Omvänd Genetisk Morfolino Approach Använda Cardiac ventrikulär injektion att transfektera flera svår mål vävnader i Zebrafish Larva

Summary

En anpassningsbar omvända genetisk metod för zebrafisk att bedöma geners funktion under senare stadier av utveckling och fysiologiska homeostas t.ex. vävnadsregenerering med hjälp intraventrikulära injektioner av genspecifika morpholinos.

Abstract

Den zebrafisk är en viktig modell för att förstå den cell-och molekylärbiologi för orgel och bihang förnyelse. Men molekylära strategier för att anställa omvänd genetik ännu inte har utvecklats tillräckligt för att bedöma geners funktion i regeneration eller vävnad homeostas under larvstadier efter zebrafisk embryogenes, och flera vävnader i zebrafisk larv är svåra att rikta. Intraventrikulära injektioner av genspecifika morpholinos erbjuda en alternativ metod för aktuell oförmåga att genomiskt rikta zebrafisk gener i ett tidsmässigt kontrollerat sätt vid dessa etapper. Denna metod möjliggör fullständig dispergering och efterföljande inkorporering av morpholino i olika vävnader i hela kroppen, inklusive strukturer som tidigare var omöjligt att nå som de i larv stjärtfenan, en struktur som ofta används för att icke-invasivt forskning vävnadsregenerering. Flera gener som aktiveras under larv finfold regenere också presenti regenere vuxen ryggradsdjur vävnader, så att larven är en användbar modell för att förstå regeneration hos vuxna. Denna morpholino spridningsmetod gör det möjligt att snabbt och enkelt identifiera gener som krävs för regenerering av larver vävnader samt andra fysiologiska fenomen som reglerar vävnad homeostas efter embryogenes. Därför ger denna leveransmetod ett omedelbart behov strategi för tidsstyrning till utvärderingen av geners funktion efter embryogenes.

Introduction

Regenerering av organ och bihang är fundamentalt viktigt för överlevnad och kondition; dock har flera ryggradsdjur inklusive människa begränsad regenerativ förmåga. Medan flera djurmodeller finns som har omfattande förnyelseförmåga, vända genteknik för att bedöma geners funktion under orgel och bihang förnyelse förblir mycket begränsad eller obefintlig. Därför är nya metoder som krävs för att dissekera den molekylära biologin av förnyelse i dessa modellorganismer.

Den zebrafisk är en väl etablerad modell för att förstå den cell-och molekylärbiologi för orgel och bihang förnyelse ^1, inte bara på grund av dess betydande förmåga att regenerera flera organ, vävnader och bihang, utan också för att flera transgena fiskar linjer finns för att spåra celler och för att överuttrycka genen konstruerar ^{2, 3.} Dock är gen inhibition i larver zebrafisk huvudsakligen begränsat till overexpression dominerande-negativa konstruktioner, som inte är tillgängliga för alla gener av intresse eller vars transgenprodukten kan få vinst-av-funktion effekter som inte speglar den endogena aktiviteten av genen. Således behövs en alternativ metod för att specifikt avlägsna genexpression genom knockout eller knockdown för att övervinna dessa problem.

Gene-specifik inriktning med hjälp TALENS existerar som en omvänd genetiska sätt att knockout geners funktion; dock denna knockout strategi ofta begränsade till funktionella bedömningar under tidig embryogenes, eftersom ursprungliga kraven av genen förhindra ytterligare progression av embryonal utveckling. Således, studera senare fenomen som återvinning eller organ homeostas efter utveckling med TALENS är utesluten ^{4, 5.} Därför behövs en alternativ gen borttagning strategi som riktar geners funktion efter tidig utveckling för att bedöma gen krav fullt utvecklade organ och strukturer. Morfolino injektionen har visat sig vara effektiva för riktad genmodifiering i några vuxna organ och den vuxna regenere fin ^6-8, men dessa metoder kräver elektroporation och många inre organ är svåra att electroporate antingen på grund av deras läge eller på grund av deras känslighet för elektriska störningar. Dessutom vissa vävnader i larven är svåra att injicera direkt, eftersom direktinsprutning kan störa deras strukturella integritet eller för att deras storlek är begränsande. Stjärtfenan av larven är en sådan struktur, eftersom direkt injektion i finfold är inte möjlig. Således var ett alternativ till elektroporation och direktinsprutning som behövs för att rikta gener i vävnader som är för små för att injicera eller inte kan elektroporerade.

För att rikta och hämmar funktionen av specifika gener under regenerering av larver stjärtfenan, har vi modifierat befintliga morfolinogrupper teknik gör det möjligt för enEDÖMNING av geners funktion under stjärtfenan förnyelse i sen-iscensatt larv. Denna metod använder intraventrikulär leverans ⁹ av fluorescein-märkta morpholinos tillsammans med Endo-Porter transfektionsreagens ^10. Väl i ventrikeln, sprider morfolino-Endo-Porter blandningen snabbt genom hela larv via vaskulaturen och inträder vävnader som har tidigare varit omöjligt att rikta. Denna injektion metod kan modifieras för att rikta gener i specifika vävnader och kanske kan tillämpas i andra djurmodeller som idag saknar omvända genetiska metoder för att hämma geners funktion. Således ger det en snabb och enkel metod med potential för bred användning för att omedelbart studera geners funktion under allmän organ homeostas och regenerering vid larvstadier.

Protocol

1. Framställning av glas nålar (figur 1)

1. Använd glaskapillärer med en 0,75 mm diameter för framställning av injektionsnålar (Figur 1A).
2. Placera glaskapillär in en nål avdragare och dra nålen med följande parameter: uppvärmningscykel värde: 463; dra cykelvärde: 230; hastighet: 150 ms; tid: 150 ms (Figur 1B).
3. Bryt drog glaskapillär med Urmakarverktyg pincett för att producera en nål 20 ^ m diameter under ett stereoskop med en mikrometer okularet.
4. Använd en svarv med en fuktad gummi spinnrock för att slipa nålen och producera en 20 ìm avfasning (figur 1C och 1D). Anm: Sharp, avfasade nålar förbättra lättheten att införing i ventrikeln och sålunda minimera skadorna på vävnaden och möjliggör den perforerade muskel att återförsluta efter avlägsnande av nålen (figur 1E-G).

2. Förberederation av morfolino Lösning

1. Förbered morfolino lager genom upplösning av den lyofiliserade morfolino i 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till en slutlig koncentration av 7,5 mM. [Se tillverkarens anvisningar för detaljer (Material tabell)].
2. Förbered morfolino injektionslösningen genom att blanda 2,5 | il morfolino stamlösning (7,5 mM) med 2,8 ^ il Endo-Porter-stamlösning (1 mM) (Se Material tabell) till en slutlig koncentration av 3,5 mM morfolino och 0,5 mM Endo-Porter.

3. Beredning av Morpholino Injection (figur 2)

1. Fyll på med avfasade glas nål med 5 | il av denna lösning med användning av en mikropipett med en 10 | il micro pipettspetsen.
2. Sätt glaset nålen i nålhållaren av mikromanipulator ansluten till den pneumatiska pico pumpen (Fig. 2A-C).
3. Placera nålen hållaren bredvid mikroskopet så att nålen bara behöversom ska flyttas i en plan riktning för att infoga den i hjärt ventrikeln av larven (Figur 2A).
4. Justera vinkeln för injektionerna vid cirka 45 °.
5. Ställ microinjector värden enligt följande: hålla ett tryck av: 20 pounds per square inch (psi); utstötningstryck: 15 psi; 100 ms intervallet gating, periodvärde av 1,9 (motsvarar 10,9 msek).
6. Smält agaros i 1x PBS med en vanlig mikrovågsugn för att producera 20 ml av en 1,5% (vikt / volym) gel. Häll smält gel i en 10 cm petriskål. Placera en räfflad injektionsform i den varma agaros så att när härdat, kommer agaros har fåror där sederad larven kommer att placeras ¹¹ (figurerna 2D och 2E).

4. Injektioner (Figur 3)

1. Bedöva larv i 100 ml akvarievatten med 20 mg / L tricaine (L-etyl-m-amino-bensoat-metan sulfonat) tills de slutar svara röra.
2. Använd en plast Pasteur pipette för att noggrant överföra sedated larv i ett spår av den våta agaros formen så att den ventrala sidan är vänd mot den vertikala agaros vägg hos spåret (figur 3A).
3. Placera agarosplatta under stereomikroskop, så att kammaren är vänd bort från injektionsnålen (figur 3A).
4. Sänk ner nålen för att infoga det i hjärtat kammare. För in nålen bara 1-2 um i ventrikeln till att inte in nålen för djupt (fig. 3B och 3C).
5. När nålen sätts in, injicera morpholino lösningen i kammaren med 4-6 pulser, var och leverera 3 nl av lösningen, med väntande intervaller för att tillåta clearing av hjärtat (figur 3D och 3E).
6. Efter injektion, ta bort nålen (parallellt med planet för insättning) och sedan försiktigt föra larven med hjälp av en plast pasteurpipett fylld med E3 medel back in i en petriskål med färskt E3 medium.
7. Placera nålen i en petriskål med 1 x PBS för att förhindra torkning av nålen vid överföring av den injicerade larv.
8. Upprepa steg från 4,1 till 4,6 var 12-24 timme under hela experimentet. Anm: Upprepande injektioner säkerställer upptagningen och underhåll av morfolino i celler.

5. Analyser av injektioner (Figur 4)

1. Söva fisken i 100 ml akvarievatten med 20 mg / L tricaine tills de slutar svara röra.
2. Placera larven i sidled på en plan våt 1,5% (vikt / volym) agarosplatta täckt med E3 medium.
3. Bild larver med hjälp av ett stereomikroskop med ljusfält och fluorescens avbildning. OBS: Eftersom larverna är transparenta, bör den fluorescein-märkta morpholino synas som fluorescerande grönt i blodkärlen i hela djuret direkt efter injektionen. Denna fluorescens kommer att ytterligare sprida in i de vaskulariserade vävnader genom15 min (fig. 4A-4C).

6. Bedömning av regenerativ utväxt

1. Bedöma tagna bilder med hjälp Fiji Bild J fri programvara (http://fiji.sc/Fiji). För att utreda förnyelse, använda linjen-spårning verktyg för att bestämma mängden av regenerativ tillväxt som har skett på kontroll-och morfolino-injicerade larv.
2. För att kalibrera bilder, öppna en av de ursprungliga bildfilerna i Fiji genom att dra och släppa filen i huvud Fiji fönstret.
3. För att ställa in skalan för alla följande bilder, gå till "Analysera" i huvudmenyn.
4. I rullgardinsmenyn, klicka på "Ställ in skala".
5. I detta fönster, slå på "Global" alternativet genom att klicka i kryssrutan.
6. Öppna nu bilden för att mäta mängden regenerativ tillväxt igen genom att dra och släppa (se steg 6.1).
7. Välj "frihand val" verktyget i verktygsfältet.
8. Omringa området som skall mätas (Figurer 4J-4L).
9. Tryck på Ctrl + M. Detta kommer att öppna en ny "Resultat"-fönstret som visar värdet av det inringade området i kvadratiska pixlar.

Representative Results

Den skarpa, avfasade injektionsnål lätt placeras i hjärt ventrikeln av zebrafisk larv när närmade dorsalt (Figur 3A). Hjärtat fortsätter att pumpa och blodflödet bibehålls trots närvaron av nålen (fig. 3B och 3C). Noggranna injektioner inte störa morfologi ventrikeln eller hjärt sammandragningar (Figur 3D) trots injektion av morpholino in i hjärtat (figur 3E).

Inom några minuter, distribuerar morpholino-Endo-Porter-lösning i hela kroppen via kärlsystemet (fig. 4A och 4B). Den morpholino sedan distribueras från kärlsystemet till olika vävnader såsom finfold och hjärnan i minst 12 timmar eller mer som observeras från fluorescens (Figur 4C).

I denna strategi, vi tar bort den distala spetsen av the finfold, den distala spetsen av ryggmärgen, distala stammen muskeln, den distala notokord och pigmentceller (fig 4D och 4H); som alla är svåra att särskilt inrikta genom direkt injektion på grund av kompakthet (muskel), liten storlek (ryggmärg och notochord) och tunna (finfold), men verkar införliva morpholino efter serie ventricular injektioner, vilket ses av fluorescens inom dessa vävnader (Figur 4E) jämfört med uninjected djur (figur 4F och 4G). Således är denna metod relativt enkelt befrämjar leverans av morpholino till vävnader som är svåra att individuellt rikta, och det tillåter bedömning av genfunktion i flera vävnader i regenerefena på en gång. För att bedöma betydelsen av specifika gener som är involverade i förnyelse, ett kirurgiskt delvis amputerar larver stjärtfenan (figur 4H), resektion alla vävnader som har incorp derades morpholino (Figur 4I). Den larver finfold regenererar dess struktur inom några dagar efter amputation (dpa) (Figur 4J). Morfolino målinriktning   en gen som erfordras för regenerering (opublicerade data) resulterar i en störd regenereringssvar (fig. 4K) jämfört med icke-injicerade (figur 4J) och mismatch morfolino kontroller (fig 4L). Den sammanlagda effekten av dessa morfolinogrupper experiment på regenerativ utväxt kan mätas med hjälp av vanliga morfometriska verktyg i de offentligt tillgängliga Fiji program ¹² genom att spåra de regenererade vävnader och jämföra områden (figur 4J-4L). Således tillhandahåller denna gen-targeting förfarande ett snabbt och relativt enkelt analys för att testa betydelsen av gener i regenereringsprocessen.

5fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1. Framställning av glaskapillär nålar för injektion. A) Glas kapillärrör innan du drar (ovan) och drog nål (nedan). B) nål drar apparaten. C) Svarv för avfasning och vässa glasålen. Nålen betraktas genom kikaren. D) Svarven är en vätt gummisnurrande skiva. Nålen är sakta sänks ner på skivan. E) Vässad nål måste ha ett kort avfasning som inte längre (20 nm) än är bred (20 mikrometer) för att minimera det utrymme som krävs för att sätta in hela änden av nålen i larvhjärt ventrikeln. F) Högre förstoring bild som visar spetsen på nålen. G) Schematisk bild av nålspetsen som visar formen hos det koniska efter skärpning.

s/ftp_upload/51595/51595fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 2. Injektionsapparaten upplägg. A) Komplett apparat för injektion av morfolino i zebrafisk larv. B) Stå för att styra placeringen av nålen under injektion. C) I pico pump som reglerar pneumatiskt tryck för injektioner. D) Form press används att skapa agaros mögel. E) agaros mögel används för att stabilisera larv för injektion.

Figur 3. Injektion av fisk larv. A) Placering av nålen i förhållande till zebrafisk larv. B) Insättning i hjärt ventrikeln. C) Fluorescens av morpholino i nålen men frånvarande i ventrikeln innan injectipå. D) Brightfield bild visar storleksförhållandet mellan glas nål och larv ventrikeln. E) Insprutning av det fluorescerande morfolino in i hjärtat ventrikeln. Skalstrecken equal 100 um.

Figur 4. Spridning av morpholino hela fisken. A) Zebrafish 3 dagar gamla larver. B) Fluorescens av fluorescein-märkt morfolino hela kroppen vaskulaturen (v) 5 min efter ventrikulär injektion. C) Dispersion av morpholino under djurets inklusive finfold (ff), hjärna (B) i äldre larv efter injektioner av morfolino var 12 hr D) vävnader i larv stjärtfenan och bål:.. notokord (n), ryggmärg (sc), pigment (p), och finfold (ff) E) Dispergerad morfolinoflera minuter efter injektion i larvstamvävnader inklusive finfold. F) Brightfield bild av oinjicerad larv bålen och stjärtfenan. Streckad linje anger den blivande amputation planet. G) uninjected fena avbildas med GFP filter visar autofluorescens i grönt (pilspetsar). Den dendritiska formen av de fluorescerande strukturer antyder att dessa är pigmentceller. H) Brightfield bild av en kirurgiskt amputerat larv stjärtfenan genom notochord, muskel och ryggmärgen. I) Fluorescerande bild visande morfolino fördelning i stump vävnader. Morfolino inkorporering i muskler, ryggmärg, notochord och finfold. J) Regenererad caudal finfold strukturer vildtyp larven. Svart linje spårar regenererade vävnader för kvantifiering analys. K) Morpholino-medierad hämning av förnyelse. Svart linje spårning visar tydligt den reducerade regenere rerespons efter morfolino knockdown. L) Regenererad kaudala finfold av larv injiceras med en felpaming kontroll morfolino visar en liknande regeneresvar såsom i oinjicerad larv (J). Skalstrecken equal 100 um.

Discussion

Den intraventrikulär injektion ger en snabb och tillförlitlig metod för att pröva geners funktion i senare skeden av utveckling eller av kroppens homeostas utan att påverka geners funktion under foster bedömning. För att säkerställa framgång för denna teknik, bör man vara medveten om fyra viktiga punkter: 1) st, 2) uttorkning av nålen, 3) minska volymen, och 4) minimal exponeringstid i sedering lösningen. Nålar som är för små kommer att täppa ofta, medan nålar som är för stora kommer att skada ventrikeln och orsaka överdriven blödning. Medan 20 um rekommenderas, bör nålen aldrig bli mer än en femtedel av storleken på den ventrikulära kammaren. En annan kritisk punkt är att hålla nålen från att torka ut och igensättning. Den lilla storleken på nålen och den oundvikliga täta pauser för stillsam, överföring och placering larven kan ge tillräckligt med tid för att göra det möjligt för morpholino vid nålspetsen att torka ut och täppa igen kanylen. För att förhindradetta kan en doppa nålen i en petriskål med 1 x PBS. En tredje kritisk punkt är att minimera uppblåsthet av ventrikeln genom en alltför hög volym. Om doseringen begränsas av storleken på nålen, sedan öka antalet injektioner är alltid bättre att öka volymen: större volymer kan orsaka stretch skada på hjärtat. En fjärde kritisk punkt är omfattningen av sedering. Den sedering tiden är baserad på hur lång tid som behövs för förfarandet. Larver kan vara kvar i sedering lösningen och förblir sederade under flera minuter, eftersom de är ganska robust och återuppliva ganska lätt. Kommer dock att behålla fisken för länge i bedövningsmedel försämra dess återvinning eller för kort kommer att få dem att återuppliva under injektionen. Därför bör en söva bara antalet larv som en kan injicera inom en 4-minutersperiod.

En begränsning med denna nuvarande metoden är att morfolino inte prognostiseras genfunktion i en vävnadSpecifikt sätt. Två olika modifieringar kan ge vävnadsspecificitet: En ändring är att använda bur morpholinos. Efter aktivering av laserljus från en konfokalmikroskop, dessa morpholinos hämma deras gen mål, kan så tids konfokal exponering ge tid och rum kontroll till morfolino aktivitet. Bur morpholinos har använts för att rikta generna under den tidiga utvecklingen efter injektion in i en cell embryo. Även leverans på encelliga stadiet kan arbeta för att rikta gener under fosterutvecklingen, kommer koncentrationen av morpholino sannolikt vara för låg vid senare larvstadier på grund av antalet på varandra följande celldelningar som utvecklingen fortskrider till larvstadiet ^13. Mängden morfolino en kan injicera vid en-cellstadiet är även begränsad av toxiciteten ^13-15. En andra möjlig modifiering är att direkt injicera en morfolino in i organ eller vävnad som ska studeras när storleken och avbildning tillåter. Den zebrafisk larv är genomskinlig, så tittar most inre organ efter att de har tagit fram bör inte vara ett problem. De fluorescein-märkta morpholinos arbetar med detta protokoll; därför kan fluorescens användas för att spåra distributionen och vävnadsspecifik lokalisering av morfolino. Införlivandet av den fluorescein-märkta morpholino in vävnadsceller kräver närvaro av Endo-Porter-reagens, så att en annan modifikation kan vara att begränsa den rumsliga fördelningen av det Endo-Porter-reagens genom att injicera det vid lägre mängder direkt i målvävnaden. Sålunda bör rumsliga upplösningen vara möjlig med denna teknik.

Det finns transgena överuttryck metoder som ger för tid och rum kontroll av exogena genuttryck genom att kombinera vävnadsspecifika promotorer med värmechock eller tamoxifen-promotorer som möjliggör analys av geners funktion i senare skeden av utveckling eller i vissa vävnader med hjälp av vävnad specifika promotorer ^16-19. Detta inkluderar den transgenic uttryck av dominant-negativa konstruktioner som syftar till att skapa en produkt som kan konkurrera ut den endogena genen. Denna knockdown strategi är mottagliga för off-mål effekter när en transgen ger oproportionerligt uttrycksnivåer av en transgen produkt som förvärvar gain-of-function effekter ²⁰ eller när den integreras i en gen och stör genen endogena funktion ^{21, 22.} Medan morpholinos kan också generera ej åsyftade effekter, kan en lättare kontrollera och begränsa dessa effekter genom att använda mismatch kontroll morpholinos med liknande men något annorlunda målsekvenser som inte binder mål-mRNA, genom att använda flera antisens morpholinos som riktar olika sekvenser inom samma mRNA och genom att testa olika morfolinogrupper koncentrationer ^13-15. Dessutom kan morpholinos produceras och testas mycket snabbare och billigare än att designa, lyfta och testa olika dominerande-negativa transgena linjerna. Därför är den itraventricular injektion av morpholinos ger ett användbart verktyg för att knockdown gener i senare utvecklingsstadier, då dominant-negativ genmodifiering är inte möjlig. När en dominant-negativ transgen strategi är möjlig, är intraventrikulär morpholino injektion en alternativ metod för att bekräfta specificiteten av överuttryckt dominant-negativ transgen.

Det är troligt att effektiva koncentrationer mellan olika morpholinos varierar som de gör när man använder dem för gen knockdown under foster ^{13, 15.} För genen riktade i denna studie, har vi inte observera en effekt på förnyelse vid doser lägre än 3,5 mM, och icke-specifika effekter observerades inte i obalans styr med denna morpholino koncentration.

Intraventrikulär injektion möjliggör fördelningen av små molekyler för att utvärdera aktivitet och effekt i ett helt djur-system i realtid när effekten är begränsad av Penetransonera genom huden eller matsmältningssystemet eller av de mängder av föreningen tillgängliga. Det gör också inriktningen av vävnader när de inte kan riktas genom direkta injektioner, vilket är fallet för finfold. Den här metoden ger inte bara ett verktyg för att studera geners funktion under fin regenerering vid larvstadier. Eftersom morfolino integreras i larv finfold består mesenkymala celler och epidermis, kan det också ge en lämplig teknik för att undersöka rollen av gener som spelar en del i processen för sårläkning och uppkomst av hudcancer. Injektionen av morpholino tillsammans med Endo-Porter kan även appliceras på målorgan eller vävnader i vuxen zebrafisk, som kan bli föremål för kirurgi och genomskinliga vuxen zebrafisk linjer finns tillgängliga. Dessutom är denna metod inte begränsad till zebrafisk; dispersion av intraventrikulär injektion kan användas på andra ryggradsdjur modeller också, särskilt de modeller som fortfarande saknar effektiva recessiv gen metodersåsom Xenopus, Axolotlen och newt, vilka också är viktiga modeller för regenereringsstudier.

Således intraventrikulär injektion i zebrafisk erbjuder möjligheten att tidsmässigt kontrollera genuttryck med en relativt snabb protokoll att rikta flera vävnader, och mångsidigheten hos denna metod gör det möjligt för dess användning med zebrafisk transgena linjerna och för andra organismer som saknar funktionell genmodifiering eller gen knockout strategier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Morpholino with 3´fluorescein tag	Gene Tools Inc.	Customized	More information at www.gene-tools.com
Endo-Porter	Gene Tools Inc.		More information at www.gene-tools.com
Agarose	Serva	120623	For pouring plates to place the fish during injections and imaging
Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate)	Applichem		For anesthesia
E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSO4)			For larval husbandry
Petri Dishes	Sarstedt	821.472	For placing the fish during injections and imaging
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-3	For preparing injection needles
Microloader pipette tips	Eppendorf	5,242,956,003	For loading the needle
Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml)	Brand	747760/ 74775	For transfering larva
Flaming/Brown needle puller	Sutter		More information at www.sutter.com
Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5)	World Precision Instruments, Inc.	501985	To brake the needle before sharpening
Dissecting microscope	Olympus, Leica, Zeiss	Varies with the manufacturer	Part of the whole injection setup
Fluorescence camera	Olympus, Leica, Zeiss	Varies with the manufacturer	To image the fluorescence after injeciton
PicoNozzle kit (microinjector holder)	World Precision Instruments	5430-12	For microinjections
Pneumatic PicoPump (microinjector)	World Precision Instruments	SYS-PV820	For microinjections