Summary
Måling antistof funktion er nøglen til at forstå immunitet over for Plasmodium falciparum malaria. Denne metode beskriver oprensningen af levedygtige merozoiter og måling af opsonisering-afhængig fagocytose af flowcytometri.
Abstract
Plasmodium falciparum merozoit antigener er under udvikling som potentielle malariavacciner. Et aspekt af immunitet mod malaria er fjernelse af frie merozoiter fra blodet ved fagocytiske celler. Dog vurderer den funktionelle effekt af merozoit specifikke opsoniserende antistoffer er udfordrende på grund af den korte halveringstid af merozoiter og variationen af primære fagocytceller. Beskrevet i detaljer heri er en fremgangsmåde til generering af levedygtige merozoiter hjælp af E64 protease inhibitor og et assay merozoit opsonin afhængig fagocytose ved hjælp af pro-monocytiske cellelinje THP-1. E64 forhindrer schizont brud, samtidig med at udviklingen af merozoiter, der frigives ved filtrering af behandlede schizonts. Ethidiumbromid mærkede merozoites er opsoniseret med humane plasmaprøver og tilføjes til THP-1 celler. Fagocytose bedømmes ved en standardiseret high throughput protokol. Levedygtige merozoiter er en værdifuld ressource for vurderingen numerskellige aspekter af P. falciparum biologi, herunder vurdering af immunforsvar. Antistofniveauer målt ved dette assay er forbundet med klinisk immunitet mod malaria i naturligt udsatte individer. Assayet kan også være anvendelige til vurdering af vaccine inducerede antistoffer.
Introduction
Betydningen af antistoffer til immunitet over for Plasmodium falciparum malaria blev vist for 40 år siden, da immunoglobulin fra hyperimmune voksne blev passivt overført til børn, der lider af svær malaria resulterer i afhjælpes sygdom 1.. Derfor har en betydelig indsats søgt at identificere mål af beskyttende malaria immunitet, for det meste gennem måling antistoftitre til peptider eller bakterielt udtrykte proteiner ved ELISA. ELISA baseret serologi har også vist sig yderst variabel mellem undersøgelser og tager ikke antistof funktionalitet 2. Mange malaria antigener inducerer en cytophilic IgG1 og IgG3-antistof profil, især merozoit overfladeantigener 3. Denne underklasse skævhed antyder, at antistof-Fc-receptor (FcR) interaktioner med fagocytter er vigtige for effektorfunktioner opsoniserende antimerozoite antistoffer 4. Adskillige merozoit antigen vacciner under udvikling er designet til atfremkalde phagocyt effektorfunktioner 5, 6 og selvom betydelig bevis for betydningen af antistof-FcR interaktioner i modeller af gnaver malaria findes 7-9, og et par nyere undersøgelser understøtter vigtigheden af funktionelle antistoffer og phagocyt effektorfunktionerne for immunitet over for malaria hos mennesker 10, 11, dette område er stadig dårligt undersøgt. Undersøgelse merozoit specifikke opsoniserende antistoffer er blevet begrænset af to faktorer; vanskeligheden med at isolere god kvalitet merozoiter; og variable fagocytose svar fra primære celler.
Indtil for nylig var centrifugering ved høj hastighed eller Percoll-densitetsgradienter udnyttes til at isolere merozoiter fra kultursupernatanter af brud schizont kulturer. Disse merozoites var sjældent levedygtige, og ofte yderligere manipuleret af densitetscentrifugering og flere vask trin 12 eller kryopræservering 11 før anvendelse i analyser. Disse proccesser potentielt frigøre mange perifert associerede proteiner fra merozoit overflade, proteiner kendt for at være antigene mål for malaria immunitet 13.. Senest cystein proteaseinhibitor trans-Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butan (E64) er blevet anvendt til at frembringe levedygtige merozoiter. E64 forhindrer schizont brud, genererer membran lukket merozoites 14, som kan forstyrres af filtrering for at befri levedygtige merozoiter 15, 16. Denne teknik har ført til den rumlige opløsning af talrige proteiner under erythrocyt invasion 15, 17-19 og har afklaret den fase specifik virkning af flere malariamedicin 16, 20. Men frembringelsen af levedygtige merozoiter forbliver teknisk udfordrende. Til hjælp i formidlingen af denne teknik, og ansøgning til funktionelle analyser af immunitet, en detaljeret protokol for levedygtig merozoit rensning og deres anvendelse i enstandardiseret funktionel analyse af antistof: cellulær samarbejde i opsonisering og fagocytose er beskrevet her.
Denne teknik viser et betydeligt fremskridt i forhold til tidligere in vitro-analyser af merozoit opsonisering, såsom neutrofile respiratorisk burst, Antibody Dependent Cellular Inhibition (ADCI), og alternative merozoit fagocytose assays. Disse assays er dårligt reproducerbar skyldes variation i parasitter indgange og aktiviteten af primære fagocytceller 11, 21.. Forurenende hemozoin kan også dybt påvirke phagocyt funktion 22.. En nylig rapporteret robust og reproducerbar merozoit fagocytose assay 23 udnytter promonocytic cellelinie THP-1 24. Dette er en ideel celletype til high throughput flowcytometri assays, som det er ikke-klæbende og specifikt udfører Fc-receptor-medieret fagocytose 25, 26. En yderligere kompleksitet, mens investorersøgende fagocytose er, at graden af fagocytose er afhængig af antallet af merozoiter i forhold til THP-1-celler og plasmakoncentration. For at sikre reproducerbarhed mellem eksperimenter, bør merozoites blive optalt og en defineret koncentration anvendes. På grund af deres lille størrelse, flow-cytometrisk kvantificering er påkrævet.
Den her beskrevne procedure fjerner hemozoin og genererer levedygtige merozoites og beskriver en anvendelse af disse merozoites til flowcytometrisk tælling af merozoiter efterfulgt af opsonisering og fagocytose. Selv om der teknisk krævende, kan de teknikker, der er beskrevet vise sig nyttige i at belyse bidraget fra merozoit overflade specifikt antistofrespons naturligt erhvervet og vaccine-induceret immunitet.
Protocol
BEMÆRK: Alle trin, foruden centrifugering og flowcytometri, bør udføres i et stinkskab med laminært flow for at opretholde sterilitet. At der træffes passende forholdsregler med hensyn til håndtering af humane prøver. Assayet er meget følsom for små mængder af plasma. De fortyndinger er optimale for at løse svarene spænder 5-78% med plasma fra semi-immune børn fra Papua Ny Guinea (PNG). Den optimale fortynding kan variere med plasma-apparater bliver testet, og det anbefales derfor, at plasma titreres for at bestemme eksperimentelle betingelser for hvert program. Sikre inddragelse af 2 negative kontroller THP-1 celler med merozoiter i fravær af plasma; og THP-1 celler med merozoiter opsoniseret med en pulje af plasma fra malaria naive individer. Dette vil muliggøre kontrol for merozoit tilslutning til THP-1 celler og til at muliggøre streng flow-cytometri gating fagocytose begivenheder.
Anvendelsen af PNG plasmaprøver blevgodkendt af Medical Research Rådgivende Udvalg, Papua Ny Guinea Sundhedsministeriet, Walter og Eliza Hall Institute Menneskelige Research Ethics Committee (projekt nummer 04/04). Skriftligt samtykke blev indhentet fra forældre / værger for alle deltagere.
1.. THP-1 Kultur
- Oprethold den humane, monocytiske cellelinje THP-1 i RPMI-1640 medium suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS) og 55 uM 2-mercapthoethanol (THP-1-medium) og ved 37 ° C i en 5% CO2 befugtet inkubator.
- Oprethold celler ved en densitet på under 5 x 10 5 celler / ml. BEMÆRK: Overgrowth vil resultere i differentiering i klæbende celler og nedregulering af Fc-receptorer. Når cellerne er blevet overført cirka 10 gange, optø et nyt hætteglas til at opretholde celle-fænotype.
2.. Antibody Prøveforberedelse og fortynding
- Heat inaktiverer plasma, der skal testes og malaria-naive kontrol plasma ved at inkubere ved 56 °; C i 30 minutter
- Serielt fortynde plasmaprøver til 1/2, 000 i THP-1 medium.
- Store fortyndet plasma ved -20 ° C.
3.. Kultur af stærkt synkroniseret P. falciparum
BEMÆRK: GFP-udtrykkende parasit line D10-PfPHG 27 blev udnyttet på grund af sin 48 hr livscyklus som bistår synkronisering af parasitter, og den kontrollerede timing E64 tilføjelse. Hertil kommer, fordi denne linje udtrykker GFP i cytosolen, denne linje tillader påvisning af parasitæmi og frie merozoiter ved flowcytometrisk påvisning af GFP. Men GFP fluorescensintensitet er ikke tilstrækkelig til at tilvejebringe visualisering i THP-1-celler, og derfor er merozoiter modfarvet med ethidiumbromid (EtBr). Andre parasit stammer kan anvendes, forudsat at stramme synkront er opnåeligt. Synkronisering parasitter ved hjælp af en kombination af sorbitol behandling at lysere modne former 28 og heparin til inhibering af invasion 15
- Vedligehold P. falciparum parasitter i O + humane erythrocytter (RBC) til 3% hæmatokrit i RPMI-1640 medium (pH 7,4) suppleret med 25 mg / ml HEPES, 50 pg / ml hypoxanthin, 10% poolet humant serum, 2 mg / ml natriumbicarbonat og 20 pg / ml gentamycin (Parasite medium). Der tilsættes 5 mg / ml Blasticidin S-hydrochlorid til dyrkningsmediet til selektion for GFP + parasitter.
- Inkuber kulturer i lufttætte kasser eller alternativt dobbelt forseglede dyrkningskolber ved 37 ° C i en atmosfære af 1% O2, 4% CO2 og 95% N2.
- Forbered tynde smear dias, fix i 100% methanol i 10 sek, og pletten med 10% Giemsa-opløsning i 6,7 mm (pH 7,1) fosfatbuffer (Giemsa-opløsning) i 10 min for at overvåge parasitemia. Efter farvningen skylles dias i vand og lufttørre. Vurdere parasitemia hjælp af en 100X olieimmersion linse.
- Oprethold parasit kulturer ved en parasitæmi under 5% inficerede RBC ved at opdele kulturer og tilføje uinficeredeRBC efter behov.
- For at synkronisere med heparin, der tilsættes 20 IE / ml medicinsk-grade heparin til at ringe-trins kulturer.
- Når flertallet af parasitter er på schizont stadium, pellet cellerne ved 300 xg i 5 min, fjerne heparin-holdigt medium og resuspender i parasit medium at tillade schizont brud og merozoit invasion.
- Efter 4 timer tilsættes 20 IE / ml heparin tilbage til kulturer, blokering yderligere invasion merozoit. BEMÆRK: Det kan være nødvendigt flere cykler af sorbitol og heparin behandling, før parasitter er tilstrækkeligt synkroniseret. For at generere passende antal merozoites, forberede 150 ml parasit kultur ved 3 - 5% parasitæmi.
4.. Isolering af Late Stage P. falciparum trofozoiter
- Seksogtredive timer efter returnering heparin til kulturer, pelletere dyrkede celler ved 300 xg i 5 minutter, og resuspender pellet i parasit medium ved 25% hæmatokrit.
- Vedhæft en stor magnetisk søjle (matrix volumen på 6,3ml) til en magnet, og tempereres kolonnen med parasitten medium, og sørg for alle luftbobler fjernes.
- Tilsæt resuspenderet P. falciparum kultur til kolonnen, og justere flow til en dråbe pr sek.
- Når kulturen har passeret gennem søjlen, søjlen vaskes med parasit-medium, indtil gennemstrømning er klart.
- Eluere parasitter fra kolonnen i 30 ml 37 ° C parasit medium.
- Forbered en tynd udstrygning af parasitter, fix i 100% methanol i 10 sek, og plette med Giemsa-opløsning i 3 min. Undersøg dias under lup, og sikre, at parasitter næsten fylde de røde blodlegemer, og synes at være i tidlige schizont faser. Hvis parasitter ikke har nået den passende modning fase tilbage oprensede parasitter til en 37 ° C inkubator i en atmosfære af 1% O2, 4% CO2 og 95% N2, indtil passende udviklet. BEMÆRK: Renhed på mere end 90% inficerede røde blodlegemer er nødvendig for at sikre RBCS ikke forurener merozoit præparater.
- Behandle isolerede schizonts med 10 uM E64 (Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butan (E64) for 6 - 10 timer BEMÆRK:. Er mulige Længere inkubationstider med E64 imidlertid de merozoiter producerede ikke længere være invasiv.
5.. Isolering af P. falciparum merozoites
- Efter inkubation med E64, smøre parasitter, fix celler i 100% methanol, og pletten med Giemsa-opløsning for at vurdere dannelsen af membran-lukkede merozoites. BEMÆRK: Et godt udbytte af merozoiter opnås, hvis mere end 50% af parasitter har dannet membran lukkede merozoites.
- Pellet E64-behandlede schizonts ved 1.900 xg i 8 min. Vask med 50 ml RT RPMI-1640 medium (pH 7,4) suppleret med 25 mg / ml HEPES, 50 pg / ml hypoxanthin, 2 mg / ml natriumbicarbonat og 20 ug / ml gentamycin (vask medium) for at fjerne resterende humant serum .
- Pellet resuspenderes i 2 ml vaskemedium. BEMÆRK: Brug af FCS-holdige THP-1-medier vil producere skumning under filtrering.
- Filtrere de 2 ml resuspenderet E64-schizonts gennem en sprøjte filter 1,2 μm/32 mm. Filtratet opsamles i et 10 ml rør. BEMÆRK: Filtratet indeholder merozoites og hemozoin krystaller, med un-bristede schizonts og snavs indsamlet i filteret.
- Vedhæft en lille magnetisk kolonne til en magnet, og ligevægt med 500 ul THP-1 medium.
- Filtratet passere over den magnetiske spalte. Saml gennemstrømning. BEMÆRK: Hemozoin vil binde til kolonnen, mens merozoiter vil passere igennem.
- Pass gennemstrømningen over kolonnen to gange mere for at fjerne hemozoin, indsamling strømningen gennem hver gang.
- Søjlen skylles med 2 ml RT THP-1 medium til at indsamle de resterende merozoites.
- Tilføj EtBr ved 10 ug / ml (slutkoncentration) og plet i 30 minutter ved stuetemperatur. Beskyt mod lys for at forhindre fotoblegning. Bemærk: Sørg for, at alle EtBr forurenet væske og pLastic affald bortskaffes på en måde egnet til cytotoksiske kemikalier. Merozoiter ikke længere invasiv efter denne inkubering.
- Spin ned merozoites ved 4.000 xg i 10 min.
- Kassér supernatanten i passende affaldsbeholder.
- Resuspender merozoit pellet i 4 ml THP-1 medium og spin ned ved 4.000 xg i 10 min.
- Tilføj THP-1 medium op til et volumen på 15 ml, og beskytte mod lys.
6.. Kvantificering merozoit Koncentration ved flowcytometri
- Bring tælle perler til RT.
- Forbered PBS med 0,5% BSA til fortynding merozoiter.
- Tæl merozoites ved 3 fortyndinger; 1 i 100; 1 i 50 og 1 i 25. Forbered 3 FACS-rør med 940, 930 og 910 pi PBS +0,5% BSA, hhv. Tilsæt 10, 20 og 40 ul af oprensede merozoiter pr rør, hhv.
- Vortex optælling perler til 30 sek, og der tilsættes 50 ul perler pr FACS rør indeholdende fortyndede merozoites.
- Kør tre diluted merozoit prøver på et flowcytometer udstyret med en 488 nm laser. Indstil en stringent gate for merozoiter baseret på EtBr og GFP-fluorescens dobbelt fluorescens og gate optælling perler ved fluorescens i en separat kanal. Anskaf begivenheder indtil 2.000 perler indsamles. Bemærk: Disse instruktioner refererer til at tælle GFP + merozoites der er blevet mod-farvet med EtBr. Hvis ikke udnytter GFP udtrykke parasitter derefter sat merozoit porte baseret på sidespredning og EtBr fluorescens.
- Bestemme forholdet af merozoiter: perler ved at dividere antallet af merozoit hændelser, som 2.000 optælling perlehændelser, beregne et forhold for hver fortynding. Brug tælle perle batch specifikationer til at bestemme antallet af perler i de 50 pi perler føjet per rør.
- Gange antallet af perler i 50 pi med fortyndingsfaktoren og ved merozoit: perlen ratio for at fortyndingsfaktor. Dette nummer svarer til koncentrationen af merozoiter pr ml. Udfør these trin for hver fortynding.
- Gennemsnittet af merozoit målte koncentrationer på tværs af de tre fortyndinger. BEMÆRK: Standardafvigelser på over 10% for koncentrationen bestemmes for 1 ud af 100, 1 i 50 og 1 i 25 fortyndinger indikerer tekniske unøjagtigheder i forberedelsen tælle prøver.
- Resuspender merozoites på 8 x 10 6 merozoites / ml i THP-1 medium at sikre en endelig ratio på fire merozoiter pr THP-1 celle. BEMÆRK: Anden merozoit til THP-1-forhold, kan anvendes, og koncentrationerne bør ændres i overensstemmelse hermed.
7.. Fagocytose Assay
- Tilføj 200 pi varme inaktive FCS per brønd af 96 godt U-bundplader, og henstår ved RT O / N til at blokere plader. Efter inkubationen fjernes FCS og vaske brøndene to gange med 200 ul sterilt PBS. Fjern PBS og gemme plader ved 4 ° C indtil brug.
- Beregne antallet af THP-1-celler, der kræves for at teste plasma prøver og kontroller, så tredobbelte brønde pr prøve på 1 x 10
- Bestem THP-1 kultur-koncentration ved at indlæse 10 ul af kulturen på en hæmocytometer dias. Tæl antallet af celler til stede i 4 sæt af 16 hjørnefelt af hæmocytometer under et mikroskop, så gennemsnittet af de tæller. Multiplicer gennemsnitlige tælle med 10.000 for at beregne antallet af celler per ml.
- Spin ned det nødvendige antal THP-1-celler ved 500 xg i 5 minutter og resuspenderes ved 6,7 x 10 5 celler / ml i THP-1 medium.
- Tilføj 150 pi THP-1-celler i THP-1 medium per brønd til en FCS-blokerede 96 brønds U-bundplade, hvilket resulterer i 10 5 celler / brønd. Forbered 3 brønde pr prøve, som vil blive afprøvet. Retur pladen til inkubator indtil den er klar til at tilføje merozoites.
- Tilføj 150 pi merozoit forberedelse på 8 x 10 6 / ml per brønd til en separat FCS-blokerede 96 brønds U-bundplade. Forbered et godt pr testede prøve
- Tilsæt 10 ul af tilberedte fortyndede plasmaprøver per godt, til than pladen, der indeholder merozoites, og bland godt for at sikre homogen opløsning.
- Fjern THP-1 plade fra rugemaskinen, og der tilsættes 50 ul af merozoit / plasma opløsning pr brønd indeholdende THP-1 celler, med tredobbelte brønde pr plasmaprøve.
- Bland godt, og der inkuberes ved 37 ° C i 5% CO 2, befugtet inkubator i 40 min. Dæk med folie for at beskytte mod lys.
- Efter 40 min, centrifugeres prøverne i 5 minutter ved 500 xg i et 4 ° C forud afkølet centrifuge til at anholde fagocytose.
- Fjern supernatanten og vaske cellerne to gange i iskoldt PBS +0,5% BSA +2 mM EDTA (FACS buffer). BEMÆRK: EDTA vil lette i at opretholde en enkelt celle suspension til flowcytometri analyse.
- Fix celler i 90 pi 2% paraformaldehyd (PFA) i PBS +0,5% BSA +2 mM EDTA (FACS fiksativ). Efterlad på is, indtil overtagelsen, beskyttet mod lys.
8.. Flowcytometri
- Anskaf prøver ved hjælp af et flowcytometer udstyret with en 488 nm laser og high throughput pladelæser vedhæftet fil. BEMÆRK: Dette vil gøre det muligt op til 400 plasmaprøver skal testes fra én merozoit forberedelse. Celler kan også overføres til rør til manuel prøve læsning.
- Gate levedygtige THP-1 celler ved fremad og sidespredning.
- Indstil EtBr positive port baseret på "THP-1 celler med merozoiter og ingen plasma kontrol.
- Anskaf et minimum på 10.000 begivenheder pr prøve.
9.. Dataanalyse
- Analysere data ved hjælp af flowcytometri analyse software, og fastsætte strenge porte for EtBr positive begivenheder.
- Beregn den procentvise fagocytose for hver prøve: den% af EtBr + celler for prøven minus% positive celler med ikke-immunt plasma.
- Gennemsnitlige resultater på tværs af tre eksemplarer. BEMÆRK: standardafvigelser for en tredobbelt på over 10% indikerer eksperimentelle unøjagtigheder. Nogle baggrund EtBr positive begivenheder kan observeres som følge af merozoite vedhæftning til overfladen af THP-1 celler, men bør være konsistent på tværs af alle prøver indeholdende merozoites. Indstilling af porten baseret på "THP-1 celler med merozoiter og ingen plasma 'kontrol, og derefter fratrække nogen baggrund af de» THP-1 celler med ikke-immunt plasma' kontrol vil resultere i% fagocytose, der afspejler den fluorescens som følge af internaliseret / fagocyteret kun merozoites.
Representative Results
Modningen fase af parasitter inden E64 behandling er afgørende for generering af membran-lukket merozoiter. Figur 1ai viser passende modning fase af schizonts for tilføjelse E64. Parasitterne skal være stort og næsten fylder de røde blodlegemer. En dappled udseende Giemsa farve indikerer merogony er påbegyndt, og E64 bør tilføjes at give membran-lukkede merozoites (Figur 1Aii). Hvis der tilsættes E64 tidligere at trophozoite stadie parasitter, er membran lukkede merozoites genereres ikke, selv efter 12 timer af E64. I stedet parasitter tage på abnorm morfologi, såsom udvidelsen af fordøjelsessystemet vakuole (figur 1BI og 1Bii), og merozoitter ikke dannet. Hvis der tilsættes E64 senere schizonts er membran-lukkede merozoites ikke genereres som schizont brud er uhæmmet (figur 1CI og 1Cii). Et højt niveau af parasit synkront er påkrævet, andreklogt en række af alle tre udfald beskrevne vil ses efter E64 behandling.
Fjernelse af hemozoin er endnu et vigtigt skridt for rensende merozoites. Hvis merozoites ikke renset fra hemozoin så merozoit-hemozoin dannes klynger, som ikke kan fjernes ved pipettering. Disse aggregater køre på cytometret som enkeltstående begivenheder, om end med forskellige fremadrettede scatter og side-scatter egenskaber end enlige merozoites, hvilket resulterer i unøjagtig merozoit optælling ved flowcytometri (figur 2A). Som THP-1-celler kan også fagocytere hemozoin kan disse merozoit-hemozoin klynger også fagocyteret (figur 2B). Disse aggregater er meget EtBr fluorescerende, da de indeholder flere merozoites. Fagocytose af aggregater resulterer i en THP-1 EtBr fluorescens profil svarende til den observeret for fagocytose af flere individuelle merozoitter. Derfor, hvis hemozoin ikke fjernes, vil EtBr fluorescensen af THP-1-celler være en overestimate af opsoniserende potentiale for plasma, der testes. Hemozoin er også rapporteret at signifikant vil ændre phagocyt funktion. GFP-positive merozoiter er kontra farvet med EtBr at øge visualisering af merozoiter fagocyteres af THP-1-celler. Brug de betingelser, der er beskrevet i denne protokol, er alle GFP-positive merozoites kontrastfarvet med EtBr, der har en lysere fluorescensintensitet (figur 3A). Fagocytose vurdering af EtBr fluorescens sikrer overlegen opløsning på merozoit fagocytose end GFP-fluorescens (figur 3B).
Antallet af merozoiter tilsættes til assayet modulerer mængden af fagocytose observeret. Af denne grund, nøjagtig optælling ved flowcytometri er kritisk. Stigende forhold af merozoiter: THP-1 vil resultere i øget vedhæftning af merozoiter til THP-1-celler i fravær af plasma (figur 4A). Stigende merozoit: THP-1-forhold resulterer også i øget phagocytosis reaktioner når merozoites er opsoniseret (figur 4B). A 04:01 merozoit: THP-1 forhold anbefales til robuste phagocytiske svar. Ved hjælp af dette forhold, og fortynding af plasma angivet, denne analyse er i stand til at løse lav, mellemliggende og høje niveauer af opsoniserende antistoffer. Mellem 0 og 78 procent fagocytose reaktioner er blevet observeret ved brug PNG plasma prøver og andre betingelser, der er beskrevet. Sådanne reaktioner er for nylig vist, at associere med naturligt erhvervet klinisk immunitet over for malaria 10.. Figur 5 viser eksempler på de 4 kvartiler fagocytose svar fra PNG individer.
Figur 1.. Timing af E64 tilføjelse er afgørende for at generere membran-lukkede merozoites. (A) Passende maturatio. n etape af parasitter i) før E64 behandling, og ii) membran-lukkede merozoites produceret efter 6 timer på E64 behandling (B) membran lukkede merozoites genereres ikke E64 føjes til umodne parasitter; i) sent trofozoitter og ii) efter 12 timer på E64 (C) Schizont brud hæmmes ikke, hvis der tilsættes E64 til sent segmenterede schizonts.; i) sent schizonts, og ii) efter 6 timer på E64. Målestokken repræsenterer 10 um.
Figur 2.. Hemozoin fjernelse er afgørende for at generere en enkelt celle merozoit suspension. Merozoit-hemozoin aggregater form efter filtrering af membran lukkede merozoites, medmindre hemozoin magnetisk er adskilt fra merozoitter. (A) Fremadrettede scatter og side-scatter plots af merozoites med hemozoin fjernetog hemozoin bibeholdes. (B) Hemozoin-merozoit aggregater kan fagocyteret af THP-1-celler. Diff-Quick farvede cyto-spin lysbilleder af THP-1 celler inkuberet med PNG plasma opsoniseret merozoit præparater med eller uden hemozoin. Målestokken repræsenterer 10 um.
Figur 3. Ethidiumbromidfarvning tillader overlegen opløsning af merozoit fagocytose. D10-GFP-oprensede merozoiter er modfarvet med EtBr at forbedre fluorescensintensiteten. (A) Flowcytometri histrogram af oprensede merozoiter med gating på GFP-positive merozoiter og et dot-blot viser EtBr fluorescens i denne låge GFP positive population. (B) Forward scatter versus GFP og fremadspredning versus EtBr af THP-1 celler efter fagocytose af GFP og EtBr dobbelte fluorescerende merozoites. Gates blev d Rawn baseret på THP-1-celler med merozoiter og ingen plasma kontrol.
Figur 4 merozoit:. THP-1 forhold påvirker graden af fagocytose observeret. (A) Five merozoit: THP-1 nøgletal er afbildet; 50:1, 20:1, 10:1, 4:1, 01:01. Celler kun kontrol indikerer baggrundsfluorescens grund THP-1-celler. THP-1 EtBr fluorescens for hver forholdet er indiceret til merozoiter opsoniseret med en pulje af PNG plasma eller med ikke-immunt australske plasma (B) Middel fluorescensintensitet af THP-1-celler for forskellige merozoit:. THP-1-forhold, og opsonisering med en pool af PNG plasma eller non-immunt australske plasma (gennemsnit + SEM). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Kan måles Et stort udvalg af opsoniserende antistoffer. Merozoiter blev opsoniseret med plasma fra PNG individer og inkuberet med THP-1-celler. Fire repræsentative fagocytose svar er vist. Gates blev trukket baseret på THP-1 celler med merozoiter og ingen plasma kontrol, og tallene angiver% fagocytose efter fradrag af THP-1 celler med ikke-immunt plasma kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
For at måle merozoit fagocytose er færdighed i to teknikker kræves: rensning af merozoiter og THP-1 fagocytose assay. De mest kritiske trin for at kombinere disse to teknikker er: 1) Highly synkroniserede parasitter; 2) Tilføjelse E64 på det rigtige tidspunkt til at give membran lukkede merozoites; 3) Fjernelse hemozoin at undgå aggregater; 4) Præcis merozoit optælling ved flowcytometri; 5) fortynding af plasma, der anvendes; og 6) opretholdelse af lav celletæthed og antal passager af THP-1-celler. Omhyggelig overvejelse af disse centrale aspekter vil sikre robuste fagocytose svar overholdes.
Selv om der er beskrevet her er fremstillingen af merozoiter til vurdering fagocytose Teknikken kan anvendes til en bred vifte af anvendelser. Uafhængigt af den ned stream metode optimale merozoit præparater afhænger af korrekt timing E64 tillæg for at generere merozoites. E64 her beskrevne har vist sig at yield invasive merozoites til brug i høj opløsning mikroskopi af invasion begivenheder og narkotika følsomhed assays 15-20. Mens merozoit levedygtighed ikke er essentiel for fagocytose, er integriteten af merozoit overfladecoating påkrævet. Derfor E64-metoden beskrevet her giver høj kvalitet merozoites der skal produceres for at vurdere antistof respons til overfladen pels. Som skitseret i figur 1, hvis der er tilsat E64 for tidligt eller for sent membran lukkede merozoiter dannes ikke. Af denne grund er meget synkrone parasit kulturer påkrævet. Her er brugen af sorbitol og heparin behandlinger tæt synkronisere D10-GFP-parasit kulturer til et vindue på 2 timer er beskrevet. Heparin kan fremme gametocytogenesis i andre laboratorium isolater og derfor bør bruges med forsigtighed. Alternative metoder til synkronisering, såsom alanin, kan også anvendes, forudsat at tæt synkroniseret parasitter produceres 29. Hvis E64 føjes til asynkrone parasitter, en lavere proportion af membran-lukkede merozoites vil blive produceret og resterende parasit-inficerede RBC vil enten briste normalt eller udvikle unormal morfologi. Tilstedeværelsen af parasitter, som ikke har udviklet sig til membran lukket merozoiter vil resultere i tilstopning af filteret og reducere merozoit opnåede udbytte.
Under filtrering af membran lukket merozoiter, hemozoin frigøres fra fordøjelseskanalen vakuoler og er til stede som frie krystaller i opløsningen. Hemozoin er meget proinflammatoriske og er blevet rapporteret at modulere monocyt og makrofag fagocytose svar 30, 31. Ud over at modulere fagocytose, som vist i figur 2, kan hemozoin danne aggregater med merozoitter i opløsning. Som THP-1 celler kan fagocytere disse aggregater, kan dette være en væsentlig confounder for løsningen af antistof-medieret fagocytose. Derfor er det nødvendigt at fjerne hemozoin i denne analyse til AVOID yderligere kompleksitet af hemozoin på fagocytsystem biologi. Desuden kan manglende fjerne hemozoin også være skadelig ved brug af denne teknik til at generere frie merozoiter til andre anvendelser, navnlig når merozoit kvantificering er påkrævet.
Som skitseret i figur 4, antallet af merozoiter hvormed assayet kan påvirke graden af fagocytose af THP-1-celler. Selvom flowcytometri tillader tælling af merozoit koncentration, omhyggelig pipettering og kopiere tællinger af merozoites er nødvendige for at forbedre nøjagtigheden. Dette er især kritisk, hvis flere parasit linjer skal testes side-by-side. Det er tidligere blevet påvist, at plasma fra semi-immune børn fra PNG kan fortyndes betydeligt, før svarene falde 23. Beskrevet her er den optimale fortynding af plasma (1/120, 000 endelig fortynding af plasma) for en gruppe på 5 - 12 år gamle PNG børn, der producerede store udvalg af phagocyt. Osis responser, der er beskrevet i figur 5. Denne serie tilladt for lagdeling af svarene i fire grupper (0 - 19%, 20-39%, 40-59% og 60-79% fagocytose), og regression modellering viste, at opsoniserende svar var forbundet med beskyttelse mod klinisk sygdom og high-density parasitæmia 10 Til forskellige kohorteundersøgelser kan det være nødvendigt at justere plasmafortynding at sikre fagocytose af THP-1-celler ikke er mættet eller under niveauet for detektion.
Flowcytometri giver hurtig og kvantificerbare fagocytose med forbedret nøjagtighed over mikroskopi. Denne protokol er en høj kapacitet, plade baseret og automatiseret erhvervelse af 96-brønds plader for at studere naturligt erhvervet humoral immunitet. Metoden kræver farvning af merozoiter med ethidiumbromid imidlertid alternative DNA pletter såsom SYBRgreen, DAPI og propidium iod, membran pletter eller proteinholdige pletter kunne udnyttes. Denne analyse vil være modtagelig for Primary monocytter eller neutrofiler, og kunne tilpasses, hvis phagocyt eller FcR biologi var af interesse. Primære celler eller THP-1-celler differentierede in vitro med PMA kan bruges til at studere fagocytose i malaria og andre patogener 12, 32-34. Men ved hjælp af primære celler kan være en udfordring, da disse celler er vedhængende og også vise ikke-antistof-medieret fagocytose 35. Desuden variation i renhed, levedygtighed og funktionalitet er nogle af de vigtigste begrænsninger i anvendelsen af primære fagocytiske celler. Fc-receptorer er involveret i merozoit fagocytose forbliver karakteriseret, og derfor er anvendelse af blokerende antistoffer specifikke Fc-receptorer kunne belyse bidraget fra hver Fc receptor til merozoit fagocytose. Som THP-1 fagocytose er FcR afhængig muliggør dette ligetil fortolkning af fagocytose observeret. Denne analyse også egner sig til at tage fat på antigenspecificiteten af opsoniserende antistoffer, som kan opnås ved utilders knock-out parasitter for merozoit overfladeantigener, eller ved hjælp af affinitetsoprensede humane antistoffer til merozoit overfladeproteiner. Endvidere i dybden studier af cytokin responser efter merozoit fagocytose mangler, og kan opnås ved hjælp af denne analyse.
Disse to teknikker udgør betydelige fremskridt til studiet af funktionelle antimerozoite antistoffer. Oprensningen af høj kvalitet merozoiter er fordelagtigt at bruge kryopræserverede merozoiter eller fluorescerende mikrosfærer overtrukket med merozoit antigener. Selv om denne analyse er blevet brugt som et redskab til at vurdere naturligt erhvervet immunitet, kan det vise et vigtigt redskab til at løse køb af immunitet som reaktion på vaccination. Mens det er blevet vist for nylig, at fagocytose eller opsonised merozoiter er forbundet med beskyttelse mod klinisk malaria, er det ikke muligt at drage direkte konklusioner af in vitro-THP-1 fagocytose in vivo phagocytosis af merozoiter som fagocytose i denne analyse sker under statiske forhold og i fravær af konkurrerende røde blodlegemer. De potentielle tilpasninger af denne analyse kan således give et alsidigt værktøj til yderligere forståelse af malaria og merozoit fagocytose.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at anerkende børnene og voksne plasmadonorer og personalet på Papua Ny Guinea Institute of Medical Research. Forfatterne vil gerne takke Amandine B Carmagnac, Catherine Q Nie, Danny W Wilson, Ivo Mueller og Diana S Hansen for deres bidrag til udviklingen af denne teknik, og tak den australske Røde Kors blod og serum packs. Dette arbejde blev gjort muligt gennem victorianske delstatsregeringen operationelle infrastruktur Support og australske regering NHMRC IRIISS. Dette arbejde blev støttet af National Sundhed og Medical Research Council tildeler # 1031212 og # 637.406, og National Institutes of Health tilskud # AI089686.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| THP-1 cell line | American Type Culture Collection | TIB-202 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 31800-089 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Invitrogen | 10099-141 | |
| 2-mercapthoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | Use in Fume Hood |
| Pen/Strep Solution (100x) | Sigma | P0781 | |
| HEPES | SAFC | 90909C | Cell culture grade |
| Hypoxanthine | Calbiochem | 4010 | |
| Human Serum | Donation from Australian Red Cross | Available commercially (i.e. Invitrogen) | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 1.06329.0500 | |
| Gentamycin | Pfizer | 61022027 | Injection Quality |
| Heparin Sodium BP (5000 IU/ml) | Pfizer | Porcine origin | |
| Blasticidin S-hydrochloride | Sigma-Aldrich | 15205 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | 50-70-4 | |
| E64 Protease Inhibitor | Sigma-Aldrich | E3132-10MG | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 98281-100G | Use for phosphate buffer |
| Na2HPO4.2H20 | Merck | 10383.4G | Use for phosphate buffer |
| Giemsa's azur eosin methylene blue solution | Merck | 1.09204.0500 | 1:10 dilution in 6.7 mN Phosphate buffer (make fresh each stain) |
| EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1 M, pH 7.2 |
| Acrodisc Syringe Filters 1.2-μm/32-mm | Pall Life Sciences | 4656 | |
| QuadroMACS Separator (for small column) | MACS Miltenyi BioTec | 130-091-051 | Interchangeable with MidiMACS |
| VarioMACS Separator (for large columns) | MACS Miltenyi BioTec | 130-090-282 | |
| MACS MultiStand | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
| LS Column (small magnetic column) | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
| Large magnetic column | MACS Miltenyi BioTec | 130-041-305 | |
| Ethidium Bromide | Bio-Rad | 1510433 | Cytotoxic |
| CountBright Absolute Counting Beads | Invitogen | C36950 | |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer with HTS plate reader | BD Biosciences | ||
| EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1 M, pH 7.2 |
| FlowJo cytometry analysis software | Tree Star |
References
- Cohen, S., McGregor, I. A., Carrington, S. Gamma-globulin and acquired immunity to human malaria. Nature. 192, 733-737 (1961).
- Fowkes, F. J. I., Richards, J. S., Simpson, J. A., Beeson, J. G. The relationship between anti-merozoite antibodies and incidence of Plasmodium falciparum malaria: A systematic review and meta-analysis. PLoS Medicine. Medicine, P. L. oS. 7, (2010).
- Bouharoun-Tayoun, H., Attanath, P., Sabchareon, A., Chongsuphajaisiddhi, T., Druilhe, P. Antibodies that protect humans against Plasmodium falciparum blood stages do not on their own inhibit parasite growth and invasion in vitro, but act in cooperation with monocytes. The Journal of experimental medicine. 172, 1633-1641 (1990).
- Jafarshad, A., et al. A novel antibody-dependent cellular cytotoxicity mechanism involved in defense against malaria requires costimulation of monocytes FcgammaRII and FcgammaRIII. Journal of immunology. 178, Baltimore, MD. 3099-3106 (1950).
- Genton, B., et al. A recombinant blood-stage malaria vaccine reduces Plasmodium falciparum density and exerts selective pressure on parasite populations in a phase 1-2b trial in Papua New Guinea. The Journal of Infectious Diseases. 185, 820-827 (2002).
- Sirima, S. B., Cousens, S., Druilhe, P. Protection against malaria by MSP3 candidate vaccine. The New England journal of medicine. 365, 1062-1064 (2011).
- Llewellyn, D., et al. Assessment of antibody-dependent respiratory burst activity from mouse neutrophils on Plasmodium yoelii malaria challenge outcome. Journal of leukocyte biology. , (2013).
- McIntosh, R. S., et al. The importance of human FcgammaRI in mediating protection to malaria. PLoS pathogens. 3, 72 (2007).
- Pleass, R. J., et al. Novel antimalarial antibodies highlight the importance of the antibody Fc region in mediating protection. Blood. 102, 4424-4430 (2003).
- Hill, D. L., et al. Opsonizing Antibodies to P. falciparum Merozoites Associated with Immunity to Clinical Malaria. PLoS One. 8, (2013).
- Joos, C., et al. Clinical Protection from Falciparum Malaria Correlates with Neutrophil Respiratory Bursts Induced by Merozoites Opsonized with Human Serum Antibodies. PLoS ONE. 5, (2010).
- Kumaratilake, L. M., Ferrante, A. Opsonization and phagocytosis of Plasmodium falciparum merozoites measured by flow cytometry. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7, 9-13 (2000).
- Richards, J. S., et al. Identification and Prioritization of Merozoite Antigens as Targets of Protective Human Immunity to Plasmodium falciparum Malaria for Vaccine and Biomarker Development. The Journal of Immunology. , (2013).
- Salmon, B. L., Oksman, A., Goldberg, D. E. Malaria parasite exit from the host erythrocyte: a two-step process requiring extraerythrocytic proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 271-276 (2001).
- Boyle, M. J., et al. Isolation of viable Plasmodium falciparum merozoites to define erythrocyte invasion events and advance vaccine and drug development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 14378-14383 (2010).
- Wilson, D. W., Langer, C., Goodman, C. D., Mcfadden, G. I., Beeson, J. G. Defining the timing of action of anti-malarial drugs against Plasmodium falciparum. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 1-46 (2013).
- Angrisano, F., et al. Spatial Localisation of Actin Filaments across Developmental Stages of the Malaria Parasite. PLoS ONE. 7, (2012).
- Riglar, D. T., et al. Super-resolution dissection of coordinated events during malaria parasite invasion of the human erythrocyte. Cell Host and Microbe. 9, 9-20 (2011).
- Zuccala, E. S., et al. Subcompartmentalisation of Proteins in the Rhoptries Correlates with Ordered Events of Erythrocyte Invasion by the Blood Stage Malaria Parasite. PLoS ONE. 7, (2012).
- Marapana, D. S., et al. Malaria Parasite Signal Peptide Peptidase is an ER-Resident Protease Required for Growth but not for Invasion. Traffic. 13, 1457-1465 (2012).
- Rzepczyk, C. M., Lopez, J. A., Anderson, K. L., Alpers, M. P. Investigation of the effect of monocytes with Papua New Guinea sera on Plasmodium falciparum in culture. International Journal for Parasitology. 18, 401-406 (1988).
- Schofield, L., Mueller, I. Clinical immunity to malaria. Curr Mol Med. 6, 205-221 (2006).
- Hill, D. L., et al. Efficient measurement of opsonizing antibodies to Plasmodium falciparum merozoites. PLoS ONE. 7, (2012).
- Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). International journal of cancer Journal international du cancer. 26, 171-176 (1980).
- Ackerman, M. E., et al. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. Journal of Immunological Methods. 366, 8-19 (2011).
- Ataíde, R., et al. Using an Improved Phagocytosis Assay to Evaluate the Effect of HIV on Specific Antibodies to Pregnancy-Associated Malaria. PLoS ONE. 5, (2010).
- Wilson, D. W., Crabb, B. S., Beeson, J. G. Development of fluorescent Plasmodium falciparum for in vitro growth inhibition assays. Malar J. 9, 152 (2010).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. J Parasitol. 65, 418-420 (1979).
- Braun-Breton, C., Rosenberry, T. L., da Silva, L. P. Induction of the proteolytic activity of a membrane protein in Plasmodium falciparum by phosphatidyl inositol-specific phospholipase. C. Nature. 332, 457-459 (1988).
- Jaramillo, M., Godbout, M., Olivier, M. Hemozoin induces macrophage chemokine expression through oxidative stress-dependent and -independent mechanisms. J Immunol. 174, 475-484 (2005).
- Schofield, L., Tachado, S. D. Regulation of host cell function by glycosylphosphatidylinositols of the parasitic protozoa. Immunology and cell biology. 74, 555-563 (1996).
- Khusmith, S., Druilhe, P., Gentilini, M. Enhanced Plasmodium falciparum merozoite phagocytosis by monocytes from immune individuals. Infection and immunity. 35, 874-879 (1982).
- Lunov, O., et al. Differential uptake of functionalized polystyrene nanoparticles by human macrophages and a monocytic cell line. ACS. 5, 1657-1669 (2011).
- Tebo, A. E., Kremsner, P. G., Luty, A. J. Fcgamma receptor-mediated phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes in vitro. Clinical and experimental immunology. 130, 300-306 (2002).
- McGilvray, I. D., Serghides, L., Kapus, A., Rotstein, O. D., Kain, K. C. Nonopsonic monocyte/macrophage phagocytosis of Plasmodium falciparum-parasitized erythrocytes: a role for CD36 in malarial clearance. Blood. 96, 3231-3240 (2000).
