 형태, 이러한 신경 세포와 섬유 아세포와 같은 명백한 세포 유형의 모양을 잃을 수도 있음. 분화 한 단셀이 디스 파제 및 세정에 의해 제거 될 수있다, 그러나, 이러한 특성을 가진 콜로니를 수동 배양 (29)로부터 제거되어야한다.
마이크로 어레이 분석을위한 RNA의 준비는 다음 중요한 단계입니다. 일치하지 않는 RNA의 품질은 마이크로 어레이 데이터의 변화의 중요한 원천입니다. RNA 추출은 고 분자량과 최상의 결과를 위해 최소 성능이 저하 된 RNA를 생성해야한다. 성공한RNA 추출은 최소한의 저하 및 오염 RNases 무료로 총 RNA를 얻을 것입니다. 260 nm에서 분광 광도법에 의한 RNA 농도의 판정 후, 샘플의 순도는 다당류 나 단백질의 오염을 검출하기 위해 230 및 280 nm에서 결정되어야한다. RNA의 230:260:280 비율은 더 오염 (30)와 고품질의 RNA를 표시하기 위해 1시 2분 1초해야한다.
마이크로 어레이 실험을 계획 할 때 가장 중요한 단계는 프로브에 하이브리드 특정인지 확인하고, 감지 된 신호가 그 샘플 세트에 대한 유효한지 확인하기 위해 세중의 각 샘플을 실행하는 음성 대조군의 포함이다. 마이크로 어레이 결과를 분석하는 동안, 중요한 점은 배경 잡음이 각 특정 프로브에 대한 진정한 신호 강도를주는 관찰 된 신호로부터 감산되는, 배경 보정이다. 진정한 긍정적 인 신호를 강조하면서이 단계는 오탐 (false positive)을 제거합니다. </ P>
마지막으로, 네트워크 및 마이크로 어레이 결과 통로 분석에서, 가장 중요한 단계는 분석을 실행하기 전에 올바른 파라미터 및 필터를 확립하는 것이다. 이 단계는 네트워크를 생성하고, 차분 비교에서 발현되는 것으로 도시 된 miRNAs의 영향 세포 경로를 식별하기 위해 소프트웨어에 의해 사용되는 데이터베이스를 결정할 것이다.
이 보고서에 기술 된 방법을 사용하여 데이터의 취득 후, 결과의 해석 중에 이러한 분석의 한계를 고려할 필요가있다. 가능성이 있지만 RPE 문화가 RPE 세포의 동질 인구 아니라고 가능한 남아있다. 안티-TRA-1-60 정렬 프로세스는 여전히 세포 마커를 표현 줄기 세포를 제거하는 음의 선택 과정이다; 그러나 나머지 세포가 순수한 망막 색소 상피 세포입니다 보증하지 않습니다. 형태 학적으로 세포가 색소 침착의 고전 RPE 형태를 전시하지만ND 다각형 셀 형상은, 그것이 모든 세포가 RPE 것을 가능하다.
마이크로 어레이 실험 인해 매우 짧은 시퀀스, 특히 마이크로 RNA의 경우, RNA의 발현에 가양을 생산할 수있다. 이 실험에 사용되는 마이크로 어레이 시스템은 각 타겟의 상이한 영역을 표적으로하는 다수의 프로브를 포함하지만, 결과는 항상 QRT-PCR에 의해 확인되어야한다.
재간 IPA에 의한 마이크로 어레이 데이터 분석 재간 데이터베이스의 양과 정보의 품질에 의존한다. 유전자 기능 및 세포 경로에 대한 정보의 대부분은 형질 전환 세포주에서 또는 암 연구의 맥락에서 실시한 실험으로부터 도출된다. 따라서,이 프로그램을 사용하여 통로 및 네트워크 분석의 결과는 항상 일차 전지에 대한 중요한 수 없거나,이 경우, 줄기 세포.
이러한 제한에도 불구하고,이 보고서에 기술 된 방법이 사용될 수있다iPS 세포와 태아 RPE, iPS 세포에서 파생 RPE와의 miRNA의 마이크로 어레이 분석을위한 RNA 추출의 문화. 이러한 분석법에 의해 생성 된 데이터는 분화 과정에 관여 된 miRNAs를 식별뿐만 아니라, RPE의 기능을 조절 것에 사용될 수있다.
더의 miRNA가 차등 IPS-RPE 비교 대의 IPS에 비해 IPS-RPE 비교 대 태아의 망막 색소 상피에서 발현된다는 것을 발견했지만, 이것에 대한 여러 가지 이유가 있습니다. 우선,이 분석이 수행 된 시점에서의 miRNA 마이크로 어레이 플랫폼은 1205 인간 144 바이러스의 miRNAs를 검출 할 수 있었다. 그 이후로,이 플랫폼은 2,000 인간의 miRNA에 대한 프로브를 포함하도록 확장되었습니다. 그것은 더의 miRNA가 발견 될 경우 miRNA의 차등 발현 프로파일이 변경됩니다 확실히 가능하다. 이 분석에 의해 검출 1349의 miRNAs 중에서, 대부분의 miRNAs는 세포 유형 (도 2B 및 2C 간의 발현의 차이를 보이지 않았다
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
여기에 포함 된 의견이나 주장은 저자의 개인 전망이며, 공식 또는 육군의 부 또는 국방부의 의견을 반영하는 것으로 해석되어서는 안됩니다.
저자 휘트니 A. 그린, 알베르토 Muñiz 및 라 메쉬 R. Kaini가 USAISR에 국가 연구위원회 박사 학위 취득 후 연구 Associateship를 개최하면서이 연구를 수행 하였다.
마이크로 어레이 분석은 Greehey 어린이 암 연구소 마이크로 어레이 핵심 시설 및 UT 건강 과학 센터 샌 안토니오에서 생물 정보학 부서에 의해 수행되었다.
이 작품은 미국 육군 임상 재활 의학 연구 프로그램 (CRMRP) 및 군사 운영 의학 연구 프로그램 (MOMRP)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-β-mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Fetal RPE media RTEGM kit | Life Technologies | 195406 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Trypsin | Hyclone(Fisher) | 25200-072 | |
| Miltenyi Biotec washing buffer | StemGent | 130-092-987 | |
| Miltenyi Biotec rinsing buffer | StemGent | 130-092-222 | |
| Anti-TRA-1-60 microbead kit | StemGent | 130-095-816 | |
| Miltenyi Biotec cell sorter column | StemGent | 130-021-101 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | |
| RNA 6000 Pico LabChip kit | Agilent | G2938-90046 | |
| Human miRNA microarray v16 | Agilent | G4471A |
References
- Yu, Z., et al. miRNAs regulate stem cell self-renewal and differentiation. Front Genet. 3, 191 (2012).
- Romano, G., et al. A commentary on iPS cell biology: Potential applications in autologous tissue and cell transplantation, development of new models for the study of human pathological conditions and drug screening. J Cell Physiol. 229, 148-152 (2014).
- Almeida, P. E., et al. Immunogenicity of pluripotent stem cells and their derivatives. Circ Res. 112, 549-561 (2013).
- Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2427-2434 (2009).
- Kokkinaki, M., et al. Human induced pluripotent stem-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells exhibit ion transport, membrane potential, polarized vascular endothelial growth factor secretion, and gene expression pattern similar to native RPE. Stem Cells. 29, 825-835 (2011).
- Bharti, K., et al. The new paradigm: retinal pigment epithelium cells generated from embryonic or induced pluripotent stem cells. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 21-34 (2011).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Pera, M. F. Stem cells. A new year and a new era. Nature. 451, 135-136 (2008).
- Subba Rao, M., et al. Thinking outside the liver: Induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19, 3385-3396 (2013).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50, 327-332 (2011).
- Lee, K. S., et al. Human sensory neurons derived from induced pluripotent stem cells support varicella-zoster virus infection. PLoS One. 7, (2012).
- Alipio, Z., et al. Reversal of hyperglycemia in diabetic mouse models using induced-pluripotent stem (iPS)-derived pancreatic beta-like cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 13426-13431 (2010).
- la Cour, M., Tezel, T. The retinal pigment epithelium. Adv Organ Biol. 10, 253-272 (2005).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4, (2009).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379, 713-720 (2012).
- Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 198-209 (2014).
- Leonardo, T. R., et al. The functions of microRNAs in pluripotency and reprogramming. Nat Cell Biol. 14, 1114-1121 (2012).
- Arora, A., et al. Prediction of microRNAs affecting mRNA expression during retinal development. BMC Dev Biol. 10, (2010).
- Huntzinger, E., Izaurralde, E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay. Nat Rev Genet. 12, 99-110 (2011).
- Mallanna, S. K., Rizzino, A. Emerging roles of microRNAs in the control of embryonic stem cells and the generation of induced pluripotent stem cells. Dev Biol. 344, 16-25 (2010).
- Guo, H., et al. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466, 835-840 (2010).
- Adijanto, J., et al. Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) promotes differentiation of human retinal pigment epithelium (RPE) by regulating microRNAs-204/211 expression. J Biol Chem. 287, 20491-20503 (2012).
- Hu, G., et al. Identification of miRNA signatures during the differentiation of hESCs into retinal pigment epithelial cells. PLoS One. 7, (2012).
- Wilson, K. D., et al. MicroRNA profiling of human-induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 18, 749-758 (2009).
- Neveu, P., et al. MicroRNA profiling reveals two distinct p53-related human pluripotent stem cell states. Cell Stem Cell. 7, 671-681 (2010).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).
- Qiagen, miRNeasy Mini Handbook. Sample and Assay Technologies. , (2013).
- Microarray System with miRNA Complete Labeling and Hyb Kit. Agilent Technologies. , (2011).
- Maintenance of hESCs and hiPSCs in mTESR1 and mTESR2. Stem Cell Technologies. , (2010).
- The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. About Biotechnology. , (2013).
