Summary
微小RNA（miRNA）的由人诱导多能干细胞（iPS）细胞（iPS-RPE）和胎儿视网膜色素上皮衍生的人诱导多能干细胞的访问（iPS细胞），视网膜色素上皮细胞（RPE），进行比较。
Abstract
本报告的目的是描述的协议，用于比较的microRNA（miRNA）的人类诱导多能干细胞（iPS）细胞，视网膜色素上皮细胞（RPE）从人类iPS细胞（iPS-RPE）导出，胎儿视网膜色素上皮的配置文件。该协议包括收集的RNA通过微阵列分析，以及微阵列数据的分析，找出差异表达三种细胞类型的miRNA。该方法iPS细胞和胎儿视网膜色素上皮的文化解释。用于从人iPS分化的RPE的协议也被描述。我们描述了RNA提取技术被选中，允许非常小RNA在一个miRNA芯片的使用极大的恢复。最后，细胞通路和微阵列数据的网络分析解释。这些技术将促进三种不同类型的细胞的miRNA表达谱进行比较。
Introduction
干细胞具有无限制和分化成任何体细胞类型的潜力来复制的能力。的技术，体细胞重编程为多能干细胞的发展，就引起了极大的热情在研究界和临床医生之间，作为个性化的组织再生的出现在地平线上1。诱导多能干细胞（iPS细胞）表现出无限的复制能力和多能性的相同的功能，胚胎干细胞（ES细胞），同时规避与胚胎干细胞相关的伦理困境。此外，病人的干细胞不会刺激免疫反应，大大增加了成功的治疗性应用2-3的概率。根据特定的培养条件下，iPS细胞已经显示出分化成体外几种不同的细胞类型，包括心肌细胞，神经细胞，胰腺β细胞，肝细胞和视网膜色素上皮（RPE）4-12。
在RPE是一个专门的层设在视网膜的后面，执行多种功能，这对于视力健康和功能，如杂散光，吞噬作用的光感受器外段的吸收必需的色素上皮细胞，和类视黄酸处理的生产视觉生色。视网膜色素上皮因损伤或疾病功能障碍深刻地影响感光健康和视觉功能就证明了致盲的疾病，是潜在的视网膜色素上皮病变，如年龄相关性黄斑变性（AMD），Stargardt病和色素性视网膜炎（RP）的结果13。可以恢复视力确实有效的治疗方法尚未实现，并更换视网膜色素上皮病变与正常RPE细胞可能是为了防止视力14-15损失的最佳选择。 RPE由iPS（IPS-RPE）是衍生的细胞的一个可能的来源，以取代受损视网膜色素上皮。的iPS-RPE表达characteris抽动RPE蛋白质LRAT，CRALBP，PEDF和RPE65;显示经典的高色素六角形的RPE形态;并执行RPE功能，如吞噬作用，视黄酸类化合物的处理，和11的分泌- 顺视网膜5,16。然而，之前的iPS-RPE可用于治疗中，IPS-RPE必须彻底特征。理解支配RPE分化的因素是必要的，以改善细胞用于临床应用的产率和纯度。
细胞分化是高度调节基因表达的结果。转录因子的基因组和协调的后生重构所需的分化和发育17期间发生的细胞命运的决定。信息核糖核酸（mRNA）的翻译者的microRNA（miRNA）的调控提出了调控的另一个层面，影响细胞命运1。 miRNA是短，约为22个核苷酸，核苷酸的长度，要么抑制翻译的结合到mRNA的3'非编码区或靶mRNA的降解。的miRNA已经在几乎所有组织中被发现，而且迄今超过2,000人独特的microRNA已经注册在数据库中的miRBase。由于miRNA的要求只有部分互补结合到靶mRNA，单个的miRNA有可能绑定到几十或上百个目标，反之亦然， 即单个基因可以由几个不同的miRNA有针对性。这种混杂的结合特性大大提高了监管的复杂性，在细胞功能18-21各玩各的水平以及确定单个miRNA的功能的难易程度和作用。然而，研究表明，miRNA的通过影响DNA甲基化状态17细化分化过程中的基因表达。在一项研究更具体的RPE，miR-204/211被证明能促进视网膜色素上皮22的上皮细胞表型。另一组分析了miRNA的个人资料视网膜色素上皮的过程中由ES细胞分化，并透露组不同的miRNA在分化过程中23表示。事实上，miRNA表达谱可以明确区分的细胞类型，包括胚胎干细胞，前体细胞，和终末分化细胞24,25。超过250个miRNA的表达在视网膜上。基于这些研究，我们推测，RPE细胞或者由iPS分化过程中的miRNA中发挥重要作用。
本报告的目的是从IMR90-4的iPS描述为RPE的分化的协议细胞，收集的RNA的微阵列分析和微阵列数据的分析，以确定差异表达三种类型的细胞的iPS细胞的miRNA， ，的iPS-RPE细胞和胎儿的RPE。总RNA从每种细胞类型的培养物中提取和杂交的miRNA的微阵列，包含特异性针对1205人的miRNA和144病毒的miRNA探针。基因芯片结果进行比较d，来确定哪些miRNA的差异表达在不同的细胞类型。 miRNA的2倍或更大的表达倍数变化被选择用于进一步分析。甲miRNA的分析软件程序来鉴定差异表达的miRNA的潜在目标，并生成由所选择的miRNA调节的蜂窝网络。
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Protocol
培养试剂和培养板的1。准备
- mTeSR1媒体：根据制造商的指示准备mTeSR1媒体。解冻百毫升mTeSR1 5倍的补充一夜之间在4°C。添加百毫升mTeSR1 5倍的补充至400ml mTeSR1基础培养基中拌匀。此介质是稳定的，在4℃下进行长达2周，并在-20℃下6个月。
- 分化培养基：准备分化培养基中的DMEM/F12，得到0.1mM的β-巯基乙醇，0.1mM非必需氨基酸，2.0 2mM L-谷氨酰胺，10％敲除血清，和10微克/毫升庆大霉素。
- 的iPS-RPE媒体：准备的iPS-RPE媒体在MEM中，得到1X N1的补充，0.1mM非必需氨基酸，250μg/ ml的牛磺酸，13毫微克/毫升三碘-L-甲状腺原氨酸钠盐，20毫微克/毫升氢化可的松，5微克/毫升庆大霉素和15％FBS的26。
- 三碘-L-甲状腺原氨酸钠盐原液。为了准备储备液溶解1.0毫克三碘-L-甲状腺素的在1N氢氧化钠轻轻旋转钠钠盐。接下来添加49.0毫升基础介质，使50.0毫升的三碘-L-甲状腺原氨酸钠盐的20微克/毫升。准备分装和直到需要冻结在-20°C。使用适当的音量，以达到理想的浓度在最终培养基。
- 氢化可的松原液：要准备氢化可的松原液，溶解1毫克的氢化可的松1毫升的无水乙醇轻轻搅动。接下来添加19.0毫升基础介质的为50微克/毫升20毫升氢化可的松原液。分装，冷冻在-20°C，直到需要。使用适当量以达到所需浓度在最终培养基中。
- 胎儿的视网膜色素上皮生长培养基。通过将所有的试剂在RTEGM试剂盒中的基础培养基制备生长培养基，按照制造商指示除外FBS。
- 胎儿视网膜色素上皮电镀媒体。通过将少量的生长培养基，以无菌容器和一个准备电镀媒体西元FBS到2％的终浓度。
- 分散酶：准备分散酶的1毫克/毫升的DMEM/F12中的工作液。
- Matrigel包被板：在DMEM/F12准备基质胶到0.08毫克/毫升。
- 外套每孔一个6孔板用1.0mL的基质胶溶液中。
- 孵育包被的板在室温下搅拌1.0小时。
- 在1.0小时孵育后，吸去多余的DMEM/F12。
- 加入0.5毫升mTeSR1媒体，以避免干燥。基质胶涂层板现已准备就绪。
2，培养的iPS
- 之前的iPS细胞播种都管，暖mTESR1媒体至室温，并在基质胶包被的平板准备。
- 迅速解冻在37℃水浴中IMR90-4 iPS细胞。然后从水浴中取出冷冻管和消毒用70％的乙醇。
- 用2毫升的移液管，以减少细胞聚集体破碎细胞转移到15毫升锥形管中。
- 逐滴加入5 mL水中的RM mTeSR1媒体向细胞并轻轻混匀。离心细胞，在300×g离心5分钟，在室温下，去除上清。
- 小心地重悬细胞聚集体在2毫升mTeSR1介质和种子细胞到6孔板的一个孔中。
- 将板放入37℃的培养箱中培养，并用5％CO 2，95％湿度。
- 每天都在变化的iPS细胞培养基。播种后5-7天未分化克隆将出现。检查未分化的殖民地，它们准备好通道（与密集中心殖民地）。
iPS细胞的3。传代
- 之前开始到通道中的iPS细胞，都管，分散酶溶液，DMEM/F12和mTERS1介质温热至室温，并在基质胶包被的平板准备。
- 之前传代iPS细胞，通过刮区和抽吸介质除去分化的地方。分化应保持低于井20％的高质量文化。仔细冲洗的iPS含细胞以及用2ml的DMEM/F12的并加入1 ml的1毫克/毫升分散酶到每个孔中。
- 在37℃下7分钟。吸出分散酶，轻轻冲洗细胞集落用2毫升的DMEM/F12的两倍。
- 冲洗后，加入2ml mTSER1的每个孔中。
- 用5毫升的移液管轻轻刮板的集落形成的聚集体。
- 转移分离的菌落到15毫升锥形管中。加足够mTeSR1媒体的种子细胞的下一通道。
4，分化的iPS细胞来的iPS RPE
- 板块上，以在mTESR1媒体新涂层板的iPS细胞。
- 允许iPS细胞集落，扩大在文化4-5天。
- 替代mTeSR1媒体用4ml分化培养基。改变一半的媒体，每3天。
- 让色素病灶增长足够大，可以手动解剖出来的文化（40-50天）。
- 使用200μL枪头切割四周，抬起色素的菌落。
- 收集和集中的解剖殖民地在一个15毫升的锥形管。
- 然后加入5 ml DMEM/F12到汇集RPE细胞，离心300×g离心5分钟两次。
- 通过孵育汇集的iPS-RPE用0.25％胰蛋白酶EDTA制备单细胞溶液。
- 冲洗的iPS-RPE细胞与IPS RPE媒体和板将收集的细胞在新鲜的基质胶涂覆在4ml的iPS-RPE媒体良好。
- 培养细胞3周前通过。更改介质每3天。在实验中，板的iPS-RPE在100,000个细胞/ cm 2。收集细胞于17日，播种当天计数为0天。
5，样品采集
- iPS细胞采集
- 培养的iPS细胞的未分化直至菌落观察到致密的中心。
- 在冲洗DMEM/F12殖民地。
- 使用accutas解离成单个细胞 Ë。收集细胞入15ml锥形管中并离心分离，在300×g离心5分钟。吸上清。重悬在2毫升的DMEM/F12。
- 胎儿视网膜色素上皮收藏
- 冲洗胎儿视网膜色素上皮细胞培养用DMEM/F12并用0.25％胰蛋白酶EDTA解离成单细胞。
- 收集细胞在15毫升锥形管。离心机在300×g离心5分钟。吸上清。重悬在2毫升的DMEM/F12。
- 的iPS-RPE细胞采集
- 当上IPS-RPE达到第3代和第5代，收集通过后第17天的细胞。冲洗的iPS-RPE两次在PBS中，通过温育与1.0ml 0.25％胰蛋白酶制备单细胞悬浮液。
- 胰蛋白酶中和用2毫升冰冷的iPS-RPE媒体。
- 收集在15毫升锥形管中，离心分离机，在300×g离心5分钟，将细胞。吸上清。
- 重悬细胞悬浮于3ml的染色缓冲液从微珠试剂盒。
- 保留所有试剂在4°C，直到使用，但不要在冰工作。从步骤5.3.4在300×g离心5分钟，离心分离细胞悬浮液。吸上清。
- 将细胞再悬浮于由每2×10 6细胞微珠试剂盒100μl的染色缓冲液中。
- 加10微升每2×10 6细胞抗TRA-1-60-PE抗体。
- 并充分混匀，4℃10分钟。
- 在1-2毫升缓冲液中每2×10 6细胞洗涤细胞。离心10分钟，在300×g下。吸上清。
- 将细胞再悬浮于80微升的染色缓冲液中每2×10 6个细胞。每2×10 6个细胞加入20微升抗-PE标记的微珠（由试剂盒）。拌匀。孵育15分钟，在4℃下
- 加入1-2毫升染色缓冲液每2×10 6个细胞。离心10分钟，在300×g下。吸上清。
- 重悬细胞在500＆＃956;升的染色缓冲液中。
- 磁性细胞分离：
- 将列在磁性细胞分选仪。冲洗柱用3毫升的染色缓冲液中。
- 6.8应用细胞悬液到列。
- 放置一个管子在负端口收集TRA-1-60阴性细胞。
7。总RNA提取
- 裂解细胞，通过使用市售的离心均化微型旋转柱设计用于核酸小量制备在运行样品。
- 从iPS细胞的iPS-RPE和胎儿RPE与市售的RNA提取试剂盒设计为保留小分子RNA 27提取总RNA。
- 测定总RNA浓度使用NanoDrop分光光度计。
8，生物分析仪和芯片分析
- 检查RNA的完整性与生物分析仪与市售RNA质量套件配合使用。
- 孵育100纳克总RNA用小牛肠磷酸酶在37℃，30分钟
- 用100％DMSO中，在100℃下进行5分钟变性的RNA。
- 标签使用PCP-Cy3的T4连接酶孵育在16℃，1小时的样品。
- 杂交上的8_x_15K格式人类miRNA芯片。
- 根据制造商的说明冲洗阵列和在5μm的使用扫描仪的分辨率进行扫描。
- 使用微阵列特征提取软件与miRNA芯片兼容采集数据。
- 处理所述miRNA的信号，以确定每个样品中表达的相对水平。
- 比较样品组之间的每个miRNA的表达水平。选择的miRNA用于进一步的分析至少2倍差异表达。
- 用市售软件对数据进行分析，按照指示生成的差异表达的miRNA 28可视化热图。
9。途径分析
- 在Excel格式8.9选择的miRNA的保存数据。
- 登录到在线的RNA途径分析程序。上传Excel文件。选择“灵活的格式”的文件格式，并从标识符类型下拉列表中选择“安捷伦”。
- 根据原始数据的标题，指定“ID”探测ID列，并指定“观察1”和“对数比”到日志口粮列。选择“忽略”对于所有其他列。
- 选择如下的参数进行分析：信心：只有实验观察到;包括直接和间接的关系;并包括内源性化学物质;选择别出心裁的知识库作为参照组。选择参照分子的数据库，其中包括来自所有物种的数据，所有的细胞系和组织，以及所有的突变。
- 运行网络和通路分析。
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Representative Results
iPS细胞（ 图1A）培养在分化条 件以诱导分化成的iPS-RPE细胞。上IPS-RPE展出的六角形色素细胞形态（ 图1B）相似，胎儿视网膜色素上皮（ 图1C）经典的视网膜色素上皮表型。
为了更好地理解了miRNA可能分化过程中发挥由iPS来的iPS-RPE的作用，进行miRNA表达的微阵列分析。总RNA从iPS细胞，胎儿视网膜色素上皮，和iPS-RPE使用mirVana miRNA分离试剂盒，以确保小RNA最大保留收集。杂交到微阵列芯片实验室之前将RNA进行定量并测定其纯度。相当于1205人和144病毒的miRNA探针用于分析miRNA的表达从每个样品组。的信号进行分析，以确定各miRNA的表达从每个样品的相对水平。该数据被用来比较所述miRNAë的iPS-RPE细胞上的表达配置文件的iPS和胎儿的RPE。生成热图，以使各组（ 图2A）之间的差异miRNA表达的可视化。差异表达中的iPS那个83的miRNA相比的iPS-RPE，47 miRNA的上调在IPS相比的iPS-RPE和36下调中的iPS（ 图2B）。 110的miRNA差异表达胎儿视网膜色素上皮相比的iPS-RPE，用61 miRNA的上调在FRPE，和49表达下调的阻燃聚乙烯相比的iPS-RPE（ 图2C）。路径分析与别出心裁的IPA软件的指示差异表达的miRNA靶转录为参与细胞发育，生长，增殖和存活，细胞周期和细胞运动的基因。 miRNA的表达在体内眼组织中发现被富集的iPS-RPE细胞和胎儿视网膜色素上皮相比IPS（ 图3和4）。
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图1：IPS，胎儿视网膜色素上皮和IPS-RPE的明场图像。iPS细胞在微分之前，胎儿视网膜色素上皮和视网膜色素上皮由iPS衍生的明场图像（100X）。无论是胎儿的视网膜色素上皮和iPS-RPE显示六边形和色素沉着的经典视网膜色素上皮的形态。 请点击此处查看该图的放大版本。
由iPS-RPE图2。的miRNA表达谱相比，IPS和胎儿的RPE A）热图描绘的miRNA表达差异的相对程度。颜色规模代表了miRNA的上文（红色），下面（绿色）的表达水平，或的的iPS-RPE miRNA表达谱在所有样品中平均表达水平（黑色）B）比较，以iPS细胞。 三）比较中的iPS-RPE miRNA表达谱胎儿视网膜色素上皮。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
的父母iPS细胞兑的iPS源性视网膜色素上皮的miRNA的表达图谱图3 A）网络分析。前4网络分开显示（左）和合并（中心）的差异表达的miRNA。 二）通路分析。 的PLEASE点击此处查看这个数字的放大版本。
图4 A）网络的胎儿视网膜色素上皮兑的iPS源性视网膜色素上皮的miRNA的表达谱分析。前7网络分开显示（左）和合并（中心）的差异表达的miRNA。 二）通路分析。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
总之，这份报告描述了用于培养iPS细胞的方法，能干-RPE和胎儿的RPE。从视网膜色素上皮衍生的iPS在形态和功能上类似于胎儿视网膜色素上皮。上IPS-RPE也表达特性的RPE基因，包括RPE65，CRALBP，PEDF和LRAT 16。为了进一步表征这些细胞，提取RNA，并用于进行微阵列分析，以确定差异表达的miRNA。的信号强度的分析表明，在胎儿的RPE检测与的iPS-RPE比较的差异表达的miRNA的最大数目，暗示的iPS-RPE可能更成熟。未来的研究计划，以验证这些结果与RT-PCR。
有迹象表明，必须小心地进行，以确保准确的数据的检测和采集的成功此实验过程中几个关键点。 iPS细胞的培养过程中的第一个关键步骤发生。 iPS细胞必须保持在一个PLUripotent状态，以保持自己的干性。细胞必须仔细的分化迹象日常检查。未分化的iPS细胞成长为紧凑的多细胞菌落。这些细胞应该有一个高核到细胞质的比例和核仁明显。在IPS菌落的特征是明显的边界，以细胞为中心的若干层。分化的迹象包括定义的集落边界，非均匀的细胞形态，并且明显的细胞类型，例如神经细胞和成纤维细胞的外观损失。已分化的单细胞可通过分散酶和漂洗除去，但是，与这些特征的菌落必须手动从培养29除去。
RNA微阵列分析的编制是一个关键步骤。不一致的RNA的质量是变异性的微阵列数据的显著源。 RNA提取应该产生高的分子量和最低限度降解的RNA以获得最佳效果。成功RNA提取将产生的总RNA和最低降解作用，无任何污染RNA酶。测定用分光光度法在260nm处的RNA浓度后，将样品的纯度应在230和280nm处进行测定，以检测污染物与多糖或蛋白质。该230:260:280比例的RNA应该是1:2:1，表明高质量的RNA没有污染30。
在规划的微阵列实验中，最关键的步骤是加入阴性对照，以确保杂交的探针是特异性的，以一式三份运行的每个样品，以确保检测到的信号是有效的该样本集。中的微阵列结果的分析中，关键的一点是背景校正，其中，所述背景噪声从所观察到的信号，得到对于每个特定的探针的真实信号强度中减去。该步骤可以消除误报，同时强调真正的积极的信号。</ P>
最后，网络和的微阵列结果的途径分析过程中，最重要的步骤是建立运行分析之前正确的参数和过滤器。这个步骤将确定哪个数据库将要使用的软件生成的网络和鉴定被证明是差异表达的比较中的miRNA影响细胞途径。
采集中使用本报告中所描述的方法的数据后，有必要对结果的解释过程中要考虑这些分析的局限性。尽管可能性不大，但它仍然可能是RPE文化不是RPE细胞的同质人口。抗TRA-1-60的分类处理是一个阴性选择过程，消除了细胞仍然表达干细胞标志物;但是它不保证剩余的细胞是纯的RPE细胞。虽然形态的细胞表现出的沉着经典RPE形态第二多边形细胞形状，有可能并非所有的细胞是视网膜色素上皮。
微阵列实验可能产生误判为RNA的表达，特别是在微小RNA的情况下，由于非常短的序列。虽然用于本次实验的微阵列系统包括多个探测到目标每个目标的不同区域，其结果应始终通过定量RT-PCR验证。
通过别出心裁的IPA微阵列数据的分析依赖于在别出心裁的数据库的数量和质量的信息。多对基因功能和细胞途径的信息是从上转化的细胞系或在癌症研究的背景下进行的实验而得。因此，通路和网络分析的使用该程序的结果可能并不总是相关的原代细胞或在这种情况下，干细胞。
尽管有这些限制，可用于本报告中所描述的方法培养iPS细胞和胎儿的视网膜色素上皮，从iPS细胞色素上皮衍生，提取的RNA进行的miRNA微阵列分析。由这些测定中所产生的数据可被用于识别所涉及的分化过程的miRNA，以及那些调节RPE功能。
虽然已发现了更多的miRNA差异表达在胎儿RPE与比在IPS对比的iPS-RPE比较的iPS-RPE的比较，有许多可能的原因。首先，在已进行该测定时，所述miRNA微阵列平台是能够检测人的1205和144病毒的miRNA。自那时以来，该平台已扩大到包括探针超过2,000人的miRNA。这当然是可能的，如果检测到更多的miRNA miRNA的差异表达谱将发生变化。通过该测定中检测出的1349 miRNA的，最miRNA的显示，表达的细胞类型（ 图2B和2C之间没有差别
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
此处包含的意见或主张是作者的个人观点，并不应被理解为官方或反映了陆军部和国防部的意见。
这项研究进行的同时，作者惠特尼A.格林，阿尔贝托穆尼斯和拉梅什R.凯妮召开全国研究理事会博士后研究员院士在USAISR。
微阵列分析是由Greehey儿童癌症研究所基因芯片核心设备和生物信息学系UT健康科学中心圣安东尼奥进行。
这项工作是由美国陆军临床康复医学研究发展计划（CRMRP）和军事作战医学研究发展计划（MOMRP）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-β-mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Fetal RPE media RTEGM kit | Life Technologies | 195406 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Trypsin | Hyclone(Fisher) | 25200-072 | |
| Miltenyi Biotec washing buffer | StemGent | 130-092-987 | |
| Miltenyi Biotec rinsing buffer | StemGent | 130-092-222 | |
| Anti-TRA-1-60 microbead kit | StemGent | 130-095-816 | |
| Miltenyi Biotec cell sorter column | StemGent | 130-021-101 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | |
| RNA 6000 Pico LabChip kit | Agilent | G2938-90046 | |
| Human miRNA microarray v16 | Agilent | G4471A |
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