Summary
Le profil des souches d'origine humaine pluripotentes (iPS), l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dérivées de l'homme induit-souches pluripotentes (iPS) (iPS-RPE), et RPE fœtale microARN (miARN), ont été comparés.
Abstract
L'objectif de ce rapport est de décrire les protocoles pour comparer le profil des anthropique-souches pluripotentes (iPS), l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dérivées de cellules iPS humaines (iPS-RPE), et RPE fœtale microRNA (miRNA). Les protocoles comprennent la collecte de l'ARN pour l'analyse par puces à ADN, et l'analyse des données de puces à ADN pour identifier les miARN qui sont exprimés de manière différentielle entre trois types de cellules. Les méthodes de culture de cellules iPS et RPE fœtale sont expliqués. Le protocole utilisé pour la différenciation de l'EPR de iPS humaines est également décrite. La technique d'extraction d'ARN, nous décrivons a été choisie pour permettre une récupération maximale de l'ARN très faible pour une utilisation dans un microréseau miARN. Enfin, voie cellulaire et l'analyse du réseau de données de puces à ADN est expliqué. Ces techniques vont faciliter la comparaison des profils de miARN de trois types de cellules différents.
Introduction
Les cellules souches ont la capacité de se répliquer sans limite et le potentiel de se différencier en n'importe quel type de cellules somatiques. Le développement des techniques de reprogrammer des cellules somatiques en cellules souches pluripotentes a suscité beaucoup d'enthousiasme dans la communauté des chercheurs et des cliniciens, comme l'avènement de la régénération des tissus personnalisé à l'horizon 1. Induire-souches pluripotentes (iPS) présentent les mêmes caractéristiques de potentiel réplicatif illimité et pluripotence comme souches embryonnaires (ES) des cellules tout en contournant les dilemmes éthiques liés à la CES. En outre, les cellules souches provenant de patients ne seront pas stimuler une réponse immunitaire, ce qui augmente considérablement la probabilité de succès des applications thérapeutiques 3.2. Dans des conditions de culture spécifiques, les cellules iPS ont été montrés pour se différencier en plusieurs types différents de cellules in vitro, y compris les cardiomyocytes, les neurones, les cellules bêta pancréatiques, des hépatocytes, et l'épithélium pigmentaire rétinien (RPE) 4-12.
La RPE est une couche de cellules epitheliales spécialisées pigmentés situés à l'arrière de la rétine qui exécute plusieurs fonctions qui sont essentielles pour la santé visuelle et fonction telle que l'absorption de la lumière parasite, la phagocytose des segments externes des photorécepteurs, et le traitement des rétinoïdes pour la production de chromophore visuelle. Le dysfonctionnement de l'EPR en raison de dommages ou maladie affecte profondément la santé des photorécepteurs et la fonction visuelle comme en témoignent les maladies cécitantes qui sont le résultat de la pathologie de l'EPR sous-jacente comme la dégénérescence liée à l'âge (DMLA), la maladie de Stargardt et la rétinite pigmentaire (RP) 13. Traitements vraiment efficaces qui peuvent restaurer la vision n'ont pas été atteints, et le remplacement des RPE malade avec sain RPE peut être la meilleure option pour éviter la perte de vision 14-15. EPR dérivé de cellules iPS (iPS-RPE) est une source possible de cellules pour remplacer l'EPR endommagé. iPS-RPE exprime caracprotéines RPE tic LRAT, CRALBP, PEDF, et RPE65; affiche la classique fortement pigmentée hexagonale RPE morphologie; et exerce des fonctions RPE comme la phagocytose, le traitement rétinoïde, et la sécrétion de 11 - 5,16 rétinienne cis. Toutefois, avant iPS-RPE peut être utilisé en thérapeutique, l'IPS-RPE doit être caractérisée à fond. La compréhension des facteurs qui régissent différenciation RPE est nécessaire d'améliorer le rendement et la pureté des cellules pour être utilisé pour des applications cliniques.
La différenciation cellulaire est le résultat de l'expression des gènes fortement réglementé. Remodelage épigénétique du génome et de la coordination des facteurs de transcription sont requis pour les décisions du destin cellulaire qui se produisent lors de la différenciation et de développement 17. Règlement de message de l'ARN (ARNm) traduction par les microARN (miARN) présente encore un autre niveau de la réglementation qui affecte le destin des cellules 1. MiRNAs sont courtes, ~ 22 nt, longueurs de nucléotides qui soit la traduction suppress parla liaison à la 3 'UTR de l'ARNm ou de cibler l'ARNm de la dégradation. MiRNAs ont été détectés dans pratiquement tous les tissus et à ce jour plus de 2000 microARN humains uniques ont été enregistrés dans la base de données miRBase. Depuis miARN exigent complémentarité partielle de se lier à l'ARNm cible, un seul miARN peut potentiellement se lier à des dizaines ou des centaines de cibles, et vice versa, c'est à dire un seul ARNm peut être visé par plusieurs miARN différents. Cette caractéristique de liaison promiscuité augmente considérablement le niveau de complexité de la réglementation ainsi que le niveau de difficulté de déterminer les fonctions de miARN individuels et le rôle de chacun dans les fonctions cellulaires 18-21. Néanmoins, des études ont montré que les miARN affine l'expression des gènes lors de la différenciation en affectant le statut de méthylation d'ADN 17. Dans une étude plus spécifique de l'EPR, miR-204/211 a été montré pour promouvoir le phénotype épithélial de l'EPR 22. Un autre groupe a analysé le profil miRNAde RPE cours de la différenciation des cellules ES et révélé ensembles distincts de miARN sont exprimés au cours du processus de différenciation 23. En fait, les profils de miARN peuvent clairement distinguer les types de cellules, y compris les cellules souches embryonnaires, des cellules précurseurs et des cellules à différenciation terminale 24,25. Plus de 250 miARN sont exprimés dans la rétine. Sur la base de ces études, nous faisons l'hypothèse que les miARN jouent un rôle important au cours de la différenciation des RPE de iPS.
L'objectif de ce rapport est de décrire les protocoles pour la différenciation des RPE de IMR90-4 cellules iPS, collection de l'ARN pour l'analyse par puces à ADN, et l'analyse des données de puces à ADN pour identifier les miARN qui sont exprimés de manière différentielle entre trois types de cellules, les cellules iPS , iPS-RPE et RPE fœtale. L'ARN total a été extrait à partir de cultures de chaque type de cellule et hybride à une puce à ADN miRNA, contenant des sondes spécifiques pour 1205 miARN humains et 144 miARN viraux. Les résultats de puces à ADN ont été comparerd pour déterminer le miARN ont été exprimés de façon différentielle entre les différents types cellulaires. miARN avec 2 fois ou plus facteur de variation de l'expression ont été sélectionnés pour une analyse plus approfondie. Un logiciel d'analyse miARN a été utilisé pour identifier des cibles potentielles des miARN exprimés de manière différentielle et de générer des réseaux cellulaires régulés par les miARN sélectionnés.
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Protocol
1. Préparation de la Culture Réactifs et Culture Plaques
- mTeSR1 médias: Préparer médias mTeSR1 selon les instructions du fabricant. Décongeler 100 ml de supplément mTeSR1 5x nuit à 4 ° C. Ajouter 100 ml de supplément mTeSR1 5x 400 ml de mTeSR1 milieux de base et bien mélanger. Ce support est stable à 4 ° C pendant jusqu'à 2 semaines et à -20 ° C pendant 6 mois.
- médias de différenciation: Préparez le support de différenciation dans DMEM/F12 pour obtenir 0,1 mM β-mercaptoéthanol, 0,1 mM acides aminés non essentiels, 2,0 mM de L-glutamine, sérum de KO de 10%, et 10 pg / ml de gentamicine.
- iPS-RPE médias: Préparer médias iPS-RPE dans MEM pour donner supplément 1x N1, 0,1 mM acides aminés non essentiels, 250 ug / taurine ml, ml de sel de sodium de 13 ng / triiodo-L-thyronine, 20 ng / ml d'hydrocortisone, 5 ug / ml de gentamicine, 15 et 26% de FBS.
- Sel de sodium solution stock triiodo-L-thyronine. Pour préparer la solution mère dissoudre 1,0 mg de triiodo-L-thyroninesel de sodium 1 N dans de l'hydroxyde de sodium en remuant doucement. Suivant ajouter 49,0 ml de milieu de base pour faire 50,0 ml de 20 pg / ml de sel de sodium triiodo-L-thyronine. Préparer des aliquotes et congeler à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire. Utiliser un volume approprié pour atteindre la concentration souhaitée dans les milieux de culture final.
- Hydrocortisone solution stock: Pour préparer une solution stock d'hydrocortisone, solubiliser 1 mg d'hydrocortisone dans 1 ml d'éthanol absolu par agitation douce. Ensuite, ajoutez 19,0 ml de milieu de base pour 20 ml d'hydrocortisone solution stock de 50 pg / ml. aliquoter et congeler à -20 ° C jusqu'à utilisation. Utiliser un volume approprié pour obtenir la concentration désirée dans le milieu de culture final.
- Milieu de croissance de RPE foetal. Préparer le milieu de croissance en mélangeant tous les réactifs dans le kit RTEGM dans le milieu de base, selon les instructions du fabricant, sauf pour le FBS.
- Fœtale médias RPE de placage. Préparer des milieux placage par transfert d'une petite quantité de milieu de croissance dans un récipient stérile et d'unedd FBS à une concentration finale de 2%.
- Dispase: Préparer la solution de travail de dispase de 1 mg / ml dans DMEM/F12.
- Matrigel plaques enduites: Préparer matrigel dans DMEM/F12 à 0,08 mg / ml.
- Manteau de chaque puits d'une plaque à 6 puits avec 1,0 ml de la solution de Matrigel.
- Incuber les plaques revêtues à la température ambiante pendant 1,0 h.
- Après l'incubation de 1,0 heures, aspirer l'excédent DMEM/F12.
- Ajouter 0,5 ml de milieu mTeSR1 pour éviter le séchage. Les plaques de matrigel enduit sont maintenant prêts à être utilisés.
2. IPS Culture
- Avant iPS cellules semis ont tous les tubes, les médias mTESR1 chaud à la température ambiante, et les matrigel plaques enduites de prêts.
- Dégeler rapidement les cellules iPS IMR90-4 dans un bain d'eau à 37 °. Ensuite, retirer le tube cryogénique du bain d'eau et stériliser en utilisant 70% d'éthanol.
- Transférer les cellules dans un tube conique de 15 ml à l'aide d'une pipette 2 ml de réduire au minimum la rupture des agrégats cellulaires.
- Goutte à goutte, ajoutez 5 ml de warm médias mTeSR1 aux cellules et mélanger délicatement. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à température ambiante et retirer le surnageant.
- Remettre en suspension soigneusement les agrégats de cellules dans 2 ml de milieu mTeSR1 et épépiner les cellules sur un puits d'une plaque de six puits.
- Placer la plaque dans un incubateur et la culture à 37 ° avec 5% de CO2, 95% d'humidité.
- Changer les milieux de culture de cellules iPS quotidien. Colonies indifférenciées apparaissent 5-7 jours après le semis. Vérifiez colonies indifférenciées qui sont prêts pour le passage (colonies avec un centre dense).
3. Repiquage des cellules iPS
- Avant de commencer le passage des cellules iPS, ont tous les tubes, solution dispase, DMEM/F12 et mTERS1 médias réchauffé jusqu'à la température ambiante, et le matrigel revêtu des plaques prêtes.
- Avant de passage de cellules iPS, retirez tous les domaines de la différenciation en grattant la zone et aspirer les médias. La différenciation devrait rester en dessous de 20% du bien pour une grandecultures de qualité. Rincer soigneusement le contenant des cellules iPS-bien avec 2 ml DMEM/F12 et ajouter 1 ml de 1 mg / ml dispase à chaque puits.
- Incuber à 37 ° C pendant 7 min. Aspirer la dispase et rincer délicatement les colonies de cellules avec 2 ml de DMEM/F12 deux fois.
- Après rinçage, ajouter 2 ml de mTSER1 à chaque puits.
- L'utilisation d'un pipette de 5 ml gratter doucement les colonies de la plaque pour former des agrégats.
- Transférer les colonies individuelles dans un tube conique de 15 ml. Ajouter un média mTeSR1 suffisantes pour ensemencer la suivante passage des cellules.
4. Différenciation des cellules iPS pour iPS-RPE
- Plaquer les cellules iPS sur une plaque nouvellement revêtu dans les médias mTESR1.
- Permettre aux colonies de cellules iPS à développer pour 4-5 jours de culture.
- Médias mTeSR1 substitut avec les médias de différenciation 4 ml. Changer la moitié des médias tous les 3 jours.
- Permettre aux foyers pigmentées de croître suffisamment grande pour être disséqué manuellement de la culture (40-50 jours).
- Utilisez un200 pi pointe de la pipette pour couper autour et lever les colonies pigmentées.
- Recueillir et mettre en commun les colonies disséqués dans un tube conique de 15 ml.
- Ajouter ensuite 5 ml de DMEM/F12 aux cellules de l'EPR en gestion commune et centrifugeuse à 300 g pendant 5 min à deux reprises.
- Préparer une solution à une seule cellule par incubation de la mise en commun iPS-RPE avec 0,25% de trypsine EDTA.
- Rincer les cellules iPS-RPE avec les médias iPS-RPE et plaquer les cellules recueillies sur un matrigel revêtu bien dans 4 ml de milieu iPS-RPE frais.
- Culture des cellules pendant 3 semaines avant au passage. Modifiez les médias tous les 3 jours. Pour l'expérience, plaque iPS-RPE à 100 000 cellules / cm 2. Recueillir des cellules le jour 17. Comptez le jour de l'ensemencement comme jour 0.
5. Prélèvement des échantillons
- Cellules iPS Collection
- Culture des cellules iPS jusqu'à colonies indifférenciées sont observés à être dense au centre.
- Rincer les colonies dans DMEM/F12.
- Dissocier en cellules individuelles en utilisant accutas e. Recueillir les cellules dans un tube conique de 15 ml et centrifuger à 300 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant. Remettre en suspension dans 2 ml de DMEM/F12.
- Fœtale Collection RPE
- Rincer les cultures de cellules foetales RPE avec DMEM/F12 et se dissocier en cellules individuelles en utilisant 0,25% de trypsine EDTA.
- Recueillir les cellules dans un tube conique de 15 ml. Centrifuger à 300 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant. Remettre en suspension dans 2 ml de DMEM/F12.
- iPS-RPE cellulaire Collection
- Lorsque l'IPS-RPE atteindre passage 3 et 5 passage, recueillir les cellules sur Jour 17 après le passage. Rincer iPS-RPE deux fois dans du PBS et on prépare une suspension de cellules isolées par incubation avec 1,0 ml de trypsine à 0,25%.
- Neutraliser la trypsine avec 2 ml de glace froide médias iPS-RPE.
- Recueillir les cellules dans un tube conique de 15 ml et centrifuger à 300 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant.
- Remettre en suspension la suspension de cellules dans 3 ml de tampon de coloration du kit de microbille.
- Conservez tous les réactifs à 4 ° C jusqu'à leur utilisation, mais ne fonctionnent pas sur la glace. Centrifugeuse cellule suspension de l'étape 5.3.4 à 300 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant.
- Resuspendre les cellules dans 100 ul de tampon de coloration du kit de microbilles par 2 x 10 6 cellules.
- Ajouter 10 ul d'anti-TRA-1-60-PE anticorps par 2 x 10 6 cellules.
- Bien mélanger et incuber à 4 ° C pendant 10 min.
- Laver les cellules dans 1-2 ml de tampon par 2 x 10 6 cellules. Centrifugeuse pendant 10 min à 300 x g. Aspirer le surnageant.
- Resuspendre les cellules dans 80 ul de tampon de coloration par 2 x 10 6 cellules. Ajouter 20 ul de microbilles anti-PE marqués (dans le kit) par 2 x 10 6 cellules. Mélangez bien. Incuber pendant 15 min à 4 ° C.
- Ajouter 1-2 ml de tampon de coloration par 2 x 10 6 cellules. Centrifugeuse pendant 10 min à 300 x g. Aspirer le surnageant.
- Remettre les cellules dans 500 & #956; l de tampon de coloration.
- Séparation magnétique de cellules:
- Placez colonne de tri cellulaire magnétique. Rincer la colonne avec 3 ml de tampon de coloration.
- Appliquer suspension cellulaire de 6,8 sur une colonne.
- Placez un tube au port négatif pour recueillir les TRA-1-60 cellules négatives.
7. Extraction de l'ARN total
- Lyse des cellules en exécutant les échantillons à travers une colonne microcentrifuge homogénéisateur mini tour disponible dans le commerce conçu pour minipreps d'acides nucléiques.
- Extraire l'ARN total des cellules iPS, iPS-RPE, et RPE fœtale avec le kit d'extraction d'ARN disponible dans le commerce destinée à préserver les petites molécules d'ARN 27.
- Déterminer des concentrations d'ARN totaux en utilisant un spectrophotomètre de Nanodrop.
8. Bioanalyzer et biopuces Assay
- Vérifier l'intégrité de l'ARN avec Bioanalyzer en conjonction avec kit disponible dans le commerce de la qualité de l'ARN.
- Incuber 100 ng del'ARN total avec la phosphatase intestinale de veau à 37 ° C pendant 30 minutes
- Dénaturer l'ARN en utilisant 100% de DMSO à 100 ° C pendant 5 min.
- Étiqueter les échantillons avec du PCP-Cy3 utilisant la T4 ligase par incubation à 16 ° C pendant 1 heure.
- S'hybrider sur un format de tableau 8_x_15K miARN humain.
- Laver les tableaux selon les instructions du fabricant et de numériser à une résolution de 5 um en utilisant un scanner.
- Acquérir des données en utilisant un logiciel d'extraction de caractéristiques de puces à ADN compatible avec la puce miARN.
- Traiter les signaux de miARN pour déterminer le niveau relatif d'expression de chaque échantillon.
- Comparer les niveaux de chaque miRNA entre les groupes d'échantillons d'expression. Sélectionnez miARN avec l'expression différentielle au moins deux fois pour une analyse ultérieure.
- Utilisation d'un logiciel disponible dans le commerce pour l'analyse des données, suivez les instructions pour générer des cartes de chaleur pour la visualisation des miARN exprimés de manière différentielle 28.
9. Analyse de Pathway
- Sauvegardez les données de miARN sélectionnés en 8.9 en format Excel.
- Connectez-vous au programme d'analyse en ligne de la voie de l'ARN. Téléchargez le fichier Excel. Sélectionnez "Format flexible" pour le format de fichier et sélectionnez "Agilent" dans la liste déroulante pour le type d'identificateur.
- Au point de données brutes, assigner "ID" pour sonder la colonne d'identification et d'attribuer "Observation 1" et "log rapport" à la colonne journal de la ration. Sélectionnez "ignorer" pour toutes les autres colonnes.
- Sélectionnez les paramètres d'analyse comme suit: Confiance: observé expérimentalement que; inclure les relations directes et indirectes; et inclure des produits chimiques endogènes; Sélectionnez la base de connaissances d'Ingenuity comme l'ensemble de référence. Choisir la base de données des molécules de référence qui comprend des données provenant de toutes les espèces, toutes les lignées cellulaires et les tissus, et toutes les mutations.
- réseau Run et la voie analyses.
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Representative Results
cellules iPS (figure 1A) ont été cultivées dans des conditions de différenciation pour induire la différenciation en cellules iPS-RPE. L'IPS-RPE exposé classique phénotype de l'EPR de hexagonal pigmentée morphologie cellulaire (figure 1B) similaire à RPE fœtale (figure 1C).
Pour mieux comprendre le rôle que peut jouer miRNA au cours du processus de différenciation de cellules iPS à iPS-RPE, l'analyse des microréseaux d'expression des miARN a été menée. L'ARN total a été recueilli à partir de cellules iPS, RPE fœtale, et iPS-RPE en utilisant le kit d'isolement Mirvana miRNA pour assurer une rétention maximale de petits ARN. L'ARN a été quantifié et testé pour la pureté avant l'hybridation à la LabChip de puces à ADN. Sondes représentant 1 205 144 miARN viraux humains et ont été utilisés pour analyser l'expression de miARN de l'ensemble de l'échantillon. Les signaux ont été analysés afin de déterminer les niveaux relatifs d'expression d'un miARN provenant de chaque échantillon. Les données ont été utilisées pour comparer le miRNA e profil de Xpression de iPS-RPE iPS et RPE fœtale. Plan de la chaleur ont été générés pour permettre la visualisation de l'expression du miRNA écart entre les groupes (figure 2A). 83 miARN qui ont été exprimés de manière différentielle dans les iPS par rapport à iPS-RPE, avec 47 miARN surexprimés dans les cellules iPS par rapport à iPS-RPE, et 36 régulée à la baisse dans les iPS (figure 2B). 110 miARN ont été exprimés de manière différentielle dans RPE fœtale par rapport à iPS-RPE, avec 61 miARN surexprimés dans le fRPE, et 49 dans la régulation négative par rapport à fRPE iPS-EPR (figure 2C). Analyse de filière avec le logiciel Ingenuity IPA indiqué les miARN transcriptions cibles exprimés de manière différentielle des gènes impliqués dans le développement cellulaire, la croissance, la prolifération et la survie, cycle cellulaire, et le mouvement cellulaire. MiRNAs exprimés dans les tissus oculaires in vivo ont été trouvés à être enrichi en iPS-RPE et RPE fœtale par rapport à iPS (figures 3 et 4).
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Figure 1. Des images en fond clair de iPS, RPE fœtale, et iPS-RPE. Images en fond clair (100X) de cellules iPS avant la différenciation, RPE fœtale, et EPR dérivé de cellules iPS. Tant le RPE fœtale et iPS-RPE afficher RPE morphologie classique de forme hexagonale et la pigmentation. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Profil d'expression des miARN de iPS-EPR par rapport aux iPS et RPE fœtale. A) cartes de chaleur représentent le degré relatif de l'expression différentielle des miARN. La couleuréchelle représente les niveaux de la miRNA comme ci-dessus (rouge), ci-dessous (vert) expression, ou au niveau moyen de l'expression (noir) dans tous les échantillons. B) Comparaison des profils miRNA de iPS-RPE des cellules iPS. C) Comparaison des profils miRNA de iPS-EPR à RPE fœtale. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. A) L'analyse de réseau des profils d'expression des miRNA des cellules iPS parents contre l'EPR iPS dérivées. Les quatre grands réseaux sont présentés séparément (à gauche) et fusionnées (centre). B) Analyse de filière de miARN exprimés de manière différentielle. Please cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. A) L'analyse de réseau des profils d'expression des miRNA de RPE fœtus contre l'EPR iPS dérivées. Les 7 premiers réseaux sont présentés séparément (à gauche) et la fusion (au centre) analyse. B) de voie des miARN exprimés de manière différentielle. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
En conclusion, ce rapport décrit les méthodes utilisées pour la culture de cellules iPS, iPS-RPE, et RPE fœtale. EPR dérivé de iPS sont morphologiquement et fonctionnellement similaire à RPE fœtale. L'IPS-RPE exprime aussi des gènes de RPE caractéristiques dont RPE65, CRALBP, PEDF, et LRAT 16. Pour mieux caractériser ces cellules, l'ARN a été extrait et utilisé pour effectuer l'analyse des microréseaux d'identifier exprimé de manière différentielle miARN. Analyse des intensités de signal a révélé que le plus grand nombre de miARN exprimés de manière différentielle a été détecté dans l'EPR fœtale contre comparaisons iPS-RPE, ce qui suggère l'IPS-RPE peut être plus mature. Les études futures sont prévues pour valider ces résultats à la RT-PCR.
Il existe plusieurs points critiques au cours de cette expérience, qui doivent être réalisées avec soin pour assurer le succès de l'essai et acquisition de données exactes. La première étape du clavier se produit pendant la culture des cellules iPS. cellules iPS doivent rester dans un PLUripotent état pour maintenir leur caractère souche. Les cellules doivent être soigneusement inspectés quotidiennement pour des signes de différenciation. Cellules iPS indifférenciées poussent comme des colonies multicellulaires compacts. Les cellules doivent avoir une grande nucléaire ratio de cytoplasme et nucléoles proéminents. Les colonies iPS sont caractérisés par une frontière distincte, avec plusieurs couches de cellules au centre. Les signes de différenciation comprennent la perte de frontières définies de colonies, la morphologie des cellules non-uniforme, et l'apparition de différents types de cellules évidentes, telles que les neurones et les fibroblastes. Les cellules individuelles qui se sont différenciés peuvent être éliminés par la dispase et rinçage, cependant, les colonies présentant ces caractéristiques doivent être retirées manuellement à partir de la culture 29.
Préparation de l'ARN pour l'analyse de puces à ADN est la prochaine étape critique. Incompatible qualité de l'ARN est une source importante de variabilité dans les données de puces à ADN. extraction de l'ARN devrait donner un poids moléculaire élevé et de l'ARN peu dégradée pour de meilleurs résultats. Réussiextraction de l'ARN donnera l'ARN total avec une dégradation minimale et libre de tout contaminant RNases. Après détermination de la concentration d'ARN par spectrophotométrie à 260 nm, la pureté de l'échantillon doit être déterminée à 230 et 280 nm pour détecter la contamination avec des polysaccharides ou des protéines. Le rapport 230:260:280 pour l'ARN doit être 01:02:01 pour indiquer l'ARN de haute qualité, sans contamination 30.
Lors de la planification de l'expérience de puces à ADN, l'étape la plus critique est l'inclusion de témoins négatifs pour assurer l'hybridation à des sondes est spécifique, et à tester chaque échantillon en trois exemplaires pour assurer que les signaux détectés sont valables que pour les échantillons ensemble. Au cours de l'analyse des résultats de puces à ADN, un point clé est une correction de fond, dans lequel le bruit de fond est soustraite du signal observé pour donner le vrai intensité de signal pour chaque sonde particulière. Cette étape permettra d'éliminer les faux positifs, tout en soulignant les vrais signaux positifs. </ P>
Enfin, au cours de réseau et l'analyse de la voie des résultats de puces à ADN, l'étape la plus importante est d'établir les paramètres et les filtres corrects avant de lancer l'analyse. Cette étape permettra de déterminer les bases de données sera utilisée par le logiciel pour générer les réseaux et identifier les voies cellulaires qui sont touchés par les miARN est prouvé qu'ils sont exprimés de manière différentielle dans les comparaisons.
Après l'acquisition de données en utilisant les méthodes décrites dans le présent rapport, il est nécessaire de tenir compte des limites de ces tests lors de l'interprétation des résultats. Bien que peu probable, il est possible que la culture de l'EPR n'est pas une population homogène de cellules RPE. Le processus de tri anti-TRA-1-60 est un processus de sélection négative qui élimine les cellules qui expriment encore des marqueurs de cellules souches; mais il ne garantit pas les cellules restantes sont des cellules RPE pures. Bien que morphologiquement les cellules présentent une morphologie classique de l'EPR de pigmentation une forme de la cellule polygonale, il est possible que toutes les cellules non sont RPE.
expériences de puces à ADN peuvent produire des résultats faussement positifs pour l'expression de l'ARN, en particulier dans le cas de micro-ARN en raison des séquences très courtes. Bien que le système de puces à ADN utilisé pour cette expérience comprenait des sondes multiples pour cibler différentes régions de chaque cible, les résultats doivent toujours être validés par qRT-PCR.
L'analyse des données de puces à ADN par Ingenuity IPA dépend de la quantité et de la qualité de l'information dans la base de données Ingenuity. La plupart des informations sur la fonction des gènes et les voies cellulaires est dérivé à partir d'expériences réalisées sur des lignées cellulaires transformées ou dans le contexte de la recherche sur le cancer. Par conséquent, les résultats de la voie et de l'analyse de réseau à l'aide de ce programme ne sont pas toujours pertinents pour les cellules primaires ou, dans ce cas, les cellules souches.
Malgré ces limites, les méthodes décrites dans le présent rapport peuvent être utilisés pourculture de cellules iPS et RPE fœtale, dérivant RPE de cellules iPS, et l'extraction de l'ARN pour l'analyse des microréseaux de miARN. Les données générées par ces dosages peuvent être utilisés pour identifier des miRNAs impliqués dans le processus de différenciation, ainsi que ceux qui régulent les fonctions de l'EPR.
Bien que plus de miARN ont été trouvés à être exprimés de manière différentielle dans le RPE fœtale vs comparaison iPS-RPE que dans les iPS vs comparaison iPS-RPE, il ya beaucoup de raisons possibles pour cela. Tout d'abord, au moment de ce test a été réalisé, la plate-forme de puces à ADN miRNA était capable de détecter 1 205 144 miARN viraux et humaines. Depuis ce temps, la plate-forme a été élargie pour inclure des sondes pour plus de 2.000 miARN humains. Il est certainement possible que les profils d'expression différentiels miRNA vont changer si plus de miARN sont détectés. Sur les 1 349 miARN détectés par ce test, la plupart des miARN ont montré aucune différence dans l'expression entre les types de cellules (figures 2B et 2C
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les opinions exprimées dans le présent article sont celles des auteurs et ne doivent pas être interprétées comme fonctionnaire ou comme reflétant les vues du Département de l'Armée ou le ministère de la Défense.
Cette recherche a été réalisée alors que les auteurs Whitney A. Greene, Alberto Muñiz, et Ramesh R. Kaini tenu un attaché de recherche postdoctorale du Conseil national de recherches à l'USAISR.
analyses de biopuces ont été effectuées par l'Institut de recherche sur le cancer de puces à ADN base la facilité de la Greehey enfants et Département bioinformatique à l'UT Health Science Center à San Antonio.
Ce travail a été soutenu par le Programme de l'armée américaine médecine clinique de réadaptation de la recherche (CRMRP) et militaire du programme de recherche de la médecine opérationnelle (MOMRP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-β-mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Fetal RPE media RTEGM kit | Life Technologies | 195406 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Trypsin | Hyclone(Fisher) | 25200-072 | |
| Miltenyi Biotec washing buffer | StemGent | 130-092-987 | |
| Miltenyi Biotec rinsing buffer | StemGent | 130-092-222 | |
| Anti-TRA-1-60 microbead kit | StemGent | 130-095-816 | |
| Miltenyi Biotec cell sorter column | StemGent | 130-021-101 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | |
| RNA 6000 Pico LabChip kit | Agilent | G2938-90046 | |
| Human miRNA microarray v16 | Agilent | G4471A |
References
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