Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

High Yield Rensing av Published: July 17, 2014 doi: 10.3791/51590
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Division of Infection and Immunity, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, 2Department of Medical Biology, University of Melbourne

Summary

Måling antistoff funksjonen er nøkkelen til å forstå immunitet mot Plasmodium falciparum malaria. Denne metoden beskrives rensing av levedyktige merozoites, og måling av opsonization avhengig fagocytose ved strømningscytometri.

Abstract

Plasmodium falciparum merozoite antigener er under utvikling som potensielle malariavaksiner. Et aspekt av immunitet mot malaria er fjerning av frie merozoites fra blodet ved fagocytiske celler. Men vurdere den funksjonelle effekten av merozoite spesifikke opsonizing antistoffer er utfordrende på grunn av den korte halveringstiden til merozoites og variasjonen av primære fagocytiske celler. Beskrevet i detalj heri er en metode for generering av levedyktige merozoites hjelp av E64-proteaseinhibitor, og en assay av merozoite opsonin avhengig fagocytose ved hjelp av pro-monocyttisk cellelinje THP-1. E64 forhindrer schizont brudd samtidig som utviklingen av merozoites som frigjøres ved filtrering av behandlede schizonter. Etidiumbromid merket merozoites er opsonized med humane plasmaprøver og lagt til THP-1 celler. Fagocytose blir vurdert av en standardisert høy gjennomstrømning protokoll. Levedyktige merozoites er en verdifull ressurs for å vurdere numerlige aspekter ved P. falciparum biologi, herunder vurdering av immunforsvar. Antistoffnivåer målt ved denne analysen er forbundet med klinisk immunitet mot malaria i naturlig utsatte individer. Analysen kan også være av nytte for å vurdere vaksineinduserte antistoffer.

Introduction

Betydningen av antistoffer for immunitet mot Plasmodium falciparum malaria ble vist for 40 år siden, da immunglobulin fra hyperimmune voksne ble passivt overført til barn som lider av alvorlig malaria resulterer i lindres sykdom en. Derfor har betydelig innsats søkt å identifisere mål av beskyttende malarial immunitet, for det meste gjennom å måle antistoff titere til peptider eller bacterially uttrykte proteiner av ELISA. ELISA basert serologi har også vist seg svært variabel mellom studier, og omhandler ikke antistoff funksjonalitet to. Mange malaria antigener indusere en cytophilic IgG1 og IgG3 antistoffprofil, spesielt merozoite overflateantigener tre. Denne underklasse skjevhet tyder på at antistoff-Fc-reseptor (FCR) interaksjoner med fagocytter er viktig for de effektorfunksjoner av opsonizing antimerozoite antistoffer fire. Flere merozoite antigen vaksiner under utvikling er utformet for åfremkaller phagocyte effektorfunksjoner 5, 6, og selv om betydelige bevis på viktigheten av antistoff-FeR interaksjoner i modeller av gnager malaria eksisterer 7-9, og noen nylige studier støtter betydningen av funksjonelle antistoffer og phagocyte effektorfunksjoner for immunitet til malaria hos mennesker 10, 11, forblir dette område lite studert. Studier i merozoite spesifikke opsonizing antistoffer har vært begrenset av to faktorer; vanskene med å isolere god kvalitet merozoites; og variable fagocytose svar fra primære celler.

Inntil nylig var høy hastighet sentrifugering eller Percoll tetthetsgradienter benyttes til å isolere merozoites fra dyrkningssupernatanter av sprekker schizont kulturer. Disse merozoites var sjelden levedyktig, og ofte ytterligere manipulert ved tetthetssentrifugering og flere vasketrinn 12, eller nedfrysing 11 før bruk i analyser. Disse procsesser potensielt løsner mange perifert knyttet proteiner fra merozoite overflaten, proteiner kjent for å være antigene mål av malaria immunitet 13. Nylig cystein protease inhibitor trans-Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butan (E64) har blitt brukt til å generere levedyktige merozoites. E64 hindrer schizont ruptur, genererer membranlukket merozoites 14, som kan være avbrutt ved filtrering for å frigjøre levedyktige merozoites 15, 16. Denne teknikken har ført til den romlige oppløsningen av en rekke proteiner ved erytrocytt invasjon 15, 17-19 og har klarlagt stadium spesifikk effekt av flere antimalariamidler 16, 20. Men den generasjonen av levedyktige merozoites forblir teknisk utfordrende. For å hjelpe til i formidling av denne teknikken og anvendelse til funksjonelle undersøkelser av immunitet, en detaljert protokoll for levedyktige merozoite rensing og deres anvendelse i enstandardisert funksjonell analyse av antistoff: cellular samarbeid i opsonization og fagocytose er beskrevet her.

Denne teknikken viser et betydelig fremskritt i forhold til tidligere i vitro av merozoite opsonization, som nøytrofile åndedretts briste, Antistoff Dependent Cellular Hemming (ADCI), og alternative merozoite fagocytose analyser. Disse analysene er dårlig reproduserbar grunn av variasjon i parasitt-innganger, og aktiviteten av primære fagocytiske celler 11, 21. Forurensende hemozoin kan også dypt påvirke phagocyte funksjon 22. En nylig rapportert robust og reproduserbar merozoite fagocytose assay 23 benytter promonocytic cellelinje THP-1 24. Dette er en ideell celletype for høy gjennomstrømning flowcytometri assays som det er ikke-klebende, og spesielt utfører Fc-reseptormediert fagocytose 25, 26. En ekstra kompleksitet mens investigating fagocytose, er at graden av fagocytose er avhengig av antallet merozoites forhold til THP-1-celler og plasmakonsentrasjon. For å sikre reproduserbarhet mellom eksperimenter, bør merozoites være nummerert og en definert konsentrasjon som brukes. På grunn av sin lille størrelse, flowcytometrisk kvantifisering er nødvendig.

Prosedyren er beskrevet her fjerner hemozoin og genererer levedyktige merozoites, og beskriver en anvendelse av disse merozoites for flowcytometrisk oppregning av merozoites fulgt av opsonization og fagocytose. Selv om det teknisk krevende, kan de teknikkene som beskrives vise seg nyttig i å belyse bidrag merozoite overflate spesifikke antistoffresponsen til naturlig ervervet og vaksine indusert immunitet.

Protocol

NOTE: Alle trinn, i tillegg til sentrifugering og flowcytometri, bør utføres i en laminær strømningshette for å opprettholde sterilitet. Sikre riktige forholdsregler er tatt om håndtering av humane prøver. Denne analysen er svært følsomme for små mengder av plasma. De fortynninger tilbys er optimal for å løse svar fra 5 - 78% med plasma fra semi-immune barn fra Papua Ny-Guinea (PNG). Den optimale fortynning kan variere med plasma sett blir testet, og derfor anbefales det at plasma titreres for å avgjøre eksperimentelle forhold for hver applikasjon. Sikre inkludering av to negative kontroller THP-1 celler med merozoites i fravær av plasma; og THP-1 celler med merozoites opsonized med en pool av plasma fra malaria naive individer. Dette vil gi kontroll for merozoite tilslutning til THP-1 celler og for å muliggjøre strenge flow-cytometri gating av fagocytose hendelser.

Bruken av PNG plasmaprøvene vargodkjent av Medical Research Advisory Committee, Papua Ny-Guinea Helsedepartementet, The Walter og Eliza Hall Institute Menneskelig forskningsetiske komité (prosjektnummer 04/04). Skriftlig samtykke ble innhentet fra foreldre / foresatte til alle deltakerne.

En. THP-1 Kultur

  1. Oppretthold human monocytisk cellelinje THP-1 i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS) og 55 uM 2-mercaptoethanol (THP-1-medium), og ved 37 ° C i en 5% CO2 fuktet inkubator.
  2. Oppretthold-celler ved en tetthet under 5 x 10 5 celler / ml. NB overvekst vil resultere i differensiering til adherente celler og nedregulering av Fc-reseptorer. Når cellene er blitt passaged omtrent 10 ganger den tines en ny beholder for å opprettholde celle fenotype.

2. Antistoff Prøvepreparering og fortynning

  1. Varme inaktivere plasma som skal undersøkes, og malaria-naive styre plasma ved inkubering ved 56 °; C i 30 min
  2. Serielt fortynnet plasmaprøver til 1/2, 000 i THP-1-medium.
  3. Oppbevares utvannet plasma ved -20 ° C.

Tre. Culture of Highly Synkronisert P. falciparum

MERK: GFP-uttrykke parasitt linjen D10-PfPHG 27 ble utnyttet på grunn av sin 48 timers livssyklus som bistår synkronisering av parasitter og kontrollert timing av E64 tillegg. Videre, fordi denne linjen uttrykker GFP i cytosol, gjør at denne linjen påvisning av parasittmengden og gratis merozoites etter flowcytometrisk påvisning av GFP. Imidlertid er GFP fluorescensintensitet ikke er tilstrekkelig til å gi visualisering i THP-1-celler, og derfor, er merozoites kontrafarget med etidiumbromid (EtBr). Andre parasitt-stammer kan anvendes, forutsatt at tett synkroni er oppnåelig. Synkron parasitter ved hjelp av en kombinasjon av sorbitol behandling til å lysere modne formene 28 og heparin for å hemme invasjon 15

  1. Oppretthold P. falciparum parasitter in O + humane erytrocytter (RBC) ved 3% hematocrit i RPMI-1640-medium (pH 7,4) supplert med 25 mg / ml HEPES, 50 pg / ml hypoxantin, 10% sammenslått humant serum, 2 mg / ml natriumbikarbonat, og 20 mikrogram / ml gentamycin (Parasite medium). Tilsett 5 mg / ml Blasticidin S-hydroklorid til kulturmediet for å selektere for GFP + parasitter.
  2. Inkuber kulturer i lufttette bokser eller alternativt dobbelt forseglet kulturflasker ved 37 ° C i en atmosfære av 1% O2, 4% CO2 og 95% N2.
  3. Forbered tynne smøre lysbilder, fikse i 100% metanol i 10 sek, og flekken med 10% Giemsa løsning i 6,7 mM (pH 7,1) fosfat buffer (Giemsas løsning) for 10 min å overvåke parasitemia. Etter farging, skyll raset i vann og lufttørke. Vurdere parasitemia bruker en 100X oljeneddyppingsobjektivet linse.
  4. Oppretthold parasitt kulturer på en parasitemia under 5% smittet RBC ved å splitte kulturer og legge infisertRBC etter behov.
  5. For å synkronisere med heparin, tilsett 20 IE / ml av medisinsk-grade heparin å ringe stadium kulturer.
  6. Når flertallet av parasitter er på schizont scenen, pellet cellene ved 300 xg i 5 min, ta heparin-holdig medium og resuspender i parasitt medium for å tillate schizont ruptur og merozoite invasjon.
  7. Etter fire timer, legger 20 IU / ml heparin tilbake til kulturer, blokkerer videre merozoite invasjon. MERK: Flere sykluser av sorbitol og heparin behandling kan være nødvendig før parasitter er tilstrekkelig synkronisert. For å generere passende antall merozoites, forberede 150 ml parasitt kultur på 3 - 5% parasittmengden.

4. Isolering av Late Stage P. falciparum Trophozoites

  1. Trettiseks hr etter retur heparin til kulturer, pellet dyrkede celler ved 300 xg i 5 min, og resuspender pelleten i parasitt-medium ved 25% hematokrit.
  2. Fest en stor magnetisk kolonne (matrise volum på 6,3ml) til en magnet, og ekvilibrere kolonnen med parasitten medium, slik at alle luftbobler fjernes.
  3. Legg det resuspenderte P. falciparum kulturen til kolonnen, og justere strømningshastigheten til en dråpe per sek.
  4. Når kulturen har passert gjennom kolonnen, vaskes kolonnen med parasitten medium inntil gjennomstrømnings går klart.
  5. Eluer parasitter fra kolonnen i 30 ml 37 ° C parasitt medium.
  6. Forbered en tynn smøre av parasitter, fikse i 100% metanol i 10 sek, og flekker med Giemsa løsning for 3 min. Undersøke raset under mikroskopet, og sørge for at parasitter nesten fylle den røde blodlegemer, og ser ut til å være i tidlig schizont stadier. Dersom parasitter ikke har nådd den riktige modningstrinn, tilbake rensede parasitter til en 37 ° C inkubator i en atmosfære av 1% O2, 4% CO2 og 95% N2 inntil tilstrekkelig utviklet. MERK: Purity på mer enn 90% infiserte røde blodceller er nødvendig for å sikre RBCs ikke forurense merozoite forberedelser.
  7. Unn isolerte schizonter med 10 mikrometer E64 (Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butan (E64) for 6 - 10 timer. MERK: Lengre inkubasjonstidene med E64 er mulig, men de merozoites produsert vil ikke lenger være invasiv.

5. Isolering av P. falciparum merozoites

  1. Etter inkubasjon med E64, smøre parasitter, fikse-celler i 100% metanol, og flekken med Giemsa-løsning for å vurdere dannelse av membran-omsluttet merozoites. MERK: Et godt utbytte av merozoites vil oppnås dersom den er større enn 50% av parasitter har dannet membran lukkede merozoites.
  2. Pellet E64-behandlet schizonter på 1900 xg i 8 min. Vask med 50 ml RT RPMI-1640-medium (pH 7,4) supplert med 25 mg / ml HEPES, 50 pg / ml hypoxantin, 2 mg / ml natriumbikarbonat, og 20 pg / ml gentamycin (vaskemedium) for å fjerne gjenværende av humant serum .
  3. Resuspender pellet i 2 ml vaskemedium. MERK: Ved hjelp av FCS-holdige THP-1 media vil produsere skumming under filtrering.
  4. Filter 2 ml resuspendert E64-schizonter gjennom en 1,2 μm/32 mm sprøytefilter. Samle opp filtratet i et 10 ml rør. MERK: filtratet inneholder merozoites og hemozoin krystaller, med un-sprukket schizonter og rusk samles i filteret.
  5. Fest en liten magnetisk kolonne til en magnet, og likevekt med 500 mL THP-1 medium.
  6. Pass filtratet over magnetisk kolonnen. Samle gjennomstrømning. MERK: Hemozoin vil binde seg til kolonnen, mens merozoites vil passere gjennom.
  7. Før gjennomstrømning over kolonnen to ganger til for å fjerne hemozoin, samle strømningen gjennom hver gang.
  8. Vask kolonnen med 2 ml av RT THP-1 medium for å samle eventuelle gjenværende merozoites.
  9. Legg EtBr på 10 mikrogram / ml (sluttkonsentrasjon) og flekk i 30 min ved RT. Beskytt mot lys for å hindre fotobleking. Merk: Sørg for at all EtBr forurenset væske og plastic avfall blir deponert på en måte som passer for cytotoksiske kjemikalier. Merozoites er ikke lenger invasiv følger denne inkubasjon.
  10. Spinn ned merozoites på 4000 xg i 10 min.
  11. Kast supernatant i passende avfallsbeholder.
  12. Resuspender pelleten merozoite i 4 ml THP-1-medium, og spinne ned ved 4000 xg i 10 min.
  13. Til THP-1-medium inntil et volum på 15 ml, og beskyttes mot lys.

6. Kvantifisere Merozoite Konsentrasjon av flowcytometri

  1. Bring telle perler til RT.
  2. Forbered PBS med 0,5% BSA for å fortynne merozoites.
  3. Count merozoites på tre fortynninger; En i 100; En i 50 og en i 25 år. Forbered tre FACS rør med 940, 930 og 910 mL PBS 0,5% BSA, henholdsvis. Tilsett 10, 20 og 40 ul av rensede merozoites per rør, henholdsvis.
  4. Vortex telle perler for 30 sek, og legge til 50 mL av perler per FACS rør som inneholder utvannet merozoites.
  5. Kjør tre diluted merozoite prøver på et flowcytometer utstyrt med en 488 nm laser. Sett en strengere gate for merozoites basert på EtBr og GFP fluorescens dual fluorescens, og gate telle perler av fluorescens i en egen kanal. Acquire hendelser før 2000 perler er samlet. Merk: Disse instruksjonene viser til telling GFP + merozoites som er kontra farget med EtBr. Hvis ikke utnytte GFP uttrykke parasitter deretter satt merozoite porter basert på sidespredning og EtBr fluorescens.
  6. Bestemme forholdet mellom merozoites: perler ved å dividere antall merozoite hendelsene med 2000 telling perle hendelser, beregne en ratio for hver fortynning. Bruk telling perle batch spesifikasjoner for å bestemme antall perler i 50 mL av perler lagt per tube.
  7. Multipliser antall perler i 50 pl med fortynningsfaktoren og ved merozoite: bead-forholdet for den fortynningsfaktor. Dette tallet tilsvarer konsentrasjonen av merozoites per ml. Utfør these trinnene for hver fortynning.
  8. Gjennomsnittlig de merozoite konsentrasjonene målt over de tre fortynninger. MERK: Standardavvik i overkant av 10% for konsentrasjonene som er fastsatt for en i 100, en i 50, og en i 25 fortynninger indikerer tekniske unøyaktigheter i forberedelsene telleprøver.
  9. Resuspender merozoites på 8 x 10 6 merozoites / ml i THP-1-medium for å sikre en endelig forhold på fire merozoites pr THP-1-celle. MERK: Andre merozoite til THP-1 forholdstall kan benyttes, og konsentrasjoner bør endres tilsvarende.

7. Fagocytose Assay

  1. Legg 200 mL av varme inaktive FCS per brønn av 96 godt U-bunnplater, og la på RT O / N å blokkere plater. Etter inkubasjon, fjerne FCS og vaske brønner to ganger med 200 mL sterilt PBS. Fjern PBS og lagre platene ved 4 ° C inntil behov.
  2. Beregn hvor mange THP-1-celler som kreves for å teste plasmaprøver og kontroller, slik tredoble brønner per prøve på 1 x 10
  3. Bestem THP-1 kultur konsentrasjonen ved å laste 10 mL av kultur på en haemocytometer lysbilde. Tell antall celler tilstede i 4 sett av 16 hjørne kvadrater av haemocytometer under et mikroskop, og gjennomsnittet av tellinger. Multipliser gjennomsnittlig telling av 10000 til å beregne antallet av celler pr ml.
  4. Spinn ned det nødvendige antall THP-1-celler ved 500 xg i 5 min, og resuspender på 6,7 x 10 5 celler / ml i THP-1-medium.
  5. Tilsett 150 pl av THP-1-celler i THP-1-medium per brønn i et FCS-blokkerte 96 brønn U-bunnplaten, noe som resulterer i 10 5 celler / brønn. Forbered 3 brønner pr prøven som skal testes. Returner plate til inkubator før du er klar til å legge merozoites.
  6. Tilsett 150 pl av merozoite preparatet på 8 x 10 6 / ml per brønn til en separat FCS-blokkerte 96 brønn U-bunnplaten. Forbered en brønn per prøve testet
  7. Legg 10 mL preparerte utvannet plasmaprøver per brønn, til tHan plate som inneholder merozoites, og bland godt for å sikre homogen løsning.
  8. Fjern det THP-1-plate fra inkubatoren, og tilsett 50 pl av merozoite / plasma-løsning per brønn inneholdende THP-1-celler, med tredoble brønner pr plasmaprøve.
  9. Bland godt og inkuber ved 37 ° C i 5% CO 2, fuktig inkubator i 40 min. Dekk med folie for å beskytte mot lys.
  10. Etter 40 min, sentrifugere prøven 5 min ved 500 xg i en 4 ° C prechilled sentrifuge for å arrestere fagocytose.
  11. Fjern supernatant og vaske cellene to ganger i iskald PBS +0,5% BSA 2 mM EDTA (FACS-buffer). MERK: EDTA vil legge til rette for å opprettholde en enkelt celle suspensjon for flowcytometri analyse.
  12. Fikse-celler i 90 pl av 2% paraformaldehyd (PFA) i PBS +0,5% BSA 2 mM EDTA (FACS fiksativ). La på is inntil oppkjøpet, beskyttet mot lys.

8. Flowcytometri

  1. Acquire prøver å bruke et flowcytometer utstyrt with en 488 nm laser og høy gjennomstrømning plateleser vedlegg. MERK: Dette vil gjøre det mulig opp til 400 plasmaprøver som skal testes fra en merozoite forberedelse. Celler kan også overføres til rør for manuell prøve lasting.
  2. Gate levedyktige THP-1 celler ved forover og sidespredning.
  3. Sett EtBr positive gate basert på 'THP-1 celler med merozoites og ingen plasma' kontroll.
  4. Tilegne seg et minimum av 10 000 hendelser per prøve.

9. Data Analysis

  1. Analysere data ved hjelp av flowcytometri analyse programvare, og sette strenge porter for EtBr positive hendelser.
  2. Beregn prosentandelen fagocytose for hver prøve: i% av EtBr +-celler for prøven minus% positive celler med ikke-immun plasma.
  3. Gjennomsnittlige resultater på tvers triplicates. MERK: Standardavvik for en tre eksemplarer i overkant av 10% indikerer eksperimentelle unøyaktigheter. Noen bakgrunns EtBr positive hendelser kan observeres som følge av merozoite adhesjon til overflaten av THP-1-celler, men bør være konsistent i alle prøver som inneholdt merozoites. Stille gate basert på 'THP-1 celler med merozoites og ingen plasma' kontroll, og deretter trekke noen bakgrunn av de "THP-1 celler med ikke-immune plasma 'kontroll vil medføre% fagocytose som reflekterer fluorescens grunn internalisert / phagocytosed merozoites bare.

Representative Results

Modningen fasen av parasitter før E64 behandling er avgjørende for å generere membran lukkede merozoites. Figur 1Ai viser riktig modning stadium av schizonter for å legge til E64. Parasittene bør være store og nesten fyller den røde blodcellen. En flekkete utseende Giemsa flekken indikerer merogony har startet, og E64 skal legges for å gi membran vedlagt merozoites (Figur 1Aii). Hvis E64 er lagt tidligere for å trophozoite scene parasitter, er membran lukkede merozoites ikke generert selv etter 12 timer på E64. I stedet parasitter ta på unormal morfologi som utvidelse av fordøyelses vakuole (Figur 1Bi og 1Bii), og merozoites er ikke dannet. Hvis E64 er lagt til senere å schizonter, er membran vedlagt merozoites ikke genereres som schizont ruptur er uhemmet (Figur 1Ci og 1Cii). Et høyt nivå av parasitt synkroni kreves, annetmessig et utvalg av alle tre resultater som er beskrevet vil ses etter E64 behandling.

Fjerning av hemozoin er et annet kritisk punkt for rensing merozoites. Hvis merozoites ikke er renset fra hemozoin deretter merozoite-hemozoin klynger danner som ikke kan forskyves ved pipettering. Disse aggregatene kjøres på cytometeret som enkelthendelser, om enn med ulike fremtids scatter og side-scatter egenskaper enn enkelt merozoites, noe som resulterer i unøyaktige merozoite telling av flowcytometri (Figur 2A). Som THP-1 celler kan også phagocytose hemozoin, kan disse merozoite-hemozoin klynger også phagocytosed (figur 2B). Disse aggregatene er svært EtBr fluorescerende som de inneholder flere merozoites. Fagocytose av aggregater resultater i et THP-1 EtBr fluoresenceprofil tilsvarende den som ble observert for fagocytose av flere individuelle merozoites. Derfor, hvis hemozoin ikke fjernes, vil det EtBr fluorescensen av THP-1-celler som en overestimate av opsonizing potensialet for plasma som blir testet. Hemozoin er også rapportert å betydelig endre phagocyte funksjon. GFP positive merozoites er teller farget med EtBr å øke visualisering av merozoites phagocytosed av THP-1 celler. Ved hjelp av vilkårene som er beskrevet i denne protokollen, er alle GFP positive merozoites kontra med EtBr som har en lysere fluorescens intensitet (figur 3A). Fagocytose vurdering av EtBr fluorescens gir overlegen oppløsning på merozoite fagocytose enn GFP fluorescens (Figur 3B).

Antallet merozoites tilsatt til analysen vil modulere mengden av fagocytose observert. Av denne grunn er nøyaktig telling ved strømningscytometri kritisk. Økende forholdstall på merozoites: THP-1 vil resultere i økt tilslutning av merozoites til THP-1-celler i fravær av plasma (Fig. 4A). Økende merozoite: THP-1 forholdstall også resulterer i økt phagocytosis reaksjoner når merozoites er opsonized (Figur 4B). En 04:01 merozoite: THP-1-forhold anbefales for robuste fagocyttiske svar. Ved hjelp av dette forhold, og fortynning av plasma er angitt, er denne analysen kunne løse lave, middels og høye nivåer av opsonizing antistoffer. Mellom 0 og 78 prosent fagocytose svar har blitt observert ved hjelp PNG plasmaprøver og de andre forholdene som er beskrevet. Slike reaksjoner er nylig vist å assosiere med naturlig ervervet klinisk immunitet mot malaria 10. Figur 5 viser eksempler på de fire kvartiler av fagocytose svar fra PNG individer.

Figur 1
Figur 1. Timing av E64 tillegg er avgjørende for å generere membran lukkede merozoites. (A) Passende maturatio. n stadium av parasitter i) før E64 behandling, og ii) membran lukkede merozoites produsert etter seks timer på E64 behandling (B) membran lukkede merozoites genereres ikke ved E64 blir lagt til umodne parasitter; i) sent stadium trophozoites, og ii) etter 12 timer på E64 (C) schizont ruptur er ikke hemmet hvis E64 blir lagt til sent segmentert schizonter.; i) sent stadium schizonter, og ii) etter 6 timer på E64. Scale bar representerer 10 mikrometer.

Fig. 2
Hemozoin fjerning Figur 2.. Kritisk for å generere en enkeltcelle-suspensjon merozoite Merozoite-hemozoin aggregater form etter filtrering over membran lukkede merozoites. Mindre hemozoin er magnetisk skilt fra merozoites. (A) Forover-scatter og side-spredningsplott av merozoites med hemozoin fjernetog hemozoin beholdt. (B) Hemozoin-merozoite tilslag kan phagocytosed av THP-1 celler. Diff-Quick farget cyto-spin lysbilder av THP-1 celler inkubert med PNG plasma opsonized merozoite preparater med eller uten hemozoin. Scale bar representerer 10 mikrometer.

Figur 3
Figur 3. Ethidiumbromid farging gir overlegen oppløsning på merozoite fagocytose. D10-GFP rensede merozoites er kontra med EtBr å forbedre fluorescens intensitet. (A) Flowcytometri histrogram av renset merozoites med gating på GFP positive merozoites, og en dot blot viser EtBr fluorescens innenfor denne gated GFP positive befolkningen. (B) Forward scatter versus GFP og frem scatter versus EtBr av THP-1 celler etter fagocytose av GFP og EtBr dual fluorescerende merozoites. Gates ble d Rawn basert på THP-1-celler med merozoites og ingen plasma kontroll.

Figur 4
Figur 4. merozoite:. THP-1-forhold påvirker graden av fagocytose observert. (A) Fem merozoite: THP-1 prosenter er avbildet; 50:1, 20:01, 10:01, 04:01, 01:01. Celler eneste kontrollen indikerer bakgrunnsfluoresens grunn THP-1 celler. THP-1 EtBr fluorescens for hver ratio er indisert for merozoites opsonized med en pool av PNG plasma eller med immune australske plasma (B) Mean fluorescens intensiteten av THP-1 celler for ulike merozoite:. THP-1 forholdstall, og opsonization med et basseng av PNG plasma eller immune australske plasma (gjennomsnittlig + SEM). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

ove_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 5
Figur 5. Et stort utvalg av opsonizing antistoffer kan måles. Merozoites ble opsonized med plasma fra PNG individer og inkuberes med THP-1 celler. Fire representative fagocytose svar er vist. Gates ble trukket på grunnlag av THP-1 celler med merozoites og ingen plasma kontroll, og tallene indikerer% fagocytose etter subtraksjon av THP-1 celler med ikke-immune plasma kontroll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

For å måle merozoite fagocytose, er ferdigheter i to teknikker som kreves: rensing av merozoites og THP-1 fagocytose analysen. De mest viktige skritt for å kombinere disse to teknikkene er: 1) Meget synkronisert parasitter; 2) Legge E64 på riktig tidspunkt for å gi membran vedlagte merozoites; 3) Fjerning hemozoin å unngå tilslag; 4) Nøyaktig merozoite telling av flowcytometri; 5) den fortynnede plasma brukt; og 6) å opprettholde lav celletetthet, og passasjen antall THP-1-celler. Nøye vurdering av disse viktige aspektene vil sikre robuste fagocytose respons er observert.

Selv om det, som er beskrevet her er fremstillingen av merozoites for vurdering av fagocytose, kan teknikken benyttes for en lang rekke anvendelser. Uavhengig av nedstrøms metodikk, optimale merozoite forberedelser avhenge riktig timing E64 tillegg for å generere merozoites. Den E64-metoden som beskrives her er blitt vist til yield invasive merozoites for bruk i høy oppløsning mikroskopi av invasjons hendelser og narkotika sensitivitetsanalyser 15-20. Mens merozoite levedyktighet er ikke avgjørende for fagocytose, er integriteten til merozoite overflate belegge nødvendig. Derfor E64-metoden som er beskrevet her gjør det mulig for høykvalitets merozoites som skal produseres for å vurdere antistoffresponsen til overflaten strøk. Som beskrevet i figur 1, hvis E64 tilsettes for tidlig eller for sent membran lukkede merozoites ikke er dannet. Av denne grunn er svært synkrone parasitt kulturer nødvendig. Her, ved bruk av sorbitol og heparin behandlinger for å tett synkron D10-GFP parasitt kulturer i et vindu av 2 timer er beskrevet. Heparin kan fremme gametocytogenesis i andre lab isolerer, og dermed bør brukes med forsiktighet. Alternativt synkroniseringsmetoder som alanin, kan også brukes, forutsatt at tett synkronisert parasitter blir produsert 29. Hvis E64 tilsettes til asynkrone parasitter, en lavere proportion av membran lukkede merozoites vil bli produsert og resterende parasitt-infisert RBC vil enten briste normalt eller utvikle unormal morfologi. Tilstedeværelsen av parasitter som ikke har utviklet seg til membran-omsluttet merozoites vil resultere i tilstopping av filteret, og i betydelig grad redusere merozoite utbyttet erholdt.

Under filtrering av membran-omsluttet merozoites er hemozoin frigjort fra fordøyelses vakuoler og er til stede som frie krystaller i oppløsningen. Hemozoin er meget proinflammatoriske og har blitt rapportert til å modulere monocytt-og makrofag fagocytose responser 30, 31. I tillegg til å modulere fagocytose, slik som vist i figur 2, kan hemozoin danner aggregater med merozoites i løsningen. Som THP-1 celler kan phagocytose disse aggregatene, kan dette være en stor confounder for oppløsningen av antistoff mediert fagocytose. Derfor er det nødvendig med fjerning av hemozoin i denne analysen til AVoid ekstra kompleksitet hemozoin på phagocyte biologi. I tillegg, kan unnlatelse av å fjerne hemozoin også være skadelige ved bruk av denne teknikk for å generere frie merozoites for andre anvendelser, særlig der merozoite kvantifisering er nødvendig.

Som vist i figur 4, lagt antall merozoites til analysen kan påvirke graden av fagocytose av THP-1-celler. Selv flowcytometri åpner for telling av merozoite konsentrasjon, forsiktig pipettering og replikere tellinger av merozoites er nødvendig for å forbedre nøyaktigheten. Dette er spesielt viktig om flere parasitt linjer skal testes side-ved-side. Det har tidligere blitt vist at plasma fra semi-immune barn fra PNG kan bli vesentlig fortynnet før responser avta 23.. Beskrevet her er den optimale fortynning av plasma (1/120, 000 endelig fortynning av plasma) for en kohort av 5 - 12 år gamle PNG barn som produserte det store utvalget av phagocyt. osis reaksjoner som er beskrevet i figur 5 Denne serien tillatt for lagdeling av responser i fire grupper (0 - 19%, 20 - 39%, 40 - 59% og 60-79% fagocytose), og regresjonsmodellering avslørte at opsonizing responser forbundet med beskyttelse mot klinisk sykdom og høy tetthet parasitt 10 For forskjellige kohortstudiene kan det være nødvendig å justere plasma fortynning for å sikre at fagocytose av THP-1-celler er ikke mettet eller under nivået for deteksjon.

Flowcytometri tillater rask og kvantifiserbare fagocytose med forbedret nøyaktighet over mikroskopi. Denne protokollen er en høy gjennomstrømning, plate basert og automatisert kjøp av 96 brønners plater å studere naturlig ervervet humoral immunitet. Metoden krever farging av merozoites med etidiumbromid, imidlertid kan alternative DNA-flekker som SYBRgreen, DAPI og propidium jod, membran flekker eller proteinflekker kunne utnyttes. Denne analysen vil være mottakelig for Primary monocytter eller nøytrofile, og kan tilpasses hvis phagocyte eller FcR biologi var av interesse. Primære celler eller THP-1-celler differensiert in vitro med PMA kan brukes til å studere fagocytose i malaria og andre patogener 12, 32-34. Men ved hjelp av primærceller kan være utfordrende som disse cellene er tilhenger og også vise ikke-antistoff mediert fagocytose 35. I tillegg er variasjonen i renhet, levedyktighet og funksjon er noen viktige begrensninger for bruken av primære fagocytiske celler. Fc-reseptorene som er involvert i merozoite fagocytose forbli uncharacterized, og derfor bruker blokkerer antistoffer mot spesifikke Fc reseptorer kunne belyse bidraget fra hver Fc Receptor å merozoite fagocytose. Som THP-1 fagocytose er avhengig av FcR, muliggjør dette enkel tolkning av fagocytose observert. Denne analysen gir seg også til å ta opp Antigenspesifisiteten opsonizing antistoffer som kan oppnås ved utilizing knock-out parasitter for merozoite overflateantigener, eller ved hjelp av affinitetsrenset humane antistoffer mot merozoite overflateproteiner. Videre i dybden studier av cytokin respons følgende merozoite fagocytose mangler, og kan oppnås ved hjelp av denne analysen.

Disse to teknikker utgjør betydelige fremskritt til studiet av funksjonelle antimerozoite antistoffer. Rensing av høy kvalitet merozoites er en fordel med å bruke cryopreserved merozoites, eller fluorescerende sfærer belagt med merozoite antigener. Selv om denne analysen har vært brukt som et verktøy for å evaluere naturlig ervervet immunitet, kan det vise seg å være et viktig verktøy for å adressere kjøp av immunitet i respons på vaksinasjon. Mens det er nylig blitt vist at fagocytose eller opsonised merozoites er forbundet med beskyttelse mot klinisk malaria, er det ikke mulig å trekke slutninger fra direkte in vitro THP-1-fagocytose i in vivo phagocytosis av merozoites som fagocytose i denne analysen skjer under statiske betingelser og i fravær av konkurrerende røde blodlegemer. De potensielle tilpasninger av denne analysen kan dermed gi et allsidig verktøy for videre forståelse av malaria og merozoite fagocytose.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å erkjenne barn og voksen plasmagivere, og de ansatte på Papua Ny-Guinea Institute of Medical Research. Forfatterne ønsker å takke Amandine B Carmagnac, Catherine Q Nie, Danny W Wilson, Ivo Mueller og Diana S Hansen for deres bidrag til utviklingen av denne teknikken, og takker den australske Røde Kors for blod og serum pakker. Dette arbeidet ble gjort mulig gjennom viktoriansk delstatsmyndighetene Operasjonell Infrastruktur Support og australske regjeringen NHMRC IRIISS. Dette arbeidet ble støttet av National Health and Medical Research Council bevilger # 1031212 og # 637406, og National Institutes of Health stipend # AI089686.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
THP-1 cell line American Type Culture Collection TIB-202
RPMI-1640 Gibco 31800-089
Fetal Calf Serum (FCS) Invitrogen 10099-141
2-mercapthoethanol  Sigma-Aldrich M6250-100ML Use in Fume Hood
Pen/Strep Solution (100x) Sigma P0781
HEPES SAFC 90909C Cell culture grade
Hypoxanthine Calbiochem 4010
Human Serum  Donation from Australian Red Cross Available commercially (i.e. Invitrogen)
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Merck 1.06329.0500
Gentamycin Pfizer 61022027 Injection Quality
Heparin Sodium BP (5000 IU/ml) Pfizer Porcine origin
Blasticidin S-hydrochloride Sigma-Aldrich 15205
D-Sorbitol Sigma-Aldrich 50-70-4
E64 Protease Inhibitor Sigma-Aldrich E3132-10MG
KH2PO4 Sigma-Aldrich 98281-100G Use for phosphate buffer
Na2HPO4.2H20 Merck 10383.4G Use for phosphate buffer
Giemsa's azur eosin methylene blue solution Merck 1.09204.0500 1:10 dilution in 6.7 mN Phosphate buffer (make fresh each stain)
EDTA disodium salt Merck 10093.5V 0.1 M, pH 7.2
Acrodisc Syringe Filters 1.2-μm/32-mm Pall Life Sciences 4656
QuadroMACS Separator (for small column) MACS Miltenyi BioTec 130-091-051 Interchangeable with MidiMACS 
VarioMACS Separator (for large columns) MACS Miltenyi BioTec 130-090-282
MACS MultiStand MACS Miltenyi BioTec 130-042-303
LS Column (small magnetic column) MACS Miltenyi BioTec 130-042-401
Large magnetic column MACS Miltenyi BioTec 130-041-305
Ethidium Bromide Bio-Rad 1510433 Cytotoxic
CountBright Absolute Counting Beads Invitogen C36950
BD FACSCalibur Flow Cytometer with HTS plate reader BD Biosciences
EDTA disodium salt Merck 10093.5V 0.1 M, pH 7.2
FlowJo cytometry analysis software Tree Star

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cohen, S., McGregor, I. A., Carrington, S. Gamma-globulin and acquired immunity to human malaria. Nature. 192, 733-737 (1961).
  2. Fowkes, F. J. I., Richards, J. S., Simpson, J. A., Beeson, J. G. The relationship between anti-merozoite antibodies and incidence of Plasmodium falciparum malaria: A systematic review and meta-analysis. PLoS Medicine. Medicine, P. L. oS. 7, (2010).
  3. Bouharoun-Tayoun, H., Attanath, P., Sabchareon, A., Chongsuphajaisiddhi, T., Druilhe, P. Antibodies that protect humans against Plasmodium falciparum blood stages do not on their own inhibit parasite growth and invasion in vitro, but act in cooperation with monocytes. The Journal of experimental medicine. 172, 1633-1641 (1990).
  4. Jafarshad, A., et al. A novel antibody-dependent cellular cytotoxicity mechanism involved in defense against malaria requires costimulation of monocytes FcgammaRII and FcgammaRIII. Journal of immunology. 178, Baltimore, MD. 3099-3106 (1950).
  5. Genton, B., et al. A recombinant blood-stage malaria vaccine reduces Plasmodium falciparum density and exerts selective pressure on parasite populations in a phase 1-2b trial in Papua New Guinea. The Journal of Infectious Diseases. 185, 820-827 (2002).
  6. Sirima, S. B., Cousens, S., Druilhe, P. Protection against malaria by MSP3 candidate vaccine. The New England journal of medicine. 365, 1062-1064 (2011).
  7. Llewellyn, D., et al. Assessment of antibody-dependent respiratory burst activity from mouse neutrophils on Plasmodium yoelii malaria challenge outcome. Journal of leukocyte biology. , (2013).
  8. McIntosh, R. S., et al. The importance of human FcgammaRI in mediating protection to malaria. PLoS pathogens. 3, 72 (2007).
  9. Pleass, R. J., et al. Novel antimalarial antibodies highlight the importance of the antibody Fc region in mediating protection. Blood. 102, 4424-4430 (2003).
  10. Hill, D. L., et al. Opsonizing Antibodies to P. falciparum Merozoites Associated with Immunity to Clinical Malaria. PLoS One. 8, (2013).
  11. Joos, C., et al. Clinical Protection from Falciparum Malaria Correlates with Neutrophil Respiratory Bursts Induced by Merozoites Opsonized with Human Serum Antibodies. PLoS ONE. 5, (2010).
  12. Kumaratilake, L. M., Ferrante, A. Opsonization and phagocytosis of Plasmodium falciparum merozoites measured by flow cytometry. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7, 9-13 (2000).
  13. Richards, J. S., et al. Identification and Prioritization of Merozoite Antigens as Targets of Protective Human Immunity to Plasmodium falciparum Malaria for Vaccine and Biomarker Development. The Journal of Immunology. , (2013).
  14. Salmon, B. L., Oksman, A., Goldberg, D. E. Malaria parasite exit from the host erythrocyte: a two-step process requiring extraerythrocytic proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 271-276 (2001).
  15. Boyle, M. J., et al. Isolation of viable Plasmodium falciparum merozoites to define erythrocyte invasion events and advance vaccine and drug development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 14378-14383 (2010).
  16. Wilson, D. W., Langer, C., Goodman, C. D., Mcfadden, G. I., Beeson, J. G. Defining the timing of action of anti-malarial drugs against Plasmodium falciparum. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 1-46 (2013).
  17. Angrisano, F., et al. Spatial Localisation of Actin Filaments across Developmental Stages of the Malaria Parasite. PLoS ONE. 7, (2012).
  18. Riglar, D. T., et al. Super-resolution dissection of coordinated events during malaria parasite invasion of the human erythrocyte. Cell Host and Microbe. 9, 9-20 (2011).
  19. Zuccala, E. S., et al. Subcompartmentalisation of Proteins in the Rhoptries Correlates with Ordered Events of Erythrocyte Invasion by the Blood Stage Malaria Parasite. PLoS ONE. 7, (2012).
  20. Marapana, D. S., et al. Malaria Parasite Signal Peptide Peptidase is an ER-Resident Protease Required for Growth but not for Invasion. Traffic. 13, 1457-1465 (2012).
  21. Rzepczyk, C. M., Lopez, J. A., Anderson, K. L., Alpers, M. P. Investigation of the effect of monocytes with Papua New Guinea sera on Plasmodium falciparum in culture. International Journal for Parasitology. 18, 401-406 (1988).
  22. Schofield, L., Mueller, I. Clinical immunity to malaria. Curr Mol Med. 6, 205-221 (2006).
  23. Hill, D. L., et al. Efficient measurement of opsonizing antibodies to Plasmodium falciparum merozoites. PLoS ONE. 7, (2012).
  24. Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). International journal of cancer Journal international du cancer. 26, 171-176 (1980).
  25. Ackerman, M. E., et al. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. Journal of Immunological Methods. 366, 8-19 (2011).
  26. Ataíde, R., et al. Using an Improved Phagocytosis Assay to Evaluate the Effect of HIV on Specific Antibodies to Pregnancy-Associated Malaria. PLoS ONE. 5, (2010).
  27. Wilson, D. W., Crabb, B. S., Beeson, J. G. Development of fluorescent Plasmodium falciparum for in vitro growth inhibition assays. Malar J. 9, 152 (2010).
  28. Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. J Parasitol. 65, 418-420 (1979).
  29. Braun-Breton, C., Rosenberry, T. L., da Silva, L. P. Induction of the proteolytic activity of a membrane protein in Plasmodium falciparum by phosphatidyl inositol-specific phospholipase. C. Nature. 332, 457-459 (1988).
  30. Jaramillo, M., Godbout, M., Olivier, M. Hemozoin induces macrophage chemokine expression through oxidative stress-dependent and -independent mechanisms. J Immunol. 174, 475-484 (2005).
  31. Schofield, L., Tachado, S. D. Regulation of host cell function by glycosylphosphatidylinositols of the parasitic protozoa. Immunology and cell biology. 74, 555-563 (1996).
  32. Khusmith, S., Druilhe, P., Gentilini, M. Enhanced Plasmodium falciparum merozoite phagocytosis by monocytes from immune individuals. Infection and immunity. 35, 874-879 (1982).
  33. Lunov, O., et al. Differential uptake of functionalized polystyrene nanoparticles by human macrophages and a monocytic cell line. ACS. 5, 1657-1669 (2011).
  34. Tebo, A. E., Kremsner, P. G., Luty, A. J. Fcgamma receptor-mediated phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes in vitro. Clinical and experimental immunology. 130, 300-306 (2002).
  35. McGilvray, I. D., Serghides, L., Kapus, A., Rotstein, O. D., Kain, K. C. Nonopsonic monocyte/macrophage phagocytosis of Plasmodium falciparum-parasitized erythrocytes: a role for CD36 in malarial clearance. Blood. 96, 3231-3240 (2000).

Tags

Immunologi parasittsykdommer malaria, Hemozoin antistoff Fc Receptor opsonization merozoite fagocytose THP-1
High Yield Rensing av<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoites For bruk i Opsonizing Antistoff Analyser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hill, D. L., Eriksson, E. M.,… More

Hill, D. L., Eriksson, E. M., Schofield, L. High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays. J. Vis. Exp. (89), e51590, doi:10.3791/51590 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter