Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ملامح التعبير microRNA من خلايا الجذع الإنسان، الشبكية المشتقة من الظهارة الصبغية المحفزة، والجنين الظهارة الصبغية الشبكية

Published: June 24, 2014 doi: 10.3791/51589
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Ocular Trauma, U.S. Army Institute of Surgical Research, JBSA Fort Sam Houston

Summary

والرنا الميكروي (ميرنا) لمحات من الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان (آي بي إس) الخلايا، والظهارة الصبغية الشبكية (RPE) المشتقة من الإنسان يسببها المحفزة الجذعية (آي بي إس) خلايا (IPS-RPE)، وRPE الجنين، وتمت مقارنة.

Abstract

الهدف من هذا التقرير هو لوصف بروتوكولات لمقارنة الرنا الميكروي (ميرنا) لمحات من الإنسان يسببها المحفزة الجذعية (آي بي إس) الخلايا، والظهارة الصبغية الشبكية (RPE) المشتقة من خلايا الجذع الإنسان (IPS-RPE)، وRPE الجنين. وتشمل البروتوكولات جمع الحمض النووي الريبي لتحليلها من قبل ميكروأري، وتحليل البيانات ميكروأري لتحديد miRNAs التي أعرب تفاضلي بين ثلاثة أنواع الخلايا. يتم شرح طرق لثقافة خلايا الجذع وRPE الجنين. كما يتم وصف بروتوكول يستخدم لتمايز RPE من الجذع الإنسان. وقد تم اختيار تقنية استخراج الحمض النووي الريبي وصفنا للسماح الانتعاش القصوى من الحمض النووي الريبي الصغيرة جدا للاستخدام في ميكروأري ميرنا. أخيرا، وأوضح مسار الخلوية وتحليل شبكة من البيانات ميكروأري. وهذه التقنيات تسهيل المقارنة بين ملامح ميرنا من ثلاثة أنواع مختلفة من الخلايا.

Introduction

الخلايا الجذعية لديها القدرة على تكرار بلا حدود والقدرة على التمايز إلى أي نوع من الخلايا الجسدية. وقد أثارت تطوير تقنيات لإعادة برمجة الخلايا الجسدية إلى خلايا الجذعية المحفزة الإثارة كبيرة في الأوساط البحثية وبين الأطباء، وظهور شخصية تجديد الأنسجة تلوح في الأفق 1. الجذعية المحفزة التي يسببها (آي بي إس) الخلايا يحمل نفس الميزات من إمكانات غير محدودة وتعدد القدرات تنسخي كما الجذعية الجنينية (ES) الخلايا في حين التحايل على المعضلات الأخلاقية المرتبطة المجالس الاقتصادية والاجتماعية. بالإضافة إلى ذلك، سوف الخلايا الجذعية المشتقة من المريض لا تحفز الاستجابة المناعية، مما يزيد كثيرا من احتمال التطبيقات العلاجية الناجحة 2-3. في ظل ظروف ثقافة محددة، وقد ثبت أن خلايا الجذع على التمايز إلى عدة أنواع مختلفة من الخلايا في المختبر، بما في ذلك العضلية، الخلايا العصبية، خلايا بيتا في البنكرياس، الكبد، وظهارة الصباغية الشبكية (RPE) 4-12.

وRPE هو عبارة عن طبقة من الخلايا الظهارية المتخصصة المصطبغة تقع في الجزء الخلفي من شبكية العين التي تنفذ العديد من الوظائف التي تعتبر أساسية للصحة البصرية وظيفة مثل امتصاص الضوء الشارد، البلعمة من شرائح مبصرة الخارجي، وتجهيز الرتينوئيدات لإنتاج من حامل اللون البصرية. خلل في RPE بسبب الضرر أو مرض يؤثر تأثيرا عميقا الصحية مبصرة وظيفة البصرية كما يتضح من الأمراض المسببة للعمى التي هي نتيجة لالكامنة علم الأمراض RPE مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD)، ومرض ستارغاردت، والتهاب الشبكية الصباغي (RP) 13. لم تتحقق علاجات فعالة حقا أن يمكن استعادة الرؤية، واستبدال RPE المريضة مع RPE صحية قد يكون الخيار الأفضل لمنع فقدان البصر 14-15. RPE المستمدة من الجذع (IPS-RPE) هو مصدر ممكن من الخلايا لتحل محل RPE التالفة. IPS-RPE عن characterisالبروتينات RPE التشنج الانتقال بعيد المدى المحددة، CRALBP، PEDF، وRPE65؛ يعرض الكلاسيكية المصطبغة للغاية التشكل RPE سداسية؛ ويؤدي وظائف RPE مثل البلعمة، وتجهيز ريتينويد، وإفراز 11 - 5،16 الشبكية رابطة الدول المستقلة. ولكن، قبل IPS-RPE يمكن استخدامها علاجيا، وIPS-RPE يجب أن تتسم بدقة. فهم العوامل التي تحكم RPE التمايز ضروري لتحسين المحصول والنقاء من الخلايا لاستخدامها في التطبيقات السريرية.

تمايز الخلايا هي نتيجة لدرجة عالية من التنظيم التعبير الجيني. ويلزم إعادة جينية من الجينوم وتنسيق عوامل النسخ لقرارات مصير الخلية التي تحدث أثناء تمايز والتنمية 17. تنظيم رسالة الحمض النووي الريبي (مرنا) الترجمة من قبل الرنا الميكروي (ميرنا) يقدم حتى الآن مستوى آخر من التنظيم الذي يؤثر على الخلايا مصير 1. MiRNAs قصيرة، ~ 22 الإقليم الشمالي، وأطوال من النيوكليوتيدات التي إما ترجمة قمع من قبلالربط إلى 3 'UTR مرنا أو استهداف مرنا للتدهور. تم الكشف عن MiRNAs في جميع الأنسجة تقريبا وحتى الآن تم تسجيل أكثر من 2،000 microRNAs الإنسان فريدة من نوعها في قاعدة البيانات miRBase. منذ miRNAs تتطلب التكامل الجزئي فقط لربط مرنا الهدف، يمكن ميرنا واحدة يحتمل أن ربط عشرات أو مئات من الأهداف، والعكس بالعكس، أي ومرنا واحدة يمكن أن تكون مستهدفة من قبل العديد من miRNAs مختلفة. هذه الخاصية ملزمة منحل يزيد بشكل كبير من مستوى تعقيد التنظيم وكذلك مستوى صعوبة تحديد وظائف لل miRNAs الفردية ودور كل المسرحيات في الوظائف الخلوية 18-21. ومع ذلك، فقد أظهرت الدراسات أن تهذب ميرنا التعبير الجيني أثناء تمايز عن طريق التأثير في الوضع الحامض النووي 17. في دراسة أكثر تحديدا إلى RPE، وقد تبين miR-204/211 لتعزيز النمط الظاهري الظهارية من RPE 22. مجموعة أخرى بتحليل البيانات الشخصية ميرنامن RPE خلال تمايز الخلايا الجذعية الجنينية من وكشفت مجموعات متميزة من ميرنا وأعرب خلال عملية التمايز 23. في الواقع، يمكن تمييز ملامح ميرنا دون لبس أنواع الخلايا، بما في ذلك خلايا ES، خلايا السلائف، وخلايا متباينة عضال 24،25. وأعرب أكثر من 250 miRNAs في شبكية العين. استنادا إلى هذه الدراسات، ونحن نفترض أن miRNAs تلعب دورا هاما خلال تمايز RPE من الجذع.

الهدف من هذا التقرير هو لوصف بروتوكولات للتمايز RPE من IMR90-4 خلايا الجذع، وجمع الحمض النووي الريبي لتحليلها من قبل ميكروأري، وتحليل البيانات ميكروأري لتحديد miRNAs التي أعرب تفاضلي بين ثلاثة أنواع الخلايا، وخلايا الجذع ، IPS-RPE وRPE الجنين. تم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من الثقافات من كل نوع من الخلايا والمهجنة لميكروأري ميرنا، التي تحتوي على تحقيقات محددة ل1،205 miRNAs الإنسان و144 miRNAs الفيروسية. تم مقارنة النتائج ميكروأريد لتحديد التي تم miRNAs وأعرب تفاضلي بين أنواع مختلفة من الخلايا. وقد تم اختيار miRNAs مع 2 أضعاف أضعاف أو أكبر تغيير في التعبير لمزيد من التحليل. تم استخدام برنامج حاسوبي لتحليل ميرنا تحديد أهداف محتملة للmiRNAs وأعرب تفاضلي لتوليد الشبكات الخلوية التي ينظمها miRNAs المحدد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الكواشف الثقافة ومركبات الثقافة

  1. mTeSR1 وسائل الإعلام: إعداد وسائل الاعلام mTeSR1 وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة. ذوبان الجليد 100 مل من mTeSR1 5X تكملة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. إضافة 100 مل من mTeSR1 5X تكملة ل400 مل من وسائل الإعلام mTeSR1 القاعدية وتخلط جيدا. هذه الوسائط هي مستقرة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل الى 2 أسابيع وعند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر.
  2. وسائل الإعلام التمايز: إعداد وسائل الإعلام التمايز في DMEM/F12 لانتاج 0.1MM β-المركابتويثانول، 0.1 ملم الأحماض الأمينية غير الأساسية، 2.0 ملي L-الجلوتامين، و 10٪ خروج المغلوب المصل، و 10 ميكروغرام / مل جنتاميسين.
  3. IPS-RPE وسائل الإعلام: إعداد وسائل الاعلام IPS-RPE في MEM لانتاج تكملة 1X N1، 0.1 ملم الأحماض الأمينية غير الأساسية، و 250 ميكروغرام / مل التورين، 13 نانوغرام / مل triiodo-L-ثيرونين ملح الصوديوم، و 20 نانوغرام / مل الهيدروكورتيزون، 5 ميكروغرام / مل جنتاميسين، و 15٪ FBS 26.
  4. Triiodo-L-ثيرونين ملح الصوديوم محلول المخزون. لإعداد محلول المخزون حل 1.0 ملغ من triiodo-L-ثيرونينملح الصوديوم في 1 N هيدروكسيد الصوديوم بواسطة يحوم بلطف. المقبل إضافة 49.0 مل من وسائل الإعلام قاعدة لجعل 50.0 مل من 20 ميكروغرام / مل من triiodo-L-ثيرونين ملح الصوديوم. إعداد مأخوذة وتجميد في -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. استخدام حجم مناسب لتحقيق التركيز المطلوب في وسائل الإعلام الثقافة النهائي.
  5. الهيدروكورتيزون حل الأسهم: لإعداد محلول المخزون الهيدروكورتيزون، ذوبان 1 ملغ من الهيدروكورتيزون في 1 مل من الإيثانول المطلق من قبل الإثارة لطيف. المقبل إضافة 19.0 مل من وسائل الإعلام قاعدة ل20 مل الهيدروكورتيزون محلول المخزون من 50 ميكروغرام / مل. قسامة والتجميد في -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. استخدام حجم مناسب لتحقيق التركيز المطلوب في وسائل الإعلام الثقافة النهائي.
  6. الجنين المتوسطة النمو RPE. إعداد وسائط النمو عن طريق خلط جميع الكواشف في عدة RTEGM في وسائل الإعلام القاعدية، وفقا لتوجيهات المصنع باستثناء FBS.
  7. الجنين وسائل الاعلام الطلاء RPE. إعداد وسائل الاعلام الطلاء عن طريق نقل كمية صغيرة من وسائط النمو إلى حاوية معقمة وFBS ي إلى تركيز النهائي من 2٪.
  8. Dispase: يعد حل عمل dispase من 1 ملغ / مل في DMEM/F12.
  9. Matrigel المغلفة لوحات: إعداد matrigel في DMEM/F12 إلى 0.08 ملغ / مل.
  10. معطف كل بئر من لوحة 6 جيدا مع 1.0 مل من الحل matrigel.
  11. احتضان لوحات مغلفة في درجة حرارة الغرفة ل1.0 ساعة.
  12. بعد الحضانة 1.0 ساعة، نضح DMEM/F12 الزائدة.
  13. إضافة 0.5 مل من وسائل الإعلام mTeSR1 لتجنب التجفيف. لوحات matrigel المغلفة هي الآن جاهزة للاستخدام.

2. الجذع الثقافة

  1. قبل البذر الخلايا المحفزة لديها جميع الأنابيب، دافئة وسائل الإعلام mTESR1 إلى درجة حرارة الغرفة، وmatrigel المغلفة لوحات جاهزة.
  2. ذوبان الجليد بسرعة الجذع خلايا IMR90-4 في 37 ° C حمام الماء. ثم إزالة cryovial من حمام الماء وتعقيم باستخدام الايثانول 70٪.
  3. نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل المخروطية باستخدام ماصة 2 مل لتقليل كسر الركام الخلية.
  4. إسقاط الحكيم إضافة 5 مل من واجمهورية مقدونيا وسائل الإعلام mTeSR1 إلى الخلايا وبلطف المزيج. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة طاف.
  5. في resuspend بعناية المجاميع خلية في 2 مل من وسائل الإعلام mTeSR1 والبذور الخلايا على بئر واحدة من لوحة جيدا ستة.
  6. وضع لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية والثقافة مع 5٪ CO 2، 95٪ الرطوبة.
  7. تغيير وسائل الإعلام ثقافة الخلية الجذع اليومية. سوف تظهر المستعمرات غير متمايزة 5-7 أيام بعد البذر. التحقق من وجود مستعمرات غير متمايزة التي هي على استعداد للمرور (المستعمرات مع مركز الكثيفة).

3. الركض من خلايا الجذع

  1. قبل بداية لمرور الخلايا المحفزة، وجميع الأنابيب، والحل dispase، ارتفعت درجة حرارة DMEM/F12 وmTERS1 وسائل الإعلام لدرجة حرارة الغرفة، وmatrigel المغلفة لوحات جاهزة.
  2. قبل الركض خلايا الجذع، وإزالة أي مجالات التمايز عن طريق كشط المنطقة والشفط وسائل الإعلام. ينبغي أن يظل تمايز أقل من 20٪ من البئر لارتفاعالثقافات الجودة. شطف بعناية المحفزة التي تحتوي على الخلية جيدا مع 2 مل DMEM/F12 وإضافة 1 مل من 1 ملغ / مل dispase إلى كل بئر.
  3. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. نضح dispase وشطف بلطف المستعمرات الخلية مع 2 مل من DMEM/F12 مرتين.
  4. بعد الشطف، إضافة 2 مل من mTSER1 إلى كل بئر.
  5. باستخدام ماصة 5 مل كشط بلطف المستعمرات من لوحة لتشكيل المجاميع.
  6. نقل المستعمرات منفصلة إلى أنبوب مخروطي 15 مل. إضافة وسائط كافية mTeSR1 على البذور مرور القادم من الخلايا.

4. تمايز الخلايا المحفزة لIPS-RPE

  1. لوحة الخلايا المحفزة على لوحة مطلية حديثا في وسائل الإعلام mTESR1.
  2. تسمح مستعمرات الخلايا المحفزة لتوسيع لمدة 4-5 أيام في الثقافة.
  3. بديل وسائل الإعلام مع وسائل الاعلام mTeSR1 4 مل التمايز. تغيير نصف إحدى وسائل الإعلام كل 3 أيام.
  4. تسمح بؤر المصطبغة لتنمو كبيرة بما يكفي لتكون تشريح يدويا من ثقافة (40-50 يوما).
  5. استخدام200 ميكرولتر ماصة تلميح إلى قطع حول ورفع المستعمرات المصطبغة.
  6. جمع وتجميع المستعمرات تشريح في أنبوب مخروطي 15 مل.
  7. ثم يضاف 5 مل من DMEM/F12 إلى الخلايا RPE المجمعة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق مرتين.
  8. إعداد الحل وحيدة الخلية التي يحتضنها المجمع IPS-RPE مع التربسين EDTA 0.25٪.
  9. شطف خلايا الجذع-RPE مع وسائل الاعلام IPS-RPE وحة الخلايا والتي تم جمعها على بئر في 4 مل من وسائل الإعلام IPS-RPE المغلفة matrigel جديدة.
  10. ثقافة الخلايا لمدة 3 أسابيع قبل مرور. تغيير وسائل الإعلام كل 3 أيام. للتجربة، لوحة IPS-RPE في 100،000 خلية / سم 2. جمع الخلايا في يوم 17. عدد اليوم من بذر يوما 0.

5. جمع العينات

  1. الجذع جمع الخليوي
    1. ثقافة خلايا الجذع حتى لوحظ المستعمرات غير متمايزة لتكون كثيفة في المركز.
    2. شطف المستعمرات في DMEM/F12.
    3. فصل في الخلايا واحدة باستخدام accutas ه. جمع الخلايا في أنبوب مخروطي 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. نضح طاف. resuspend في 2 مل من DMEM/F12.
  2. الجنين RPE كوكتيل
    1. شطف الثقافات خلية الجنين RPE مع DMEM/F12 وفصل في الخلايا واحد باستخدام التربسين EDTA 0.25٪.
    2. جمع الخلايا في أنبوب مخروطي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. نضح طاف. resuspend في 2 مل من DMEM/F12.
  3. IPS-RPE مجموعة الخليوي
    1. عندما IPS-RPE تصل مرور 3 ومرور 5، وجمع الخلايا في يوم 17 بعد مرور. شطف IPS-RPE مرتين في برنامج تلفزيوني وإعداد تعليق خلية واحدة من قبل الحضانة مع 1.0 مل من 0.25٪ التربسين.
    2. تحييد التربسين مع 2 مل من الجليد الباردة وسائل الإعلام IPS-RPE.
    3. جمع الخلايا في أنبوب مخروطي 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. نضح طاف.
    4. resuspend وتعليق خلية في 3 مل من العازلة تلطيخ من عدة microbead.
ve_title "> 6. السلبية اختيار IPS-RPE لإزالة خلايا غير متمايزة

  1. إبقاء كل الكواشف في 4 درجات مئوية حتى استخدامها، ولكن لا تعمل على الجليد. الطرد المركزي تعليق خلية من الخطوة 5.3.4 في 300 x ج لمدة 5 دقائق. نضح طاف.
  2. خلايا resuspend في 100 ميكرولتر من العازلة تلطيخ من عدة microbead في 2 × 10 6 خلايا.
  3. إضافة 10 ميكرولتر من مكافحة TRA-1-60-PE الأجسام المضادة في 2 × 10 6 خلايا.
  4. تخلط جيدا واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  5. غسل الخلايا في 1-2 مل من العازلة في 2 × 10 6 خلايا. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 300 × ز. نضح طاف.
  6. خلايا resuspend في 80 ميكرولتر من العازلة تلطيخ في 2 × 10 6 خلايا. إضافة 20 ميكرولتر من بلي مكافحة PE المسمى (من مجموعة) في 2 × 10 6 خلايا. تخلط جيدا. احتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  7. إضافة 1-2 مل من العازلة تلطيخ في 2 × 10 6 خلايا. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 300 × ز. نضح طاف.
  8. الخلايا resuspend في 500 & #956، ل من العازلة تلطيخ.
  9. الفصل المغناطيسي الخلية:
    1. وضع عمود في فارز الخلية المغناطيسي. شطف العمود مع 3 مل من العازلة تلطيخ.
    2. تطبيق تعليق خلية من 6.8 إلى العمود.
    3. وضع أنبوب في ميناء السلبية لجمع TRA-1-60 خلايا سلبية.

7. إجمالي استخراج الحمض النووي الريبي

  1. ليز الخلايا عن طريق تشغيل العينات من خلال المتاحة تجاريا العمود ميكروسنتريفوج الخالط صغيرة مصممة لتدور minipreps الحمض النووي.
  2. استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من خلايا الجذع، IPS-RPE، وRPE الجنين مع عدة متاحة تجاريا استخراج الحمض النووي الريبي تهدف إلى الحفاظ على جزيئات الحمض النووي الريبي الصغيرة 27.
  3. تحديد مجموع تركيزات الحمض النووي الريبي باستخدام معمل NanoDrop.

8. Bioanalyzer والفحص ميكروأري

  1. التحقق من سلامة الحمض النووي الريبي مع Bioanalyzer بالتزامن مع متاحة تجاريا عدة نوعية الحمض النووي الريبي.
  2. احتضان 100 نانوغرام منالحمض النووي الريبي مجموع مع الفوسفاتيز العجل المعوية عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة
  3. تفسد الحمض النووي الريبي باستخدام 100٪ DMSO في 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  4. تسمية العينات مع PCP-T4 يغاز CY3 استخدام من قبل الحضانة عند 16 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  5. هجن على شكل 8_x_15K الإنسان مجموعة ميرنا.
  6. غسل المصفوفات وفقا لتعليمات الشركة الصانعة والمسح الضوئي بدرجة وضوح 5 ميكرون باستخدام الماسح الضوئي.
  7. الحصول على البيانات باستخدام ميزة ميكروأري برنامج استخراج متوافق مع ميكروأري ميرنا.
  8. معالجة الإشارات ميرنا لتحديد المستوى النسبي للتعبير في كل عينة.
  9. مقارنة مستويات التعبير عن كل ميرنا بين مجموعات العينة. حدد miRNAs مع ما لا يقل عن شقين التعبير التفاضلي لمزيد من التحليل.
  10. باستخدام البرمجيات المتاحة تجاريا لتحليل البيانات، اتبع الإرشادات لتوليد خرائط الحرارة لتصور لل miRNAs وأعرب تفاضلي 28.

9. تحليل المسار

  1. حفظ البيانات من miRNAs المحدد في 8.9 في تنسيق Excel.
  2. تسجيل الدخول إلى برنامج تحليل المسارات الحمض النووي الريبي على الانترنت. تحميل ملف Excel. حدد "تنسيق مرنة" لتنسيق الملف وحدد "اجيلنت" من القائمة المنسدلة لنوع محدد.
  3. تحت عنوان البيانات الخام، تعيين "معرف" للتحقيق في العمود رقم وتعيين "رصد 1" و "نسبة تسجيل الدخول" إلى العمود التموينية السجل. حدد "تجاهل" لكافة الأعمدة الأخرى.
  4. تحديد معايير للتحليل على النحو التالي: الثقة: لوحظ تجريبيا فقط؛ وتشمل العلاقات المباشرة وغير المباشرة؛ وتشمل المواد الكيميائية الذاتية؛ حدد قاعدة معارف الإبداع باسم مجموعة مرجعية. اختيار قاعدة البيانات من الجزيئات المرجعية التي تشمل البيانات من جميع الأنواع، وجميع خطوط الخلايا والأنسجة، وجميع الطفرات.
  5. يحلل شبكة المدى والمسار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كانت تزرع خلايا الجذع (الشكل 1A) في ظروف التمايز للحث على التمايز إلى خلايا IPS-RPE. وIPS-RPE عرضت النمط الظاهري RPE الكلاسيكية من سداسية المصطبغة مورفولوجيا الخلايا (الشكل 1B) مماثلة لRPE الجنين (الشكل 1C).

من أجل فهم أفضل للدور الذي يمكن أن تضطلع به ميرنا خلال عملية التمايز من الجذع إلى IPS-RPE، أجري تحليل ميكروأري من ميرنا التعبير. وقد تم جمع الحمض النووي الريبي مجموع من خلايا الجذع، RPE الجنين، وIPS-RPE استخدام عدة عزلة mirVana ميرنا لضمان الاحتفاظ القصوى من الرنا الصغيرة. وكان كميا الحمض النووي الريبي واختبارها للنقاء قبل التهجين إلى labchip ميكروأري. واستخدمت تحقيقات يمثلون 1،205 144 miRNAs الإنسان الفيروسية وتحليل ميرنا التعبير من كل مجموعة العينة. وقد تم تحليل الإشارات لتحديد المستويات النسبية للتعبير عن كل من ميرنا كل عينة. تم استخدام البيانات لمقارنة ميرنا ه الملف الشخصي xpression من IPS-RPE إلى الجذع وRPE الجنين. وقد تم توليد خرائط الحرارة لتمكين التصور التعبير ميرنا الفرق بين المجموعتين (الشكل 2A). 83 miRNAs التي تم وأعرب تفاضلي في الجذع مقارنة IPS-RPE، مع 47 miRNAs upregulated في الجذع مقارنة IPS-RPE، و 36 downregulated في الجذع (الشكل 2B). وأعرب تفاضلي 110 miRNAs في RPE الجنين مقارنة IPS-RPE، مع 61 miRNAs upregulated في fRPE، و 49 downregulated في fRPE مقارنة IPS-RPE (الشكل 2C). وأشار تحليل المسار مع برنامج الإبداع IPA وأعرب تفاضلي النصوص الهدف miRNAs لجينات لها دور في التنمية الخلوية، والنمو، والانتشار والبقاء على قيد الحياة، دورة الخلية، والحركة الخلوية. أعرب MiRNAs في أنسجة العين في الجسم الحي وعثر لتخصيبه في IPS-RPE وRPE الجنين بالمقارنة مع الجذع (أرقام 3 و 4).

ر "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الشكل 1
الشكل 1. الصور Brightfield من الجذع، RPE الجنين، وIPS-RPE. الصور Brightfield (100X) من خلايا الجذع قبل التمايز، RPE الجنين، وRPE المستمدة من الجذع. كل من RPE الجنين وIPS-RPE عرض الكلاسيكية التشكل RPE من شكل سداسي وتصبغ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. الشخصى التعبير ميرنا من IPS-RPE مقارنة الجذع وRPE الجنين. أ) خرائط الحرارة تصور درجة النسبية التعبير التفاضلية لل miRNAs. لونعلى نطاق ويمثل مستويات التعبير من ميرنا على النحو الوارد أعلاه (الأحمر)، أدناه (الأخضر)، أو على مستوى التعبير تعني (أسود) في جميع العينات. B) مقارنة لمحات من ميرنا IPS-RPE لخلايا الجذع. C) مقارنة لمحات من ميرنا IPS-RPE إلى RPE الجنين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الرقم 3. أ) تحليل شبكة من ملامح التعبير ميرنا من خلايا الجذع الأبوية مقابل RPE المحفزة المشتقة. وتظهر أعلى 4 شبكات منفصلة (يسار) واندمجت (في الوسط). ب) تحليل المسار لل miRNAs وأعرب تفاضلي. التنوير القائلبورصة عمان انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الشكل 4. أ) تحليل شبكة من ملامح التعبير ميرنا من الجنين RPE مقابل RPE المحفزة المشتقة. وتظهر أعلى 7 شبكات منفصلة (يسار) ودمج (وسط) التحليل. B) المسار لل miRNAs وأعرب تفاضلي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في الختام، ويصف هذا التقرير والأساليب المستخدمة في الثقافة خلايا الجذع، IPS-RPE، وRPE الجنين. RPE المستمدة من الجذع هي شكليا ووظيفيا مماثلة لRPE الجنين. يعبر عن IPS-RPE أيضا الجينات RPE مميزة بما في ذلك RPE65، CRALBP، PEDF، والانتقال بعيد المدى المحددة 16. لمزيد من تميز هذه الخلايا، تم استخراج الحمض النووي الريبي واستخدامها لإجراء تحليل ميكروأري لتحديد وأعرب تفاضلي ميرنا. وكشف تحليل شدة إشارة إلى أن تم الكشف عن أكبر عدد لل miRNAs وأعرب تفاضلي في RPE الجنين مقابل مقارنات IPS-RPE، مما يشير إلى IPS-RPE قد تكون أكثر نضجا. ومن المقرر الدراسات المستقبلية للتحقق من صحة هذه النتائج مع RT-PCR.

هناك عدة نقاط حرجة خلال هذه التجربة التي يجب تنفيذها بعناية لضمان نجاح الفحص والحصول على بيانات دقيقة. يحدث الخطوة الرئيسية الأولى خلال ثقافة خلايا الجذع. يجب أن تبقى خلايا الجذع في PLUripotent الدولة للحفاظ على stemness بهم. الخلايا يجب تفتيشها بدقة يوميا بحثا عن علامات التمايز. غير متمايزة خلايا الجذع تنمو مستعمرات متعددة الخلايا المدمجة. ينبغي أن يكون للخلايا النووية إلى ارتفاع نسبة السيتوبلازم والأنوية بارزة. وتتميز المستعمرات الجذع بحدود متميزة، مع عدة طبقات من الخلايا في المركز. وتشمل علامات التمايز فقدان حدود محددة مستعمرة، مورفولوجيا الخلايا غير موحدة، وظهور أنواع الخلايا واضحة، مثل الخلايا العصبية والخلايا الليفية. خلايا مفردة التي متباينة يمكن إزالتها عن طريق dispase والشطف، ولكن، مع المستعمرات هذه الخصائص يجب إزالة يدويا من الثقافة 29.

إعداد الحمض النووي الريبي لتحليل ميكروأري هي الخطوة الحاسمة المقبلة. نوعية الحمض النووي الريبي غير متناسقة هي مصدر كبير من التباين في البيانات ميكروأري. استخراج الحمض النووي الريبي ينبغي أن تسفر عالية الوزن الجزيئي والحمض النووي الريبي المتدهورة الحد الأدنى للحصول على أفضل النتائج. ناجحوسوف تسفر استخراج الحمض النووي الريبي الحمض النووي الريبي مجموع مع الحد الأدنى من تدهور وخالية من أي تلوث RNases. بعد تحديد تركيز الحمض النووي الريبي بواسطة القياس الطيفي في 260 نانومتر، وينبغي تحديد نقاء العينة في 230 و 280 نانومتر للكشف عن التلوث مع السكريات أو البروتين. نسبة 230:260:280 لRNA يجب أن يكون للإشارة 01:02:01 جودة عالية الحمض النووي الريبي مع عدم وجود تلوث 30.

عند التخطيط للتجربة ميكروأري، فإن الخطوة الأكثر أهمية هو إدراج ضوابط السلبية لضمان التهجين لتحقيقات غير محددة، و لتشغيل كل عينة في ثلاث نسخ للتأكد من أن الكشف عن إشارات صالحة للأن مجموعة العينة. خلال تحليل النتائج ميكروأري، والنقطة الأساسية هي تصحيح الخلفية، حيث يتم طرح الضوضاء الخلفية من إشارة لوحظ أن يعطي كثافة إشارة ينطبق على كل مسبار خاص. وهذه الخطوة القضاء على ايجابيات كاذبة، مع تسليط الضوء على إشارات إيجابية حقيقية. </ ع>

أخيرا، خلال الشبكة وتحليل المسارات لنتائج ميكروأري، فإن الخطوة الأكثر أهمية هو وضع المعلمات والمرشحات الصحيحة قبل تشغيل التحليل. وهذه الخطوة التي تحدد قواعد البيانات سيتم استخدامها من قبل البرنامج لتوليد الشبكات وتحديد مسارات الخلوية التي تأثرت miRNAs أظهرت أن أعرب تفاضلي في المقارنات.

بعد الحصول على البيانات باستخدام الأساليب المذكورة في هذا التقرير، فمن الضروري النظر في القيود المفروضة على هذه المقايسات خلال تفسير النتائج. على الرغم من غير المرجح، فإنه لا يزال من الممكن أن ثقافة RPE ليس السكان متجانسة من الخلايا RPE. عملية الفرز مكافحة TRA-1-60 هو عملية الاختيار السلبي الذي يزيل الخلايا الجذعية التي لا تزال تعبر عن علامات الخلية؛ ومع ذلك فإنه لا يضمن الخلايا المتبقية هي خلايا RPE النقي. على الرغم من أن الخلايا شكليا يحمل التشكل RPE الكلاسيكية تصبغ والثانية شكل الخلية متعدد الأضلاع، فمن الممكن أن ليس كل الخلايا RPE.

تجارب ميكروأري قد تنتج ايجابيات كاذبة للتعبير عن الحمض النووي الريبي، وخاصة في حالة الرنا الميكروي نظرا لمتواليات قصيرة جدا. على الرغم من أن نظام ميكروأري المستخدمة في هذه التجربة شملت تحقيقات متعددة لاستهداف مناطق مختلفة من كل هدف، وينبغي دائما التحقق من صحة النتائج وفقا لQRT-PCR.

تحليل البيانات ميكروأري بواسطة الإبداع IPA يتوقف على كمية ونوعية المعلومات الموجودة في قاعدة البيانات الإبداع. ويستمد الكثير من المعلومات على وظيفة الجين ومسارات الخلوية من التجارب التي أجريت على خطوط الخلايا تحولت أو في سياق أبحاث السرطان. لذلك، قد لا تكون نتائج مسار وتحليل الشبكة باستخدام هذا البرنامج دائما ذات الصلة لالخلايا الأولية أو، في هذه الحالة، والخلايا الجذعية.

على الرغم من هذه القيود، الطرق الموضحة في هذا التقرير يمكن استخدامها لثقافة خلايا الجذع الجنينية وRPE، المستمدة RPE من خلايا الجذع، واستخراج الحمض النووي الريبي لتحليل ميكروأري من ميرنا. ويمكن استخدام البيانات التي تولدها هذه المقايسات لتحديد miRNAs المشاركة في عملية التمايز، وكذلك تلك التي تنظم وظائف RPE.

على الرغم من أن تم العثور على أكثر miRNAs أن أعرب تفاضلي في RPE الجنين مقابل المقارنة IPS-RPE مما كانت عليه في الجذع مقابل المقارنة IPS-RPE، هناك العديد من الأسباب المحتملة لذلك. في المقام الأول، في الوقت الذي تم إجراء هذا الاختبار، كانت منصة ميكروأري ميرنا قادرة على الكشف عن 1،205 144 miRNAs الإنسان والفيروسية. منذ ذلك الوقت، تم توسيع منصة لتشمل تحقيقات لأكثر من 2،000 miRNAs الإنسان. فمن الممكن بالتأكيد أن ميرنا ملامح التعبير الفرق سوف تتغير إذا تم الكشف عن أكثر miRNAs. من 1،349 miRNAs الكشف عنها بواسطة هذا الاختبار، فإن معظم لل miRNAs لم تظهر أي اختلاف في التعبير بين أنواع الخلايا (أرقام 2B و 2C

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

الآراء الواردة في هذه الوثيقة أو التأكيدات هي آراء خاصة للكتاب ولا يمكن تفسيره بأنه مسؤول أو كما تعكس آراء زارة الجيش أو وزارة الدفاع.

تم إجراء هذا البحث في حين أن الكتاب يتني A. غرين، ألبرتو مونيز وراميش ر Kaini عقد المجلس الوطني للبحوث ما بعد الدكتوراه البحوث الزمالة في USAISR.

أجريت فحوصات ميكروأري من قبل Greehey طفولة مرفق معهد أبحاث السرطان ميكروأري الأساسية وإدارة المعلوماتية الحيوية في مركز العلوم الصحية UT سان انطونيو.

وأيد هذا العمل من قبل الجيش الأمريكي برنامج السريرية التأهيلية الطب بحوث (CRMRP) وبرنامج بحوث الطب التشغيلية العسكرية (MOMRP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mTeSR1 media + 5X supplement Stem Cell Technologies 5850
DMEM/F12 Life Technologies 11330-032
2-β-mercaptoethanol Sigma M-7154
Non essential amino acids Hyclone(Fisher) SH30853.01
Knockout serum replacement Life Technologies 10828-028
Gentamicin  Life Technologies 15750-060
MEM media Life Technologies 10370-021
N1 supplement Sigma N-6530-5ML
Taurine Sigma T-8691-25G
Hydrocortisone Sigma H0888-1G
Fetal bovine serum Hyclone(Fisher) SH3008803HI
Triiodo-l-thyronine sodium salt Sigma T6397
Sodium hydroxide Sigma S5881
Fetal RPE media RTEGM kit Life Technologies 195406
Dispase Life Technologies 17105-041
Matrigel BD Biosciences 354277
Phosphate buffered saline Hyclone(Fisher) 10010-023
Trypsin Hyclone(Fisher) 25200-072
Miltenyi Biotec washing buffer StemGent 130-092-987
Miltenyi Biotec rinsing buffer StemGent 130-092-222
Anti-TRA-1-60 microbead kit StemGent 130-095-816
Miltenyi Biotec cell sorter column StemGent 130-021-101
RNeasy micro kit Qiagen 74004
QIA shredder Qiagen 79654
RNA 6000 Pico LabChip kit Agilent G2938-90046
Human miRNA microarray v16 Agilent G4471A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, Z., et al. miRNAs regulate stem cell self-renewal and differentiation. Front Genet. 3, 191 (2012).
  2. Romano, G., et al. A commentary on iPS cell biology: Potential applications in autologous tissue and cell transplantation, development of new models for the study of human pathological conditions and drug screening. J Cell Physiol. 229, 148-152 (2014).
  3. Almeida, P. E., et al. Immunogenicity of pluripotent stem cells and their derivatives. Circ Res. 112, 549-561 (2013).
  4. Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2427-2434 (2009).
  5. Kokkinaki, M., et al. Human induced pluripotent stem-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells exhibit ion transport, membrane potential, polarized vascular endothelial growth factor secretion, and gene expression pattern similar to native RPE. Stem Cells. 29, 825-835 (2011).
  6. Bharti, K., et al. The new paradigm: retinal pigment epithelium cells generated from embryonic or induced pluripotent stem cells. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 21-34 (2011).
  7. Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
  8. Pera, M. F. Stem cells. A new year and a new era. Nature. 451, 135-136 (2008).
  9. Subba Rao, M., et al. Thinking outside the liver: Induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19, 3385-3396 (2013).
  10. Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50, 327-332 (2011).
  11. Lee, K. S., et al. Human sensory neurons derived from induced pluripotent stem cells support varicella-zoster virus infection. PLoS One. 7, (2012).
  12. Alipio, Z., et al. Reversal of hyperglycemia in diabetic mouse models using induced-pluripotent stem (iPS)-derived pancreatic beta-like cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 13426-13431 (2010).
  13. la Cour, M., Tezel, T. The retinal pigment epithelium. Adv Organ Biol. 10, 253-272 (2005).
  14. Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4, (2009).
  15. Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379, 713-720 (2012).
  16. Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 198-209 (2014).
  17. Leonardo, T. R., et al. The functions of microRNAs in pluripotency and reprogramming. Nat Cell Biol. 14, 1114-1121 (2012).
  18. Arora, A., et al. Prediction of microRNAs affecting mRNA expression during retinal development. BMC Dev Biol. 10, (2010).
  19. Huntzinger, E., Izaurralde, E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay. Nat Rev Genet. 12, 99-110 (2011).
  20. Mallanna, S. K., Rizzino, A. Emerging roles of microRNAs in the control of embryonic stem cells and the generation of induced pluripotent stem cells. Dev Biol. 344, 16-25 (2010).
  21. Guo, H., et al. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466, 835-840 (2010).
  22. Adijanto, J., et al. Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) promotes differentiation of human retinal pigment epithelium (RPE) by regulating microRNAs-204/211 expression. J Biol Chem. 287, 20491-20503 (2012).
  23. Hu, G., et al. Identification of miRNA signatures during the differentiation of hESCs into retinal pigment epithelial cells. PLoS One. 7, (2012).
  24. Wilson, K. D., et al. MicroRNA profiling of human-induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 18, 749-758 (2009).
  25. Neveu, P., et al. MicroRNA profiling reveals two distinct p53-related human pluripotent stem cell states. Cell Stem Cell. 7, 671-681 (2010).
  26. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).
  27. Qiagen, miRNeasy Mini Handbook. Sample and Assay Technologies. , (2013).
  28. Microarray System with miRNA Complete Labeling and Hyb Kit. Agilent Technologies. , (2011).
  29. Maintenance of hESCs and hiPSCs in mTESR1 and mTESR2. Stem Cell Technologies. , (2010).
  30. The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. About Biotechnology. , (2013).

Tags

علم الأحياء الجزيئية، العدد 88، الرنا الميكروي، ميكروأري، والخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان، ظهارة الصباغية الشبكية
ملامح التعبير microRNA من خلايا الجذع الإنسان، الشبكية المشتقة من الظهارة الصبغية المحفزة، والجنين الظهارة الصبغية الشبكية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Greene, W. A., Muñiz, A.,… More

Greene, W. A., Muñiz, A., Plamper, M. L., Kaini, R. R., Wang, H. C. MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (88), e51589, doi:10.3791/51589 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter