Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

ارتفاع العائد تنقية Published: July 17, 2014 doi: 10.3791/51590
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Division of Infection and Immunity, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, 2Department of Medical Biology, University of Melbourne

Summary

قياس وظيفة الأجسام المضادة هو المفتاح لفهم حصانة لالملاريا المنجلية. يصف هذا الأسلوب تنقية merozoites قابلة للحياة، وقياس تعتمد على طهاية البلعمة من قبل التدفق الخلوي.

Abstract

المتصورة المنجلية مستضدات أقسومة قيد التطوير لقاحات الملاريا المحتملة. جانب واحد من الحصانة ضد الملاريا هو إزالة merozoites خالية من الدم من قبل خلايا البلعمة. ومع ذلك تقييم فعالية وظيفية معينة من الأجسام المضادة opsonizing أقسومة يمثل تحديا بسبب القصير نصف عمر merozoites وتباين الخلايا البلعمية الأولية. وصفت بالتفصيل في هذه الوثيقة هو وسيلة لتوليد merozoites قابلة للحياة باستخدام مثبط البروتياز E64، ومقايسة من أقسومة تعتمد طاهية-البلعمة باستخدام خط خلية موالية للالوحيدات THP-1. E64 يمنع تمزق المتقسمة بينما يسمح للتطوير merozoites التي تم إصدارها عن طريق الترشيح من schizonts المعالجة. وopsonized merozoites بروميد إيثيديوم المسمى مع عينات البلازما البشرية، وأضاف إلى THP-1 الخلايا. ويتم تقييم البلعمة بواسطة بروتوكول إنتاجية عالية موحدة. merozoites قابلة للحياة هي موردا قيما لتقييم NUMERجوانب من الأوس P. البيولوجيا المنجلية، بما في ذلك تقييم الوظيفة المناعية. وترتبط مستويات الأجسام المضادة يقاس هذا الاختبار مع الحصانة السريرية لمرض الملاريا في الأفراد المعرضين بشكل طبيعي. قد يكون الفحص أيضا من استخدام الأجسام المضادة لتقييم اللقاح التي يسببها.

Introduction

وقد تبين أهمية الأجسام المضادة للمناعة ضد الملاريا المنجلية قبل 40 عاما، عندما المناعي من البالغين مفرط المناعة نقلت بشكل سلبي على الأطفال الذين يعانون من الملاريا الحادة مما أدى إلى التخفيف من حدة المرض 1. بالتالي، سعت جهدا كبيرا لتحديد أهداف الحصانة ملاريا وقائية، معظمها من خلال قياس الأجسام المضادة لالتتر الببتيدات أو البروتينات أعرب البكتريا بواسطة ELISA. وقد ثبت الأمصال ELISA يستند أيضا متغير بدرجة كبيرة بين الدراسات، ولا يتناول وظيفة الأجسام المضادة 2. العديد من المستضدات الملاريا لحث على IgG1 أليف الخلايا والأجسام المضادة IgG3 الشخصي، وخاصة المستضدات السطحية أقسومة 3. يوحي هذا التحيز فرعية أن الأجسام المضادة مستقبلات FC-(FCR) التفاعلات مع البالعات مهمة لوظائف المستجيب من opsonizing الأجسام المضادة antimerozoite 4. صممت عدة لقاحات أقسومة مستضد قيد التطوير لانتزاع ظائف المستجيب بلعمية 5 و 6 و على الرغم من الأدلة الهامة لأهمية التفاعلات الأجسام المضادة FCR في نماذج من القوارض الملاريا موجود 7-9، ودعم عدد قليل من الدراسات التي أجريت مؤخرا على أهمية الأجسام المضادة وظيفية وظائف بلعمية المستجيب للحصانة لالملاريا في البشر 10، 11، لا تزال هذه المنطقة المدروسة على نحو رديء. وقد تم دراسة الأجسام المضادة في opsonizing محددة أقسومة محدودة من قبل اثنين من العوامل؛ صعوبة في عزل merozoites نوعية جيدة؛ والاستجابات البلعمة متغير من الخلايا الأولية.

حتى وقت قريب، واستخدمت الطرد المركزي عالية السرعة أو الكثافة Percoll تدرجات لعزل merozoites من supernatants ثقافة تمزق الثقافات المتقسمة. كانت هذه merozoites نادرا ما قابلة للحياة، وغالبا ما تتلاعب مزيدا من الكثافة الطرد المركزي ويغسل متعددة الخطوات من 12، أو 11 الحفظ بالتبريد قبل استخدامها في المقايسات. هذه بروكesses يحتمل فصل العديد من البروتينات المرتبطة محيطيا من سطح أقسومة والبروتينات المعروف أن أهداف الأنتيجين الحصانة ملاريا 13. مؤخرا السيستين مثبط البروتياز عبر Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4 الغوانيدينو) البوتان (E64) وقد استخدمت لتوليد merozoites قابلة للحياة. E64 يمنع تمزق المتقسمة، وتوليد غشاء المغلقة merozoites 14، والتي يمكن أن تتعطل عن طريق الترشيح لتحرير merozoites قابلة للحياة 15 و 16. وقد تؤدي هذه التقنية إلى القرار المكانية من خلال العديد من البروتينات كرات الدم الحمراء الغزو 15، 17-19، وتوضيح تأثير مرحلة معينة من الأدوية المضادة للملاريا عدة 16 و 20. ومع ذلك، فإن جيل من merozoites قابلة للحياة لا يزال تحديا تقنيا. للمساعدة في نشر هذه التقنية وتطبيقها لالمقايسات الفنية الحصانة، بروتوكول مفصلة لتنقية أقسومة قابلة للحياة واستخدامها فييوصف التعاون الخلوية في طهاية والبلعمة هنا: مقايسة وظيفية موحدة من الأجسام المضادة.

يوضح هذه التقنية تقدما كبيرا خلال فحوصات في المختبر السابقة من أقسومة طهاية، مثل انفجار العدلات الجهاز التنفسي، والأجسام المضادة التابعة الخلوية تثبيط (ADCI)، وفحوصات أقسومة البلعمة البديلة. هذه هي المقايسات استنساخه سيئة بسبب التباين في مدخلات الطفيلي ونشاط الخلايا البلعمية الابتدائي 11، 21. قد تلويث هيموزوين أيضا تؤثر تأثيرا عميقا بلعمية وظيفة 22. وذكرت مؤخرا قوية وقابلة للتكرار أقسومة البلعمة مقايسة 23 يستخدم خط الخلية promonocytic THP-1 24. هذا هو نوع من الخلايا مثالية لفحوصات التدفق الخلوي إنتاجية عالية كما هو غير ملتصقة ويؤدي FC-مستقبلات بوساطة البلعمة 25 و 26 على وجه التحديد. على تعقيد إضافي بينما التحرياتtigating البلعمة هو أن درجة البلعمة يعتمد على عدد من merozoites نسبة إلى THP-1 الخلايا وتركيز البلازما. لضمان استنساخ التجارب بين، merozoites يجب أن يكون تعداد وتركيز المعرفة المستخدمة. نظرا لصغر حجمها، وتدفق مطلوب الكمي cytometric.

الإجراء الموضح هنا يزيل هيموزوين ويولد merozoites قابلة للحياة، ويصف تطبيق هذه merozoites لتدفق cytometric تعداد merozoites تليها طهاية والبلعمة. على الرغم من أن تطلبا من الناحية الفنية، والأساليب المذكورة قد تكون مفيدة في توضيح مساهمة استجابات الأجسام المضادة المحددة لسطح أقسومة المكتسبة طبيعيا واللقاح بفعل الحصانة.

Protocol

ملاحظة: جميع الخطوات، إلى جانب الطرد المركزي والتدفق الخلوي، يجب أن يتم تنفيذ داخل غطاء تدفق الصفحي للحفاظ على العقم. ضمان اتخاذ الاحتياطات المناسبة بشأن التعامل مع العينات البشرية. الفحص حساس جدا لكميات صغيرة من البلازما. التخفيفات المقدمة هي الأمثل لحل الردود تتراوح 5-78٪ من الأطفال مع البلازما شبه مأمن من بابوا غينيا الجديدة (PNG). قد تختلف التخفيف الأمثل مع مجموعات البلازما التي يجري اختبارها، وبالتالي فمن المستحسن أن يكون معاير البلازما لتحديد الظروف التجريبية لكل تطبيق. ضمان إدراج 2 ضوابط السلبية THP-1 الخلايا مع merozoites في غياب البلازما؛ وTHP-1 الخلايا مع merozoites opsonized مع مجموعة من البلازما من الملاريا الأفراد السذاجة. وهذا سوف يسمح لمراقبة أقسومة الالتزام THP-1 الخلايا وتمكين صارمة النابضة التدفق الخلوي من الأحداث البلعمة.

كان استخدام عينات البلازما PNGالتي وافقت عليها اللجنة الاستشارية للبحوث الطبية، وبابوا غينيا الجديدة وزارة الصحة، والتر وإليزا هول جنة معهد بحوث أخلاقيات الإنسان (مشروع رقم 04/04). تم الحصول على موافقة خطية من الآباء / أولياء الأمور من جميع المشاركين.

1. THP-1 الثقافة

  1. الحفاظ على خط خلية الوحيدات الإنسان THP-1 في المتوسط ​​RPMI-1640 تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين (FCS) و 55 ميكرومتر 2-mercapthoethanol (THP-1 متوسطة) وعند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة مرطب.
  2. الحفاظ على خلايا في مناطق ذات كثافة أقل من 5 × 10 5 خلية / مل. ملاحظة: سوف يؤدي فرط في التمايز في الخلايا الملتصقة وأسفل تنظيم التيسير المستقبلات. مرة واحدة تم passaged الخلايا حوالي 10 مرات، وذوبان الجليد قارورة جديدة للحفاظ على النمط الظاهري الخلية.

2. إعداد نموذج الجسم المضاد والتخفيف

  1. الحرارة تعطيل البلازما لفحصها والملاريا السذاجة تحكم البلازما التي يحتضنها في 56 °؛ مئوية لمدة 30 دقيقة
  2. متسلسل تمييع عينات البلازما إلى 1/2، 000 في THP-1 حبة متوسطة الحجم.
  3. البلازما المخفف مخزن في -20 درجة مئوية.

3. ثقافة المتزامنة عالية P. المنجلية

ملاحظة: الخط الطفيلي، معربا عن GFP D10-PfPHG استخدمت 27 نظرا ل48 ساعة دورة الحياة الذي يساعد تزامن الطفيليات وتوقيت رقابة من E64 بالإضافة إلى ذلك. وعلاوة على ذلك، لأن هذا الخط يعبر عن GFP في العصارة الخلوية، هذا الخط يسمح الكشف عن الطفيليات في الدم وmerozoites مجانا من الكشف عن تدفق cytometric من GFP. ومع ذلك، فإن كثافة مضان GFP ليست كافية لتوفير التصور داخل THP-1 الخلايا، وبالتالي، يتم counterstained merozoites مع إيثيديوم بروميد (EtBr). يمكن استخدام سلالات طفيلي أخرى، شريطة أن التزامن ضيق يمكن تحقيقه. مزامنة الطفيليات باستخدام مزيج من العلاج السوربيتول إلى ليز أشكال ناضجة 28 والهيبارين لمنع الغزو 15

  1. الحفاظ على P. المنجلية الطفيليات في O + الكريات الحمراء البشرية (RBC) في 3٪ الهيماتوكريت في المتوسط ​​RPMI-1640 (الرقم الهيدروجيني 7.4) تستكمل مع 25 ملغ / مل HEPES، 50 ميكروغرام / هيبوزانتين مل، 10٪ تجميع المصل البشري، 2 ملغ / مل بيكربونات الصوديوم، و 20 ميكروغرام / مل جنتاميسين (متوسطة الطفيلي). إضافة 5 ملغ / مل Blasticidin S-هيدروكلوريد إلى مستنبت لتحديد لGFP + الطفيليات.
  2. احتضان الثقافات في صناديق ضيقة الهواء أو قوارير مختومة بدلا من ثقافة مزدوجة عند 37 درجة مئوية في جو من 1٪ O 2، 4٪ CO 2 و 95٪ N 2.
  3. إعداد الشرائح مسحة رقيقة، وإصلاح في الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 10 ثانية، وصمة عار مع 10٪ بالغيمزا الحل في 6.7 ملم (7.1 درجة الحموضة) العازلة الفوسفات (حل بالغيمزا) لمدة 10 دقيقة لرصد الطفيل. بعد تلطيخ، وشطف الشرائح في الماء والهواء الجاف. تقييم الطفيل باستخدام 100X عدسة الغمر النفط.
  4. الحفاظ على الثقافات الطفيلي في الطفيل أقل من 5٪ المصابة RBC عن طريق تقسيم الثقافات وإضافة المعافينRBC كما هو مطلوب.
  5. لمزامنة مع الهيبارين، إضافة 20 وحدة دولية / مل من الصف الطبية الهيبارين لعصابة مرحلة الثقافات.
  6. في حين أن معظم الطفيليات في مرحلة المتقسمة، وخلايا بيليه في 300 x ج لمدة 5 دقائق، وإزالة المحتوية على الهيبارين والمتوسطة resuspend في طفيل المتوسطة للسماح تمزق المتقسمة والغزو أقسومة.
  7. بعد 4 ساعات، إضافة 20 وحدة دولية / مل الهيبارين إلى الثقافات، ومنع أي غزو أقسومة أخرى. ملاحظة: قد تكون هناك حاجة عدة دورات من السوربيتول والعلاج الهيبارين قبل تتم مزامنة الطفيليات بما فيه الكفاية. لإنشاء أرقام مناسبة من merozoites، وإعداد 150 مل من ثقافة الطفيلي في 3-5٪ الطفيليات في الدم.

4. عزل أواخر المرحلة P. المنجلية النواشط

  1. ستة وثلاثون ساعة بعد عودته إلى الهيبارين الثقافات، بيليه الخلايا المستزرعة في 300 x ج لمدة 5 دقائق، وبيليه resuspend في طفيل المتوسطة عند 25٪ الهيماتوكريت.
  2. إرفاق العمود المغناطيسي كبيرة (حجم المصفوفة 6.3مل) إلى المغناطيس، وتتوازن مع العمود الطفيلي المتوسطة، والتأكد من إزالة جميع فقاعات الهواء.
  3. إضافة P. معلق ثقافة المنجلية إلى العمود، وضبط معدل تدفق إلى قطرة واحدة في الثانية.
  4. مرة واحدة وقد مرت الثقافة من خلال العمود، وغسل العمود مع الطفيلي متوسطة حتى يعمل من خلال تدفق واضح.
  5. أزل الطفيليات من العمود في 30 مل من 37 درجة مئوية طفيل المتوسطة.
  6. إعداد مسحة رقيقة من الطفيليات، وإصلاح في الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 10 ثانية، وصمة عار مع حل بالغيمزا لمدة 3 دقائق. فحص الشريحة تحت المجهر، والتأكد من أن الطفيليات تملأ تقريبا خلايا الدم الحمراء، ويبدو أن في مراحل مبكرة المتقسمة. إذا لم تصل بعد إلى مرحلة النضج الطفيليات المناسب، والعودة الطفيليات المنقى إلى الحاضنة 37 درجة مئوية في جو من 1٪ O 2، 4٪ CO 2 و 95٪ N 2 حتى وضعت بشكل مناسب. مطلوب الطهارة أكبر من 90٪ المصابة خلايا الدم الحمراء لضمان R: ملاحظةBCS لا تلوث الاستعدادات أقسومة.
  7. علاج schizonts معزولة مع 10 ميكرومتر E64 (Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4 الغوانيدينو) البوتان (E64) ل6-10 ساعة ملاحظة: أوقات أطول الحضانة مع E64 هي ممكن، ولكن سوف تنتج merozoites لم يعد من الممكن الغازية.

5. عزل P. المنجلية Merozoites

  1. بعد الحضانة مع E64، تشويه الطفيليات، وإصلاح الخلايا في الميثانول بنسبة 100٪، وصمة عار مع بالغيمزا الحل لتقييم تشكيل merozoites المغلقة الغشاء. ملاحظة: سيتم الحصول على محصول جيد من merozoites إذا أكبر من 50٪ من الطفيليات وقد شكلت غشاء merozoites المغلقة.
  2. schizonts بيليه E64 المعاملة في 1،900 x ج لمدة 8 دقائق. تغسل مع 50 مل من المتوسط ​​RPMI RT-1640 (الرقم الهيدروجيني 7.4) تستكمل مع 25 ملغ / مل HEPES، 50 ميكروغرام / مل هيبوزانتين، 2 ملغ / مل بيكربونات الصوديوم، و 20 ميكروغرام / مل جنتاميسين (غسل المتوسطة) لإزالة ما تبقى مصل الإنسان .
  3. resuspend وبيليه في 2 مل من غسل المتوسطة. ملاحظة: يمكنك استخدام FCS المحتوية على THP-1 وسائل الاعلام إنتاج مزبد خلال الترشيح.
  4. تحديد مل 2 من معلق E64-schizonts خلال 1.2 ملم μm/32 تصفية حقنة. جمع الراشح في أنبوب 10 مل. ملاحظة: الراشح يحتوي merozoites وبلورات هيموزوين، مع schizonts-تمزق الامم المتحدة والحطام التي تم جمعها في التصفية.
  5. إرفاق العمود مغناطيسية صغيرة إلى المغناطيس، وتتوازن مع 500 ميكرولتر THP-1 حبة متوسطة الحجم.
  6. تمرير الترشيح خلال عمود المغناطيسي. جمع من خلال تدفق. ملاحظة: سوف هيموزوين ربط العمود، في حين merozoites سوف بالمرور.
  7. تمر من خلال تدفق على عمودين أكثر من مرة لإزالة هيموزوين، وجمع تدفق من خلال كل الوقت.
  8. شطف العمود مع 2 مل من THP RT-1 حبة متوسطة الحجم لجمع أي merozoites المتبقية.
  9. إضافة EtBr في 10 ميكروغرام / مل (تركيز النهائي) وصمة عار لمدة 30 دقيقة في RT. حماية من الضوء لمنع photobleaching من. ملاحظة: تأكد من أن جميع وسائل ص EtBr الملوثةيتم التخلص من النفايات lastic منها بطريقة مناسبة للمواد الكيميائية السامة للخلايا. لم يعد Merozoites هي الغازية التالية هذه الحضانة.
  10. تدور باستمرار في merozoites 4،000 x ج لمدة 10 دقيقة.
  11. تجاهل طاف في حاوية النفايات المناسبة.
  12. في resuspend أقسومة بيليه في 4 مل THP-1 متوسطة، وتدور باستمرار في 4000 x ج لمدة 10 دقيقة.
  13. إضافة THP-1 حبة متوسطة الحجم تصل إلى حجم 15 مل، وحمايتها من الضوء.

6. تحديد مقدار أقسومة تركيز من قبل التدفق الخلوي

  1. جلب عد حبات لRT.
  2. إعداد برنامج تلفزيوني مع 0.5٪ BSA لتمييع merozoites.
  3. عد merozoites في 3 التخفيفات؛ 1 في 100؛ 1 في 50 و 1 في 25. إعداد نظام مراقبة الأصول الميدانية 3 أنابيب مع 940، 930 و 910 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني +0.5٪ BSA، على التوالي. إضافة 10 و 20 و 40 ميكرولتر من merozoites النقية لكل أنبوب، على التوالي.
  4. الخرز دوامة العد لمدة 30 ثانية، وإضافة 50 ميكرولتر من الخرز في أنبوب يحتوي على نظام مراقبة الأصول الميدانية merozoites المخفف.
  5. تشغيل ثلاث ديلأقسومة عينات uted على تدفق عداد الكريات مجهزة مع ليزر 488 نانومتر. تعيين بوابة صرامة لmerozoites استنادا EtBr ومضان GFP مضان مزدوجة، والخرز بوابة العد بواسطة مضان في قناة منفصلة. اكتساب الأحداث حتى يتم جمع 2،000 الخرز. ملاحظة: هذه التعليمات تشير إلى عد GFP + merozoites التي تم الملون مواجهة مع EtBr. إن لم يكن استخدام GFP معربا عن الطفيليات ثم تعيين بوابات أقسومة على أساس مبعثر الجانب وEtBr مضان.
  6. تحديد نسبة merozoites: الخرز بقسمة عدد من الأحداث أقسومة من 2،000 العد الأحداث حبة، وحساب نسبة لكل التخفيف. استخدام المواصفات دفعة العد حبة لتحديد عدد من الخرز في 50 ميكرولتر من الخرز المضافة لكل أنبوب.
  7. ضرب عدد من الخرز في 50 ميكرولتر من قبل عامل التخفيف وقبل أقسومة: نسبة حبة لذلك عامل التخفيف. هذا الرقم يعادل تركيز merozoites لكل مل. أداء الجنوب شرقي الخطوات لكل التخفيف.
  8. متوسط ​​التركيزات أقسومة قياس عبر التخفيفات ثلاثة. ملاحظة: الانحرافات المعيارية بما يزيد عن 10٪ لتركيزات المقررة لل1 في 100، 1 في 50، و 1 في 25 التخفيفات تشير إلى أخطاء فنية في إعداد عينات العد.
  9. في resuspend merozoites في 8 × 10 6 merozoites / مل في THP-1 حبة متوسطة الحجم لضمان نسبة النهائي من أربعة merozoites في THP-1 الخلية. ملاحظة: أقسومة أخرى لTHP-1 النسب يمكن استخدامها، ويجب أن يتم تعديل تركيزات فقا لذلك.

7. الفحص البلعمة

  1. إضافة 200 ميكرولتر من الحرارة FCS غير نشط لكل بئر من 96 لوحات جيدا U-القاع، وترك في RT O / N لمنع وحات. بعد الحضانة، وإزالة FCS ويغسل الآبار مرتين مع برنامج تلفزيوني العقيمة 200 ميكرولتر. إزالة برنامج تلفزيوني وألواح تخزينها في 4 درجات مئوية حتى المطلوبة.
  2. حساب عدد THP-1 الخلايا المطلوبة لاختبار عينات البلازما والضوابط، مما يسمح الآبار ثلاث نسخ لكل عينة في 1 × 10
  3. تحديد THP-1 تركيز الثقافة عن طريق تحميل 10 ميكرولتر من ثقافة إلى شريحة haemocytometer. حساب عدد الخلايا الموجودة في 4 مجموعات من 16 الساحات ركن من أركان haemocytometer تحت المجهر، ثم متوسط ​​التهم. مضاعفة متوسط ​​تعداد وضعته و10،000 لحساب عدد الخلايا لكل مل.
  4. تدور باستمرار العدد المطلوب من THP-1 الخلايا في 500 x ج لمدة 5 دقائق، و resuspend في 6.7 × 10 5 خلية / مل في THP-1 حبة متوسطة الحجم.
  5. إضافة 150 ميكرولتر من THP-1 الخلايا في THP-1 المتوسطة لكل بئر لحظر FCS-96 لوحة جيدا U-السفلي، مما أدى في 10 5 خلية / جيدا. إعداد 3 آبار في العينة التي سيتم اختبارها. العودة إلى لوحة الحاضنة حتى على استعداد لإضافة merozoites.
  6. إضافة 150 ميكرولتر من إعداد أقسومة في 8 × 10 6 / مل لكل بئر لحظر FCS-96 لوحة جيدا U-أسفل منفصلة. الاستعداد الجيد واحدة لكل عينة اختبار
  7. إضافة 10 ميكرولتر من استعداد عينات البلازما المخفف لكل بئر، لرانه يحتوي على لوحة merozoites، وتخلط جيدا لضمان حل متجانسة.
  8. إزالة لوحة THP-1 من الحاضنة، وإضافة 50 ميكرولتر من الحل أقسومة / البلازما لكل بئر تحتوي على خلايا THP-1، مع الآبار ثلاث نسخ لكل عينة البلازما.
  9. تخلط جيدا، واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2، حاضنة مرطب لمدة 40 دقيقة. مع تغطية احباط للحماية من ضوء.
  10. بعد 40 دقيقة، وعينات من أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 x ج في 4 ° C prechilled الطرد المركزي لإلقاء القبض البلعمة.
  11. إزالة طاف، وغسل الخلايا مرتين في الجليد الباردة PBS +0.5٪ BSA +2 ملي EDTA (FACS العازلة). ملاحظة: سوف EDTA تسهيل في الحفاظ على تعليق خلية واحدة لتحليل التدفق الخلوي.
  12. إصلاح الخلايا في 90 ميكرولتر من 2٪ بارافورمالدهيد (PFA) في برنامج تلفزيوني +0.5٪ BSA +2 ملي EDTA (نظام مراقبة الأصول الميدانية تثبيتي). يترك على الجليد حتى الاستحواذ، محمية من الضوء.

8. التدفق الخلوي

  1. الحصول على عينات باستخدام تدفق عداد الكريات واي مجهزةال ليزر 488 نانومتر وإنتاجية عالية قارئ لوحة المرفق. ملاحظة: وهذا سيمكن تصل إلى 400 عينات البلازما لفحصها من إعداد أقسومة واحدة. يمكن أيضا نقل خلايا لأنابيب لدليل نموذج التحميل.
  2. بوابة قابلة للحياة THP-1 الخلايا عن طريق إلى الأمام والجانب مبعثر.
  3. تعيين البوابة إيجابية EtBr على أساس 'THP-1 الخلايا مع merozoites ولا البلازما "السيطرة.
  4. الحصول على الحد الأدنى من 10،000 الأحداث في العينة.

9. تحليل البيانات

  1. تحليل البيانات باستخدام التدفق الخلوي برامج التحليل، ووضع بوابات صرامة للأحداث إيجابية EtBr.
  2. حساب نسبة البلعمة لكل عينة: ل٪ من EtBr + الخلايا لعينة ناقص الخلايا إيجابية٪ مع البلازما غير المناعي.
  3. متوسط ​​النتائج عبر يثلث. ملاحظة: الانحرافات المعيارية لثلاث نسخ بما يزيد عن 10٪ تشير إلى عدم الدقة التجريبية. ويمكن ملاحظة خلفية بعض الأحداث EtBr إيجابية نتيجة merozoiيجب أن تكون الشركة المصرية للاتصالات التصاق على سطح THP-1 الخلايا، ولكن متناسقة عبر جميع العينات التي تحتوي على merozoites. ووضع بوابة على أساس 'THP-1 الخلايا مع merozoites ولا البلازما' السيطرة، ومن ثم يحذف أي خلفية 'THP-1 خلايا البلازما مع غير محصنة' السيطرة يؤدي إلى٪ البلعمة التي تعكس مضان بسبب المنضوية / المبتلعة merozoites فقط.

Representative Results

مرحلة نضوج الطفيليات قبل العلاج E64 هو أمر حاسم لتوليد merozoites المغلقة الغشاء. يبين الشكل 1Ai مرحلة النضج المناسبة من schizonts لإضافة E64. يجب أن تكون الطفيليات الكبيرة وملء ما يقرب من خلايا الدم الحمراء. A مظهر أرقط من بالغيمزا صمة عار يشير بدأت نماء جزئي، وينبغي أن يضاف E64 لانتاج merozoites المغلقة غشاء (الشكل 1Aii). إذا تم إضافة E64 في وقت سابق إلى أتروفة الطفيليات المرحلة، لا يتم إنشاء غشاء merozoites المغلقة حتى بعد 12 ساعة من E64. بدلا الطفيليات تأخذ على التشكل غير طبيعية مثل توسيع فجوة في الجهاز الهضمي (الشكل 1Bi و1Bii)، وليس تتشكل merozoites. إذا تم إضافة E64 في وقت لاحق إلى schizonts، لا يتم إنشاء merozoites المغلقة الغشاء كما هو يحتاطون المتقسمة تمزق (الشكل 1Ci و1Cii). مطلوب مستوى عال من الطفيليات التزامن، وغيرهاسيتبين الحكمة مجموعة من جميع النتائج الثلاث المذكورة بعد العلاج E64.

إزالة هيموزوين هو خطوة حاسمة أخرى لتنقية merozoites. إذا لم يتم تنقيته من merozoites هيموزوين ثم تشكيل مجموعات-أقسومة هيموزوين التي لا يمكن فكها من قبل pipetting. هذه المجاميع تعمل على عداد الكريات كأحداث واحد، وإن كان ذلك مع مختلف الأمام ومبعثر والجانب مبعثر من الخصائص merozoites واحد، مما أدى إلى عد أقسومة غير دقيقة من قبل التدفق الخلوي (الشكل 2A). كما THP-1 الخلايا يمكن أيضا يبلعم هيموزوين، هذه المجموعات أقسومة-هيموزوين يمكن أيضا المبتلعة (الشكل 2B). هذه المجاميع هي الفلورسنت EtBr للغاية لأنها تحتوي على merozoites متعددة. البلعمة من نتائج المجاميع في THP-1 الشخصي EtBr مضان يعادل ذلك الذي لوحظ لالبلعمة من merozoites فردية متعددة. وبالتالي، إذا لم يتم إزالة هيموزوين، فإن مضان EtBr من THP-1 الخلايا يكون سverestimate من إمكانات لopsonizing البلازما التي يجري اختبارها. وتفيد التقارير أيضا إلى هيموزوين يغير كثيرا ظيفة بلعمية. هي ملطخة merozoites إيجابية GFP مواجهة مع EtBr لزيادة التصور من merozoites المبتلعة من قبل THP-1 الخلايا. باستخدام الظروف الموصوفة في هذا البروتوكول، وcounterstained جميع merozoites GFP إيجابية مع EtBr التي لديها كثافة مضان أكثر إشراقا (الشكل 3A). تقييم البلعمة من قبل EtBr مضان يتيح دقة فائقة من أقسومة البلعمة من GFP مضان (الشكل 3B).

فإن عدد merozoites تضاف إلى فحص تعدل كمية البلعمة ملاحظتها. لهذا السبب، العد دقيقة بواسطة التدفق الخلوي أمر بالغ الأهمية. زيادة نسب merozoites: سوف THP-1 يؤدي إلى زيادة التزام merozoites لTHP-1 الخلايا في غياب البلازما (الشكل 4A). زيادة أقسومة: THP-1 نسب النتائج أيضا إلى زيادة درجة الحموضةردود agocytosis عندما يتم opsonized merozoites (الشكل 4B). 4:1 أقسومة: ينصح THP-1 نسبة للاستجابات أكلة قوية. باستخدام هذه النسبة، والتخفيف من البلازما المشار إليها، هذا الاختبار هو قادرة على حل مستويات منخفضة ومتوسطة وعالية من الأجسام المضادة opsonizing. وقد لوحظت بين 0 و 78 في المئة الردود البلعمة باستخدام PNG عينات البلازما وغيرها من الشروط وصفها. وتظهر هذه الاستجابات مؤخرا لاقترانه المكتسبة طبيعيا الحصانة السريرية لمرض الملاريا 10. ويبين الشكل 5 أمثلة من 4 الربعية الردود البلعمة من الأفراد PNG.

الشكل 1
الشكل 1. توقيت E64 بالإضافة إلى ذلك أمر بالغ الأهمية لتوليد merozoites المغلقة الغشاء. (A) maturatio المناسبةلا يتم إنشاء ن مرحلة من الطفيليات ط) قبل العلاج E64، والثاني) merozoites المغلقة غشاء إنتاجها بعد 6 ساعة من العلاج E64 (B) غشاء merozoites المغلقة إذا تم إضافة E64 للطفيليات غير ناضجة؛ ط) النواشط المرحلة المتأخرة، والثاني) بعد 12 ساعة من E64 (لا تحول دون C) المتقسمة تمزق إذا تم إضافة E64 إلى أواخر schizonts مجزأة؛ ط) schizonts المرحلة المتأخرة، والثاني) بعد 6 ساعة من E64. يمثل شريط نطاق 10 ميكرون.

الرقم 2
الشكل 2. إزالة هيموزوين أمر بالغ الأهمية لتوليد تعليق أقسومة وحيدة الخلية. الشكل المجاميع أقسومة-هيموزوين التالية الترشيح من الغشاء merozoites المغلقة، ما لم يتم فصل هيموزوين مغناطيسيا من merozoites. (A) إلى الأمام، مبعثر والجانبية مبعثر المؤامرات من merozoites مع هيموزوين إزالةواحتفظ هيموزوين. (B) المجاميع هيموزوين أقسومة يمكن المبتلعة من قبل THP-1 الخلايا. ملطخة فرق-خيارات الشرائح خلوي تدور من THP-1 الخلايا المحتضنة مع بابوا نيو غينيا البلازما opsonized الاستعدادات أقسومة مع أو بدون هيموزوين. يمثل شريط نطاق 10 ميكرون.

الرقم 3
الرقم 3. يسمح إيثيديوم بروميد تلطيخ لدقة فائقة من أقسومة البلعمة. يتم counterstained D10-GFP merozoites المنقى مع EtBr لتحسين كثافة مضان (أ) التدفق الخلوي histrogram من merozoites المنقى مع تبوب على merozoites إيجابية GFP، وصمة عار نقطة تظهر EtBr مضان GFP في هذا مسور السكان إيجابية. (B) مبعثر إلى الأمام مقابل GFP ومبعثر إلى الأمام مقابل EtBr من THP-1 خلايا البلعمة التالية من GFP وEtBr merozoites الفلورسنت مزدوجة. ود بوابات rawn استنادا إلى خلايا THP-1 مع merozoites وأي سيطرة البلازما.

الرقم 4
الرقم 4 أقسومة: THP-1 نسبة يؤثر على درجة من البلعمة ملاحظتها. (أ) خمسة أقسومة: وصفت THP-1 النسب؛ 50:1، 20:01، 10:01، 04:01، 1:1. الخلايا السيطرة فقط يشير مضان الخلفية بسبب THP-1 الخلايا. يشار THP-1 EtBr مضان لكل نسبة لmerozoites opsonized مع مجموعة من PNG البلازما أو البلازما مع الاسترالي nonimmune (B) متوسط ​​كثافة مضان THP-1 للخلايا أقسومة مختلفة:. THP-1 النسب، و opsonization مع بركة من PNG البلازما أو البلازما الاسترالية nonimmune (يعني + ووزارة شؤون المرأة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

ove_content "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الرقم 5
الرقم 5. هناك مجموعة كبيرة من الأجسام المضادة opsonizing يمكن قياسها. تم opsonized Merozoites مع البلازما من الأفراد PNG وحضنت مع THP-1 الخلايا. يتم عرض أربعة ردود البلعمة ممثل. ووضعت بوابات استنادا إلى خلايا THP-1 مع merozoites وأي سيطرة البلازما، والأرقام تشير إلى البلعمة٪ بعد الطرح من الخلايا THP-1 مع التحكم في البلازما غير المناعي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

لقياس أقسومة البلعمة، والكفاءة في اثنين من التقنيات المطلوبة: تنقية merozoites وTHP-1 البلعمة الفحص. أهم الخطوات الحاسمة لدمج هذه التقنيات هما: 1) الطفيليات متزامنة للغاية؛ 2) إضافة E64 في الوقت الصحيح لانتاج الغشاء merozoites المغلقة؛ 3) إزالة هيموزوين لتجنب الركام؛ 4) عد أقسومة دقة من قبل التدفق الخلوي؛ 5) التخفيف من البلازما المستخدمة؛ و6) الحفاظ على كثافة خلايا انخفاض عدد ومرور THP-1 الخلايا. ودراسة متأنية لهذه الجوانب الرئيسية لوحظ ضمان استجابات قوية البلعمة.

وعلى الرغم من وصفها هنا هو إعداد merozoites لتقييم البلعمة، ويمكن استخدام هذه التقنية لمجموعة واسعة من التطبيقات. بغض النظر عن منهجية تيار أسفل، الاستعدادات أقسومة الأمثل تعتمد على توقيت E64 بالإضافة إلى ذلك بشكل صحيح من أجل توليد merozoites. وقد تبين طريقة E64 الموصوفة هنا إلى ذدرع merozoites الغازية للاستخدام في ارتفاع القرار المجهري للأحداث الغزو وفحوصات الحساسية المخدرات 15-20. بينما الجدوى أقسومة ليست ضرورية لالبلعمة، مطلوب سلامة معطف سطح أقسومة. وبالتالي فإن أسلوب E64 الموصوفة هنا يسمح merozoites عالية الجودة التي يتم إنتاجها لتقييم استجابات الأجسام المضادة إلى معطف السطح. كما هو مبين في الشكل 1، إذا تم إضافة E64 في وقت مبكر جدا أو لا تتشكل بعد فوات الأوان غشاء merozoites المغلقة. لهذا السبب، هناك حاجة الثقافات الطفيلي متزامن للغاية. هنا، واستخدام العلاجات السوربيتول والهيبارين لبإحكام مزامنة D10-GFP الثقافات الطفيلي إلى نافذة من 2 ساعة يوصف. الهيبارين يمكن أن تعزز gametocytogenesis في مختبر أخرى يعزل، وبالتالي يجب أن تستخدم بعناية. طرق تزامن البديلة مثل ألانين يمكن أن تستخدم أيضا، شريطة أن الطفيليات متزامنة بإحكام ويتم إنتاج 29. إذا تم إضافة E64 للطفيليات غير متزامنة، دعامة أقلوسيتم إنتاج ortion من merozoites المغلقة الغشاء وإصابة الطفيلي المتبقية سوف RBC إما تمزق عادة أو تطوير التشكل غير طبيعي. فإن وجود الطفيليات التي لم تتطور في الغشاء المغلقة merozoites يؤدي إلى انسداد الفلتر والحد بشكل كبير من العائد أقسومة الحصول عليها.

خلال الترشيح من merozoites المغلقة الغشاء، هيموزوين يتحرر من فجوات الهضمي وبوصفها بلورات الحرة في الحل. هيموزوين هو proinflammatory للغاية وتم الإبلاغ لتعديل الوحيدات البلاعم والبلعمة الردود 30 و 31. بالإضافة إلى تحوير البلعمة، كما هو مبين في الشكل 2، ويمكن تشكيل المجاميع هيموزوين مع merozoites في الحل. كما THP-1 الخلايا يمكن يبلعم هذه المجاميع، وهذا يمكن أن يكون المحير الرئيسية لقرار من الأجسام المضادة بوساطة البلعمة. لذلك، إزالة هيموزوين ضروري في هذا الاختبار لAVتعقيد إضافي OID من هيموزوين على بلعمية علم الأحياء. بالإضافة إلى ذلك، عدم إزالة هيموزوين قد تكون ضارة أيضا عند استخدام هذه التقنية لتوليد merozoites الحرة لتطبيقات أخرى، وخاصة التي تتطلب أقسومة الكمي.

كما هو مبين في الشكل (4)، وأضاف أن عدد merozoites إلى مقايسة يمكن أن تؤثر على درجة من البلعمة من قبل THP-1 الخلايا. على الرغم من التدفق الخلوي يسمح لتعداد تركيز أقسومة، pipetting لدقيق وتكرار التهم من merozoites ضرورية لتحسين الدقة. هذا أمر بالغ الأهمية خصوصا إذا الطفيلي خطوط متعددة هي لفحصها جنبا إلى جنب. وقد سبق أن ثبت أن البلازما من نصف الأطفال في مأمن من PNG يمكن أن تضعف بشكل كبير قبل الانخفاض الردود 23. الموصوفة هنا هو التخفيف الأمثل من البلازما (1/120، 000 التخفيف النهائي من البلازما) لفيف من 5 - الأطفال PNG من العمر 12 سنة التي أنتجت مجموعة كبيرة من phagocyt. ردود عمليات التفتيش الموقعي هو موضح في الشكل 5 هذا النطاق المسموح به لالطبقية من الردود إلى أربع مجموعات (0-19٪، 20 - 39٪، 40-59٪ و60-79٪ البلعمة)، وكشفت النمذجة الانحدار أن الاستجابات opsonizing ارتبطت الحماية من المرض السريري وجود الطفيليات في الدم عالية الكثافة 10 للفوج يدرس مختلفة قد يكون من الضروري لضبط التخفيف البلازما لضمان البلعمة من قبل THP-1 الخلايا لا غير المشبعة أو دون مستوى الكشف.

التدفق الخلوي يسمح البلعمة سريعة وقابلة للقياس الكمي مع تحسين دقة أكثر المجهري. هذا البروتوكول هو إنتاجية عالية، لوحة ومقرها الآلي اقتناء 96 لوحات جيدة لدراسة المكتسبة طبيعيا الحصانة الخلطية. يتطلب أسلوب تلطيخ مع بروميد إيثيديوم merozoites والبقع الحمض النووي ولكن البديلة مثل SYBRgreen، دابي وpropidium اليود والبقع أو البقع غشاء البروتين يمكن الاستفادة منها. سيكون هذا الاختبار تكون قابلة للPRIMARذ حيدات أو العدلات، ويمكن تكييفها إذا كان بلعمية أو FCR بيولوجيا الفائدة. الخلايا الأولية أو THP-1 خلايا متباينة في المختبر مع سلطة النقد الفلسطينية يمكن استخدامها لدراسة البلعمة في الملاريا ومسببات الأمراض الأخرى 12، 32-34. ومع ذلك باستخدام الخلايا الأولية قد تكون صعبة حيث أن هذه الخلايا هي ملتصقة وعرض غير الأجسام المضادة بوساطة البلعمة 35 أيضا. بالإضافة إلى ذلك، تقلب في الطهارة، والسلامة وظائف بعض القيود الرئيسية لاستخدام الخلايا البلعمية الأولية. المستقبلات التيسير المشاركة في أقسومة البلعمة تبقى uncharacterized، وبالتالي يمكن منع استخدام الأجسام المضادة لمستقبلات محددة التيسير توضيح مساهمة كل التيسير مستقبلات لأقسومة البلعمة. كما THP-1 البلعمة هو FCR تعتمد، وهذا يتيح تفسير واضحة من البلعمة ملاحظتها. هذا الاختبار يفسح المجال أيضا لمعالجة خصوصية المستضد من الأجسام المضادة التي opsonizing يمكن تحقيقه عن طريق UTILizing الطفيليات خروج المغلوب لمستضدات سطح أقسومة، أو باستخدام تقارب الأجسام المضادة البشرية النقية لأقسومة البروتينات السطحية. علاوة على ذلك، دراسات متعمقة الردود خلوى التالية أقسومة البلعمة تعاني من نقص، ويمكن تحقيق ذلك باستخدام هذا الاختبار.

هذه التقنيات اثنين تشكل تقدما كبيرا لدراسة الأجسام المضادة antimerozoite الوظيفية. تنقية merozoites جودة عالية هو مفيد لاستخدام merozoites cryopreserved، أو المجهرية الفلورسنت المغلفة مع مستضدات أقسومة. على الرغم من أن هذا الاختبار قد تم استخدامه كأداة لتقييم المناعة المكتسبة طبيعيا، فإنه قد يثبت أداة هامة لمعالجة اكتساب الحصانة ردا على التطعيم. في حين أنه ثبت مؤخرا أن البلعمة أو merozoites opsonised يرتبط مع حماية من الملاريا السريرية، وأنه ليس من الممكن التوصل إلى استنتاجات مباشرة من في المختبر THP-1 البلعمة لفي الجسم الحي phagocytoجهاز الأمن والمخابرات من merozoites كما البلعمة في هذا الاختبار يحدث في ظل ظروف ثابتة وغياب خلايا الدم الحمراء المتنافسة. وبالتالي قد التعديلات المحتملة لهذا الاختبار توفير أداة مرنة لمزيد من فهم الملاريا وأقسومة البلعمة.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

الكتاب نود أن نعترف الأطفال والجهات المانحة البلازما الكبار، والموظفين في بابوا غينيا الجديدة معهد للأبحاث الطبية. فإن الكتاب أود أن أشكر أماندين B Carmagnac، كاثرين س نيه، داني ويلسون W، ايفو مولر وديانا S هانسن لمساهمتهم في تطوير هذه التقنية، وأشكر الصليب الأحمر الأسترالي لحزم الدم والمصل. وقدم هذا العمل ممكنا من خلال الفيكتوري حكومة الولاية التنفيذية البنية التحتية ودعم الحكومة الأسترالية NHMRC IRIISS. وأيد هذا العمل من قبل مجلس البحوث الطبية الصحية الوطنية ويمنح # 1031212 # 637406 و، والمعاهد الوطنية للصحة منح AI089686 #.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
THP-1 cell line American Type Culture Collection TIB-202
RPMI-1640 Gibco 31800-089
Fetal Calf Serum (FCS) Invitrogen 10099-141
2-mercapthoethanol  Sigma-Aldrich M6250-100ML Use in Fume Hood
Pen/Strep Solution (100x) Sigma P0781
HEPES SAFC 90909C Cell culture grade
Hypoxanthine Calbiochem 4010
Human Serum  Donation from Australian Red Cross Available commercially (i.e. Invitrogen)
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Merck 1.06329.0500
Gentamycin Pfizer 61022027 Injection Quality
Heparin Sodium BP (5000 IU/ml) Pfizer Porcine origin
Blasticidin S-hydrochloride Sigma-Aldrich 15205
D-Sorbitol Sigma-Aldrich 50-70-4
E64 Protease Inhibitor Sigma-Aldrich E3132-10MG
KH2PO4 Sigma-Aldrich 98281-100G Use for phosphate buffer
Na2HPO4.2H20 Merck 10383.4G Use for phosphate buffer
Giemsa's azur eosin methylene blue solution Merck 1.09204.0500 1:10 dilution in 6.7 mN Phosphate buffer (make fresh each stain)
EDTA disodium salt Merck 10093.5V 0.1 M, pH 7.2
Acrodisc Syringe Filters 1.2-μm/32-mm Pall Life Sciences 4656
QuadroMACS Separator (for small column) MACS Miltenyi BioTec 130-091-051 Interchangeable with MidiMACS 
VarioMACS Separator (for large columns) MACS Miltenyi BioTec 130-090-282
MACS MultiStand MACS Miltenyi BioTec 130-042-303
LS Column (small magnetic column) MACS Miltenyi BioTec 130-042-401
Large magnetic column MACS Miltenyi BioTec 130-041-305
Ethidium Bromide Bio-Rad 1510433 Cytotoxic
CountBright Absolute Counting Beads Invitogen C36950
BD FACSCalibur Flow Cytometer with HTS plate reader BD Biosciences
EDTA disodium salt Merck 10093.5V 0.1 M, pH 7.2
FlowJo cytometry analysis software Tree Star

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cohen, S., McGregor, I. A., Carrington, S. Gamma-globulin and acquired immunity to human malaria. Nature. 192, 733-737 (1961).
  2. Fowkes, F. J. I., Richards, J. S., Simpson, J. A., Beeson, J. G. The relationship between anti-merozoite antibodies and incidence of Plasmodium falciparum malaria: A systematic review and meta-analysis. PLoS Medicine. Medicine, P. L. oS. 7, (2010).
  3. Bouharoun-Tayoun, H., Attanath, P., Sabchareon, A., Chongsuphajaisiddhi, T., Druilhe, P. Antibodies that protect humans against Plasmodium falciparum blood stages do not on their own inhibit parasite growth and invasion in vitro, but act in cooperation with monocytes. The Journal of experimental medicine. 172, 1633-1641 (1990).
  4. Jafarshad, A., et al. A novel antibody-dependent cellular cytotoxicity mechanism involved in defense against malaria requires costimulation of monocytes FcgammaRII and FcgammaRIII. Journal of immunology. 178, Baltimore, MD. 3099-3106 (1950).
  5. Genton, B., et al. A recombinant blood-stage malaria vaccine reduces Plasmodium falciparum density and exerts selective pressure on parasite populations in a phase 1-2b trial in Papua New Guinea. The Journal of Infectious Diseases. 185, 820-827 (2002).
  6. Sirima, S. B., Cousens, S., Druilhe, P. Protection against malaria by MSP3 candidate vaccine. The New England journal of medicine. 365, 1062-1064 (2011).
  7. Llewellyn, D., et al. Assessment of antibody-dependent respiratory burst activity from mouse neutrophils on Plasmodium yoelii malaria challenge outcome. Journal of leukocyte biology. , (2013).
  8. McIntosh, R. S., et al. The importance of human FcgammaRI in mediating protection to malaria. PLoS pathogens. 3, 72 (2007).
  9. Pleass, R. J., et al. Novel antimalarial antibodies highlight the importance of the antibody Fc region in mediating protection. Blood. 102, 4424-4430 (2003).
  10. Hill, D. L., et al. Opsonizing Antibodies to P. falciparum Merozoites Associated with Immunity to Clinical Malaria. PLoS One. 8, (2013).
  11. Joos, C., et al. Clinical Protection from Falciparum Malaria Correlates with Neutrophil Respiratory Bursts Induced by Merozoites Opsonized with Human Serum Antibodies. PLoS ONE. 5, (2010).
  12. Kumaratilake, L. M., Ferrante, A. Opsonization and phagocytosis of Plasmodium falciparum merozoites measured by flow cytometry. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7, 9-13 (2000).
  13. Richards, J. S., et al. Identification and Prioritization of Merozoite Antigens as Targets of Protective Human Immunity to Plasmodium falciparum Malaria for Vaccine and Biomarker Development. The Journal of Immunology. , (2013).
  14. Salmon, B. L., Oksman, A., Goldberg, D. E. Malaria parasite exit from the host erythrocyte: a two-step process requiring extraerythrocytic proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 271-276 (2001).
  15. Boyle, M. J., et al. Isolation of viable Plasmodium falciparum merozoites to define erythrocyte invasion events and advance vaccine and drug development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 14378-14383 (2010).
  16. Wilson, D. W., Langer, C., Goodman, C. D., Mcfadden, G. I., Beeson, J. G. Defining the timing of action of anti-malarial drugs against Plasmodium falciparum. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 1-46 (2013).
  17. Angrisano, F., et al. Spatial Localisation of Actin Filaments across Developmental Stages of the Malaria Parasite. PLoS ONE. 7, (2012).
  18. Riglar, D. T., et al. Super-resolution dissection of coordinated events during malaria parasite invasion of the human erythrocyte. Cell Host and Microbe. 9, 9-20 (2011).
  19. Zuccala, E. S., et al. Subcompartmentalisation of Proteins in the Rhoptries Correlates with Ordered Events of Erythrocyte Invasion by the Blood Stage Malaria Parasite. PLoS ONE. 7, (2012).
  20. Marapana, D. S., et al. Malaria Parasite Signal Peptide Peptidase is an ER-Resident Protease Required for Growth but not for Invasion. Traffic. 13, 1457-1465 (2012).
  21. Rzepczyk, C. M., Lopez, J. A., Anderson, K. L., Alpers, M. P. Investigation of the effect of monocytes with Papua New Guinea sera on Plasmodium falciparum in culture. International Journal for Parasitology. 18, 401-406 (1988).
  22. Schofield, L., Mueller, I. Clinical immunity to malaria. Curr Mol Med. 6, 205-221 (2006).
  23. Hill, D. L., et al. Efficient measurement of opsonizing antibodies to Plasmodium falciparum merozoites. PLoS ONE. 7, (2012).
  24. Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). International journal of cancer Journal international du cancer. 26, 171-176 (1980).
  25. Ackerman, M. E., et al. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. Journal of Immunological Methods. 366, 8-19 (2011).
  26. Ataíde, R., et al. Using an Improved Phagocytosis Assay to Evaluate the Effect of HIV on Specific Antibodies to Pregnancy-Associated Malaria. PLoS ONE. 5, (2010).
  27. Wilson, D. W., Crabb, B. S., Beeson, J. G. Development of fluorescent Plasmodium falciparum for in vitro growth inhibition assays. Malar J. 9, 152 (2010).
  28. Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. J Parasitol. 65, 418-420 (1979).
  29. Braun-Breton, C., Rosenberry, T. L., da Silva, L. P. Induction of the proteolytic activity of a membrane protein in Plasmodium falciparum by phosphatidyl inositol-specific phospholipase. C. Nature. 332, 457-459 (1988).
  30. Jaramillo, M., Godbout, M., Olivier, M. Hemozoin induces macrophage chemokine expression through oxidative stress-dependent and -independent mechanisms. J Immunol. 174, 475-484 (2005).
  31. Schofield, L., Tachado, S. D. Regulation of host cell function by glycosylphosphatidylinositols of the parasitic protozoa. Immunology and cell biology. 74, 555-563 (1996).
  32. Khusmith, S., Druilhe, P., Gentilini, M. Enhanced Plasmodium falciparum merozoite phagocytosis by monocytes from immune individuals. Infection and immunity. 35, 874-879 (1982).
  33. Lunov, O., et al. Differential uptake of functionalized polystyrene nanoparticles by human macrophages and a monocytic cell line. ACS. 5, 1657-1669 (2011).
  34. Tebo, A. E., Kremsner, P. G., Luty, A. J. Fcgamma receptor-mediated phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes in vitro. Clinical and experimental immunology. 130, 300-306 (2002).
  35. McGilvray, I. D., Serghides, L., Kapus, A., Rotstein, O. D., Kain, K. C. Nonopsonic monocyte/macrophage phagocytosis of Plasmodium falciparum-parasitized erythrocytes: a role for CD36 in malarial clearance. Blood. 96, 3231-3240 (2000).

Tags

علم المناعة، العدد 89، الأمراض الطفيلية، والملاريا،
ارتفاع العائد تنقية<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; Merozoites للاستخدام في فحوصات ضد طهائي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hill, D. L., Eriksson, E. M.,… More

Hill, D. L., Eriksson, E. M., Schofield, L. High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays. J. Vis. Exp. (89), e51590, doi:10.3791/51590 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter