Summary
항체의 기능을 측정하는 것은 변형체 falciparum의 말라리아에 대한 내성을 이해하는 열쇠입니다. 이 방법은 가능한 merozoites의 정화 및 유동 세포 계측법에 의해 옵 소닌 의존 식균 작용의 측정에 대해 설명합니다.
Abstract
변형체 falciparum의의 merozoite 항원은 잠재적 인 말라리아 백신으로 개발 중에있다. 말라리아에 대한 내성의 한 측면은 식세포에 의해 혈액에서 무료 merozoites의 제거입니다. 그러나 merozoite 특정 opsonizing 항체의 기능적인 효능을 평가 인해 merozoites의 짧은 반감기 및 기본 식세포의 변화에 대한 도전입니다. 상세히 설명하면 본원 E64 프로테아제 저해제를 사용 가능한 merozoites를 생성하기위한 방법, 및 프로 단핵 세포주 THP-1을 사용 merozoite의 분석 opsonin 의존 식균이다. 처리 schizonts의 여과에 의해 출시되는 merozoites의 개발을 허용하면서 E64는 schizont 파열을 방지 할 수 있습니다. 에티 디움 브로마이드 표시 merozoites은 인간의 혈장 샘플 옵 소닌과 THP-1 세포에 추가됩니다. 식균 작용은 표준화 된 높은 처리량 프로토콜에 의해 평가된다. 가능한 merozoites은 numer에 대한 평가를위한 귀중한 자원이다P.의 OU를 측면 면역 기능의 평가를 포함한 falciparum의 생물학. 이 분석에 의해 측정 된 항체 수준은 자연적으로 노출 된 개인의 말라리아 임상 면역과 연결되어 있습니다. 분석은 또한 백신에 의한 항체를 평가하는 데 사용 될 수 있습니다.
Introduction
변형체 falciparum의 말라리아에 대한 내성에 대한 항체의 중요성은 40 년 전, 고 면역 성인에서 면역 글로불린 때 소극적으로 완화 질병 1의 결과로 심각한 말라리아로 고통받는 아이들에게 옮겨 줬습니다. 따라서, 상당한 노력은 주로 ELISA에 의해 펩타이드 나 세균 발현 된 단백질에 항체가를 측정을 통해 보호 말라리아 면제의 대상을 식별하기 위해 노력했다. ELISA 기반 혈청학 또한 연구 사이의 높은 변수 입증하고 있으며, 항체 기능 2가 해결되지 않습니다. 많은 말라리아 항원은 세포 친화의 IgG1과 동반되었고 IgG3 아형 항체 프로파일, 특히 merozoite 표면 항원 3을 유도한다. 이 서브 클래스 바이어스 식세포와 항체-FC-수용체 (의 FcR) 상호 작용이 antimerozoite 항체 4를 opsonizing의 이펙터 기능을 위해 중요하다는 것을 시사한다. 개발중인 여러 merozoite 항원 백신으로 설계식세포의 이펙터 기능 5, 6을 이끌어 설치류 말라리아의 모델에서 항체의 FcR 상호 작용의 중요성에 대한 중요한 증거가 7-9 존재하고, 몇 가지 최근의 연구는 인간의 말라리아에 대한 내성 기능 항체 식세포의 이펙터 기능의 중요성을 지원하지만 10, 11,이 지역은 제대로 공부 남아있다. merozoite 특정 opsonizing 항체에 관한 연구는 두 가지 요인에 의해 제한되었습니다; 좋은 품질의 merozoites 분리의 어려움; 일차 전지에서 변수 식균 작용 응답.
최근까지, 고속 원심 분리 또는 퍼콜 밀도 구배가 schizont 문화를 파열의 배양 상층 액에서 merozoites을 분리하기 위해 사용되었다. 이 merozoites 드물게 가능한했고, 종종 더 밀도 원심 분리에 의해 조작 및 여러 세척 분석에 사용하기 전에 (12), 또는 냉동 보존 11 단계를 반복합니다. 이 PROCesses 잠재적 merozoite면에서 많은 주변으로 연결된 단백질, 말라리아 면역 (13)의 항원 대상이 될 것으로 알려진 단백질을 분리합니다. 최근 시스테인 프로테아제 저해제 트랜스 Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4 - 구 아니 디노 페닐) 부탄 (E64)은 가능한 merozoites를 생성하는 데 사용되었다. E64는 가능한 merozoites 15, 16 해방을 여과하여 중단 될 수 막 동봉 merozoites 14, 생성, schizont 파열을 방지 할 수 있습니다. 이 기술은 적혈구의 침공 15, 17 ~ 19 동안 수많은 단백질의 공간 해상도로 이어질하고 여러 가지 항 말라리아 약 16, 20의 무대 특정 효과를 명확히했다. 그러나, 가능한 merozoites의 생성은 기술적으로 도전 남아있다. 면역의 기능 분석 실험에서 가능한 merozoite 정화 및 그 사용에 대한 자세한 프로토콜이 기술과 응용 프로그램의 보급에 도움항체의 표준화 된 기능 분석 : 옵 소닌 식균 작용의 휴대 협력은 여기에 설명되어 있습니다.
이 기술은 호중구 호흡 버스트, 항체 의존성 세포 억제 (ADCI), 대체 merozoite 식균 작용의 분석과 같은 merozoite의 옵 소닌 이전 생체 외 분석 실험을 통해 상당한 진보를 보여줍니다. 이 분석으로 인해 기생충 입력의 변화 및 기본 식세포 (11, 21)의 활동을 제대로 재현 할 수 있습니다. 오염 hemozoin는 뿌리깊은 식세포 기능 (22)에 영향을 미칠 수 있습니다. 최근에보고 된 강력하고 재현 merozoite 식균 작용의 분석 (23)는 promonocytic 세포주 THP-1 (24)를 사용합니다. 이 비 부착하고 구체적으로 구단 수용체 매개 식균 작용 (25, 26)을 수행하는 등이 높은 처리량 유동 세포 계측법의 분석을위한 최적의 세포 유형입니다. 복잡성 inves의 동안식균 작용을 tigating은 식균 작용의 정도는 THP-1 세포 및 혈장 농도에 대하여 merozoites의 수에 의존한다는 것이다. 실험 간의 재현성을 보장하기 위해, merozoites 열거되어야하고 정의 농도가 사용된다. 때문에 그들의 작은 크기에, 유세포 정량화가 필요 흐른다.
여기에서 설명하는 절차는 hemozoin을 제거하고 가능한 merozoites를 생성하고, 옵 소닌 식균 작용 다음 merozoites의 유세포 열거 이러한 merozoites의 응용 프로그램에 대해 설명합니다. 기술적으로하지만, 설명 된 기술은 자연스럽게 취득하고 백신이 면역을 유도하는 merozoite 표면에 특정 항체 반응의 기여를 해명에 유용 할 수 있습니다.
Protocol
NOTE : 모든 단계, 원심 분리 및 유동 세포 계측법 게다가, 무균 유지를 층류 후드 내에서 수행되어야한다. 적절한 예방 조치가 인간의 시료의 취급에 관한 촬영되어 있는지 확인합니다. 분석은 플라즈마의 적은 양에 매우 민감하다. 78 % 파푸아 뉴기니 (PNG)에서 반 면역 아이들 플라즈마 - 제공하는 희석 5 이르기까지 응답을 해결하기위한 최적입니다. 최적의 희석은 플라즈마 세트는 테스트중인에 따라 달라질 수 있으며, 따라서 플라즈마는 각 응용 프로그램에 대한 실험 조건을 결정하는 적정하는 것이 좋습니다. 플라즈마의 부재에 merozoites 2 음성 대조군 THP-1 세포의 포함을 확인합니다; 및 merozoites와 THP-1 세포가 말라리아 순진 개인의 플라즈마의 풀과 옵 소닌. 이 THP-1 세포에 merozoite 준수에 대한 제어를 허용하고 식균 작용 이벤트의 엄격한 유동 세포 계측법 게이팅을 활성화 할 수 있습니다.
PNG 혈장 샘플을 사용했다의학 연구 자문위원회, 보건 파푸아 뉴기니 장관, 월터와 엘리자 홀 연구소의 인간 연구 윤리위원회 (프로젝트 번호 4월 4일)에 의해 승인. 서면 동의가 모든 참가자의 부모 / 보호자로부터 얻은 것입니다.
1. THP-1 문화
- 5 % CO 2 배양기에서 10 % 소 태아 혈청 (FCS), 55 μM 2 mercapthoethanol (THP-1 매체)로 보충 RPMI-1640 배지에서 37 ° C에서 인간 단핵구 세포주 THP-1을 유지한다.
- 5 × 10 5 세포 / ml 이하의 농도에서 세포를 유지한다. 참고 : 전면에 자라 난이 부착 세포로 및 아래로 규제 구단 수용체의 분화가 발생합니다. 세포가 약 10 회 계대 배양 한 후, 세포의 표현형을 유지하기 위해 새로운 바이알을 해동.
2. 항체 샘플 준비 및 희석
- 열을 비활성화 플라즈마는 56 ℃에서 배양하여 테스트 말라리아 순진 제어 플라즈마 할; 30 분 C
- 직렬 THP-1 매체에 1 / 2, 000로 혈장을 희석.
- -20 ° C.에 보관 희석 플라즈마
고 동기화 P. 3. 문화 열대열
참고 : GFP - 표현 기생충 라인 D10-PfPHG 27 인해 기생충의 동기화 및 E64 첨가의 제어 타이밍을 지원의 48 시간의 라이프 사이클에 활용되었다. 이 라인은 세포질에서 GFP를 표현하기 때문에 또한,이 라인은 GFP의 유세포 감지하여 parasitaemia 무료 merozoites 감지 할 수 있습니다. 그러나, GFP의 형광 강도는 THP-1 세포 내에서 시각화를 제공하기에 충분하지 않고, 따라서 merozoites 티듐 브로마이드 (EtBr)와 대조된다. 다른 기생충 변종 꽉 싱크로 달성 것을 제공, 이용 될 수있다. 내습 15을 억제하는 성숙한 형태 28과 헤파린을 용해하는 소르비톨 처리를 조합하여 기생충 동기화
- P.에게 유지 원충은 RPMI-1640 배지에 3 % 용적률 25 ㎎ / ㎖ HEPES, 50 ㎍ / ㎖의 산틴, 10 % 풀링 된 인간 혈청, 2 ㎎ / ㎖ 탄산 수소 나트륨과 보충 (산도 7.4)에서 O + 인간의 적혈구 (RBC)에서 기생충 및 20 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신 (기생충의 중간). GFP + 기생충 선택 배지에 5 ㎎ / ㎖ 블라 S-염산을 추가합니다.
- 1 % O 2, 4 % CO 2와 95 % N 2 분위기에서 37 ° C의 공기 단단한 상자 또는 선택적으로 이중 밀봉 배양 플라스크에 문화를 품다.
- 얇은 얼룩 슬라이드를 준비하는 10 초 동안 100 %의 메탄올에 수정 한 6.7 밀리미터 (산도 7.1) 기생충을 모니터링하는 10 분 동안 인산염 완충액 (지엠 사 (Giemsa) 용액)의 10 % 지엠 사 (Giemsa) 용액으로 얼룩. 염색 후, 물, 공기 건조에 슬라이드를 씻어. 100X 기름 침지 렌즈를 사용하여 기생충을 평가합니다.
- 문화를 분할하고 감염되지 않은 추가 5 % 감염된 RBC 아래 기생충에 기생 문화를 유지RBC 필요.
- 헤파린과 동기화, 문화 단계 링 의료용 헤파린의 20 IU / ㎖를 추가합니다.
- 기생충의 대부분이 schizont 단계에있을 때, 5 분 300 XG에 펠렛 세포는 schizont 파열 및 merozoite의 침입을 허용하는 기생충의 중간에있는 헤파린 함유 중간에 resuspend를 제거합니다.
- 4 시간 후, 더 merozoite의 침입을 차단, 다시 문화 20 IU / ml의 헤파린을 추가합니다. 참고 : 기생충이 충분히 동기화되기 전에 소르비톨 및 헤파린 치료의 여러 사이클이 요구 될 수있다. 5 % parasitaemia - merozoites의 적절한 숫자를 생성하기 위해, 3에서 기생충 문화 150 ㎖를 준비합니다.
늦은 단계 P. 4. 분리 열대열 Trophozoites
- 서른 여섯 시간의 문화에 헤파린을 반환 한 후, 5 분 300 XG에서 배양 된 세포를 펠렛, 25 %의 적혈구에 기생 매체에 resuspend 펠렛.
- 큰 자기 칼럼 (6.3 매트릭스 볼륨을 연결합니다ML) 자석에, 모든 기포가 제거되었는지 확인하고, 기생충 매체와 열 평형.
- 재현 탁 P. 추가 falciparum의 문화 칼럼 및 초 당 한 방울로 유량을 조정합니다.
- 문화 컬럼을 통과하면 흐름을 통해 분명히 실행될 때까지, 기생충 매체로 열을 씻는다.
- 37 ° C 기생충 배지 30 ㎖의 열에서 기생충을 용출.
- 기생충의 얇은 얼룩을 준비 10 초 동안 100 %의 메탄올에 고정하고, 3 분 동안 지엠 사 (Giemsa) 용액으로 염색. 현미경 슬라이드를 검사, 기생충이 거의 적혈구를 작성하고 초기 schizont 단계에있는 것으로 표시되는지 확인합니다. 기생충은 적절한 성숙 단계에 도달하지 않은 경우 적절하게 개발 될 때까지, 1 % O 2, 4 % CO 2와 95 % N 2 분위기에서 37 ° C 배양기에 정제 된 기생충을 반환합니다. NOTE : 90 % 이상 감염된 적혈구의 순도는 R을 보장하기 위해 필요수익 증권은 merozoite 준비를 오염시키지 마십시오.
- . 10 μM E64 6 (Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4 - 구 아니 디노) 부탄 (E64)와 격리 된 schizonts 치료 - 10 시간 주 : E64와 긴 배양 시간이 가능하다, 그러나 생산 merozoites는 더 이상 침략 수 없습니다.
P. 5. 격리 열대열 Merozoites
- E64와 함께 배양 한 후, 100 % 메탄올에 세포를 고정하고, 막 동봉 merozoites의 형성을 평가하는 지엠 사 (Giemsa) 솔루션 얼룩, 기생충을 바른다. 주 : 기생충의 50 % 이상이 막 동봉 merozoites을 형성 한 경우 merozoites의 좋은 수익률을 얻을 수 있습니다.
- 펠렛 8 분 1,900 XG에서 schizonts를 E64 처리. 나머지 인간 혈청을 제거하기 위해 RT RPMI-1640 배지 50 ㎖의 25 ㎎ / ㎖ HEPES, 50 ㎍ / ㎖의 산틴, 2 ㎎ / ㎖ 탄산 수소 나트륨, 20 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신 (세척 중) 보충 (산도 7.4)로 세척 .
- 세척 배지 2 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 참고 : THP-1 미디어를 FCS가 함유하여 여과하는 동안 거품을 생성합니다.
- 1.2 μm/32 mm의 주사기 필터를 통해 재 부유 E64-schizonts의 2 ㎖를 필터링합니다. 10 ML 튜브에 여과 액을 수집합니다. 참고 : 여과 필터에서 수집되지 않은 파열 schizonts 및 파편, merozoites 및 hemozoin 결정이 포함되어 있습니다.
- 자석에 작은 자석 열을 부착하고, 500 ㎕의 THP-1 매체 평형.
- 자기 칼럼을 통해 여과 액을 전달합니다. 흐름을 통해 수집합니다. 참고 : merozoites 통과 반면 Hemozoin는 열에 바인딩합니다.
- 각각의 시간을 통해 흐름을 수집, hemozoin을 제거하려면 열 두 번에 걸쳐 흐름을 통해 전달합니다.
- 나머지 merozoites를 수집하는 RT THP-1 배지 2 ㎖로 컬럼을 씻어.
- 10 ㎍ / ㎖ (최종 농도) 및 RT에서 30 분 동안 얼룩에 EtBr을 추가합니다. 광표백을 방지하기 위해 빛으로부터 보호합니다. 주 : 확인 모든 EtBr 오염 된 액체 및 Plastic 폐기물은 독성 화학 물질에 적합한 방식으로 배치된다. Merozoites이 배양 한 다음 더 이상 침략 없습니다.
- 10 분 동안 4,000 XG에서 merozoites 스핀 다운.
- 적절한 폐기 용기에 상층 액을 버린다.
- 4 ML THP-1 매체에 merozoite 펠렛을 재현 탁하고, 10 분 동안 4,000 XG에 스핀 다운.
- 15 ML의 볼륨 THP-1 매체를 추가하고 빛으로부터 보호합니다.
유동 세포 계측법 6. 수치화 Merozoite 집중
- RT에 구슬을 계산 가져와.
- merozoites을 희석 0.5 % BSA와 PBS를 준비합니다.
- 3 희석에 merozoites 카운트; (100)에서 1; 50 1 25 1. 각각 PBS +0.5 %의 BSA의 940, 930 및 910 μL로 3 FACS 튜브를 준비합니다. 각각 튜브 당 정제 merozoites의 10, 20, 40 μl를 추가합니다.
- 30 초 동안 소용돌이 계산 구슬, 및 희석 merozoites을 포함하는 FACS 튜브 당 구슬의 50 μl를 추가합니다.
- 세 DIL을 실행흐름 uted의 merozoite 샘플 사이토 488 nm의 레이저를 탑재. 별도의 채널에서 형광에 의해 EtBr 및 GFP의 형광 이중 형광에 기초 merozoites, 게이트 카운트 구슬의 엄격한 게이트를 설정합니다. 2,000 비즈가 수집 될 때까지 이벤트를 취득. 참고 :이 지침은 EtBr로 반대 염색 한 GFP + merozoites 계산을 참조하십시오. 다음 측 분산 및 EtBr 형광에 기초 merozoite 게이트를 설정 기생충을 표현 GFP를 사용하지 않는 경우.
- merozoites의 비율 결정 : 2000 카운트 비드 이벤트에 의해 merozoite 이벤트의 수를 분할함으로써 비드를 각각 희석 비율을 계산한다. 튜브 당 추가 구슬의 50 μL에 구슬의 수를 결정하는 계수 구슬 배치 사양을 사용합니다.
- 희석 요인에 의해 merozoite 50 μL에 구슬의 수를 곱 : 그 희석 계수에 대한 비드 비율을. 이 숫자는 ML 당 merozoites의 농도가 동일합니다. 일을 수행각 희석 단계를 이거지.
- 세 희석에 걸쳐 측정 merozoite 농도를 평균. 50에서 100, 1에서 1 결정 농도가 10 %를 초과하는 표준 편차를, 1 (25)의 희석 계수 샘플을 준비 기술적으로 부정확 한 내용을 나타냅니다합니다.
- THP-1 세포 당 네 개의 merozoites의 최종 비율을 보장하기 위해 THP-1 배지에서 8 × 10 6 merozoites / ㎖에서 merozoites을 재현 탁. THP-1 비율로 다른 merozoite이 사용될 수 있고, 농도를 적절하게 수정해야합니다.
7. 식균 작용의 분석
- 96 웰 U-바닥 플레이트 잘 당 열 비활성 FCS 200 μl를 추가하고, 번호판을 차단하는 RT O / N에 둡니다. 배양 한 다음, FCS를 제거하고 200 ㎕의 멸균 PBS로 두 번 우물을 씻어. 필요한 때까지 4 ° C에서 PBS 및 저장 플레이트를 제거합니다.
- 1 ×에서 샘플 당 삼중 웰을 허용 혈장 샘플 및 컨트롤을 테스트하는 데 필요한 THP-1 세포의 수를 계산
- 혈구의 슬라이드에 문화의 10 μl를로드하여 THP-1 문화 농도를 결정합니다. 현미경 하에서 혈구의 16 각형의 사각형의 4 세트에 존재하는 세포의 수를 계산 한 후 카운트를 평균. 밀리리터 당 세포의 수를 계산하기 만함으로써 평균 횟수를 곱한다.
- 5 분 동안 500 XG에서 THP-1 세포의 필요한 개수를 스핀 다운하고, THP-1 배지에서 6.7 × 105 세포 / ml로 재현 탁.
- 10 5 세포 / 웰의 결과로, FCS 차단 된 96 개의 U-바닥 판에 잘 당 THP-1 매체 THP-1 세포의 150 μl를 추가합니다. 테스트 할 샘플 당 3 우물을 준비합니다. merozoites를 추가 할 준비가 될 때까지 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다.
- 물론 별도의 FCS 차단 96 개의 U-바닥 판에 8 × 10 6 / ml의 당에 merozoite 준비의 150 μl를 추가합니다. 테스트 샘플 당 하나의 잘 준비
- t에 잘 당 준비 희석 혈장의 10 μl를 추가합니다그는 그 merozoites을 포함 접시, 그리고 균일 한 솔루션을 보장하기 위해 잘 섞는다.
- 인큐베이터에서 THP-1 플레이트를 제거하고, 혈장 샘플 당 세중 우물에 잘 THP-1 세포를 포함하는 당 merozoite / 플라즈마 솔루션의 50 μl를 추가합니다.
- 잘 혼합하고, 5 % CO 2, 40 분 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 알을 품다. 빛으로부터 보호하기 위해 호일로 커버.
- 40 분, 4 ° C에서 500 XG에서 5 분 원심 분리기 샘플은 식균 작용을 체포하기 위해 원심 분리기를 prechilled 후.
- 상층 액을 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS +0.5 %의 BSA +2 mM의 EDTA (FACS 버퍼)에 두 번 세포를 씻으십시오. NOTE : EDTA는 유세포 분석을위한 단일 세포 현탁액을 유지하는 것을 용이하게 할 것이다.
- PBS +0.5 %의 BSA +2 mM의 EDTA (FACS 정착액)에서 2 % 파라 포름 알데히드 (PFA)의 90 μl의 세포를 수정. 빛으로부터 보호를 인수 할 때까지 얼음에 둡니다.
8. 유동 세포 계측법
- 탑재 WI 플로우 사이토 미터를 사용하여 샘플을 획득488 nm의 레이저 및 높은 처리량 플레이트 리더 첨부 파일을 토륨. 참고 :이 하나 merozoite 준비에서 테스트 할 400 혈장까지 가능하게 할 것이다. 세포는 또한 수동 시료 로딩 튜브로 옮겨 질 수있다.
- 전방 및 측면 산란에 의한 게이트 가능한 THP-1 세포.
- 컨트롤 'merozoites없이 플라즈마 THP-1 세포'에 따라 EtBr 긍정적 인 게이트를 설정합니다.
- 샘플 당 10,000의 최소 취득.
9. 데이터 분석
- 분석 소프트웨어 유동 세포 계측법, 및 EtBr 긍정적 인 이벤트에 대한 엄격한 게이트를 설정하여 데이터를 분석 할 수 있습니다.
- 비 면역 플라즈마 샘플 마이너스 % 양성 세포에 대한 EtBr + 세포의 % : 각 샘플에 대한 백분율 식균 작용을 계산합니다.
- 삼중에 걸쳐 평균 결과. 주 : 10 %를 초과하는 세중의 표준 편차는 실험 부정확를 나타냅니다. 몇 가지 배경 EtBr 긍정적 인 이벤트가 merozoi의 결과로 관찰 할 수있다테 THP-1 세포의 표면에 접착하지만 merozoites가 포함 된 모든 샘플에 걸쳐 일관성이 있어야합니다. 다음 컨트롤 'THP-1 merozoites없이 플라즈마 세포'제어 '비 면역 플라즈마 THP-1 세포'의 배경을 빼서에 따라 게이트 설정으로 인해 내면에 형광을 반영 % 식균 작용에서 발생합니다 / 만 merozoites을 포식.
Representative Results
이전 E64 치료에 기생충의 성숙 단계는 막 동봉 merozoites를 생성하는 것이 중요합니다. 그림 1Ai는 E64를 추가 schizonts의 적절한 성숙 단계를 보여줍니다. 기생충은 클 거의 적혈구를 기입해야합니다. 지엠 사 (Giemsa) 염색의 얼룩 모양이 merogony가 시작했다 나타내고, E64는 막 동봉 merozoites (그림 1Aii)을 수득 추가해야합니다. E64는 무대 기생충을 trophozoite에 앞서 추가 한 경우, 막 동봉 merozoites 심지어 E64의 12 시간 후에 생성되지 않습니다. 대신 기생충은 소화 액포 (그림 1Bi 및 1Bii)의 확대 등의 비정상적인 형태에 걸릴 및 merozoites가 형성되지 않습니다. E64는 schizonts 나중에 추가하면 schizont 파열 (그림 1CI 및 1Cii) 노골적인되는 한, 막 동봉 merozoites가 생성되지 않습니다. 기생충 공시성 (synchrony)의 높은 수준이 요구되는 기타설명 세 가지 결과의 현명한 범위는 E64 치료 후 볼 수 있습니다.
hemozoin의 제거는 정화 merozoites에 대한 또 다른 중요한 단계입니다. merozoites이 hemozoin에서 정제되지 않은 경우 merozoite-hemozoin 클러스터는 피펫으로 빠질 수없는 형태. 이 집계는 유동 세포 계측법 (그림 2A)에 의해 부정확 merozoite 계산의 결과로, 하나의 merozoites 다른 앞으로 산란 및 측면 산란 특성이기는하지만, 하나의 이벤트로 사이토에서 실행됩니다. THP-1 세포는 또한 hemozoin을 탐식 수있는 바와 같이, 이러한 merozoite-hemozoin 클러스터는 또한 (그림 2B)을 포식 할 수 있습니다. 그들은 여러 merozoites를 포함하는 이러한 집계는 매우 EtBr 형광 있습니다. 복수의 개별 merozoites의 식균 작용에 대한 관찰에 THP-1 EtBr 형광 프로필 상당의 집계 결과의 식균 작용. hemozoin가 제거되지 않은 경우에 따라서, THP-1 세포의 EtBr 형광 O 것테스트중인 플라즈마 opsonizing 잠재력 verestimate. Hemozoin도 크게 식세포 기능을 변경하는 것으로보고된다. GFP 긍정적 merozoites은 카운터 THP-1 세포에 의해 포식 merozoites의 시각화를 증가 EtBr로 염색된다. 이 프로토콜에 설명 된 조건을 사용하여, 모든 GFP 양성 merozoites은 밝은 형광 강도 (도 3a)이 EtBr과 대조된다. EtBr 형광에 의한 식균 작용의 평가는 GFP의 형광 (그림 3B)보다 merozoite 식균 작용의 뛰어난 해상도를 가능하게한다.
상기 분석에 첨가 merozoites의 수는 관찰 된 식균 작용의 양을 조절하는 것이다. 이러한 이유로, 유동 세포 계측법에 의해 정확한 계산이 중요합니다. merozoites의 비율 증가 : THP-1은 플라즈마의 부재에서 THP-1 세포에 merozoites의 증가 부착 (그림 4A)가 발생합니다. merozoite 증가 : THP-1 비율도 증가 산도 결과agocytosis 응답 merozoites (그림 4B) 옵 소닌 때. 4:1 merozoite은 : THP-1 비율은 강력한 식세포 반응을 권장합니다. 이 비율 및 표시 플라즈마의 희석을 사용하여,이 분석은 opsonizing 항체의 낮은 중간 및 높은 수준을 확인할 수 있습니다. 0 ~ 78 %의 식균 작용 응답은 PNG 플라즈마 샘플 및 설명 다른 조건을 사용하여 관찰되었다. 이러한 응답은 최근. 그림 5는 PNG의 개인의 식균 작용 반응의 4 분위수의 예를 보여줍니다 말라리아 10 자연적으로 획득 한 임상 면역과 연관 표시됩니다.
E64 첨가 그림 1. 타이밍 막 동봉 merozoites를 생성하기위한 중요합니다. (A) 적절한 maturatio. E64는 미성숙 기생충에 추가 된 경우 n 개의 I) 이전에 E64의 치료에 기생충의 단계 및 II) E64 치료 6 시간 이후에 생산 된 막 - 동봉 merozoites (B) 막 동봉 merozoites가 생성되지 않습니다; I) 늦은 단계 trophozoites 및 E64 늦은 schizonts 분단에 추가 된 경우 II) E64의 12 시간 후 (C) Schizont 파열이 금지되지 않습니다.; I) 늦은 단계 schizonts 및 II) E64의 6 시간 후. 스케일 바는 10 μm의를 나타냅니다.
그림 2. Hemozoin 제거는 hemozoin가 자기 merozoites 분리하지 않는 한. Merozoite-hemozoin 집계가 막 동봉 merozoites의 여과 다음과 같은 형식으로 단일 셀 merozoite 현탁액을 생성하는 것이 중요합니다. (A) merozoites의 앞으로 산란 및 측면 산란 플롯과 hemozoin 제거그리고 hemozoin는 유지. (B) Hemozoin-merozoite 집계 THP-1 세포에 의해 포식 할 수 있습니다. PNG 플라즈마 배양 THP-1 세포의 비교 - 빠른 스테인드 사이토 스핀 슬라이드 hemozoin 유무에 관계없이 merozoite 준비를 옵 소닌. 스케일 바는 10 μm의를 나타냅니다.
그림 3. 에티 디움 브로마이드 염색 (A) GFP 긍정적 merozoites에 게이팅과 정제 merozoites의 histrogram 유동 세포 계측법. D10-GFP 정제 merozoites이 형광 강도를 개선하기 위해 EtBr과 대조된다. merozoite 식균 작용의 뛰어난 해상도를 허용하고 EtBr을 보여주는 점 오점 이 게이트 GFP 긍정적 인 인구 내에서 형광. (B) GFP 대 앞으로 분산 및 GFP 및 EtBr 이중 형광 merozoites의 식균 작용 다음 THP-1 세포의 EtBr 대 앞으로 분산. 게이츠는 거라고했다 rawn merozoites없이 플라즈마 제어와 THP-1 세포를 기반으로.
그림 4 merozoite :. THP-1 비율은 관찰 식균 작용의 정도에 영향을 미친다. (A) 다섯 merozoite : THP-1의 비율이 도시되어있다; 50:1 20:1 10:1 4:1 1:1. 세포 만 제어에 의한 THP-1 세포에 배경 형광을 나타냅니다. . 각 비율에 대한 THP-1 EtBr의 형광 (B) 다른 merozoite위한 THP-1 세포의 평균 형광 강도 PNG 플라즈마의 풀 또는 면역성이 호주 플라즈마 옵 소닌 merozoites에 표시됩니다 : THP-1 비율, 수영장이있는 옵 소닌 PNG 플라즈마 또는 면역성이 호주 플라즈마 (+ SEM을 의미)의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5. opsonizing 항체의 넓은 범위를 측정 할 수있다. Merozoites는 PNG 개인으로부터 플라즈마로 옵 소닌과 THP-1 세포와 함께 배양 하였다. 네 대표 식균 작용 응답이 표시됩니다. 게이츠는 merozoites없이 플라즈마 제어 THP-1 세포에 따라 그린, 숫자가 아닌 면역 플라즈마 제어와 THP-1 세포의 공제 후 %의 식균 작용을 표시했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
merozoite 식균 작용을 측정하기 위해 두 가지 기술의 숙련도가 필요합니다 merozoites 및 THP-1 식균 작용 분석의 정화. 이 두 기술을 결합하기위한 가장 중요한 단계는 다음과 같다 : 1) 높은 동기 기생충; 2) 막 동봉 merozoites을 산출하는 정확한 시간에 E64을 추가; 3) 골재를 피하기 hemozoin 분리; 유동 세포 계측법 4) 정확한 merozoite 계산; 5) 사용 플라즈마의 희석; 및 6) 낮은 세포 밀도 및 THP-1 세포의 통로 번호를 유지. 이러한 핵심적인 측면을 신중하게 고려 강력한 식균 작용 반응이 관찰되어 있는지 확인합니다.
여기에 설명되지만 탐식을 평가 merozoites의 제제이고, 기술은 다양한 애플리케이션에 이용 될 수있다. 상관없이 다운 스트림 방법론 최적 merozoite 제제는 올바르게 merozoites를 생성하기 위해 E64 가산 타이밍에 의존한다. 여기서 설명한 방법은 E64 Y 보여왔다침입 이벤트 및 약물 민감도 분석 15 ~ 20의 높은 해상도 현미경에 사용하기 위해 침략 merozoites를 ield. merozoite 생존 능력이 식균 작용에 필수적인 것은 아니지만, merozoite 표면 코팅의 무결성이 필요합니다. 따라서 여기에 설명 E64 방법 고품질 merozoites가 표층에 항체 반응을 평가하기 위해 제조 될 수있다. E64는 너무 일찍 추가되거나 너무 늦게 막 동봉 merozoites이 형성되어 있지 않은 경우, 그림 1에 설명 된대로. 이러한 이유로, 높은 동기 기생충 배양이 요구된다. 여기서, 단단히 행 소르비톨 및 헤파린 치료의 사용은 2 시간의 창 D10-GFP 기생충 배양 동기화가 설명된다. 헤파린은 다른 실험실 분리에 gametocytogenesis을 촉진 할 수 있고, 따라서주의 깊게 사용되어야한다. 예컨대 알라닌 같은 대체 동기화 방법은 또한 밀접하게 동기화 기생충은 29을 생산하는 것을 제공하는 사용될 수있다. E64은 비동기 기생충에 추가되면, 하부 지주막 동봉 merozoites의 ortion 생산하고 나머지 RBC는 일반적으로 파열되거나 비정상적인 형태를 개발할 것 하나 기생충에 감염된 것입니다. 막 동봉 merozoites로 발전하지 않은 기생충의 존재는 필터의 막힘의 원인과 크게 얻은 merozoite 수율을 줄일 수 있습니다.
막 동봉 merozoites 여과 동안 hemozoin 소화 액포에서 해방하고 솔루션 무료 결정으로 존재한다. Hemozoin 높게 염증성이며 단핵구 및 대 식세포의 탐식 응답 (30), (31)을 조절하는 것으로보고되었다. 도 2에 도시 된 바와 같이 식균 작용을 변조 외에, hemozoin은 용액 merozoites 가진 응집체를 형성 할 수있다. THP-1 세포가 이러한 집계를 탐식 할 수 있습니다,이 항체 매개 식균 작용의 해결을위한 주요 교란 요인이 될 수 있습니다. 따라서 hemozoin의 제거는 AV이 분석에 필요한식세포 생물학에 hemozoin의 OID 복잡성. merozoite 정량화가 필요합니다 특히 경우, 다른 응용 프로그램에 대한 무료 merozoites를 생성하기 위해이 기술을 사용하는 경우 또한, hemozoin을 제거하지 않으면 또한 해로운 수 있습니다.
도 4에서 설명한 바와 같이, merozoites의 수는 THP-1 세포에 의해 식세포 작용의 정도에 영향을 미칠 수있는 분석법에 첨가. 유동 세포 계측법은 merozoite 농도,주의 피펫 및 merozoites의 수를 복제의 열거 형 수 있지만 정확성을 향상시킬 필요합니다. 체류 기생충 라인 나란히 시험 할 경우에 특히 중요하다. 그것은 이전에 응답이 23 거절하기 전에 PNG에서 반 면역 아이들 플라즈마가 크게 희석 될 수 있다는 것을 증명하고있다. phagocyt의 넓은 범위를 생산 12 년 된 PNG 아이 - 5 일대에 대한 플라즈마의 최적 희석 (1 / 120 플라즈마 000 최종 희석)는 여기에 설명. (- 19 %, 20-39%, 40-59% 60 - 0 79 % 식균 작용) 그림 5에 설명 OSIS 응답이 범위는 네 그룹으로 응답 층화 허용 및 회귀 모델링 opsonizing 응답이 연관된 것으로 나타났다 다른 코호트 임상 질환과 고밀도 parasitaemia (10)로부터 보호하거나 검출 레벨 이하로 포화되지는 THP-1 세포에 의하여 식균 작용을 보장하기 위해 플라즈마의 희석 조절 될 필요가있다 연구.
유동 세포 계측법 현미경을 통해 향상된 정확도와 신속하고 정량적 식균 작용을 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 높은 처리량, 플레이트를 기반으로 자연스럽게 획득 체액 성 면역을 연구하는 96 웰 플레이트의 수집을 자동화합니다. 방법은 SYBRgreen, DAPI와의 propidium 요오드, 막 얼룩 또는 단백질 얼룩 그러나 다른 DNA 얼룩 활용 될 수 에티 디움 브로마이드 merozoites의 염색이 필요합니다. 이 분석은 PRIMAR 의무 일 것식세포 또는의 FcR 생물학 관심이 있다면 Y 단핵구 또는 호중구, 그리고 적용 할 수 있습니다. PMA와 체외에서 분화 기본 세포 또는 THP-1 세포가 말라리아 및 기타 병원균 12, 32 ~ 34의 식균 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 세포가 부착하고 또한 비 항체 매개 식균 작용 (35)를 표시 그러나 일차 전지를 사용하는 것은 도전이 될 수 있습니다. 또한, 순도, 생존 및 기능의 변화는 기본 식세포의 사용에 대한 몇 가지 중요한 제한이 있습니다. merozoite의 식균 작용에 관여 구단 수용체에 uncharacterized 남아, 따라서 특정 구단 수용체 항체를 차단하는 식균 작용을 merozoite 각 Fc 수용체의 기여를 명료하게 할 수 사용. THP-1 식균 작용이의 FcR 의존하고,이 관찰 식균 작용의 직접적인 해석을 가능하게한다. 이 분석은 또한 UTIL 의해 달성 될 수있는 항체를 opsonizing의 항원 특이성을 어드레싱라는 것으로merozoite 표면 항원에 대한 노크 아웃 기생충을 izing, 또는 표면 단백질을 merozoite 친 화성 정제 된 인간 항체를 사용하여. 또한, 깊이 merozoite 식균 작용 다음과 같은 사이토 카인 반응의 연구는 부족하고,이 분석을 사용하여 달성 될 수있다.
이 두 기술은 기능 antimerozoite 항체의 연구에 상당한 진보를 구성한다. 고품질 merozoites의 정제 동결 보존 merozoites 또는 merozoite 항원으로 코팅 된 형광 미립자를 사용하는 것이 유리하다. 이 분석은 자연스럽게 획득 내성을 평가하기위한 도구로서 사용되었지만, 예방 접종에 대한 면역 반응의 획득을 해결하기위한 중요한 도구를 증명할 수있다. 그것은 최근에 식균 작용 또는 opsonised merozoites 임상 말라리아로부터 보호와 관련된 것으로 나타났습니다 반면, 생체 phagocyto에 체외 THP-1 식균 작용에서 직접 결론을 도출 할 수 없습니다이 분석에서 식균 작용 등 merozoites의 SIS는 정적 조건에서 적혈구를 경쟁의 부재하에 일어난다. 이 분석의 잠재적 적응 따라서 말라리아 merozoite 식균 작용의 추가 이해를위한 다양한 도구를 제공 할 수 있습니다.
Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
저자는 어린이와 성인 플라즈마 기증자 및 의료 연구의 파푸아 뉴기니 학회에 직원을 인정하고 싶습니다. 저자는이 기술의 개발에 기여를 위해 아만 딘 B Carmagnac, 캐서린 Q 니, 대니 윌슨 W, 이보 뮬러와 다이아나 S 한센에게 감사를 표하고, 혈액 및 혈청 팩은 호주 적십자 감사합니다. 이 작품은 빅토리아 주 정부 운영 인프라 지원 및 호주 정부 NHMRC IRIISS을 통해 가능하게되었다. 이 작품은 국립 보건 의학 연구위원회에 의해 지원되었다 # 1031212 및 # 637406을 부여하고, 국립 보건원의 교부 번호의 AI089686.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| THP-1 cell line | American Type Culture Collection | TIB-202 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 31800-089 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Invitrogen | 10099-141 | |
| 2-mercapthoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | Use in Fume Hood |
| Pen/Strep Solution (100x) | Sigma | P0781 | |
| HEPES | SAFC | 90909C | Cell culture grade |
| Hypoxanthine | Calbiochem | 4010 | |
| Human Serum | Donation from Australian Red Cross | Available commercially (i.e. Invitrogen) | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 1.06329.0500 | |
| Gentamycin | Pfizer | 61022027 | Injection Quality |
| Heparin Sodium BP (5000 IU/ml) | Pfizer | Porcine origin | |
| Blasticidin S-hydrochloride | Sigma-Aldrich | 15205 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | 50-70-4 | |
| E64 Protease Inhibitor | Sigma-Aldrich | E3132-10MG | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 98281-100G | Use for phosphate buffer |
| Na2HPO4.2H20 | Merck | 10383.4G | Use for phosphate buffer |
| Giemsa's azur eosin methylene blue solution | Merck | 1.09204.0500 | 1:10 dilution in 6.7 mN Phosphate buffer (make fresh each stain) |
| EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1 M, pH 7.2 |
| Acrodisc Syringe Filters 1.2-μm/32-mm | Pall Life Sciences | 4656 | |
| QuadroMACS Separator (for small column) | MACS Miltenyi BioTec | 130-091-051 | Interchangeable with MidiMACS |
| VarioMACS Separator (for large columns) | MACS Miltenyi BioTec | 130-090-282 | |
| MACS MultiStand | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
| LS Column (small magnetic column) | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
| Large magnetic column | MACS Miltenyi BioTec | 130-041-305 | |
| Ethidium Bromide | Bio-Rad | 1510433 | Cytotoxic |
| CountBright Absolute Counting Beads | Invitogen | C36950 | |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer with HTS plate reader | BD Biosciences | ||
| EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1 M, pH 7.2 |
| FlowJo cytometry analysis software | Tree Star |
References
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