Summary
ऐसे जीन विशिष्ट morpholinos के intraventricular इंजेक्शन का उपयोग कर ऊतक उत्थान के रूप में विकास और शारीरिक homeostasis के बाद के चरणों के दौरान जीन समारोह का आकलन करने के लिए zebrafish के लिए एक अनुकूलनीय रिवर्स आनुवंशिक विधि.
Abstract
zebrafish सेल और अंग और उपांग उत्थान की आणविक जीव विज्ञान को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल है. हालांकि, रिवर्स आनुवंशिकी को रोजगार के लिए आणविक रणनीतियों अभी तक पर्याप्त रूप से zebrafish embryogenesis के बाद लार्वा चरणों के दौरान उत्थान या ऊतक homeostasis में जीन समारोह का आकलन करने के लिए विकसित नहीं किया गया है, और zebrafish लार्वा के भीतर कई ऊतकों लक्ष्य के लिए मुश्किल हैं. जीन विशिष्ट morpholinos के intraventricular इंजेक्शन genomically इन चरणों में एक अस्थायी नियंत्रित तरीके से zebrafish जीनों को लक्ष्य करने के लिए वर्तमान में असमर्थता के लिए एक वैकल्पिक तरीका प्रदान करते हैं. इस विधि पूर्व में इस तरह के लार्वा दुम फिन, अक्सर noninvasively ऊतक उत्थान के लिए अनुसंधान करने के लिए इस्तेमाल एक संरचना में उन के रूप में पहुँचने के लिए असंभव थे कि संरचनाओं सहित पूरे शरीर में विभिन्न ऊतकों में पूरा फैलाव और morpholino के बाद शामिल करने के लिए अनुमति देता है. लार्वा finfold उत्थान के दौरान सक्रिय कई जीनों भी presen रहे हैंवयस्क हड्डीवाला ऊतकों regenerating में टी, ताकि लार्वा वयस्कों में उत्थान को समझने के लिए एक उपयोगी मॉडल है. इस morpholino फैलाव विधि लार्वा ऊतकों के उत्थान के साथ ही embryogenesis के बाद ऊतक homeostasis को विनियमित अन्य शारीरिक घटना के लिए आवश्यक जीन की त्वरित और आसान पहचान के लिए अनुमति देता है. इसलिए, इस वितरण पद्धति embryogenesis के बाद जीन समारोह का मूल्यांकन करने के लिए अस्थायी नियंत्रण के लिए एक वर्तमान की जरूरत रणनीति प्रदान करता है.
Introduction
अंगों और उपांग के उत्थान के अस्तित्व और फिटनेस के लिए मूल रूप से महत्वपूर्ण है; हालांकि, आदमी सहित कई रीढ़ पुनर्योजी क्षमताओं सीमित है. कई पशु मॉडल व्यापक पुनर्योजी क्षमता है कि मौजूद हैं, अंग और उपांग उत्थान के दौरान जीन समारोह का आकलन करने के लिए आनुवंशिक तकनीक रिवर्स बहुत ही सीमित या न के बराबर रहते हैं. इसलिए, नए तरीकों को इन मॉडल जीवों में उत्थान की आणविक जीव विज्ञान टुकड़े करना आवश्यक हैं.
zebrafish कई ट्रांसजेनिक मछली लाइनों कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए मौजूद है क्योंकि सेल और इसकी वजह से महत्वपूर्ण कई अंगों, ऊतकों और उपांग पुनर्जीवित करने की क्षमता है, लेकिन यह भी की न केवल अंग और उपांग उत्थान 1, आणविक जीव विज्ञान को समझने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल है और जीन overexpress करने के लिए 2, 3 निर्माण करती है. हालांकि, लार्वा zebrafish में जीन निषेध मुख्य रूप से overexpre तक सीमित हैजिसका transgene उत्पाद जीन की अंतर्जात गतिविधि प्रतिबिंबित नहीं करते कि लाभ के समारोह प्रभाव प्राप्त कर सकते हैं सभी के हित के जीन या करने के लिए उपलब्ध नहीं हैं, जो प्रमुख नकारात्मक निर्माणों के ssion. इस प्रकार, विशेष रूप से पीटकर या पछाड़ना द्वारा जीन अभिव्यक्ति को दूर करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका इन मुद्दों पर काबू पाने की जरूरत है.
TALENS जीन समारोह पीटकर एक रिवर्स आनुवंशिक साधन के रूप में मौजूद है का उपयोग को लक्षित जीन विशिष्ट; जीन की प्रारंभिक आवश्यकताओं भ्रूण के विकास के लिए आगे बढ़ने से रोकने हालांकि, इस वजह पीटकर रणनीति, बहुत बार जल्दी embryogenesis दौरान कार्यात्मक आकलन तक सीमित है. इस प्रकार, इस तरह के TALENS का उपयोग कर विकास के बाद उत्थान या अंग homeostasis के रूप में बाद में घटना के अध्ययन, 5 4 रोका है. इसलिए, एक वैकल्पिक जीन को हटाने की रणनीति पूरी तरह से गठन अंगों और संरचनाओं में जीन की आवश्यकताओं का आकलन करने के लिए प्रारंभिक विकास के बाद जीन समारोह है कि लक्ष्य की जरूरत है. Morpholino इंजेक्शन कुछ वयस्क अंगों में जीन को निशाना बनाने और वयस्क फिन 6-8 regenerating में प्रभावी होना दिखाया गया है, लेकिन इन तरीकों electroporation की आवश्यकता होती है और कई आंतरिक अंगों के कारण उनके स्थान पर या के कारण बिजली के लिए उनकी संवेदनशीलता को या तो electroporate के लिए मुश्किल हैं विघटन. प्रत्यक्ष इंजेक्शन उनके संरचनात्मक अखंडता को बाधित कर सकता है, क्योंकि या उनके आकार सीमित है, क्योंकि इसके अलावा, लार्वा में कुछ ऊतकों, सीधे इंजेक्षन करने के लिए मुश्किल हैं. finfold में प्रत्यक्ष इंजेक्शन संभव नहीं है क्योंकि लार्वा की दुम का पंख, एक ऐसी संरचना है. इस प्रकार, electroporation और प्रत्यक्ष इंजेक्शन के लिए एक विकल्प है या तो इंजेक्षन करने के लिए बहुत छोटे हैं या electroporated नहीं किया जा सकता कि ऊतकों में जीनों को लक्ष्य बनाने की जरूरत थी.
लार्वा दुम फिन के उत्थान के दौरान विशेष जीन के समारोह को निशाना बनाने और बाधित करने के लिए, हम की अनुमति मौजूदा morpholino प्रौद्योगिकियों को संशोधित किया है एकदेर मंचन लार्वा में दुम फिन उत्थान के दौरान जीन समारोह की ssessment. यह विधि एक साथ एंडो पोर्टर अभिकर्मक अभिकर्मक 10 के साथ fluorescein टैग morpholinos के intraventricular वितरण 9 कार्यरत हैं. एक बार जब निलय में, morpholino-एंडो पोर्टर मिश्रण जल्दी वाहिका संरचना के माध्यम से लार्वा भर में फैलता है और लक्षित करने के लिए पहले से असंभव हो गया है कि ऊतकों में प्रवेश करती है. इस इंजेक्शन विधि विशिष्ट ऊतकों में जीन लक्ष्य को संशोधित किया जा सकता है और काफी संभवतः वर्तमान में जीन समारोह को बाधित करने के लिए रिवर्स आनुवंशिक तरीकों की कमी है कि अन्य पशु मॉडल में लागू किया जा सकता है. इस प्रकार, यह तुरंत लार्वा चरणों में सामान्य अंग homeostasis और उत्थान के दौरान जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए व्यापक रेंज इस्तेमाल के लिए क्षमता के साथ एक त्वरित और आसान तरीका प्रदान करता है.
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Protocol
1. गिलास सुई की तैयारी (चित्रा 1)
- इंजेक्शन सुई (चित्रा 1 ए) तैयार करने के लिए एक 0.75 एमएम व्यास के साथ कांच capillaries का प्रयोग करें.
- एक सुई खींचने में गिलास केशिका प्लेस और निम्न पैरामीटर के साथ सुई खींच: ताप चक्र मूल्य: 463; चक्र मूल्य खींच: 230; वेग: 150 मिसे; समय: 150 मिसे (चित्रा 1 बी).
- एक माइक्रोमीटर ऐपिस के साथ एक त्रिविमेक्ष के तहत एक 20 माइक्रोन व्यास सुई का उत्पादन करने के लिए घड़ीसाज़ चिमटी के साथ खींच लिया गिलास केशिका तोड़ो.
- सुई पैनापन और एक 20 माइक्रोन उठाव (आंकड़े 1 सी और 1 डी) के उत्पादन के लिए एक गीला रबर चरखा के साथ एक खराद का प्रयोग करें. नोट: तीव्र, beveled सुई निलय में प्रविष्टि की आसानी बेहतर बनाने और इस प्रकार के ऊतकों को नुकसान को कम करने और छिद्रित पेशी सुई (आंकड़े 1E जी) के हटाने के बाद reseal करने के लिए अनुमति देते हैं.
2. Preparmorpholino समाधान की समझना
- 7.5 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में lyophilized morpholino भंग करके morpholino स्टॉक तैयार करें. [विवरण के लिए निर्माता के निर्देशों (सामग्री तालिका) देखें].
- 3.5 मिमी morpholino और 0.5 मिमी एंडो पोर्टर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 2.8 μl एंडो पोर्टर शेयर समाधान (1 मिमी) (सामग्री तालिका देखें) के साथ 2.5 μl morpholino शेयर समाधान (7.5 मिमी) के मिश्रण से morpholino इंजेक्शन समाधान तैयार करें.
3. Morpholino इंजेक्शन की तैयारी (चित्रा 2)
- एक 10 μl microloader विंदुक टिप के साथ एक micropipette का उपयोग इस समाधान के 5 μl के साथ beveled गिलास सुई लोड.
- वायवीय पिको पंप (आंकड़े 2A सी) से जुड़ा micromanipulator की सुई धारक में कांच सुई डालें.
- अगले माइक्रोस्कोप को सुई धारक जगह सुई की जरूरत है केवल इतना है किलार्वा (2A चित्रा) के हृदय वेंट्रिकल में डालने के लिए एक तलीय दिशा में स्थानांतरित करने के लिए.
- लगभग 45 डिग्री पर इंजेक्शन के लिए कोण समायोजित करें.
- पकड़ दबाव: इस प्रकार है: microinjector मूल्यों को निर्धारित वर्ग इंच (साई) के प्रति £ 20; इंजेक्शन दबाव: 15 साई; Gating की 100 मिसे रेंज, 1.9 की अवधि मूल्य (10.9 मिसे से मेल खाती है).
- एक 1.5% की 20 मिलीलीटर (w / v) जेल का उत्पादन करने के लिए एक मानक माइक्रोवेव का उपयोग 1x पीबीएस में agarose पिघला. एक 10 सेमी पेट्री डिश में पिघल जेल डालो. एक बार कठोर, agarose बेहोश लार्वा 11 (आंकड़े 2 डी और 2 ई) रखा जाएगा जिसमें furrows होगा कि इतना गर्म agarose में एक अंडाकार इंजेक्शन फार्म रखें.
4. इंजेक्शन (चित्रा 3)
- 20 मिलीग्राम / एल tricaine (एल एथिल-M-एमिनो बेंजोएट मीथेन सल्फ़ोनेट) वे के लिए स्पर्श प्रत्युत्तर देना बंद जब तक साथ मछलीघर पानी की 100 मिलीलीटर में लार्वा anesthetize.
- एक प्लास्टिक पाश्चर pipett का प्रयोग करेंउदर की ओर नाली (चित्रा 3) के ऊर्ध्वाधर agarose दीवार के खिलाफ सामना करना पड़ रहा है, ताकि ई ध्यान से गीला agarose ढालना की एक नाली में बेहोश लार्वा स्थानांतरित करने के लिए.
- निलय दूर इंजेक्शन सुई (चित्रा 3) से सामना करना पड़ रहा है, ताकि stereomicroscope के तहत agarose प्लेट रखें.
- दिल निलय में डालने के लिए सुई कम करें. केवल 1-2 माइक्रोन भी गहराई से सुई (आंकड़े 3B और 3 सी) सम्मिलित करने के लिए नहीं ख्याल रख रही वेंट्रिकल में सुई डालें.
- सुई डाला जाता है एक बार, दिल (आंकड़े 3 डी और 3E) का समाशोधन की अनुमति देने के अंतराल इंतज़ार कर के साथ, 4-6 दालों, समाधान की प्रत्येक पहुंचाने 3 NL साथ निलय में morpholino समाधान इंजेक्षन.
- इंजेक्शन के बाद, सुई (प्रविष्टि के विमान के समानांतर) को हटाने और फिर ध्यान E3 के माध्यम बीएसी से भरा एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग लार्वा हस्तांतरणताजा E3 के माध्यम से युक्त एक पेट्री डिश में कश्मीर.
- इंजेक्शन लार्वा स्थानांतरित जब सुई के सूखने को रोकने के लिए 1x पीबीएस युक्त एक पेट्री डिश में सुई रखें.
- दोहराएँ 4.1-4.6 प्रयोग की अवधि के लिए हर 12-24 घंटा कदम. नोट: इंजेक्शन दोहरा कोशिकाओं में morpholino के तेज और रखरखाव सुनिश्चित करता है.
5. इंजेक्शन के विश्लेषण (चित्रा 4)
- वे के लिए स्पर्श प्रत्युत्तर देना बंद जब तक 20 मिलीग्राम / एल tricaine साथ मछलीघर पानी की 100 मिलीलीटर में मछली anesthetize.
- एक फ्लैट गीला 1.5% पर laterally लार्वा प्लेस E3 के माध्यम से कवर (w / v) agarose प्लेट.
- Brightfield और प्रतिदीप्ति इमेजिंग के साथ एक stereomicroscope का उपयोग कर छवि लार्वा. नोट: लार्वा पारदर्शी हैं, fluorescein टैग morpholino सीधे इंजेक्शन के बाद जानवर में रक्त वाहिकाओं में फ्लोरोसेंट ग्रीन के रूप में दिखाई जानी चाहिए. इस प्रतिदीप्ति आगे से vascularized ऊतकों में फैलाने जाएगा15 मिनट (आंकड़े 4A-4C).
रिजनरेटिव परिणाम की 6. आकलन
- फिजी छवि जम्मू मुफ्त सॉफ्टवेयर (http://fiji.sc/Fiji) का उपयोग कर कब्जा कर लिया छवियों का आकलन करें. उत्थान की जांच के लिए, नियंत्रण और morpholino इंजेक्शन लार्वा पर आ गई है कि पुनर्योजी विकास की राशि का निर्धारण करने के लिए लाइन अनुरेखण उपकरण का उपयोग करें.
- छवियों जांचना, खींचने और मुख्य फिजी विंडो में फाइल को छोड़ने के द्वारा फिजी में मूल छवि फ़ाइलों में से एक खुला.
- निम्न सभी छवियों के लिए पैमाने तय है, मुख्य मेनू में "विश्लेषण" के पास जाओ.
- "सेट पैमाने पर" मेनू क्लिक करें ड्रॉप डाउन में.
- इस विंडो में, चेक बॉक्स पर क्लिक करके "ग्लोबल" विकल्प पर बारी.
- अब खींचें और ड्रॉप (कदम 6.1 देखें) द्वारा फिर से पुनर्योजी विकास की राशि को मापने के लिए छवि खुला.
- टूल बार में "मुक्तहस्त चयन" उपकरण चुनें.
- मापा जाना क्षेत्र (फाई घेरनाGURES 4J-4L).
- प्रेस Ctrl + एम इस वर्ग पिक्सल में घेर लिया क्षेत्र का मूल्य दिखा एक नया "परिणाम" खिड़की खुल जाएगा.
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Representative Results
(चित्रा 3) पृष्ठीय रूप से संपर्क किया जब तेज, beveled इंजेक्शन सुई आसानी zebrafish लार्वा के हृदय वेंट्रिकल में रखा गया है. दिल सुई (आंकड़े 3B और 3 सी) की मौजूदगी के बावजूद पम्पिंग जारी है और रक्त प्रवाह को बनाए रखा है. सावधान इंजेक्शन दिल (चित्रा 3E) में morpholino के इंजेक्शन के बावजूद निलय या हृदय के संकुचन (चित्रा 3 डी) की आकारिकी को बाधित न करें.
मिनट के भीतर, morpholino-एंडो पोर्टर समाधान वाहिका संरचना (आंकड़े -4 ए और 4 बी) के माध्यम से पूरे शरीर में वितरित करता है. morpholino तो इस तरह के कम से कम 12 घंटे या प्रतिदीप्ति (चित्रा 4C) से मनाया के रूप में अधिक के लिए finfold और मस्तिष्क के रूप में विभिन्न ऊतकों में vasculature से वितरित किया जाता है.
इस दृष्टिकोण में, हम वीं के बाहर का टिप को दूरई finfold, रीढ़ की हड्डी, बाहर का ट्रंक मांसपेशियों, बाहर का पृष्ठरज्जु और वर्णक कोशिकाओं (आंकड़े 4D और 4H) के बाहर का टिप; जिनमें से सभी विशेष रूप से कारण सुसंहति (मांसपेशी) के लिए सीधा इंजेक्शन द्वारा लक्षित करने के लिए कठिन हैं, छोटे आकार (रीढ़ की हड्डी और पृष्ठदंड) और दुबलापन (finfold), लेकिन इन भीतर प्रतिदीप्ति द्वारा देखा जाता है जो धारावाहिक निलय इंजेक्शन के बाद morpholino शामिल करने के लिए दिखाई देते हैं ऊतकों (चित्रा 4E) uninjected जानवरों (आंकड़े 4F और 4 जी) की तुलना में. इस प्रकार, इस विधि अपेक्षाकृत आसानी से व्यक्तिगत रूप से लक्षित करने के लिए मुश्किल हो जाता है कि ऊतकों को morpholino की डिलीवरी को बढ़ावा देता है, और यह एक ही बार में Regenerating पंख में कई ऊतकों में जीन समारोह का आकलन परमिट. उत्थान में शामिल विशेष जीन के महत्व का आकलन करने के लिए, एक शल्य चिकित्सा द्वारा आंशिक रूप से Incorp है कि सभी ऊतकों resecting, लार्वा दुम फिन (चित्रा 4H) amputates morpholino (चित्रा 4I) orated. लार्वा finfold कुछ दिनों के बाद विच्छेदन (डीपीए) (चित्रा 4J) के भीतर इसकी संरचना पुन: बनाता है. Morpholino लक्ष्यीकरण उत्थान (अप्रकाशित डेटा) के लिए आवश्यक एक जीन (चित्रा 4J) और बेमेल morpholino नियंत्रण (चित्रा 4L) uninjected की तुलना में एक परेशान उत्थान प्रतिक्रिया (चित्रा 4K) में यह परिणाम है. पुनर्योजी परिणाम पर इन morpholino प्रयोगों के कुल प्रभाव पुनर्जीवित ऊतकों अनुरेखण और क्षेत्रों (आंकड़े 4J-4L) की तुलना द्वारा सार्वजनिक रूप से उपलब्ध फिजी कार्यक्रमों 12 में मानक morphometric उपकरणों का उपयोग करके मापा जा सकता है. इस प्रकार, इस जीन को लक्षित विधि उत्थान की प्रक्रिया में जीन के महत्व को परीक्षण करने के लिए एक त्वरित और अपेक्षाकृत आसान परख प्रदान करता है.
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इंजेक्शन के लिए गिलास केशिका सुइयों के चित्रा 1. तैयारी. खींच (ऊपर) और पहले ए) गिलास केशिका ट्यूब) नीचे (सुई खींच लिया. बी) सुई खींच तंत्र. सी) खराद beveling के लिए और गिलास सुई sharpening. सुई दूरबीन के माध्यम से देखा जाता है. डी) खराद एक गीला रबर कताई डिस्क है. सुई धीरे से डिस्क पर उतारा है. ई) तेज सुई नहीं रह (20 माइक्रोन है कि एक कम उठाव होना आवश्यक है) लार्वा हृदय में सुई की पूरी अंत डालने के लिए जगह की जरूरत को कम करने के लिए) 20 माइक्रोन (विस्तृत है से सुई की नोक. जी) sharpening के बाद उठाव का आकार दिखा सुई टिप की योजनाबद्ध दृश्य दिखा निलय. एफ) उच्च बढ़ाई छवि.
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चित्रा 2. इंजेक्शन तंत्र की स्थापना की. ए) zebrafish लार्वा में morpholino के इंजेक्शन के लिए पूरा तंत्र. बी) इंजेक्शन इंजेक्शन का इस्तेमाल किया. डी) फार्म प्रेस के लिए साँस का दबाव नियंत्रित करता है. सी) पिको पंप के दौरान सुई की नियुक्ति को नियंत्रित करने के लिए खड़े हो जाओ इंजेक्शन के लिए लार्वा को स्थिर करने के लिए प्रयोग किया जाता agarose ढालना बनाने के लिए. ई) agarose ढालना.
मछली लार्वा के 3 चित्र. इंजेक्शन. हृदय वेंट्रिकल में ए) zebrafish लार्वा के संबंध में सुई की नियुक्ति. बी) निवेशन. सी) सुई में morpholino की प्रतिदीप्ति लेकिन निलय में अनुपस्थित पहले injecti. डी) पर brightfield छवि गिलास सुई और लार्वा निलय दिल निलय में फ्लोरोसेंट morpholino की. ई) इंजेक्शन के बीच आकार संबंध दिखाता है. स्केल सलाखों 100 माइक्रोन के बराबर.
मछली भर morpholino की चित्रा 4. फैलाव. क) Zebrafish 3 दिन पुरानी लार्वा. बी) प्रतिदीप्ति fluorescein टैग शरीर vasculature finfold (एफएफ) सहित पशु भर morpholino (v) के 5 मिनट डाक निलय इंजेक्शन. सी) फैलाव भर morpholino, मस्तिष्क (ख) पुराने में . लार्वा morpholino के इंजेक्शन लार्वा दुम फिन और ट्रंक में हर 12 घंटा डी) ऊतकों के बाद:. पृष्ठदंड (एन), रीढ़ की हड्डी (अनुसूचित जाति), वर्णक (पी), और finfold (एफएफ) ई) morpholino बिखरेकई मिनट finfold. एफ) uninjected लार्वा ट्रंक और दुम फिन की brightfield छवि सहित लार्वा ट्रंक ऊतकों में इंजेक्शन के बाद. धराशायी लाइन ग्रीन (तीर) में autofluorescence दिखा GFP फिल्टर के साथ imaged भावी विच्छेदन विमान. जी) uninjected फिन इंगित करता है. fluorescing संरचनाओं के वृक्ष के समान आकार इन वर्णक कोशिकाओं पृष्ठदंड, मांसपेशियों और रीढ़ की हड्डी के माध्यम से एक शल्य चिकित्सा द्वारा काट लार्वा दुम फिन की. एच) brightfield छवि है कि पता चलता है. मैं) स्टंप ऊतकों में morpholino वितरण दिखा फ्लोरोसेंट छवि. मांसपेशी में morpholino समावेश, रीढ़ की हड्डी, पृष्ठरज्जु और finfold. जे) जंगली प्रकार लार्वा की दुम finfold संरचनाओं पुनर्जीवित. काले रेखा मात्रा का ठहराव के विश्लेषण के लिए पुनर्जीवित ऊतकों के उत्थान की. कश्मीर) morpholino की मध्यस्थता निषेध बताते हैं. काला लाइन ट्रेसिंग स्पष्ट रूप से कम उत्थान फिर से प्रकाश डाला गयाmorpholino पछाड़ना. एल) uninjected लार्वा (जे) के रूप में एक समान उत्थान प्रतिक्रिया दिखा एक बेमेल नियंत्रण morpholino के साथ इंजेक्शन लार्वा की दुम finfold पुनर्जीवित करने के बाद त्वरित कार्रवाई. स्केल सलाखों 100 माइक्रोन के बराबर.
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Discussion
intraventricular इंजेक्शन embryogenesis दौरान जीन समारोह को प्रभावित किए बिना विकास की या शरीर homeostasis के बाद के चरणों में जीन समारोह के परीक्षण के लिए एक त्वरित और विश्वसनीय मूल्यांकन पद्धति प्रदान करता है. इस तकनीक की सफलता सुनिश्चित करने के लिए एक चार महत्वपूर्ण बिंदुओं के बारे में पता होना चाहिए: सुई से बाहर 1) सुई आकार, 2) सुखाने, 3) की मात्रा को कम करने, और बेहोश करने की क्रिया समाधान में 4) न्यूनतम जोखिम समय. बहुत बड़ी हैं कि सुई निलय को नुकसान पहुंचा और अत्यधिक रक्तस्राव के कारण होगा, जबकि बहुत छोटे हैं कि सुई, अक्सर रोकना होगा. 20 माइक्रोन की सिफारिश की है, वहीं सुई से अधिक एक पांचवें निलय चैंबर के आकार नहीं हो जाना चाहिए. एक दूसरा महत्वपूर्ण बिंदु बाहर सुखाने और clogging से सुई रखने के लिए है. शांत, स्थानांतरण और स्थिति लार्वा को सुई और अपरिहार्य लगातार विराम देता है के छोटे आकार सुई नोक पर morpholino बाहर सूखी और सुई रोकना अनुमति देने के लिए पर्याप्त समय प्रदान कर सकते हैं. रोकने के लिएयह एक 1x पीबीएस के एक पेट्री डिश में सुई विसर्जित कर सकते हैं. एक तीसरा महत्वपूर्ण बिंदु एक मात्रा का बहुत अधिक से वेंट्रिकल की सूजन को कम करने के लिए है. खुराक सुई के आकार के द्वारा सीमित है तो इंजेक्शन की संख्या बढ़ रही है हमेशा की मात्रा में वृद्धि करने के लिए बेहतर है: बड़ी मात्रा में दिल को खिंचाव चोट पैदा कर सकता है. चौथा महत्वपूर्ण बिंदु बेहोश करने की हद तक है. बेहोश करने की क्रिया समय प्रक्रिया के लिए आवश्यक समय की लंबाई पर आधारित है. बल्कि वे मजबूत कर रहे हैं और जगह आसानी से पुनर्जीवित क्योंकि लार्वा, बेहोश करने की क्रिया समाधान में रह सकते हैं और कई मिनट के लिए बेहोश रहते हैं. हालांकि, संवेदनाहारी में भी लंबे समय से मछली को बनाए रखने इसकी वसूली ख़राब होगा या बहुत कम उन्हें इंजेक्शन के दौरान पुनर्जीवित करने के लिए प्रेरित करेगा. इसलिए, एक के बाद एक 4 मिनट की अवधि के भीतर इंजेक्षन कर सकते हैं कि लार्वा की ही संख्या शांत करना चाहिए.
इस मौजूदा पद्धति की एक सीमा morpholino एक ऊतक में जीन समारोह को लक्षित नहीं करता हैविशिष्ट तरीके. दो विभिन्न संशोधनों ऊतक विशिष्टता प्रदान कर सकते हैं: एक संशोधन बंदी morpholinos उपयोग करने के लिए है. एक confocal खुर्दबीन से लेजर प्रकाश से सक्रियण के बाद, इन morpholinos उनके जीन लक्ष्य को बाधित, ताकि समय पर confocal जोखिम morpholino गतिविधि के लिए अस्थायी और स्थानिक नियंत्रण प्रदान कर सकते हैं. बंदी morpholinos एक सेल भ्रूण में इंजेक्शन के बाद प्रारंभिक विकास के दौरान जीन लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. एकल कोशिका स्तर पर वितरण embryogenesis दौरान जीन लक्ष्य के लिए काम कर सकते हैं, morpholino की एकाग्रता की संभावना की वजह से विकास लार्वा चरण 13 को प्रगति के रूप में लगातार कोशिका विभाजन की संख्या के बाद लार्वा चरणों में बहुत कम हो जाएगा. एक के बाद एक सेल मंच पर इंजेक्षन कर सकते हैं morpholino की राशि भी विषाक्तता 13-15 तक सीमित है. एक दूसरा संभव संशोधन सीधे आकार और इमेजिंग की अनुमति जब अध्ययन किया जा अंग या ऊतक में एक morpholino इंजेक्षन है. zebrafish लार्वा पारदर्शी है, तो देखने राज्यमंत्रीवे विकसित किया है के बाद आंतरिक अंगों टी एक समस्या नहीं होनी चाहिए. fluorescein टैग morpholinos इस प्रोटोकॉल के साथ काम करते हैं; इसलिए, प्रतिदीप्ति morpholino के वितरण और ऊतक विशेष स्थानीयकरण ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ऊतक कोशिकाओं में fluorescein टैग morpholino का समावेश तो एक और संशोधन लक्ष्य ऊतक में सीधे कम मात्रा में इंजेक्शन द्वारा एंडो पोर्टर अभिकर्मक के स्थानिक वितरण को सीमित करने के लिए किया जाएगा, इंडो पोर्टर अभिकर्मक की उपस्थिति की आवश्यकता है. इस प्रकार, स्थानिक संकल्प इस तकनीक के साथ संभव होना चाहिए.
ऊतक का उपयोग कर विकास के बाद के चरणों में या कुछ ऊतकों में जीन समारोह के विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है, जो गर्मी झटका या tamoxifen-inducible प्रमोटरों के साथ ऊतक विशेष प्रमोटरों के संयोजन से exogenous जीन अभिव्यक्ति की अस्थायी और स्थानिक नियंत्रण के लिए प्रदान कि ट्रांसजेनिक overexpression तरीके हैं विशिष्ट प्रमोटरों 16-19. इस transge शामिलअंतर्जात जीन outcompete कर सकते हैं कि एक उत्पाद बनाने के लिए डिज़ाइन प्रमुख नकारात्मक निर्माणों की एनआईसी अभिव्यक्ति. एक transgene यह एक जीन में एकीकृत करता है और जीन की अंतर्जात समारोह 21, 22 बाधित जब लाभ के समारोह प्रभाव 20 या प्राप्त कर लेता है कि एक ट्रांसजेनिक उत्पाद की आय से अधिक अभिव्यक्ति के स्तर का उत्पादन जब यह पछाड़ना रणनीति बंद लक्ष्य प्रभाव के लिए अतिसंवेदनशील है. Morpholinos भी बंद लक्ष्य प्रभाव उत्पन्न कर सकते हैं, एक और अधिक आसानी से नियंत्रित और भीतर विभिन्न दृश्यों का लक्ष्य है कि कई antisense morpholinos का उपयोग करके, लक्ष्य mRNA बाँध नहीं है कि समान है लेकिन थोड़ा बदल लक्ष्य दृश्यों के साथ बेमेल नियंत्रण morpholinos का उपयोग करके इन प्रभावों को सीमित कर सकते हैं एक ही mRNA और अलग morpholino सांद्रता 13-15 परीक्षण द्वारा. इसके अलावा, morpholinos उत्पादन किया है और बहुत तेजी से और सस्ता, डिजाइनिंग को ऊपर उठाने और विभिन्न प्रमुख नकारात्मक ट्रांसजेनिक लाइनों के परीक्षण से परीक्षण किया जा सकता है. इसलिए, मेंmorpholinos के traventricular इंजेक्शन प्रमुख नकारात्मक transgenesis संभव नहीं है, जब विकास के बाद के चरणों में जीन पछाड़ना के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है. एक प्रमुख नकारात्मक ट्रांसजेनिक रणनीति संभव है जब, intraventricular morpholino इंजेक्शन overexpressed प्रमुख नकारात्मक transgene की विशिष्टता की पुष्टि के लिए एक वैकल्पिक तरीका है.
यह embryogenesis 13, 15 के दौरान जीन पछाड़ना के लिए उन्हें का उपयोग करते समय के रूप में वे अलग morpholinos के बीच प्रभावी सांद्रता, भिन्न हो जाएगा संभावना है. इस अध्ययन में लक्षित जीन के लिए, हम 3.5 मिमी से कम मात्रा में उत्थान पर एक प्रभाव का पालन नहीं किया, और गैर विशिष्ट प्रभाव बेमेल में नहीं मनाया गया इस morpholino एकाग्रता के साथ नियंत्रित करता है.
Intraventricular इंजेक्शन प्रभावकारिता Penet द्वारा सीमित है जब वास्तविक समय में एक पूरे जानवर प्रणाली में गतिविधि और प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए छोटे अणुओं के वितरण के लिए अनुमति देता हैत्वचा या पाचन तंत्र के माध्यम से या उपलब्ध यौगिक की मात्रा द्वारा राशन. वे प्रत्यक्ष इंजेक्शन द्वारा लक्षित नहीं किया जा सकता जब finfold के लिए मामला है के रूप में यह भी ऊतकों के लक्ष्य की अनुमति देता है. इस विधि लार्वा चरणों में फिन उत्थान के दौरान जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है. Morpholino mesenchymal कोशिकाओं और एपिडर्मिस शामिल लार्वा finfold में एकीकृत के बाद से, यह भी घाव भरने या त्वचा कैंसर की घटना की प्रक्रिया में भूमिका निभाते हैं कि जीन की भूमिका की जांच के लिए एक उपयुक्त तकनीक प्रदान हो सकता है. एक साथ एंडो पोर्टर के साथ morpholino के इंजेक्शन भी सर्जरी और पारदर्शी वयस्क zebrafish लाइनों के लिए उत्तरदायी हैं जो उपलब्ध हैं वयस्क zebrafish में अंगों या ऊतकों, लक्षित करने के लिए लागू किया जा सकता है. इसके अलावा, इस विधि zebrafish तक सीमित नहीं है; intraventricular इंजेक्शन द्वारा फैलाव विशेष रूप से उन मॉडलों को अभी भी प्रभावी अप्रभावी जीन के तरीकों की कमी है, साथ ही अन्य कशेरुकी मॉडल पर इस्तेमाल किया जा सकता हैभी उत्थान के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण मॉडल हैं जो Xenopus, Axolotl और न्यूट, जैसे.
इस प्रकार, zebrafish में intraventricular इंजेक्शन अस्थायी कई ऊतकों लक्ष्य एक अपेक्षाकृत जल्दी प्रोटोकॉल के साथ जीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने की क्षमता प्रदान करता है, और इस विधि की चंचलता कार्यात्मक transgenesis या कमी है कि अन्य जीवों के लिए और साथ ही zebrafish ट्रांसजेनिक लाइनों के साथ इसके उपयोग के लिए अनुमति देता है जीन पीटा रणनीतियों.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
यह काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) द्वारा समर्थित किया गया था, हम तकनीकी समर्थन के लिए Ayele Tsedeke Taddese धन्यवाद देता हूँ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Morpholino with 3´fluorescein tag | Gene Tools Inc. | Customized | More information at www.gene-tools.com |
| Endo-Porter | Gene Tools Inc. | More information at www.gene-tools.com | |
| Agarose | Serva | 120623 | For pouring plates to place the fish during injections and imaging |
| Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate) | Applichem | For anesthesia | |
| E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSO4) | For larval husbandry | ||
| Petri Dishes | Sarstedt | 821.472 | For placing the fish during injections and imaging |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-3 | For preparing injection needles |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5,242,956,003 | For loading the needle |
| Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml) | Brand | 747760/ 74775 | For transfering larva |
| Flaming/Brown needle puller | Sutter | More information at www.sutter.com | |
| Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5) | World Precision Instruments, Inc. | 501985 | To brake the needle before sharpening |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | Part of the whole injection setup |
| Fluorescence camera | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | To image the fluorescence after injeciton |
| PicoNozzle kit (microinjector holder) | World Precision Instruments | 5430-12 | For microinjections |
| Pneumatic PicoPump (microinjector) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For microinjections |
References
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