Summary
De microRNA (miRNA) profielen van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen, retinale pigment epitheel (RPE) afgeleid van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen (iPS-RPE), en foetale RPE, werden vergeleken.
Abstract
Het doel van dit rapport is om de protocollen te beschrijven voor het vergelijken van de microRNA (miRNA) profielen van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen, retinale pigment epitheel (RPE), afkomstig van menselijke iPS cellen (iPS-RPE), en foetale RPE. De protocollen omvatten collectie van RNA voor analyse door middel van microarray, en de analyse van microarray data te miRNAs een differentiële expressie tussen drie soorten cellen te identificeren. De methoden voor de cultuur van iPS cellen en foetale RPE worden toegelicht. Het protocol voor differentiatie van RPE uit menselijke iPS wordt ook beschreven. De RNA-extractie techniek beschrijven we geselecteerd om maximale terugwinning van zeer kleine RNA voor gebruik in een miRNA microarray mogelijk. Tenslotte wordt cellulaire weg en netwerk analyse van microarray data toegelicht. Deze technieken zullen de vergelijking van de miRNA profielen van drie verschillende celtypen vergemakkelijken.
Introduction
Stamcellen hebben het vermogen om te repliceren zonder beperking en kunnen differentiëren in een somatische celtype. De ontwikkeling van technieken om somatische cellen te herprogrammeren in pluripotente stamcellen heeft uitgelokt grote opwinding in de onderzoekswereld en onder clinici, zoals de komst van gepersonaliseerde weefselregeneratie is aan de horizon 1. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen vertonen dezelfde kenmerken van onbegrensde replicatieve potentieel en pluripotency als embryonale stamcellen (ES) cellen, terwijl het omzeilen van de ethische dilemma's in verband met SER. Bovendien zal-patiënt afgeleide stamcellen geen immuunrespons stimuleren aanzienlijke verhoging van de kans op succesvolle therapeutische toepassingen 2-3. Onder specifieke kweekomstandigheden, zijn iPS cellen is aangetoond differentiëren in verschillende celtypes in vitro, zoals cardiomyocyten, neuronen, pancreatische beta-cellen, hepatocyten en retinale pigmentepitheel (RPE) 4-12.
De RPE is een gespecialiseerde laag van gepigmenteerde epitheelcellen aan de achterkant van het netvlies dat verschillende functies die essentieel zijn voor visuele gezondheid en functioneren zoals absorptie van strooilicht, fagocytose van de fotoreceptor buitenste segmenten voert en verwerking van retinoïden voor de productie van visuele chromofoor. Disfunctie van de RPE als gevolg van schade of ziekte beïnvloedt diepgaand gezondheid photoreceptor en visuele functie, zoals blijkt uit de verblindende ziekten die het gevolg zijn van onderliggende RPE pathologie zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), de ziekte van Stargardt, en retinitis pigmentosa (RP) zijn 13. Echt effectieve behandelingen die visie kan herstellen niet zijn verwezenlijkt, en de vervanging van zieke RPE met gezonde RPE kan de beste optie om het verlies van het gezichtsvermogen 14-15 voorkomen. RPE afgeleid van iPS (iPS-RPE) is een mogelijke bron van cellen om de beschadigde RPE vervangen. iPS-RPE uitdrukt kenmerkentic RPE eiwitten LRAT, CRALBP, PEDF en RPE65; geeft de klassieke hoog gepigmenteerde zeshoekig RPE morfologie; RPE en voert functies uit zoals fagocytose, retinoid verwerking en secretie van 11 - cis retinal 5,16. Echter, voordat iPS-RPE therapeutisch kan worden gebruikt, de iPS-RPE moet grondig worden gekarakteriseerd. Inzicht in de factoren die RPE differentiatie regelen moet de opbrengst en zuiverheid van de cellen worden gebruikt voor klinische toepassingen te verbeteren.
Celdifferentiatie is het gevolg van de sterk gereguleerde genexpressie. Epigenetische hermodellering van het genoom en de coördinatie van transcriptiefactoren zijn vereist voor cellot beslissingen die optreden tijdens differentiatie en ontwikkeling 17. Regulering van bericht RNA (mRNA) vertaling door microRNA (miRNA) presenteert nog een ander niveau van regelgeving die cel lot 1 beïnvloedt. MiRNAs zijn kort, ~ 22 nt, lengtes van nucleotiden die ofwel onderdrukken vertaling doorbinden aan de 3 'UTR van mRNA of gewenste mRNA voor de afbraak. MiRNAs zijn ontdekt in vrijwel alle weefsels en tot op heden meer dan 2.000 unieke menselijke microRNAs hebben in de miRBase databank geregistreerd. Omdat miRNAs vereisen slechts gedeeltelijk complementair te binden aan de doelwit mRNA kan een miRNA mogelijk binden aan tientallen of honderden doelen, en vice versa, dat wil zeggen een mRNA kunnen worden gericht door verschillende miRNAs. Dit promiscue bindende eigenschap drastisch verhoogt het niveau van complexiteit van regelgeving, alsmede de moeilijkheidsgraad van het bepalen van de functies van de individuele miRNAs en de rol die elk speelt in cellulaire functies 18-21. Toch hebben studies aangetoond dat miRNA verfijnt genexpressie tijdens de differentiatie door het beïnvloeden van DNA-methylatie status van 17. In een studie specifieker voor het RPE, werd miR-204/211 getoond om de epitheliale fenotype van de RPE 22 bevorderen. Een andere groep analyseerde de miRNA profielvan RPE tijdens differentiatie van ES-cellen en onthulde verschillende sets van miRNA expressie tijdens de differentiatie proces 23. In feite kan miRNA profielen ondubbelzinnig onderscheid celtypen, waaronder ES-cellen, precursorcellen en terminaal gedifferentieerde cellen 24,25. Meer dan 250 miRNAs worden uitgedrukt in het netvlies. Op basis van deze studies, veronderstellen we dat miRNAs spelen een belangrijke rol tijdens de differentiatie van RPE van iPS.
Het doel van dit rapport is om de protocollen voor de differentiatie van RPE beschrijven uit IMR90-4 iPS cellen, de verzameling van RNA voor analyse door middel van microarray, en de analyse van microarray data te miRNAs een differentiële expressie tussen drie soorten cellen, iPS cellen te identificeren , iPS-RPE en foetale RPE. Totaal RNA werd geëxtraheerd uit kweken van elk celtype en gehybridiseerd met een miRNA microarray, probes specifiek voor menselijke miRNAs 1205 en 144 virale miRNAs. De microarray resultaten werden vergelijkend te bepalen welke miRNAs differentieel tot expressie tussen de verschillende celtypen. miRNAs met 2 keer of meer voudige verandering in expressie werden geselecteerd voor verdere analyse. Een miRNA analyse software programma werd gebruikt om potentiële doelwitten van de differentieel tot expressie miRNA's identificeren en mobiele netwerken gereguleerd door de geselecteerde miRNAs genereren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van Cultuur Reagentia en kweekplaten
- mTeSR1 media: Bereid mTeSR1 media volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Dooi 100 ml mTeSR1 5x supplement overnacht bij 4 ° C. Voeg de 100 ml mTeSR1 5x supplement tot 400 ml mTeSR1 basale media en meng goed. Dit materiaal is stabiel bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken bij -20 ° C gedurende 6 maanden.
- Differentiatie media: Bereid differentiatie media DMEM/F12 tot 0,1 mM β-mercaptoethanol, 0,1 mM niet-essentiële aminozuren, 2,0 mM L-glutamine, 10% knockout serum en 10 ug / ml gentamicine verkregen.
- iPS-RPE media: Bereid iPS-RPE media in MEM om 1x N1 supplement, 0,1 mM niet-essentiële aminozuren, 250 ug / ml taurine, 13 ng / ml trijood-L-thyronine natriumzout, 20 ng / ml hydrocortison, 5 ug opleveren / ml gentamicine en 15% FBS 26.
- Trijood-L-thyronine natriumzout stamoplossing. Om stockoplossing te bereiden oplossen 1,0 mg trijood-L-thyroninenatriumzout in 1 N natriumhydroxide onder voorzichtig schudden. Voeg vervolgens 49,0 ml basismedium aan 50,0 ml van 20 ug / ml trijood-L-thyronine natriumzout maken. Aliquots en invriezen bij -20 ° C totdat het nodig is. Gebruik de juiste hoeveelheid om de gewenste concentratie te bereiken in de uiteindelijke kweekmedium.
- Hydrocortison voorraad oplossing: Om een hydrocortison stockoplossing te bereiden, oplosbaar te maken 1 mg hydrocortison in 1 ml absolute ethanol door voorzichtig schudden. Voeg vervolgens 19,0 ml basismedium 20 ml hydrocortison voorraadoplossing van 50 ug / ml. hoeveelheid en bevriezen bij -20 ° C totdat het nodig is. Gebruik geschikte volume op de gewenste concentratie te bereiken in het uiteindelijke kweekmedium.
- Foetale RPE groeimedium. Bereid de groeimedia door mengen van alle reagentia in de kit RTEGM in de basale media, volgens de aanwijzingen van de fabrikant behalve de FBS.
- Foetale RPE plating media. Bereid plating media door overbrengen van een kleine hoeveelheid groeimedium een steriele houder en eendd FBS tot een uiteindelijke concentratie van 2%.
- Dispase: Bereid werkende oplossing van dispase van 1 mg / ml in DMEM/F12.
- Matrigel beklede platen: Bereid matrigel in DMEM/F12 tot 0,08 mg / ml.
- Coat elk putje van een 6-wells plaat met 1,0 ml van het matrigel oplossing.
- Incubeer de beklede platen bij kamertemperatuur gedurende 1,0 uur.
- Na de 1,0 uur incubatie, zuig het overtollige DMEM/F12.
- Voeg 0,5 ml mTeSR1 media om uitdrogen te voorkomen. De matrigel beklede platen zijn nu klaar voor gebruik.
2. IPS Cultuur
- Voorafgaand aan iPS cel zaaien hebben alle buizen, warm mTESR1 media tot kamertemperatuur en de matrigel beklede platen klaar.
- Snel ontdooien de IMR90-4 iPS cellen in een 37 ° C waterbad. Verwijder vervolgens de cryovial uit het waterbad en steriliseer het gebruik 70% ethanol.
- Breng de cellen om een 15 ml conische buis met een pipet 2 ml tot breken van cel aggregaten minimaliseren.
- Druppelsgewijs voeg 5 ml warm mTeSR1 media om de cellen en meng. Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant.
- Resuspendeer zorgvuldig de cel aggregaten in 2 ml mTeSR1 media en zaad van de cellen op een putje van een zes goed plaat.
- Plaats de plaat in een 37 ° C incubator cultuur met 5% CO2, 95% vochtigheid.
- Verander dagelijks de iPS celcultuur media. Ongedifferentieerde kolonies verschijnen 5-7 dagen na het zaaien. Controleer voor ongedifferentieerde kolonies die klaar zijn voor passage (kolonies met een dichte centrum) zijn.
3. Passage van iPS cellen
- Vóór begin tot de passage iPS cellen hebben alle buizen, dispase oplossing DMEM/F12 en mTERS1 media opgewarmd tot kamertemperatuur en de Matrigel beklede platen klaar.
- Vóór passage van iPS cellen, verwijder alle gebieden van differentiatie door schrapen het gebied en het opzuigen van de media. Differentiatie dient beneden 20% van de put blijven hoogkwaliteit culturen. Roer voorzichtig de iPS-cel die goed met 2 ml DMEM/F12 en voeg 1 ml van 1 mg / ml dispase aan elk putje.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 7 minuten. Zuig het dispase en voorzichtig spoel de cel kolonies met 2 ml DMEM/F12 tweemaal.
- Na spoelen, voeg 2 ml mTSER1 aan elk putje.
- Met behulp van een pipet 5 ml voorzichtig schrapen de kolonies van de plaat om aggregaten te vormen.
- Breng de vrijstaande kolonies om een 15 ml conische buis. Voeg voldoende mTeSR1 media naar de volgende passage van cellen zaad.
4. Differentiatie van iPS cellen om iPS-RPE
- Plate de iPS cellen op een nieuw bedekt plaat in mTESR1 media.
- Laat iPS cel kolonies om uit te breiden voor 4-5 dagen in de cultuur.
- Plaatsvervanger mTeSR1 media met 4 ml differentiatie media. Wijzig de helft van de media om de 3 dagen.
- Laat gepigmenteerde foci te groot genoeg om handmatig worden ontleed uit de cultuur (40-50 dagen) groeien.
- Gebruik een200 ul pipet tip om rond te snijden en til de gepigmenteerde kolonies.
- Verzamelen en bundelen de ontleed kolonies in een 15 ml conische buis.
- Voeg vervolgens 5 ml DMEM/F12 de gepoolde RPE cellen en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten tweemaal.
- Bereid een enkele cel oplossing door incubatie van de gepoolde iPS-RPE met 0,25% trypsine-EDTA.
- Spoel de iPS-cellen RPE met iPS-RPE media en het bord van de verzamelde cellen op een verse-matrigel gecoat goed in 4 ml van iPS-RPE media.
- Kweek van de cellen gedurende 3 weken voorafgaand aan passage. Wijzig de media om de 3 dagen. Voor het experiment, plaat iPS-RPE bij 100.000 cellen / cm 2. Verzamel cellen op dag 17. Tel de dag van het zaaien als dag 0.
5. Monsterneming
- iPS Cell Collection
- De cultuur van de iPS cellen tot ongedifferentieerde kolonies worden waargenomen dicht bij het centrum te zijn.
- Spoel de kolonies in DMEM/F12.
- Scheiden in afzonderlijke cellen met behulp accutas e. Verzamel de cellen in een 15 ml conische buis en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten. Aspireren supernatant. Resuspendeer in 2 ml DMEM/F12.
- Foetale RPE Collection
- Spoel Foetale RPE celculturen met DMEM/F12 en dissocieren in enkele cellen met behulp van 0,25% trypsine-EDTA.
- Verzamel de cellen in een 15 ml conische buis. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten. Aspireren supernatant. Resuspendeer in 2 ml DMEM/F12.
- iPS-RPE Cell Collection
- Wanneer de iPS-RPE bereiken doorgang 3 en doorgang 5, het verzamelen van de cellen op dag 17 na passage. Spoel iPS-RPE tweemaal in PBS en bereiden een enkele celsuspensie door incubatie met 1,0 ml van 0,25% trypsine.
- Neutraliseren trypsine met 2 ml ijskoud iPS-RPE media.
- Verzamel de cellen in een 15 ml conische buis en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten. Aspireren supernatant.
- Resuspendeer de cel suspensie in 3 ml kleurbuffer van microbead kit.
- Houd alle reagentia bij 4 ° C tot gebruik, maar werken niet op ijs. Centrifugeer celsuspensie uit stap 5.3.4 bij 300 xg gedurende 5 minuten. Aspireren supernatant.
- Resuspendeer cellen in 100 ul vlekken buffer van microbead set per 2 x 10 6 cellen.
- Voeg 10 ul van anti-TRA-1-60-PE antilichaam per 2 x 10 6 cellen.
- Goed mengen en incuberen bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
- Was de cellen in 1-2 ml buffer per 2 x 10 6 cellen. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g. Aspireren supernatant.
- Resuspendeer cellen in 80 ui kleurbuffer per 2 x 10 6 cellen. Voeg 20 ul van anti-PE gelabelde microbolletjes (vanaf kit) per 2 x 10 6 cellen. Meng goed. Incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C.
- Voeg 1-2 ml vlekken buffer per 2 x 10 6 cellen. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g. Aspireren supernatant.
- Resuspendeer cellen in 500 & #956, l vlekken buffer.
- Magnetische celscheiding:
- Plaats kolom in magnetische cel sorteerder. Kolom spoelen met 3 ml vlekken buffer.
- Solliciteer celsuspensie van 6,8 op kolom.
- Plaats een buis aan de negatieve haven naar de TRA-1-60 negatieve cellen te verzamelen.
7. Totaal RNA extractie
- Lyseren van de cellen door het uitvoeren van de monsters met een in de handel verkrijgbaar microcentrifuge homogenisator mini spinkolom ontworpen voor nucleïnezuur minipreps.
- Extract totaal RNA van iPS cellen, iPS-RPE, en foetale RPE met de commercieel verkrijgbare RNA-extractie kit ontworpen om kleine RNA-moleculen 27 te behouden.
- Bepaal totaal RNA-concentraties met een Nanodrop spectrofotometer.
8. Bioanalyzer en Microarray Assay
- Controleer de RNA integriteit met Bioanalyzer in combinatie met commercieel verkrijgbare RNA kwaliteit kit.
- Incubate 100 ngtotaal RNA met kalf intestinaal fosfatase bij 37 ° C gedurende 30 min
- Denatureren het RNA met 100% DMSO bij 100 ° C gedurende 5 minuten.
- Label de monsters met PCP-Cy3 met T4 ligase door incubatie bij 16 ° C gedurende 1 uur.
- Hybridiseren op een 8_x_15K formaat menselijke miRNA array.
- Was de arrays volgens de instructies van de fabrikant en scannen met een resolutie van 5 urn met een scanner.
- Verwerven van gegevens met behulp van microarray feature extractie software die compatibel is met de miRNA microarray.
- Verwerk de miRNA signalen naar het relatieve expressieniveau in elk monster te bepalen.
- Vergelijk de expressieniveaus van elk miRNA tussen de monstergroepen. Selecteer miRNAs met tenminste tweevoudig differentiële expressie voor verdere analyse.
- Met behulp van in de handel verkrijgbare software voor data-analyse, volgt u de instructies om warmte kaarten voor visualisatie van differentieel tot expressie miRNAs 28 genereren.
9. Pathway Analysis
- Gegevens op te slaan van de gekozen 8.9 in Excel-formaat miRNAs.
- Log in op de online RNA pathway-analyse programma. Upload het Excel-bestand. Selecteer "Flexibele Format" voor bestandsindeling en selecteer "Agilent" uit de keuzelijst voor het type identifier.
- Onder ruwe gegevens post, toewijzen "ID" naar ID-kolom sonde en wijs "Observatie 1" en "log-ratio" naar de kolom log rantsoen. Selecteer "negeren" voor alle andere kolommen.
- Selecteer de parameters voor de analyse als volgt: Vertrouwen: alleen experimenteel waargenomen; omvatten directe en indirecte relaties; en omvatten endogene chemicaliën; Selecteer de Ingenuity Kennisbank als referentie set. Kies de database van referentie-moleculen die gegevens van alle soorten, alle cellijnen en weefsels en alle mutaties omvat.
- Run netwerk en pathway-analyses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
iPS-cellen (Figuur 1A) werden gekweekt in differentiatie voorwaarden om differentiatie te induceren in iPS-cellen RPE. De iPS-RPE tentoongesteld klassieke RPE fenotype van zeshoekige gepigmenteerde cel morfologie (Figuur 1B), vergelijkbaar met foetale RPE (figuur 1C).
Om een beter inzicht in de rol die miRNA kan spelen tijdens het proces van differentiatie van iPS iPS-RPE, microarray analyse van miRNA expressie werd uitgevoerd. Totaal RNA werd verzameld uit iPS cellen, foetale RPE, en iPS-RPE met de Mirvana miRNA isolatie kit om maximaal behoud van kleine RNA's te verzekeren. Het RNA werd gekwantificeerd en getest op zuiverheid voordat hybridisatie met de microarray LabChip. Sondes die 1205 menselijke en 144 virale miRNAs werden gebruikt om miRNA expressie te analyseren vanuit elk monster set. De signalen werden geanalyseerd om de relatieve expressieniveaus van elke miRNA uit elk monster. De gegevens werden gebruikt voor het vergelijken van de miRNA e xpression profiel van iPS-RPE om iPS en foetale RPE. Heat maps werden gegenereerd om visualisatie van differentiële miRNA expressie tussen de groepen (Figuur 2A) in te schakelen. 83 miRNAs die differentieel tot expressie in de iPS opzichte van iPS-RPE, met 47 miRNAs gereguleerd in de iPS opzichte van iPS-RPE, en 36 downregulated in de iPS (Figuur 2B). 110 miRNAs werden differentieel tot expressie in foetale RPE vergelijking met iPS-RPE, met 61 miRNAs gereguleerd in de fRPE en 49 downregulated in de fRPE opzichte van iPS-RPE (figuur 2C). Pathway-analyse met Ingenuity IPA software aangegeven het differentieel tot expressie miRNA doel transcripten voor genen die betrokken zijn bij de cellulaire ontwikkeling, groei, proliferatie en overleving, celcyclus, en cellulaire beweging. MiRNAs uitgedrukt in oculaire weefsels in vivo bleken te zijn verrijkt iPS-RPE en foetale RPE opzichte iPS (figuren 3 en 4).
t "fo: keep-together.within-page =" altijd ">
Figuur 1. Brightfield afbeeldingen van iPS, foetale RPE, en iPS-RPE. Brightfield beelden (100X) van iPS cellen voorafgaand aan differentiatie, foetale RPE en RPE afgeleid van iPS. Zowel de foetale RPE en iPS-RPE tonen klassieke RPE morfologie van zeshoekige vorm en pigmentatie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. MiRNA expressie profiel van iPS-RPE vergelijking met iPS en foetale RPE. A) Heat kaarten tonen de relatieve mate van differentiële expressie van miRNAs. De kleurschaal staat voor de expressie van de miRNA zoals hierboven (rood), onder (groen), of op het gemiddelde expressieniveau (zwart) in alle monsters. B) Vergelijking van miRNA profielen van iPS-RPE om iPS cellen. C) Vergelijking van miRNA profielen van iPS-RPE foetale RPE. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. A) netwerk analyse van de miRNA expressie profielen van de ouderlijke iPS cellen ten opzichte van de iPS-afgeleide RPE. De top 4-netwerken worden apart vermeld (links) en samengevoegd (midden). B) Pathway analyse van differentieel tot expressie miRNAs. Please klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. A) netwerk analyse van de miRNA expressie profielen van foetale RPE ten opzichte van de iPS-afgeleide RPE. De top 7-netwerken worden apart vermeld (links) en samengevoegd (midden). B) Pathway analyse van differentieel tot expressie miRNAs. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kortom, dit rapport beschrijft de methoden die worden gebruikt om de cultuur iPS cellen, iPS-RPE, en foetale RPE. RPE afgeleid van iPS zijn morfologisch en functioneel vergelijkbaar met foetale RPE. De iPS-RPE spreekt ook kenmerkend RPE genen waaronder RPE65, CRALBP, PEDF en LRAT 16. Om verder te karakteriseren deze cellen, werd RNA geëxtraheerd en gebruikt om microarray-analyse uit te voeren om differentieel tot expressie miRNA identificeren. Analyse van het signaal intensiteiten bleek dat het grootste aantal van differentieel tot expressie miRNAs werd gedetecteerd in de foetale RPE versus iPS-RPE vergelijkingen, wat suggereert dat de iPS-RPE kan meer volwassen zijn. Toekomstige studies zijn gepland om deze resultaten te valideren met RT-PCR.
Er zijn verschillende kritische punten in dit experiment die zorgvuldig moet worden uitgevoerd om het succes van de bepaling en de verwerving van nauwkeurige gegevens. De eerste belangrijke stap optreedt tijdens de kweek van de iPS cellen. iPS cellen moeten in een plu blijvenripotent staat om hun stemness behouden. De cellen moeten zorgvuldig per dag worden gecontroleerd op tekenen van differentiatie. Ongedifferentieerde iPS cellen groeien zo compact meercellige kolonies. De cellen moeten een hoge nucleaire cytoplasma verhouding en prominente nucleoli hebben. De iPS kolonies worden gekenmerkt door een duidelijke grens, met verscheidene lagen cellen in het midden. Tekenen van differentiatie zijn verlies van bepaalde kolonie grenzen, niet-uniforme cel morfologie, en de verschijning van de hand liggende soorten cellen, zoals neuronen en fibroblasten. Enkele cellen die gedifferentieerd kunnen worden verwijderd door Dispase en spoelen echter kolonies met deze kenmerken handmatig worden verwijderd uit de kweek 29.
Voorbereiding van RNA voor microarray analyse is de volgende belangrijke stap. Inconsistent RNA kwaliteit is een belangrijke bron van variabiliteit in microarray data. RNA-extractie moet hoog molecuulgewicht en minimaal gedegradeerde RNA voor de beste resultaten op. GeslaagdRNA-extractie zal totaal RNA opbrengst met minimale degradatie en vrij van verontreinigende RNases. Na de bepaling van de RNA-concentratie spectrofotometrisch bij 260 nm, moet de zuiverheid van het monster bepaald bij 230 en 280 nm om verontreiniging te detecteren met polysacchariden of eiwitten. De 230:260:280 verhouding voor RNA moeten 01:02:01 hoge kwaliteit RNA geven zonder verontreiniging 30.
Bij het plannen van de microarray experiment de meest kritische stap is de opname van negatieve controles te zorgen voor de hybridisatie met de probes specifiek, en elk monster in drievoud om te verzekeren dat de gedetecteerde signalen zijn geldig voor het sample set. Tijdens de analyse van de microarray resultaten, een belangrijk punt is achtergrondcorrectie, waarbij de achtergrondruis wordt afgetrokken van het waargenomen signaal naar de werkelijke signaalintensiteit voor elke specifieke probe geven. Deze stap zal elimineren valse positieven, terwijl aandacht voor de echte positieve signalen. </ P>
Tenslotte werd netwerk en traject analyse van de microarray resultaten, de belangrijkste stap is om de juiste parameters en filters voor het uitvoeren van de analyse vastgesteld. Deze stap zal bepalen welke bestanden worden gebruikt door de software om de netwerken te genereren en identificeren van cellulaire routes die worden beïnvloed door de getoonde differentieel uitgedrukt in vergelijkingen miRNAs.
Na verwerving van gegevens met de in dit verslag beschreven werkwijzen, moet de beperkingen van deze analyses overwegen bij de interpretatie van de resultaten. Hoewel dit onwaarschijnlijk is, blijft het mogelijk dat de RPE cultuur is niet een homogene populatie van RPE cellen. De anti-TRA-1-60 sorteerproces is een negatief selectieproces dat de cellen die nog uitdrukken stamcel markers verwijdert; maar het is geen garantie voor de resterende cellen zijn pure RPE cellen. Hoewel morfologisch de cellen vertonen klassieke RPE morfologie van pigmentatie eennd veelhoekige celvorm, is het mogelijk dat niet alle cellen RPE.
Microarray experimenten kan valse positieven produceren voor de expressie van RNA, met name bij microRNA door het korte sequenties. Hoewel de microarray wordt gebruikt voor dit experiment opgenomen verschillende probes op verschillende gebieden van elk doel richten, moeten de resultaten steeds gevalideerd door qRT-PCR.
Analyse van microarray data door Ingenuity IPA is afhankelijk van de hoeveelheid en de kwaliteit van de informatie in de Ingenuity databank. Veel informatie over genfunctie en cellulaire routes wordt afgeleid uit experimenten met getransformeerde cellijnen of in het kader van kankeronderzoek. Derhalve zijn de resultaten van route en netwerkanalyse gebruik van dit programma niet altijd relevant primaire cellen of, in dit geval, stamcellen.
Ondanks deze beperkingen, kunnen de in dit rapport beschreven methoden worden gebruikt voorcultuur van iPS cellen en foetale RPE, voortvloeiende RPE van iPS cellen, en extractie van RNA voor microarray analyse van miRNA. De door deze testen gegevens kunnen worden gebruikt om miRNAs betrokken bij de differentiatie te identificeren, evenals die RPE functies reguleren.
Hoewel meer miRNAs bleken verschillend tot expressie in de foetale RPE vs iPS-RPE vergelijking dan in de iPS vs iPS-RPE vergelijking, er zijn vele mogelijke redenen voor. Allereerst, in de tijd dat deze werd uitgevoerd, de miRNA microarray platform was het opsporen 1.205 mensen en 144 virale miRNAs. Sinds die tijd heeft het platform uitgebreid met probes voor meer dan 2000 menselijke miRNAs omvatten. Het is zeker mogelijk dat de miRNA differentiële expressie profielen zal veranderen als er meer miRNA's worden gedetecteerd. Van de 1.349 miRNAs gedetecteerd door deze test meeste miRNAs vertoonden geen verschil in expressie tussen de celtypen (figuren 2B en 2C
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De meningen of beweringen hierin zijn de particuliere standpunten van de auteurs en zijn niet te worden opgevat als ambtenaar of als een afspiegeling van de opvattingen van het Ministerie van het Leger of het ministerie van Defensie.
Dit onderzoek werd uitgevoerd terwijl de auteurs Whitney A. Greene, Alberto Muñiz en Ramesh R. Kaini hield een National Research Council Postdoctoraal Research Associate bij de USAISR.
Microarray testen werden uitgevoerd door de Greehey Children's Cancer Research Institute Microarray Core Facility en Bioinformatica afdeling UT Health Science Center in San Antonio.
Dit werk werd ondersteund door de US Army Klinische Revalidatie Geneeskunde Research Program (CRMRP) en Militaire Operationele Medicine Research Program (MOMRP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-β-mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Fetal RPE media RTEGM kit | Life Technologies | 195406 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Trypsin | Hyclone(Fisher) | 25200-072 | |
| Miltenyi Biotec washing buffer | StemGent | 130-092-987 | |
| Miltenyi Biotec rinsing buffer | StemGent | 130-092-222 | |
| Anti-TRA-1-60 microbead kit | StemGent | 130-095-816 | |
| Miltenyi Biotec cell sorter column | StemGent | 130-021-101 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | |
| RNA 6000 Pico LabChip kit | Agilent | G2938-90046 | |
| Human miRNA microarray v16 | Agilent | G4471A |
References
- Yu, Z., et al. miRNAs regulate stem cell self-renewal and differentiation. Front Genet. 3, 191 (2012).
- Romano, G., et al. A commentary on iPS cell biology: Potential applications in autologous tissue and cell transplantation, development of new models for the study of human pathological conditions and drug screening. J Cell Physiol. 229, 148-152 (2014).
- Almeida, P. E., et al. Immunogenicity of pluripotent stem cells and their derivatives. Circ Res. 112, 549-561 (2013).
- Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2427-2434 (2009).
- Kokkinaki, M., et al. Human induced pluripotent stem-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells exhibit ion transport, membrane potential, polarized vascular endothelial growth factor secretion, and gene expression pattern similar to native RPE. Stem Cells. 29, 825-835 (2011).
- Bharti, K., et al. The new paradigm: retinal pigment epithelium cells generated from embryonic or induced pluripotent stem cells. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 21-34 (2011).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Pera, M. F. Stem cells. A new year and a new era. Nature. 451, 135-136 (2008).
- Subba Rao, M., et al. Thinking outside the liver: Induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19, 3385-3396 (2013).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50, 327-332 (2011).
- Lee, K. S., et al. Human sensory neurons derived from induced pluripotent stem cells support varicella-zoster virus infection. PLoS One. 7, (2012).
- Alipio, Z., et al. Reversal of hyperglycemia in diabetic mouse models using induced-pluripotent stem (iPS)-derived pancreatic beta-like cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 13426-13431 (2010).
- la Cour, M., Tezel, T. The retinal pigment epithelium. Adv Organ Biol. 10, 253-272 (2005).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4, (2009).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379, 713-720 (2012).
- Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 198-209 (2014).
- Leonardo, T. R., et al. The functions of microRNAs in pluripotency and reprogramming. Nat Cell Biol. 14, 1114-1121 (2012).
- Arora, A., et al. Prediction of microRNAs affecting mRNA expression during retinal development. BMC Dev Biol. 10, (2010).
- Huntzinger, E., Izaurralde, E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay. Nat Rev Genet. 12, 99-110 (2011).
- Mallanna, S. K., Rizzino, A. Emerging roles of microRNAs in the control of embryonic stem cells and the generation of induced pluripotent stem cells. Dev Biol. 344, 16-25 (2010).
- Guo, H., et al. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466, 835-840 (2010).
- Adijanto, J., et al. Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) promotes differentiation of human retinal pigment epithelium (RPE) by regulating microRNAs-204/211 expression. J Biol Chem. 287, 20491-20503 (2012).
- Hu, G., et al. Identification of miRNA signatures during the differentiation of hESCs into retinal pigment epithelial cells. PLoS One. 7, (2012).
- Wilson, K. D., et al. MicroRNA profiling of human-induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 18, 749-758 (2009).
- Neveu, P., et al. MicroRNA profiling reveals two distinct p53-related human pluripotent stem cell states. Cell Stem Cell. 7, 671-681 (2010).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).
- Qiagen, miRNeasy Mini Handbook. Sample and Assay Technologies. , (2013).
- Microarray System with miRNA Complete Labeling and Hyb Kit. Agilent Technologies. , (2011).
- Maintenance of hESCs and hiPSCs in mTESR1 and mTESR2. Stem Cell Technologies. , (2010).
- The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. About Biotechnology. , (2013).
