Summary
Die microRNA (miRNA)-Profile der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen), retinale Pigmentepithel (RPE) aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) (iPS-RPE) und fetale RPE abgeleitet, wurden verglichen.
Abstract
Ziel des Berichts ist es, die Protokolle für den Vergleich der microRNA (miRNA)-Profile von Menschen verursachten-pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen), retinale Pigmentepithel (RPE) aus menschlichen iPS-Zellen (iPS-RPE) abgeleitet und fetale RPE zu beschreiben. Die Protokolle beinhalten Sammlung von RNA für Microarray-Analyse durch, und die Analyse von Microarray-Daten zu miRNAs, die unterschiedlich zwischen drei Zelltypen exprimiert werden. Die Methoden zur Kultur der iPS-Zellen und fetaler RPE erklärt. Das zur Unterscheidung von menschlichen RPE von iPS-Protokoll verwendet, ist ebenfalls beschrieben. Die RNA-Extraktion Technik, die wir beschreiben, wurde ausgewählt, um maximale Erholung von sehr kleinen RNA, die für die Verwendung in einem miRNA-Microarray zu ermöglichen. Schließlich wird zellulären Weg-und Netzwerk-Analyse von Microarray-Daten erläutert. Diese Techniken werden den Vergleich der miRNA-Profile von drei unterschiedlichen Zelltypen zu erleichtern.
Introduction
Stammzellen haben die Fähigkeit, ohne Begrenzung der Möglichkeit, in jedem Zelltyp zu differenzieren replizieren. Die Entwicklung von Techniken, um Körperzellen in pluripotente Stammzellen umzuprogrammieren hat große Aufregung in der Forschung und bei den Ärzten hervorgerufen, wie die Einführung von personalisierten Geweberegeneration ist am Horizont ein. Induzierte pluripotente Stammzellen-(iPS-Zellen) weisen die gleichen Merkmale der unbegrenzten Replikationspotential und Pluripotenz embryonaler Stammzellen (ES-Zellen) unter Umgehung der ethischen Dilemmata mit WSR verbunden. Darüber hinaus wird von einem Patienten abgeleitete Stammzellen nicht stimulieren eine Immunantwort, die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen therapeutischen Anwendungen 2-3 stark erhöht. Unter bestimmten Kulturbedingungen haben iPS-Zellen gezeigt worden, um in verschiedene Zelltypen in vitro, einschließlich Herzmuskelzellen, Neuronen pankreatischen Betazellen, Leberzellen und Retina-Pigmentepithel (RP unterscheidenE) 12.04.
Das RPE ist eine spezialisierte Schicht pigmentierten Epithelzellen an der Rückseite der Retina, die mehrere Funktionen, die für visuelle Gesundheit und Funktion wie die Absorption von Streulicht, Phagozytose der Photorezeptoraußensegmente führt befindet, und die Verarbeitung von Retinoiden für die Herstellung der visuellen Chromophor. Dysfunktion des RPE aufgrund von Schäden oder Krankheit zutiefst betroffen Photorezeptor Gesundheit und visuellen Funktion, wie durch die blendende Krankheiten, die das Ergebnis der zugrunde liegenden RPE Pathologie wie der altersbedingten Makuladegeneration (AMD), Stargardt-Krankheit und Retinitis pigmentosa (RP) sind belegt 13. Wirklich wirksame Behandlungen, die Vision wiederherstellen können nicht erreicht wurden, und der Ersatz der erkrankten RPE mit gesunden RPE kann die beste Option, um einen Verlust der Sehkraft 14-15 zu verhindern. RPE von iPS (iPS-RPE) abgeleitet ist eine mögliche Quelle von Zellen, die beschädigte RPE ersetzen. iPS-RPE drückt Merktic RPE Proteine LRAT, CRALBP, PEDF und RPE65; zeigt die klassische stark pigmentierten hexagonalen RPE-Morphologie; und führt RPE-Funktionen wie Phagozytose, Retinoid-Verarbeitung und Sekretion von 11 - cis-Retinal 5,16. Doch bevor iPS-RPE therapeutisch genutzt werden kann, die iPS-RPE gründlich charakterisiert werden. Verständnis der Faktoren, Differenzierungs RPE regeln ist notwendig, um die Ausbeute und Reinheit der Zellen für klinische Anwendungen verwendet werden, zu verbessern.
Zelldifferenzierung ist das Ergebnis stark regulierten Genexpression. Epigenetische Umbau des Genoms und die Koordination von Transkriptionsfaktoren sind für Zellschicksal Entscheidungen, die während der Differenzierung und Entwicklung 17 auftreten erforderlich. Verordnung der Nachricht RNA (mRNA) Übersetzung von microRNA (miRNA) präsentiert noch eine weitere Ebene der Regulierung, die das Schicksal der Zelle 1 betrifft. MiRNAs sind kurze, ~ 22 nt, Längen von Nukleotiden, die entweder unterdrücken ÜbersetzungBindung an die 3'-UTR der mRNA oder mRNA, die für das Ziel-Abbau. MiRNAs haben in nahezu allen Geweben nachgewiesen worden, und bis heute über 2.000 einzigartigen menschlichen microRNAs im miRBase Datenbank registriert. Da miRNAs erfordern nur eine teilweise Komplementarität zu der Ziel-mRNA binden kann eine einzelne miRNA potenziell Dutzende oder Hunderte von Targets und umgekehrt zu binden, dh eine einzelne mRNA kann durch verschiedene miRNAs richtet sein. Diese Promiscuous Bindung charakteristisch erhöht drastisch die Komplexität der Regulierung sowie der Schwierigkeitsgrad der Bestimmung der Funktionen einzelner miRNAs und die jeweiligen Aufgaben in der zellulären Funktionen 18-21. Dennoch haben Studien gezeigt, dass miRNA verfeinert Genexpression während der Differenzierung durch die Beeinflussung DNA-Methylierungsstatus 17. In einer Studie mit mehr spezifisch auf die RPE, miR-204/211 wurde gezeigt, dass die epithelialen Phänotyp der RPE 22 zu fördern. Eine weitere Gruppe untersuchte die miRNA-Profilvon RPE während der Differenzierung von ES-Zellen und zeigte verschiedene Sätze von miRNA werden während des Differenzierungsprozesses 23 ausgedrückt. In der Tat kann miRNA Profile eindeutig unterscheiden Zelltypen, einschließlich ES Zellen, Vorläuferzellen und terminal differenzierte Zellen 24,25. Über 250 miRNAs in der Netzhaut exprimiert. Basierend auf diesen Studien die Hypothese auf, dass wir miRNAs eine wichtige Rolle während der Differenzierung von RPE von iPS.
Ziel des Berichts ist es, die Protokolle für die Differenzierung der RPE von IMR90-4 iPS-Zellen zu beschreiben, Sammlung von RNA für die Analyse von Mikroarrays und die Analyse von Microarray-Daten zu miRNAs, die unterschiedlich zwischen drei Zelltypen exprimiert werden, iPS-Zellen zu identifizieren , iPS-RPE und fetale RPE. Gesamt-RNA wurde aus Kulturen von jedem Zelltyp extrahiert und hybridisiert mit einem Mikroarray-miRNA, die bestimmte für 1.205 menschlichen miRNAs und 144 viralen miRNAs Sonden. Die Microarray-Ergebnisse wurden vergleichend zu bestimmen, welche miRNAs differentiell zwischen den verschiedenen Zelltypen exprimiert. miRNAs mit 2-fach oder mehr-fache Veränderung der Expression wurden für die weitere Analyse ausgewählt. Eine miRNA-Analyse-Software-Programm wurde verwendet, um potentielle Ziele der differentiell exprimierten miRNAs identifizieren und Mobilfunknetze durch die ausgewählten miRNAs reguliert erzeugen.
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Protocol
1. Vorbereitung der Reagenzien und Kultur Kulturplatten
- mTeSR1 Medien: Bereiten mTeSR1 Medien gemäß den Anweisungen des Herstellers. Auftauen 100 ml mTeSR1 5x Ergänzung Nacht bei 4 ° C. Fügen Sie die 100 ml mTeSR1 5x Ergänzung zu 400 ml mTeSR1 Grundmedien und gut mischen. Dieses Medium wird bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen und bei -20 ° C für 6 Monate stabil.
- Differenzierungsmedium: Vorbereiten Differenzierungsmedien in DMEM/F12 bis 0,1 mM β-Mercaptoethanol, 0,1 mM nichtessentiellen Aminosäuren, 2,0 mM L-Glutamin, 10% KO Serum und 10 ug / ml Gentamicin zu ergeben.
- iPS-RPE Medien: Bereiten iPS-RPE Medien in MEM, um 1x N1 Ergänzung, 0,1 mM nicht essentielle Aminosäuren, 250 ug / ml Taurin, 13 ng / ml Triiod-L-Thyronin Natriumsalz, 20 ng / ml Hydrocortison, 5 ug ergeben / ml Gentamicin, und 15% FBS 26.
- Triiod-L-Thyronin Natriumsalz Stammlösung. Um Stammlösung aufzulösen 1,0 mg Triiod-L-ThyroninNatriumsalz in 1 N Natronlauge durch vorsichtiges Schwenken. Als nächstes fügen 49,0 ml Basismedium auf 50,0 ml 20 pg / ml Triiod-L-Thyronin Natriumsalz zu machen. Aliquots und bei -20 ° C bis benötigt. Verwenden Sie geeignete Volumen, um die gewünschte Konzentration in der letzten Kulturmedien zu erreichen.
- Hydrocortison-Stammlösung: Zur Herstellung einer Stammlösung Hydrocortison, löslich zu 1 mg Hydrocortison in 1 ml absolutem Ethanol durch leichtes Schütteln. Weiter für 20 ml Hydrocortison Stammlösung von 50 ug / ml hinzuzufügen 19,0 ml Basismedium. aliquotieren und bei -20 ° C, bis sie benötigt. Verwenden Sie geeignete Volumen, um die gewünschte Konzentration in der letzten Kulturmedien zu erreichen.
- Fetal RPE Wachstumsmedium. Bereiten Sie die Wachstumsmedien durch Mischen aller Reagenzien im Kit RTEGM im Basalmedium nach den Herstelleranweisungen mit Ausnahme der FBS.
- Fetal RPE Plattenmedien. Plattenmedien herzustellen, indem eine kleine Menge an Wachstumsmedium in einen sterilen Behälter unddd FBS bis zu einer Endkonzentration von 2%.
- Dispase: Vorbereiten von Dispase Arbeitslösung von 1 mg / ml in DMEM/F12.
- Matrigel-beschichtete Platten: Bereiten Matrigel in DMEM/F12 bis 0,08 mg / ml.
- Coat jede Vertiefung einer 6-Well-Platte mit 1,0 ml der Matrigel-Lösung.
- Die beschichteten Platten bei Raumtemperatur für 1,0 Stunden.
- Nach 1,0 h Inkubation saugen das überschüssige DMEM/F12.
- 0,5 ml der mTeSR1 Medien um Trocknung zu verhindern. Die Matrigel beschichteten Platten sind nun bereit für den Einsatz.
2. IPS Kultur
- Vor der iPS-Zellaussaat haben alle Rohre, warm mTESR1 Medien auf Raumtemperatur und die Matrigel beschichteten Platten bereit.
- Tauen schnell die IMR90-4 iPS-Zellen in einem 37 ° C Wasserbad. Dann entfernen Sie die Kryoröhrchen aus dem Wasserbad und sterilisieren mit 70% Ethanol.
- Übertragen der Zellen in ein 15 ml konisches Röhrchen mit einer 2 ml-Pipette zu Bruch von Zellaggregaten zu minimieren.
- Tropfenweise mit 5 ml warm mTeSR1 Medien zu den Zellen und vorsichtig mischen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 g für 5 min bei Raumtemperatur und Überstand.
- Der Zellaggregate vorsichtig resuspendieren in 2 ml mTeSR1 Medien und Samen der Zellen auf eine Vertiefung einer sechs Well-Platte.
- Legen Sie die Platte in eine 37 ° C-Inkubator und Kultur mit 5% CO 2, 95% Luftfeuchtigkeit.
- Ändern Sie den iPS-Zellkulturmedien täglich. Undifferenzierte Kolonien wird 5-7 Tage nach Aussaat erscheinen. Prüfen Sie, ob undifferenzierte Kolonien, die bereit für den Durchgang (Kolonien mit einem dichten Zentrum) sind.
3. Passagierung von iPS-Zellen
- Vor Beginn um den Durchgang die iPS-Zellen haben alle Rohre, Dispase Lösung erwärmt DMEM/F12 und mTERS1 Medien auf Raumtemperatur und die Matrigel beschichteten Platten bereit.
- Vor der Passage iPS-Zellen, entfernen Sie alle Bereiche der Differenzierung durch Abschaben der Bereich und Absaugen der Medien. Differenzierung sollte unter 20% der gut für hoch bleibenQualität Kulturen. Die iPS-Zellen enthaltende gut mit 2 ml DMEM/F12 Sorgfältig abspülen und 1 ml 1 mg / ml Dispase in jede Vertiefung.
- Inkubieren bei 37 ° C für 7 min. Saugen Sie den Dispase und sanft spülen Sie die Zellkolonien mit 2 ml DMEM/F12 zweimal.
- Nach dem Spülen 2 ml mTSER1 in jede Vertiefung.
- Mit einem 5 ml-Pipette vorsichtig abkratzen die Kolonien von der Platte, um Aggregate zu bilden.
- Übertragen der abgelösten Kolonien zu einem 15 ml konischen Röhrchen. Ausreichend mTeSR1 Medien, um den nächsten Durchgang von Zellen Saatgut.
4. Differenzierung von iPS-Zellen zu iPS-RPE
- Platte die iPS-Zellen auf eine neu beschichtete Platte in mTESR1 Medien.
- Lassen iPS-Zellkolonien für 4-5 Tage in Kultur zu erweitern.
- Ersatz mTeSR1 Medien mit 4 ml Differenzierungsmedium. Ändern Sie die eine Hälfte der Medien alle 3 Tage.
- Ermöglichen pigmentierte Herde groß genug, um von Hand aus der Kultur präpariert werden (40-50 Tage) wachsen.
- Verwenden Sie ein200 ul Pipettenspitze auf rund geschnitten und heben Sie die pigmentierte Kolonien.
- Sammeln und zu bündeln, die seziert Kolonien in einem 15 ml konischen Röhrchen.
- Dann werden 5 ml DMEM/F12 zu den gepoolten RPE-Zellen und Zentrifuge bei 300 xg für 5 min zweimal.
- Bereiten Sie eine einzelne Zelle Lösung durch Inkubation der gepoolten iPS-RPE mit 0,25% Trypsin-EDTA.
- Spülen Sie die iPS-RPE-Zellen mit iPS-RPE Medien und Platte die gesammelten Zellen auf eine frische Matrigel-beschichteten und in 4 ml iPS-RPE-Medien.
- Kultur die Zellen für 3 Wochen vor dem Durchgang. Ändern Sie die Medien alle 3 Tage. Für das Experiment Platte iPS-RPE bei 100.000 Zellen / cm 2. Sammeln Zellen an Tag 17. Zählen Sie die Tage der Aussaat als Tag 0.
5. Probenentnahme
- iPS-Zellen-Sammlung
- Kultur die iPS-Zellen bis undifferenzierte Kolonien beobachtet dicht in der Mitte zu sein.
- Spülen Sie die Kolonien in DMEM/F12.
- Distanzieren in einzelne Zellen mit accutas E. Sammeln der Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifugieren bei 300 × g für 5 min. Überstand wird abgesaugt. Resuspendieren in 2 ml DMEM/F12.
- Fetal RPE-Sammlung
- Fetal RPE-Zellkulturen mit DMEM/F12 ausspülen und distanzieren in einzelne Zellen unter Verwendung von 0,25% Trypsin-EDTA.
- Sammeln der Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen. Zentrifugieren bei 300 g für 5 min. Überstand wird abgesaugt. Resuspendieren in 2 ml DMEM/F12.
- iPS-Zellen-RPE-Sammlung
- Wenn die iPS-RPE erreichen Durchgang 3 und Kanal 5, sammeln die Zellen an Tag 17 nach dem Durchgang. Spülen iPS-RPE zweimal in PBS und bereiten eine Einzelzellsuspension durch Inkubation mit 1,0 ml 0,25% Trypsin.
- Neutralisieren Trypsin mit 2 ml eiskaltem iPS-RPE-Medien.
- Sammeln der Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifugieren bei 300 × g für 5 min. Überstand wird abgesaugt.
- Resuspendieren der Zellsuspension in 3 ml Färbepuffer aus Mikrokügelchen-Kit.
- Halten Sie alle Reagenzien bei 4 ° C bis zur Verwendung, aber nicht auf Eis zu arbeiten. Zentrifuge Zellsuspension aus Schritt 5.3.4 bei 300 × g für 5 min. Überstand wird abgesaugt.
- Die Zellen in 100 &mgr; l Färbepuffer von Mikrokügelchen Satz pro 2 × 10 6 Zellen.
- Hinzufügen von 10 ul Anti-TRA-1-60-PE-Antikörper pro 2 × 10 6 Zellen.
- Gut mischen und Inkubation bei 4 ° C für 10 min.
- Waschen der Zellen in 1-2 ml Puffer pro 2 × 10 6 Zellen. Zentrifuge für 10 min bei 300 x g. Überstand wird abgesaugt.
- Die Zellen in 80 &mgr; l Färbepuffer pro 2 × 10 6 Zellen. Hinzufügen von 20 ul Anti-PE markierten Mikrokügelchen (aus dem Kit) pro 2 × 10 6 Zellen. Gut mischen. Inkubation für 15 min bei 4 ° C
- Hinzufügen 1-2 ml Färbepuffer pro 2 × 10 6 Zellen. Zentrifuge für 10 min bei 300 x g. Überstand wird abgesaugt.
- Die Zellen in 500 & #956, l Färbepuffer.
- Magnetische Zelltrennung:
- Zeigen Spalte in magnetischen Zellsortierer. Spülen Säule mit 3 ml Färbepuffer.
- Bewerben Zellsuspension von 6,8 auf Spalte.
- Setzen Sie ein Rohr an der negativen Port, um die TRA-1-60 negativen Zellen zu sammeln.
7. Gesamt-RNA-Extraktion
- Lyse der Zellen, indem Sie die Proben durch einen handelsüblichen Mikro Homogenisator Mini-Spin-Säule für die Nukleinsäure-Minipräparationen konzipiert.
- Auszug Gesamt-RNA aus iPS-Zellen, iPS-RPE und fetale RPE mit dem kommerziell erhältlichen RNA-Extraktions-Kits entwickelt, um kleine RNA-Moleküle 27 zu bewahren.
- Bestimmen Sie die Gesamt-RNA-Konzentrationen mit Hilfe eines Nanodrop Spektralphotometer.
8. Bioanalyzer und Microarray-Assay
- Überprüfen Sie die Integrität der RNA mit Bioanalyzer in Verbindung mit handelsüblichen Qualität der RNA-Kit.
- Inkubation von 100 ngGesamt-RNA mit Kälberdarm-Phosphatase bei 37 ° C für 30 min
- Denaturierung der RNA unter Verwendung von 100% DMSO bei 100 ° C für 5 min.
- Bezeichnen die Proben PCP-Cy3 mit T4-Ligase Inkubation bei 16 ° C für 1 Stunde.
- Hybridisieren auf einer 8_x_15K Format menschlichen miRNA-Array.
- Gemäß den Anweisungen des Herstellers Waschen Sie die Arrays und Scannen mit einer Auflösung von 5 um mit Hilfe eines Scanners.
- Erwerben Daten mittels Microarray Merkmalsextraktion-Software mit der miRNA-Microarray kompatibel.
- Verarbeiten Sie die miRNA-Signale, um die relative Höhe der Expression in jeder Probe zu bestimmen.
- Vergleichen Sie die Expressionsniveaus der einzelnen miRNA zwischen den Probengruppen. Wählen miRNAs mit mindestens zweifacher Differentialausdruck für die weitere Analyse.
- Verwendung handelsüblicher Software zur Datenanalyse, befolgen Sie die Anweisungen, um die Wärmekarten zur Visualisierung von differentiell exprimierten miRNAs 28 zu generieren.
9. Pathway Analysis
- Speichern Sie Daten von den in 8.9 im Excel-Format ausgewählt miRNAs.
- Melden Sie sich im Online-RNA-Weg-Analyse-Programm. Laden Sie die Excel-Datei. Wählen Sie "Flexible Format" für die Datei-Format und wählen Sie "Agilent" aus der Dropdown-Liste für Typ-Kennung.
- Unter Rohdaten Überschrift zuweisen "ID" ID-Spalte zu untersuchen und zuordnen "Beobachtungs 1" und "log ratio" in die Protokollration Spalte. Wählen Sie "ignorieren" für alle anderen Spalten.
- Wählen Sie die Parameter für die Analyse wie folgt: Vertrauen: nur experimentell beobachtet; beinhaltet direkte und indirekte Beziehungen; und gehören endogene Chemikalien; Wählen Sie die Ingenuity Wissensdatenbank als Referenzsatz. Wählen Sie die Datenbank mit Referenzmoleküle, die Daten von allen Arten, alle Zelllinien und Geweben, und alle Mutationen enthält.
- Netzwerk-und Run-Weg-Analysen.
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Representative Results
IPS-Zellen (1A) in Differenzierungsbedingungen gezüchtet, um die Differenzierung in iPS-RPE-Zellen zu induzieren. Die iPS-RPE RPE zeigte klassische Phänotyp der hexagonalen pigmentierte Zellmorphologie (Abbildung 1B) ähnlich fetale RPE (Abbildung 1C).
Um die Rolle der miRNA kann während der Prozess der Differenzierung von iPS zu iPS-RPE spielen, besser zu verstehen, wurde Microarray-Analyse von miRNA-Expression durchgeführt. Gesamt-RNA aus iPS-Zellen, fetale RPE und iPS-RPE mit der Mirvana miRNA Isolation Kit, um eine maximale Retention von kleinen RNAs gewährleisten gesammelt. Die RNA wurde quantitativ bestimmt und vor der Hybridisierung an die Mikroarray-Chip gelangen auf Reinheit getestet. Sonden, die 1205 menschliche und 144 viralen miRNAs wurden verwendet, um miRNA-Expression von jedem Probensatz zu analysieren. Die Signale wurden analysiert, um die relativen Expressionsniveaus jedes miRNA aus jeder Probe zu bestimmen. Die Daten wurden verwendet, um die miRNA e vergleichen xpression Profil von iPS-RPE zu iPS und fetale RPE. Wärme Karten wurden erzeugt, um die Visualisierung des Differenz miRNA-Expression zwischen den Gruppen (2A) zu ermöglichen. 83 miRNAs, die unterschiedlich in den iPS ausgedrückt wurden im Vergleich zu iPS-RPE mit 47 miRNAs in den iPS hochreguliert im Vergleich zu iPS-RPE und 36 in den iPS (2B) herunterreguliert. 110 miRNAs differentiell in der fetalen RPE exprimiert im Vergleich zu iPS-RPE mit 61 miRNAs in der FRPE hochreguliert, und in der FRPE 49 herunterreguliert im Vergleich zu iPS-RPE (Abbildung 2C). Pathway-Analyse mit Ingenuity IPA-Software die angegeben differentiell exprimierten miRNAs Ziel Transkripte für Gene, die in zellulären Entwicklung, Wachstum, Proliferation und Überleben, Zellzyklus und Zellbewegung. MiRNAs im Augengewebe in vivo exprimiert wurden gefunden, um in iPS-RPE und fetale RPE angereichert Vergleich zu iPS (Abbildungen 3 und 4) werden.
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Abbildung 1. Hell Bilder von iPS, fetale RPE und iPS-RPE. Hell Bilder (100X) von iPS-Zellen vor der Differenzierung, fetale RPE und RPE von iPS abgeleitet. Sowohl die fetale RPE-und iPS-RPE RPE anzuzeigen klassischen Morphologie der sechseckigen Form und Pigmentierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
MiRNA-Expressionsprofil von iPS-RPE Abbildung 2. Vergleich zu iPS und fetale RPE. A) Heatmaps zeigen den relativen Grad der differentiellen Expression von miRNAs. Die FarbeSkala stellt die Expression von miRNA, wie oben (rot), unten (grün), oder mit dem Mittelexpressionsniveau (schwarz) für alle Proben. B) Vergleich der miRNA-Profile von iPS-RPE zu iPS-Zellen. C) Vergleich der miRNA-Profile von iPS-RPE fetale RPE. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. A) Netzwerkanalyse der miRNA-Expressionsprofile der Eltern iPS-Zellen gegenüber der iPS-abgeleiteten RPE. Die Top-4-Netze werden gesondert dargestellt (links) und zusammengeführt (Mitte). B) Pathway Analyse der differentiell exprimierten miRNAs. Please klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. A) Netzwerkanalyse der miRNA-Expressionsprofile von fetalen RPE gegenüber der iPS-abgeleiteten RPE. Die Top-7-Netze werden gesondert dargestellt (links) und zusammengeführt (Mitte). B) Pathway Analyse der differentiell exprimierten miRNAs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Im Ergebnis dieser Bericht beschreibt die Kultur zu iPS-Zellen verwendeten Methoden, iPS-RPE und fetale RPE. RPE von iPS abgeleitet sind morphologisch und funktionell ähnlich fetale RPE. Die iPS-RPE drückt auch RPE charakteristischen Genen einschließlich RPE65, CRALBP, PEDF und LRAT 16. Zur weiteren Charakterisierung dieser Zellen wurde RNA extrahiert und dazu verwendet, Mikroarray-Analyse durchzuführen, um differentiell exprimierte miRNA identifizieren. Die Analyse der Signalintensitäten ergab, dass die größte Anzahl der differentiell exprimierten miRNAs wurde in der fetalen RPE gegen iPS-RPE-Vergleiche festgestellt, was auf die iPS-RPE kann reifer sein. Zukünftige Studien sind geplant, um diese Ergebnisse mit RT-PCR zu überprüfen.
Es gibt mehrere kritische Punkte während dieses Experiments, die sorgfältig durchgeführt werden müssen, um den Erfolg des Assays und der genaue Datenerfassung zu gewährleisten. Der erste Schlüsselschritt erfolgt während der Kultur der IPS-Zellen. iPS-Zellen müssen in einem plu bleibenripotent Zustand ihrer stemness halten. Die Zellen müssen sorgfältig täglich auf Anzeichen der Differenzierung untersucht werden. Undifferenzierte iPS-Zellen wachsen als kompakte vielzelligen Kolonien. Die Zellen sollte eine hohe Kern zu Zytoplasma-Verhältnis und prominenten Nukleolen. Die iPS-Kolonien werden durch eine deutliche Grenze ist, mit mehreren Schichten von Zellen in der Mitte. Anzeichen der Differenzierung umfassen Verlust definiert Kolonie Grenzen ungleichmäßige Zellmorphologie, und das Auftreten von Hand Zelltypen, wie beispielsweise Nervenzellen und Fibroblasten. Einzelne Zellen, die differenziert sind, können durch Dispase und Spülen entfernt werden, jedoch Kolonien mit diesen Eigenschaften müssen manuell von der Kultur 29 entfernt werden.
Herstellung von RNA für die Microarray-Analyse ist der nächste wichtige Schritt. Uneinheitliche RNA-Qualität ist eine bedeutende Quelle der Variabilität in der Microarray-Daten. RNA-Extraktion sollte mit hohem Molekulargewicht und minimal abgebaut RNA für die besten Ergebnisse zu erzielen. ErfolgreichRNA-Extraktion wird der Gesamt-RNA mit minimalen Abbau und frei von verunreinigenden RNasen ergeben. Nach der Bestimmung der RNA-Konzentration durch Spektrophotometrie bei 260 nm, sollte die Reinheit der Probe bei 230 und 280 nm bestimmt, um eine Kontamination mit Polysacchariden oder Protein nachzuweisen. Das Verhältnis 230:260:280 für RNA sollte 01.02.01 sein, um qualitativ hochwertige RNA ohne Kontamination 30 anzuzeigen.
Bei der Planung der Mikroarray-Experiment ist der wichtigste Schritt die Aufnahme der negativen Kontrollen, um sicherzustellen, das die Hybridisierung an den Sonden spezifisch ist, und jede Probe dreifach durchgeführt, um sicherzustellen, dass die erfassten Signale gültig für die Probensatz sind. Während der Analyse der Mikroarray-Ergebnisse, ist ein wesentlicher Punkt Grundkorrektur, bei dem das Hintergrundrauschen von dem beobachteten Signal, das wahre Signalintensität für jede einzelne Sonde geben subtrahiert. Dieser Schritt wird Fehlalarme zu eliminieren, während Hervorhebung der positiven Signale wahr. </ P>
Schließlich, während der Netzwerk-und Pathway-Analyse der Microarray-Ergebnisse, ist der wichtigste Schritt, um die richtigen Parameter und Filter, bevor Sie die Analyse zu schaffen. Dieser Schritt bestimmt, welche Datenbanken von der Software verwendet, um die Netzwerke zu erzeugen und zu identifizieren zelluläre Signalwege, die durch die gezeigten differentiell in den Vergleichen ausgedrückt werden miRNAs beeinflusst werden wird.
Nach der Erfassung der Daten unter Verwendung der in diesem Bericht beschriebenen Verfahren ist es notwendig, die Grenzen dieser Assays bei der Interpretation der Ergebnisse zu berücksichtigen. Obwohl es unwahrscheinlich ist, bleibt es möglich, dass die RPE Kultur keine homogene Population von RPE-Zellen. Die Anti-TRA-1-60 Sortierprozess ist ein negativer Selektionsprozess, der die Zellen, die noch Stammzellmarker exprimieren entfernt; aber es garantiert nicht, die restlichen Zellen sind reine RPE-Zellen. Obwohl die Zellen morphologisch zeigen klassische RPE-Morphologie der Pigmentierung einnd polygonale Zellform ist es möglich, dass nicht alle Zellen RPE.
Microarray-Experimente kann zu Fehlalarmen für die Expression von RNA aufgrund der sehr kurzen Sequenzen erzeugen, insbesondere im Fall von microRNA. Obwohl die Microarray-System für dieses Experiment verwendet enthalten mehrere Sonden zu den verschiedenen Regionen der einzelnen Ziel Ziel, sollten die Ergebnisse immer durch qRT-PCR validiert werden.
Analyse von Microarray-Daten von Ingenuity IPA ist abhängig von der Menge und Qualität der Informationen in der Ingenuity Datenbank. Viele der Informationen, auf die Genfunktion und zellulären Wege von Versuchen an transformierten Zelllinien oder im Rahmen der Krebsforschung durchgeführt abgeleitet. Daher werden die Ergebnisse der Bahn und Netzwerkanalyse mit diesem Programm nicht immer für Primärzellen relevant sein oder, in diesem Fall Stammzellen.
Trotz dieser Einschränkungen können die in diesem Bericht beschriebenen Verfahren verwendet werdenKultur der iPS-Zellen und fetaler RPE RPE Ableitung von iPS-Zellen, und die Extraktion von RNA für die Microarray-Analyse von miRNA. Die durch diese Tests erzeugten Daten können verwendet werden, um miRNAs in der Differenzierung beteiligt sind, sowie diejenigen, die RPE Funktionen regulieren.
Obwohl mehr miRNAs gefunden differentiell in der fetalen RPE vs iPS-RPE-Vergleich als in den iPS vs iPS-RPE Vergleich ausgedrückt werden kann, gibt es viele mögliche Gründe. Erstens, bei der dieser Test durchgeführt wurde, das miRNA-Microarray-Plattform war Aufspüren von 1.205 menschlichen und viralen miRNAs 144. Seit dieser Zeit hat die Plattform erweitert, um Sonden für über 2.000 menschlichen miRNAs umfassen. Es ist durchaus möglich, dass die miRNA-Expressionsprofile Differential wird sich ändern, wenn mehr miRNAs entdeckt werden. Der 1.349 miRNAs durch diesen Test nachgewiesen, zeigten die meisten miRNAs keinen Unterschied in der Expression zwischen den Zelltypen (Fig. 2B und 2C
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die hierin enthaltenen Meinungen und Aussagen sind die privaten Ansichten der Autoren und sind nicht als offizielle oder als die die Ansichten der Abteilung der Armee oder des Verteidigungsministeriums ausgelegt werden.
Diese Untersuchung wurde durchgeführt, während die Autoren Whitney A. Greene, Alberto Muñiz und Ramesh R. Kaini hielt eine Postdoctoral Research Associateship National Research Council an der USAISR.
Microarray-Assays wurden durch die Greehey Kinderkrebsforschungsinstitut Microarray-Core Facility und Bioinformatik-Abteilung an der UT Health Science Center in San Antonio durchgeführt.
Diese Arbeit wurde von der US Army Klinische Rehabilitative Medizin Research Program (CRMRP) und Operational Military Medicine Research Program (MOMRP) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-β-mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Fetal RPE media RTEGM kit | Life Technologies | 195406 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Trypsin | Hyclone(Fisher) | 25200-072 | |
| Miltenyi Biotec washing buffer | StemGent | 130-092-987 | |
| Miltenyi Biotec rinsing buffer | StemGent | 130-092-222 | |
| Anti-TRA-1-60 microbead kit | StemGent | 130-095-816 | |
| Miltenyi Biotec cell sorter column | StemGent | 130-021-101 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | |
| RNA 6000 Pico LabChip kit | Agilent | G2938-90046 | |
| Human miRNA microarray v16 | Agilent | G4471A |
References
- Yu, Z., et al. miRNAs regulate stem cell self-renewal and differentiation. Front Genet. 3, 191 (2012).
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