Summary
MicroRNA (מירנה) הפרופילים של גזע אנושי-Induced pluripotent תאים (iPS), אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) נגזרים מגזע אנושי-Induced pluripotent תאים (iPS) (iPS-RPE), ורשתית של העובר, הושווה.
Abstract
מטרת דו"ח זה היא לתאר את הפרוטוקולים להשוואת microRNA (מירנה) פרופילים של גזע אנושי-Induced pluripotent תאים (iPS), אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) שמקורם בתאי iPS האנושי (iPS-RPE), ורשתית של העובר. הפרוטוקולים כוללים אוסף של RNA לניתוח על ידי microarray, וניתוח של נתונים microarray לזהות miRNAs שבאים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בין שלושה סוגי תאים. השיטות לתרבות של תאי iPS ורשתית של העובר הם הסבירו. הפרוטוקול המשמש לבידול של הרשתית מiPS האנושי מתואר גם. טכניקת הפקת RNA אנו מתארים נבחרה כדי לאפשר התאוששות מקסימלי של RNA הקטן מאוד לשימוש במירנה microarray. לבסוף, מסלול הסלולר ורשת ניתוח של נתוני microarray הוא הסביר. טכניקות אלה תאפשר ההשוואה בין פרופילי מירנה משלושה סוגי תאים שונים.
Introduction
לתאי גזע יש את היכולת לשכפל ללא הגבלה והפוטנציאל להתמיין לכל סוג תא סומטי. הפיתוח של טכניקות כדי לתכנת מחדש את התאים הסומטיים לתאי גזע pluripotent עורר התרגשות רבה בקהילת המחקר ובקרב רופאים, כמו כניסתו של התחדשות רקמות אישית היא באופק 1. -Induced pluripotent תאי גזע (iPS) להפגין את אותן תכונות של פוטנציאל replicative בלתי מוגבל וpluripotency כגזע עוברי (ES) תאים תוך עקיפת הדילמות האתיות הקשורות לESCs. בנוסף, תאי גזע שמקורם בחולה לא לעורר תגובה חיסונית, מאוד להגדיל את ההסתברות ליישומים טיפוליים המוצלחים 2-3. בתנאי תרבות מסוימים, תאי iPS הוכחו להתמיין לכמה סוגי תאים שונים במבחנה, כוללים שריר לב, תאי עצב, תאים בטא בלבלב, hepatocytes, ואפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) 4-12.
הרשתית היא שכבה מיוחדת של תאי אפיתל פיגמנט ממוקמים בחלק האחורי של הרשתית שמבצעת מספר פונקציות שהם חיוניים לבריאות ותפקוד חזותיים כגון קליטת אור התועה, phagocytosis של המגזרים החיצוניים קולטי האור, ועיבוד של רטינואידים לייצור של chromophore החזותי. חוסר תפקוד של הרשתית עקב נזק או מחלה משפיע עמוקות על בריאות קולטי אור ותפקוד ראייה כפי שמעיד מחלות המסנוורים שהן התוצאה של פתולוגיה הרשתית הבסיסית כגון ניוון הקשור לגיל מקולרי (AMD), המחלה של Stargardt, ורטיניטיס פיגמנטוזה (RP) 13. טיפולים באמת יעילים שיכול לשחזר את חזון לא הושגו, והחלפה של הרשתית חולה עם הרשתית בריאה עשויה להיות האפשרות הטובה ביותר למנוע אובדן הראייה 14-15. הרשתית נובעת מiPS (iPS-RPE) היא מקור אפשרי של תאים כדי להחליף את הרשתית הפגועה. IPS-הרשתית מבטאת characterisחלבוני הרשתית טיק LRAT, CRALBP, PEDF, וRPE65; מציג את מורפולוגיה המשושה פיגמנט מאוד הקלסית הרשתית; ומבצע פונקציות הרשתית כגון phagocytosis, עיבוד retinoid, והפרשת 11 - 5,16 רשתית cis. עם זאת, לפני IPS-הרשתית יכולה לשמש טיפולית, IPS-הרשתית חייבת להיות מאופיינת באופן יסודי. הבנת הגורמים הקובעים בידול הרשתית יש צורך לשפר את התשואה וטוהר של התאים שישמש ליישומים קליניים.
התמיינות תאים היא התוצאה של ביטוי גנים מוסדרים מאוד. שיפוץ אפיגנטיים של הגנום והתיאום של גורמי שעתוק נדרש להחלטות גורל תא המתרחשות במהלך התמיינות והתפתחות 17. רגולציה של תרגום ההודעה RNA (mRNA) על ידי microRNA (מירנה) להציג עוד רמה של רגולציה המשפיעה על תא גורל 1. MiRNAs קצר, ~ 22 NT, אורכים של נוקלאוטידים כי גם תרגום לדכא ידיהקשירה של UTR '3 של mRNA או למקד את ה-mRNA לשפלה. MiRNAs זוהו כמעט בכל הרקמות ועד כה מעל 2,000 מיקרו RNA האנושי הייחודי נרשם באתר miRBase. מאז miRNAs דורש השלמה חלקית בלבד כדי לאגד את ה-mRNA היעד, מירנה אחד יכולה באופן פוטנציאלי להיקשר לעשרות או מאות מטרות, ולהיפך, כלומר mRNA אחד יכול להיות ממוקדת על ידי מספר miRNAs שונה. מאפיין מחייב מופקר זה מגדיל באופן דרמטי את רמת המורכבות של רגולציה, כמו גם את רמת קושי של קביעת הפונקציות של miRNAs פרט ואת התפקיד כל הצגות בתפקודים תאיים 18-21. עם זאת, מחקרים הראו כי מירנה משכללת ביטוי גנים במהלך בידול על ידי המשפיע על מעמדה מתילציה דנ"א 17. במחקר ספציפי יותר לרשתית, miR-204/211 הוצג כדי לקדם את הפנוטיפ האפיתל של הרשתית 22. קבוצה נוספת ניתחה את פרופיל מירנהשל הרשתית במהלך התמיינות בתאי גזע עובריים וחשפו סטים שונים של מירנה באים לידי ביטוי בתהליך ההתמיינות 23. למעשה, פרופילי מירנה יכולים באופן חד משמעי להבחין בין סוגי תאים, כוללים תאי גזע עובריים, תאים מבשר, ותאי הבדיל סופני 24,25. מעל 250 miRNAs באים לידי ביטוי ברשתית. בהתבסס על מחקרים אלה, אנו משערים כי miRNAs לשחק תפקיד חשוב בהתמיינות של הרשתית משב"ס.
מטרת דו"ח זה היא לתאר את הפרוטוקולים להתמיינות של הרשתית מIMR90-4 תאים iPS, אוסף של RNA לניתוח על ידי microarray, והניתוח של נתונים microarray לזהות miRNAs שבאים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בין שלושה סוגי תאים, תאי iPS , IPS-הרשתית ורשתית של העובר. RNA סה"כ היה שחולץ מן התרבויות של כל סוג תא והכלאה לmicroarray מירנה, המכיל בדיקות ספציפיות ל1,205 miRNAs אדם ו144 miRNAs הנגיפי. תוצאות microarray היו להשוותד כדי לקבוע אילו miRNAs באו לידי הביטוי באופן דיפרנציאלי בין סוגי התאים השונים. miRNAs עם 2 קיפול או שינוי של פי יותר בביטוי נבחרו לניתוח נוסף. תוכנת ניתוח מירנה שימשה כדי לזהות מטרות פוטנציאליות של miRNAs הביע באופן דיפרנציאלי וליצור רשתות סלולריות מוסדרים על ידי miRNAs שנבחר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת ריאגנטים תרבות וצלחות תרבות
- תקשורת mTeSR1: הכן תקשורת mTeSR1 על פי הוראות היצרן. הפשירו של תוסף mTeSR1 5x 100 מיליליטר הלילה בשעה 4 ° C. הוספה של תוסף mTeSR1 5x 100 מיליליטר 400 מיליליטר של תקשורת הבסיסית mTeSR1 ומערבבים היטב. המדיה הזו היא יציבה בC ° 4 עד 2 שבועות וב -20 מעלות צלזיוס במשך 6 חודשים.
- תקשורת בידול: הכן תקשורת בידול בDMEM/F12 להניב β-mercaptoethanol 0.1mm, 0.1 חומצות אמינו חיוניות מ"מ, L-גלוטמין 2.0 מ"מ, 10% בסרום בנוקאאוט, ו10 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין.
- תקשורת IPS-הרשתית: הכן תקשורת iPS-RPE בMEM להניב תוספת 1x N1, 0.1 חומצות אמינו חיוניות מ"מ, 250 מיקרוגרם / מיליליטר טאורין, 13 ng / ml מלח נתרן triiodo-L-thyronine, הידרוקורטיזון 20 ng / ml, 5 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין, ו15% FBS 26.
- פתרון מניות מלח נתרן Triiodo-L-thyronine. כדי להכין פתרון מניות לפזר 1.0 מ"ג triiodo-L-thyronineמלח נתרן בנתרן הידרוקסידי 1 N ידי בעדינות מתערבל. הבא להוסיף 49.0 מיליליטר של תקשורת בסיס כדי להפוך 50.0 מיליליטר של 20 מיקרוגרם / מיליליטר של מלח נתרן triiodo-L-thyronine. הכן aliquots ולהקפיא ב -20 ° C עד צורך. השתמש בנפח מתאים להשגת ריכוז הרצוי בתקשורת והתרבות הסופית.
- פתרון הידרוקורטיזון המניה: כדי להכין פתרון מניות הידרוקורטיזון, solubilize 1 מ"ג של הידרוקורטיזון ב 1 מיליליטר של אתנול מוחלט על ידי תסיסה עדינה. הבא להוסיף 19.0 מיליליטר של תקשורת בסיס ל20 פתרון מניות הידרוקורטיזון מיליליטר של 50 מיקרוגרם / מיליליטר. aliquot והקפאה ב -20 ° C עד צורך. השתמש בנפח מתאים כדי להשיג את הריכוז הרצוי בתקשורת והתרבות הסופית.
- מדיום גידול הרשתית עוברי. הכן את תקשורת הצמיחה על ידי ערבוב כל חומרים כימיים בערכת RTEGM בתקשורת הבסיסית, על פי הנחיות היצרן, למעט FBS.
- תקשורת ציפוי הרשתית עוברית. הכן תקשורת ציפוי על ידי העברת כמות קטנה של תקשורת צמיחה למכל וסטריליFBS dd לריכוז סופי של 2%.
- Dispase: הכן פתרון עבודה של dispase של 1 מ"ג / מיליליטר ב DMEM/F12.
- צלחות Matrigel מצופים: הכינו matrigel ב DMEM/F12 ל0.08 מ"ג / מיליליטר.
- מעיל היטב בכל צלחת 6 היטב עם 1.0 מיליליטר של פתרון matrigel.
- דגירה הצלחות המצופה בטמפרטורת חדר למשך 1.0 שעה.
- לאחר הדגירה 1.0 שעות, לשאוב DMEM/F12 העודף.
- הוסף 0.5 מיליליטר של תקשורת mTeSR1 כדי למנוע התייבשות. צלחות matrigel מצופים מוכנות כעת לשימוש.
2. IPS תרבות
- יש לי לפני זריעת תאי iPS כל הצינורות, מדיה mTESR1 חמה לטמפרטורת חדר, וצלחות matrigel מצופים מוכנות.
- מהירות להפשיר את תאי iPS IMR90-4 באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. ואז להסיר את cryovial מאמבט המים ולעקר באמצעות 70% אתנול.
- להעביר את תאי צינור חרוטי 15 מיליליטר באמצעות פיפטה 2 מיליליטר כדי למזער שבירה של אגרגטים תא.
- ירידה מבחינת להוסיף 5 מיליליטר של warm תקשורת mTeSR1 לתאים ולערבב בעדינות. צנטריפוגה תאי XG 300 5 דקות בטמפרטורת חדר ולהסיר את supernatant.
- resuspend בזהירות אגרגטים התא ב2 מיליליטר של תקשורת mTeSR1 וזרעי התאים על גם אחד מצלחת גם שש.
- מניחים את הצלחת לתוך 37 מעלות צלזיוס חממה ותרבות עם 5% CO 2, לחות 95%.
- לשנות את תקשורת תרבית תאי iPS יומי. מושבות לא עברו התמיינות תופיע 5-7 ימים לאחר זריעה. בדקו אם מושבות מובחנים כי הם מוכנים למעבר (מושבות במרכז צפוף).
3. Passaging של תאי iPS
- לפני תחילת מעבר לתאי iPS, שכל הצינורות, פתרון dispase, מדיה DMEM/F12 וmTERS1 חיממו לטמפרטורת חדר, וmatrigel מצופה צלחות מוכנות.
- לפני passaging תאי iPS, להסיר כל תחומי בידול על ידי גירוד באזור ונשיפת כלי התקשורת. בידול צריך להישאר מתחת 20% גם לגבוהתרבויות באיכות. לשטוף היטב היטב עם 2 DMEM/F12 מיליליטר המכיל תאי iPS ולהוסיף 1 מיליליטר של 1 מ"ג / מיליליטר dispase היטב כל אחד.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות. לשאוב dispase ולשטוף בעדינות מושבות תאים עם 2 מיליליטר של DMEM/F12 פעמיים.
- לאחר השטיפה, להוסיף 2 מיליליטר של mTSER1 היטב כל אחד.
- בעזרת פיפטה 5 מיליליטר בעדינות לגרד את המושבות של הצלחת בצורה אגרגטים.
- העבר את המושבות מנותקות לצינור חרוטי 15 מיליליטר. הוסף מדיה mTeSR1 מספיק כדי לזרוע את הקטע הבא של תאים.
4. התמיינות של תאי iPS לIPS-הרשתית
- פלייט תאי iPS על צלחת מצופה חדש בתקשורת mTESR1.
- לאפשר מושבות תאי iPS להרחיב ל4-5 ימים בתרבות.
- תקשורת mTeSR1 תחליף עם תקשורת בידול 4 מיליליטר. שינוי אחד וחצי של התקשורת כל 3 ימים.
- לאפשר מוקדי פיגמנט לצמוח גדולים מספיק כדי להיות גזור באופן ידני מתוך התרבות (40-50 יום).
- השתמש200 קצה פיפטה μl לחתוך מסביב ולהרים את מושבות פיגמנט.
- לאסוף ולרכז את המושבות גזורים בצינור חרוטי 15 מיליליטר.
- לאחר מכן להוסיף 5 מיליליטר של DMEM/F12 לתאי הרשתית ונקווה ו צנטריפוגות XG 300 5 דקות פעמיים.
- הכן פתרון תא בודד על ידי דוגרים IPS-הרשתית ונקווה עם 0.25% EDTA טריפסין.
- יש לשטוף את תאי iPS-RPE עם תקשורת IPS-הרשתית וצלחת התאים שנאספו על טרי גם ב4 מיליליטר של תקשורת IPS-הרשתית מצופה matrigel.
- תרבות התאים במשך 3 שבועות לפני המעבר. לשנות את התקשורת כל 3 ימים. לצורך הניסוי, צלחת iPS-RPE ב100,000 תאים / 2 סנטימטר. איסוף תאים ביום 17. רוזן היום של זריעה כמו יום 0.
5. אוסף דוגמאות
- אוסף תאי iPS
- תרבות תאי iPS עד מושבות לא עברו התמיינות הם נצפו להיות צפופים במרכז.
- יש לשטוף את המושבות ב DMEM/F12.
- התפרק לתאים בודדים באמצעות accutas דואר. לאסוף את התאים לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב XG 300 למשך 5 דקות. לשאוב supernatant. Resuspend ב 2 מיליליטר של DMEM/F12.
- הרשתית אוסף עוברי
- יש לשטוף בתרביות תאים עוברי הרשתית עם DMEM/F12 והתפרק לתאים בודדים באמצעות 0.25% EDTA טריפסין.
- לאסוף את התאים בצינור חרוטי 15 מיליליטר. צנטריפוגה ב XG 300 למשך 5 דקות. לשאוב supernatant. Resuspend ב 2 מיליליטר של DMEM/F12.
- אוסף נייד IPS-הרשתית
- כאשר IPS-הרשתית להגיע חלוף 3 וחלוף 5, לאסוף את התאים ביום 17 לאחר מעבר. יש לשטוף IPS-הרשתית פעמים PBS ולהכין השעיה תא בודדת על ידי דגירה עם טריפסין 1.0 מיליליטר של 0.25%.
- לנטרל טריפסין עם 2 מיליליטר של תקשורת IPS-הרשתית קרח קר.
- לאסוף את התאים בצינור 15 מיליליטר חרוטי ו צנטריפוגות ב XG 300 למשך 5 דקות. לשאוב supernatant.
- Resuspend ההשעיה התא ב 3 מיליליטר של חיץ מכתים מערכת microbead.
- שמור את כל חומרים כימיים על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש, אבל לא עובד על קרח. צנטריפוגה השעיה תא מהצעד 5.3.4 XG 300 למשך 5 דקות. לשאוב supernatant.
- תאי resuspend ב של חיץ מכתים 100 μl מערכת microbead ל2 x 10 6 תאים.
- הוסף 10 μl של נוגדן Anti-TRA-1-60-PE ל2 x 10 6 תאים.
- מערבבים היטב ודגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- שטוף תאים ב1-2 מיליליטר של חיץ לכל 2 x 10 6 תאים. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 300 x גרם. לשאוב supernatant.
- תאי resuspend ב 80 μl של חיץ מכתים ל2 x 10 6 תאים. הוסף 20 μl של microbeads אנטי PE שכותרתו (מערכה) לכל 2 x 10 6 תאים. מערבבים היטב. דגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C.
- להוסיף 1-2 מיליליטר של חיץ מכתים ל2 x 10 6 תאים. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 300 x גרם. לשאוב supernatant.
- Resuspend תאים ב500 & #956; ליטר של חיץ מכתים.
- הפרדת תא מגנטית:
- מקום עמודת סדרן תא מגנטי. יש לשטוף את העמודה עם 3 מיליליטר של חיץ מכתים.
- החל השעיה תא מ6.8 על עמודה.
- הנח צינור בנמל השלילי כדי לאסוף את TRA-1-60 תאים שליליים.
7. סה"כ RNA חילוץ
- Lyse התאים על ידי הפעלת הדגימות באמצעות טור ספין מיני homogenizer microcentrifuge זמין מסחרי המיועד לminipreps חומצות גרעין.
- חלץ RNA המוחלט מתאי iPS, IPS-הרשתית, ורשתית של העובר עם ערכת חילוץ RNA זמינה המסחרית שנועדה לשמר את מולקולות RNA קטנות 27.
- לקבוע סך ריכוזי RNA באמצעות ספקטרופוטומטר Nanodrop.
8. Bioanalyzer וMicroarray Assay
- בדוק את שלמות RNA עם Bioanalyzer בשיתוף עם ערכת איכות RNA זמינה מסחרי.
- דגירה של 100 ngרנ"א הכל עם phosphatase מעי עגל ב37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות
- לפגל RNA באמצעות DMSO 100% ב-C ° 100 למשך 5 דקות.
- תווית הדגימות עם PCP-Cy3 באמצעות האנזים T4 על ידי דגירה על 16 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
- להכליא בפורמט 8_x_15K מערך מירנה אנושי.
- שטוף את המערכים בהתאם להוראות יצרן וסריקה ברזולוציה של 5 מיקרומטר באמצעות סורק.
- רוכשת את הנתונים באמצעות תוכנת חילוץ תכונת microarray תואמת את microarray מירנה.
- לעבד את אותות מירנה כדי לקבוע את הרמה היחסית של ביטוי במדגם זה.
- השווה את רמות הביטוי של כל מירנה בין קבוצות מדגם. בחר miRNAs עם ביטוי ההפרש לפחות פי שניים לניתוח נוסף.
- באמצעות תוכנה זמינה באופן מסחרי לניתוח נתונים, בצע את ההוראות ליצירת מפות חום להדמיה של miRNAs הביע באופן דיפרנציאלי 28.
9. ניתוח מסלול
- שמור את הנתונים מmiRNAs נבחר ב8.9 בפורמט אקסל.
- היכנס לתכנית ניתוח מסלול RNA באינטרנט. העלה קובץ Excel. בחר באפשרות "תבנית גמישה" לפורמט קובץ ובחר "Agilent" מרשימה נפתחת עבור סוג המזהה.
- תחת כותרת הנתונים גולמית, להקצות "מזהה" לחקור עמודה מזהה ולהקצות "תצפית 1" ו "יומן יחס" לעמודת מנת יומן. בחר "להתעלם" לכל עמודות אחרות.
- בחר את הפרמטרים לניתוח באופן הבא: בטחון: בניסוי נצפה רק; כוללים קשרים ישירים ועקיפים; וכוללים כימיקלים אנדוגני; בחר את בסיס ידע שנינות כקבוצת ההתייחסות. בחר את מסד הנתונים של מולקולות התייחסות הכולל נתונים מכל המינים, בכל שורות התאים וברקמות, ואת כל המוטציות.
- רשת הפעלה ומסלול מנתח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תאי iPS (איור 1 א) גודלו בתנאי בידול כדי לגרום להתמיינות לתאי iPS-RPE. IPS-הרשתית הציגה פנוטיפ הרשתית קלאסי של מורפולוגיה של תאי פיגמנט משושה (איור 1) דומה לרשתית עוברית (איור 1 ג).
כדי להבין את התפקיד שמירנה עשויה לשחק בתהליך של בידול משב"ס לIPS-הרשתית טובה יותר, ניתוח microarray של ביטוי מירנה נערך. RNA סה"כ נאסף מתאי iPS, הרשתית עוברית, וIPS-הרשתית באמצעות ערכת בידוד mirVana מירנה כדי להבטיח שימור מקסימאלי של RNA הקטן. RNA היה לכמת ונבדק על טוהר לפני ההכלאה לLabChip microarray. בדיקות המייצגות את 1,205 בני אדם ו144 miRNAs הנגיפי שימשו כדי לנתח את ביטוי מירנה מכל קבוצת מדגם. האותות נותחו על מנת לקבוע את הרמות היחסית של ביטוי של כל מירנה מכל מדגם. הנתונים משמשים להשוואת דואר מירנה פרופיל Xpression של IPS-הרשתית לשב"ס ורשתית של העובר. מפות חום נוצרו כדי לאפשר הדמיה של ביטוי מירנה ההפרש בין הקבוצות (איור 2 א). 83 miRNAs שבאו לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בשב"ס בהשוואה לIPS-הרשתית, עם 47 miRNAs שהוגברו בשב"ס בהשוואה לIPS-הרשתית, ו36 downregulated בiPS (איור 2). 110 miRNAs באו לידי הביטוי באופן דיפרנציאלי ברשתית עוברית לעומת IPS-הרשתית, עם 61 miRNAs שהוגברו בfRPE, ו49 downregulated בfRPE לעומת IPS-הרשתית (איור 2 ג). ניתוח מסלול עם תוכנת שנינות IPA הצביע תמלילי יעד miRNAs הביעו באופן דיפרנציאלי לגני המעורבים בהתפתחות סלולרית, צמיחה, שגשוג והישרדות, מחזור תא, ותנועה סלולרית. MiRNAs לידי ביטוי ברקמות העין בvivo נמצאו להיות מועשר בIPS-הרשתית ורשתית של העובר בהשוואה לiPS (איורים 3 ו -4).
t "עבור: לשמור-together.within-page =" תמיד ">
איור 1. תמונות Brightfield של שב"ס, הרשתית עוברית, וIPS-הרשתית. תמונות Brightfield (100X) של תאי iPS לפני התמיינות, הרשתית עוברית, ורשתית הנגזרת משב"ס. שתי הרשתית העוברית וIPS-הרשתית להציג מורפולוגיה הרשתית קלאסית של צורה ופיגמנטציה משושה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. פרופיל ביטוי מירנה מIPS-הרשתית בהשוואה לשב"ס ורשתית של העובר.) מפות חום מתארות את המידה היחסית של ביטוי ההפרש של miRNAs. הצבעבקנה מידה מייצגת את רמות הביטוי של מירנה כאמור לעיל (אדום), בהמשך (הירוק), או במשמעות רמת ביטוי (שחור) על פני כל הדגימות. ב ') השוואה בין פרופילי מירנה של IPS-הרשתית לתאי iPS. C) השוואה של פרופילי מירנה של IPS-הרשתית לרשתית עוברית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3.) ניתוח רשת של פרופילי ביטוי מירנה של תאי iPS הורים לעומת הרשתית iPS נגזר. 4 הרשתות העליונים מוצגות בנפרד (משמאל) והתמזגו (במרכז). ב ') ניתוח מסלול של miRNAs הביע באופן דיפרנציאלי. PleASE לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4.) ניתוח רשת של פרופילי ביטוי מירנה של הרשתית עוברית לעומת הרשתית iPS נגזר. 7 הרשתות העליונים מוצגות בנפרד (משמאל) והתמזגו (במרכז) ניתוח מסלול. ב ') של miRNAs הביע באופן דיפרנציאלי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לסיכום, דו"ח זה מתאר את השיטות המשמשות לתאי iPS תרבות, IPS-הרשתית, ורשתית של העובר. הרשתית נובעת מiPS הן מורפולוגית ופונקציונלית דומות לרשתית של העובר. IPS-הרשתית גם מבטאת גנים הרשתית אופייניים כולל RPE65, CRALBP, PEDF, וLRAT 16. כדי להמשיך ולאפיין את התאים האלה, RNA הופק ומשמש לביצוע ניתוח microarray לזהות מירנה הביעה באופן דיפרנציאלי. ניתוח של עוצמות האות חשף כי המספר הגדול ביותר של miRNAs הביע באופן דיפרנציאלי זוהה ברשתית העוברית לעומת השוואות IPS-הרשתית, דבר המצביע IPS-הרשתית עשויה להיות יותר בוגרת. מחקרים עתידיים מתוכננים כדי לאמת את התוצאות הללו עם RT-PCR.
ישנן מספר נקודות קריטיות במהלך ניסוי זה שחייבת להתבצע בזהירות כדי להבטיח את הצלחתו של assay ורכישת נתונים מדויקים. צעד המפתח הראשון מתרחש במהלך התרבות של תאי iPS. תאי iPS חייבים להישאר בpluripotent מדינה כדי לשמור על stemness שלהם. התאים חייבים להיבדק יומיים בזהירות לסימנים של בידול. תאי iPS מובחנים לגדול כמושבות רב תאיים קומפקטיות. התאים צריכים להיות גרעיני גבוהה יחס ציטופלסמה וnucleoli הבולט. מושבות iPS מתאפיינות בגבול ברור, עם מספר שכבות של תאים במרכז. סימנים של בידול כוללים אובדן גבולות מוגדרים מושבה, המורפולוגיה של תאים שאינם אחידה, ואת המראה של סוגי תאי מובן מאליו, כגון תאי עצב וfibroblasts. תאים בודדים שהבדילו ניתן להסיר על ידי dispase ושטיפה, לעומת זאת, מושבות עם מאפיינים אלה יש להסיר באופן ידני מהתרבות 29.
הכנה של RNA לניתוח microarray היא השלב הקריטי הבא. איכות RNA עקבית מהווה מקור משמעותי של השתנות בנתונים microarray. מיצוי RNA אמור להניב משקל מולקולרי גבוה וRNA מינימאלי המושפל לתוצאות הטובות ביותר. מוצלחמיצוי RNA יניבו רנ"א הכל במינימום השפלה וחופשי מכל RNases מזהמת. לאחר קביעת ריכוז RNA על ידי spectrophotometry ב 260 ננומטר, את הטוהר של המדגם צריך להיקבע ב230 ו280 ננומטר כדי לזהות זיהום עם סוכרים או חלבונים. יחס 230:260:280 עבור RNA צריך להיות 01:02:01 כדי לציין RNA באיכות גבוהה עם זיהום לא 30.
כאשר מתכננים ניסוי microarray, השלב הקריטי ביותר הוא ההכללה של בקרות שליליות על מנת להבטיח את ההכלאה לבדיקות ספציפית, ולהפעיל את כל דגימה בשלושה עותקים כדי להבטיח שהאותות שאותרו תקפים שלקבוצת המדגם. במהלך ניתוח תוצאות microarray, נקודת מפתח היא תיקון רקע, שבו רעש הרקע יורד מהאות נצפתה לתת עוצמת האות נכונה עבור כל בדיקה מסוימת. צעד זה יבטל חיובי שגוי, תוך הדגשת האותות חיוביים האמיתיים. </ P>
לבסוף, ברשת וניתוח מסלול של תוצאות microarray, הצעד החשוב ביותר הוא לקבוע את הפרמטרים הנכונים ומסננים לפני הפעלת הניתוח. צעד זה יהיה לקבוע אילו מאגרי מידע ישמש את התוכנה ליצירת הרשתות ולזהות מסלולים הסלולר שמושפעים miRNAs הראה לבוא לידי הביטוי באופן דיפרנציאלי בהשוואות.
לאחר הרכישה של נתונים באמצעות השיטות שתוארו בדוח זה, יש צורך להביא בחשבון את המגבלות של מבחני אלה בפרשנות של התוצאות. אמנם סביר, זה עדיין אפשרי שתרבות הרשתית אינה אוכלוסייה הומוגנית של תאי הרשתית. תהליך המיון אנטי TRA-1-60 הוא תהליך סלקציה שלילי שמסיר את התאים שעדיין להביע נובעים סמני תא; עם זאת זה לא מבטיח את התאים הנותרים הם תאי הרשתית טהורים. למרות שמורפולוגית תאי תערוכת מורפולוגיה הרשתית קלאסית של פיגמנטציהnd צורת תא מצולעים, זה אפשרי, כי לא כל התאים הרשתית.
ניסויי microarray עשויים לייצר תוצאות חיוביות שגויות לביטוי של רנ"א, במיוחד במקרה של microRNA בשל רצפים קצרים מאוד. למרות שמערכת microarray המשמשת לניסוי זה כללה בדיקות מרובות כדי לכוון לאזורים שונים של כל יעד, צריכים להיות תמיד תוקף את התוצאות על ידי qRT-PCR.
ניתוח של נתוני microarray ידי שנינות IPA תלוי הכמות והאיכות של מידע במסד נתוני שנינות. חלק גדול מהמידע על תפקוד גן ומסלולי הסלולר נובע מניסויים שנערכו בשורות תאים הפכו או בהקשר של חקר הסרטן. לכן, התוצאות של מסלול וניתוח רשת באמצעות תכנית זו לא תמיד רלוונטיות לתאים ראשוניים או, במקרה זה, בתאי גזע.
למרות מגבלות אלה, בשיטות שתוארו בדוח זה יכול לשמש עבורתרבות של תאי iPS ורשתית עוברית, הרשתית הנובעת מתאי iPS, והפקת RNA לניתוח microarray של מירנה. נתונים שנוצרו על ידי מבחני אלה יכולים לשמש כדי לזהות miRNAs המעורב בתהליך ההתמיינות, כמו גם אלה המווסתים את פונקציות הרשתית.
למרות שיותר miRNAs נמצאו לבוא לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי ברשתית העוברית לעומת השוואת IPS-הרשתית מאשר בשב"ס לעומת השוואת IPS-הרשתית, יש הרבה סיבות אפשריות לכך. קודם כל, בזמן assay זה בוצע, פלטפורמת microarray מירנה הייתה מסוגלת לאתר 1,205 בני אדם ו144 miRNAs הנגיפי. מאז, הפלטפורמה הורחבה לכלול בדיקות במשך 2,000 miRNAs אדם. זה בהחלט אפשרי כי פרופילי ביטוי ההפרש מירנה ישתנו אם יותר miRNAs מזוהים. של miRNAs 1,349 זוהה על ידי assay זה, רוב miRNAs לא הראה שום הבדל בביטוי בין סוגי התאים (2B דמויות ו2C
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
הדעות או טענות הכלולות במסמך זה הן התצוגות אישי של הכותבים ואינם להתפרש רשמי או כפי שמשקפים את הדעות של מחלקת הצבא או משרד ביטחון.
מחקר זה בוצע בזמן שהמחברים יטני א גרין, אלברטו מוניז, וראמש ר Kaini קיימו המועצה הלאומית למחקר דוקטורים Associateship מחקר בUSAISR.
מבחני microarray בוצעו על ידי מתקן המכון לחקר סרטן Microarray Core הילדים Greehey וביואינפורמטיקה המחלקה ב UT למדעי בריאות במרכז סן אנטוניו.
עבודה זו נתמכה על ידי תכנית הצבא האמריקאי לרפואה הקלינית שיקומית מחקר (CRMRP) ותכנית צבאית לרפואה תפעולית מחקר (MOMRP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-β-mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Fetal RPE media RTEGM kit | Life Technologies | 195406 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Trypsin | Hyclone(Fisher) | 25200-072 | |
| Miltenyi Biotec washing buffer | StemGent | 130-092-987 | |
| Miltenyi Biotec rinsing buffer | StemGent | 130-092-222 | |
| Anti-TRA-1-60 microbead kit | StemGent | 130-095-816 | |
| Miltenyi Biotec cell sorter column | StemGent | 130-021-101 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | |
| RNA 6000 Pico LabChip kit | Agilent | G2938-90046 | |
| Human miRNA microarray v16 | Agilent | G4471A |
References
- Yu, Z., et al. miRNAs regulate stem cell self-renewal and differentiation. Front Genet. 3, 191 (2012).
- Romano, G., et al. A commentary on iPS cell biology: Potential applications in autologous tissue and cell transplantation, development of new models for the study of human pathological conditions and drug screening. J Cell Physiol. 229, 148-152 (2014).
- Almeida, P. E., et al. Immunogenicity of pluripotent stem cells and their derivatives. Circ Res. 112, 549-561 (2013).
- Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2427-2434 (2009).
- Kokkinaki, M., et al. Human induced pluripotent stem-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells exhibit ion transport, membrane potential, polarized vascular endothelial growth factor secretion, and gene expression pattern similar to native RPE. Stem Cells. 29, 825-835 (2011).
- Bharti, K., et al. The new paradigm: retinal pigment epithelium cells generated from embryonic or induced pluripotent stem cells. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 21-34 (2011).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Pera, M. F. Stem cells. A new year and a new era. Nature. 451, 135-136 (2008).
- Subba Rao, M., et al. Thinking outside the liver: Induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19, 3385-3396 (2013).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50, 327-332 (2011).
- Lee, K. S., et al. Human sensory neurons derived from induced pluripotent stem cells support varicella-zoster virus infection. PLoS One. 7, (2012).
- Alipio, Z., et al. Reversal of hyperglycemia in diabetic mouse models using induced-pluripotent stem (iPS)-derived pancreatic beta-like cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 13426-13431 (2010).
- la Cour, M., Tezel, T. The retinal pigment epithelium. Adv Organ Biol. 10, 253-272 (2005).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4, (2009).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379, 713-720 (2012).
- Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 198-209 (2014).
- Leonardo, T. R., et al. The functions of microRNAs in pluripotency and reprogramming. Nat Cell Biol. 14, 1114-1121 (2012).
- Arora, A., et al. Prediction of microRNAs affecting mRNA expression during retinal development. BMC Dev Biol. 10, (2010).
- Huntzinger, E., Izaurralde, E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay. Nat Rev Genet. 12, 99-110 (2011).
- Mallanna, S. K., Rizzino, A. Emerging roles of microRNAs in the control of embryonic stem cells and the generation of induced pluripotent stem cells. Dev Biol. 344, 16-25 (2010).
- Guo, H., et al. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466, 835-840 (2010).
- Adijanto, J., et al. Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) promotes differentiation of human retinal pigment epithelium (RPE) by regulating microRNAs-204/211 expression. J Biol Chem. 287, 20491-20503 (2012).
- Hu, G., et al. Identification of miRNA signatures during the differentiation of hESCs into retinal pigment epithelial cells. PLoS One. 7, (2012).
- Wilson, K. D., et al. MicroRNA profiling of human-induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 18, 749-758 (2009).
- Neveu, P., et al. MicroRNA profiling reveals two distinct p53-related human pluripotent stem cell states. Cell Stem Cell. 7, 671-681 (2010).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).
- Qiagen, miRNeasy Mini Handbook. Sample and Assay Technologies. , (2013).
- Microarray System with miRNA Complete Labeling and Hyb Kit. Agilent Technologies. , (2011).
- Maintenance of hESCs and hiPSCs in mTESR1 and mTESR2. Stem Cell Technologies. , (2010).
- The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. About Biotechnology. , (2013).
