Summary
Адаптируется обратная генетический метод для рыбок данио, чтобы оценить функции генов во время более поздних стадиях развития и физиологического гомеостаза, таких как регенерации тканей с использованием внутрижелудочковое инъекции гена конкретных Morpholinos.
Abstract
Данио является важной моделью для понимания клеточной и молекулярной биологии из органа и регенерации придаток. Однако молекулярные стратегии используют обратной генетики еще не были адекватно разработаны для оценки функции гена в регенерации или тканевого гомеостаза во время личиночной стадии после данио эмбриогенеза, и несколько тканей внутри данио личинки трудно цели. Внутрижелудочковые инъекции гена конкретных Morpholinos предложить альтернативный метод для текущего неспособности геномно генов-мишеней данио в временно контролируемым образом на этих этапах. Этот метод позволяет полностью дисперсии и последующей инкорпорации морфолино в различных тканях организма, в том числе структур, которые раньше были невозможно достичь таких, как в личиночной хвостового плавника, структуры часто используется для неинвазивного исследования регенерации тканей. Некоторые гены активированные во время личиночной регенерации finfold также изложет в регенерации тканей взрослых позвоночных, так что личинка является полезной моделью для понимания регенерации у взрослых. Этот метод морфолино дисперсии позволяет быстро и легкой идентификации генов, необходимых для регенерации тканей личинки, а также других физиологических феноменов, регулирующих тканевого гомеостаза после эмбриогенеза. Таким образом, этот способ доставки обеспечивает в настоящее время необходимо стратегию временного контроля к оценке функции гена после эмбриогенеза.
Introduction
Регенерация органов и придатков принципиально важно для выживания и фитнеса; однако, несколько позвоночные, включая человека имеют ограниченный регенеративные способности. В то время как несколько моделей животных существуют, которые имеют большой регенеративную способность, обратный генетические методы для оценки функции гена во органа и регенерации придаток остаются весьма ограничены или вообще отсутствуют. Поэтому необходимы новые подходы препарировать молекулярной биологии регенерации в этих модельных организмов.
Данио является хорошо известной моделью для понимания клеточной и молекулярной биологии органной и придаток регенерации 1, не только из-за его значительной способности регенерировать несколько органов, тканей и придатков, но и потому, что несколько трансгенные рыбы линии существуют, чтобы отслеживать клетки и для сверхэкспрессии гена конструкции 2, 3. Однако ингибирование генов в личиночной данио в основном ограничивается overexpression доминантных-отрицательных конструкций, которые не доступны для всех интересующих генов или чьи трансгенный продукт может приобрести усиления из-функции эффектов, которые не отражают эндогенный активность гена. Таким образом, альтернативный метод для удаления конкретно экспрессию гена нокаутом или нокдауна, чтобы преодолеть эти проблемы.
Джин конкретных таргетинга с помощью TALENS существует в качестве обратного генетических средств нокаутом функции гена; Однако, эта стратегия нокаут очень часто ограничивается функциональных оценок в ходе раннего эмбриогенеза, потому первоначальные требования гена предотвратить дальнейшее прогрессирование эмбрионального развития. Таким образом, изучение поздние явления, такие как регенерации или органа гомеостаза после разработки с использованием Talens исключается 4, 5. Таким образом, альтернативный стратегия удаление гена необходим, что цели функции гена после раннего развития для оценки потребностей генов в полностью сформированных органов и структур. Морфолино инъекции, как было показано, чтобы быть эффективным в ориентации генов в несколько органов взрослых и взрослых регенерации ребра 6-8, однако эти методы требуют электропорацию и многие внутренние органы трудно электропорации либо из-за их расположения или из-за их чувствительности к электрической нарушение. Кроме того, некоторые ткани в личинки трудно придать непосредственно, потому что прямой впрыск может нарушить их структурную целостность или потому, что их размер ограничивает. Хвостовой плавник личинки является одним из таких структура, потому что прямой впрыск в finfold невозможно. Таким образом, альтернативой электропорации и непосредственным впрыском было необходимо, чтобы гены-мишени в тканях, которые либо слишком малы, чтобы придать или не может быть электропорации.
В целях выявления и ингибировать функцию специфических генов при регенерации личиночной хвостового плавника, мы изменили существующие технологии морфолино позволяяssessment функции генов в процессе хвостового плавника регенерации в конце-поставил личинки. Этот метод использует внутрижелудочковую доставку 9 флуоресцеина с метками Morpholinos вместе с Эндо-Портера трансфекции реагента 10. После того, как в желудочке, смесь морфолино-Эндо-Porter быстро распространяется по всей личинки через сосудистую и входит тканей, которые были ранее невозможно цели. Этот метод инъекции может быть изменен, чтобы генов-мишеней в конкретных тканях и, вполне возможно, могут быть применены в других моделях на животных, которые в настоящее время отсутствуют обратные генетические методы, чтобы ингибировать функцию гена. Таким образом, он предлагает быстрый и простой способ с потенциалом для широкого использования диапазона немедленно изучения функции генов во время общей гомеостаза органов и регенерации в личиночной стадии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка стекла иглы (рис. 1)
- Используйте стеклянные капилляры диаметром 0,75 мм для подготовки инъекционных игл (рис. 1а).
- Поместите стеклянный капилляр в иглы съемник и вытащить иглу со следующим параметром: значение цикла нагрева: 463; потянув значение цикла: 230; скорость: 150 мс; время: 150 мс (рис. 1В).
- Перерыв вытащил стеклянный капилляр с часовщик пинцетом для получения диаметр иглы 20 мкм под стереоскоп с микрометрическим окуляром.
- Используйте станок с увлажненной резины прялкой точить иглу и производят 20 мкм скос (рис. 1В и 1Г). Примечание: Sharp, скошенные иглы улучшить простоту вставки в желудочке и таким образом свести к минимуму повреждение ткани и позволяют перфорированный мышцы запечатать после удаления иглы (рис. 1E-G).
2. Подгоной работы решения морфолино
- Подготовьте морфолино запас растворением лиофилизированного морфолино в 1х забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) до конечной концентрации 7,5 мМ. [См. инструкции производителя для деталей (материалы таблицу)].
- Приготовьте раствор для инъекций морфолино путем смешивания 2,5 мкл морфолино маточного раствора (7,5 мм) с 2,8 мкл Эндо-Портера исходного раствора (1 мм) (см. таблицу материалы) для конечной концентрации 3,5 мМ морфолино и 0,5 мМ Эндо-Porter.
3. Подготовка инъекций морфолино (рис. 2)
- Загрузите скошенной стеклянной иглу с 5 мкл этого раствора с помощью микропипетки с 10 мкл microloader кончика пипетки с.
- Вставьте стеклянную иглу в иглодержатель в микроманипулятором, подключенного к пневматическому пико насоса (фиг.2А-С).
- Поместите держатель иглы рядом с микроскопом так, чтобы игла только потребностидля перемещения в одном плоском направлении, чтобы вставить его в желудочек сердца личинки (рис. 2А).
- Отрегулируйте угол для инъекций на отметке 45 °.
- Установите значения microinjector следующим образом: держать давление: 20 фунтов на квадратный дюйм (пси); давление выброса: 15 фунтов на квадратный дюйм; 100 мс диапазон стробирования, период значение 1,9 (соответствует 10,9 мс).
- Расплава агарозы в 1х PBS с использованием стандартного микроволновую печь, чтобы произвести 20 мл 1,5% (вес / объем) геле. Налейте расплавленный гель в блюдо 10 см Петри. Наведите рифленую форму впрыска в теплую агарозы, чтобы после затвердевания агарозы будет борозды, в которых в отключке личинка будут размещены 11 (рис. 2D и 2E).
4. Инъекции (рис. 3)
- Обезболить личинку в 100 мл аквариумной воды с 20 мг / л Tricaine (L-этил-м-амино-бензоат-метансульфоната), пока они не перестают отвечать на ощупь.
- С помощью пластиковой Пастера pipettе тщательно передавать седативные личинку в паз мокрой агарозном пресс-формы таким образом, что брюшная сторона обращена к вертикальной агарозном стенки канавки (фиг.3А).
- Поместите агарозном пластину под стереомикроскопа таким образом, чтобы желудочек, обращенной от инъекционной иглы (фиг.3А).
- Опустите иглу, чтобы вставить его в желудочка сердца. Вставьте иглу только 1-2 мкм в желудочке, стараясь не вставить иглу слишком глубоко (рис. 3В и 3С).
- После того, как игла вводится, впрыснуть морфолиновое решение в желудочек с 4-6 импульсов, каждый доставки 3 нл раствора, с ожиданием интервалы, чтобы расчистку сердца (Цифры 3D и 3E).
- После инъекции удалить иглу (параллельно плоскости вставки), а затем тщательно передачи личинку с использованием пипетки Пастера пластик, заполненный E3 среднего бактерийК в чашку Петри, содержащую свежий E3 среду.
- Поместите иглу в чашку Петри, содержащую 1X PBS, чтобы предотвратить высыхание иглы при передаче введенного личинки.
- Повторите шаги 4.1-4.6 каждый 12-24 час в течение всего срока эксперимента. Примечание: Повторяя инъекции обеспечивает поглощение и поддержание морфолино в клетках.
5. Анализ инъекций (рис. 4)
- Обезболить рыбу в 100 мл аквариумной воды с 20 мг / л Tricaine, пока они не перестают отвечать на ощупь.
- Поместите личинку в поперечном направлении на плоской влажной 1,5% (вес / объем) агарозном пластина покрыта E3 среды.
- Личинки изображения с использованием стереомикроскопа с светлого и флуоресцентных изображений. Примечание: Как личинки прозрачны, флуоресцеина с метками морфолино должны быть видны как флуоресцентный зеленый в кровеносных сосудах в течение всего животного непосредственно после инъекции. Это флуоресценции будет дальше разогнать в васкуляризированных тканей15 мин (фиг.4А-4С).
6. Оценка регенеративной вырост
- Оценить отснятые изображения с помощью Фиджи изображения J бесплатное программное обеспечение (http://fiji.sc/Fiji). Для исследования регенерации, используйте инструмент строки-трассировку, чтобы определить количество восстановительного роста, который произошел на контроле и морфолинозамещенной вводят личинки.
- Для калибровки изображения, открыть один из оригинальных файлов изображений в Фиджи, перетаскивая файл в главное окно Фиджи.
- Чтобы установить масштаб для всех следующих изображений, перейдите в раздел "Анализ" в главном меню.
- В выпадающем меню выберите "Установить масштабе".
- В этом окне включите опцию "Глобал", нажав на флажок.
- Теперь откройте изображение, чтобы измерить количество восстановительного роста снова путем перетаскивания (см. шаг 6.1).
- Выберите "от руки Выборки" инструмент на панели инструментов.
- Окружите область, которая будет измеренное (FiГюреш 4J-4L).
- Нажмите Ctrl + М. Это откроет новое окно «Результаты», показывающий значение окруженной области в квадратных пикселей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Резкое, скошенные инъекционной иглы легко размещены в желудочек сердца данио личинки при приближении дорсально (фиг.3А). Сердце продолжает накачки и кровоток поддерживается, несмотря на присутствие иглы (фиг. 3В и 3С). Тщательные инъекции не нарушают морфологию желудочка или сердечных сокращений (рис. 3D), несмотря на инъекции морфолино в сердце (рис. 3Е).
В течение нескольких минут, решение морфолино-Эндо-Портер распределяет по всему телу через сосудистую (4A и 4В). Морфолино затем распределяется из сосудистой сети в различных тканях, таких как finfold и головного мозга, по крайней мере 12 ч или более, как наблюдается с флуоресценции (фиг.4С).
При таком подходе, мы удаляем дистальный конец гое finfold, дистальный кончик спинного мозга, дистальной ствола мышц, дистальный хорды и пигментных клеток (фиг. 4D и 4H); все из которых трудно непосредственно для прямого впрыска из-за компактности (мышцы), малый размер (спинного мозга и хорда) и тонкость (finfold), но по-видимому, включать морфолино после последовательных инъекций желудочковых, что видно по флуоресценции в них ткани (рис. 4E) по сравнению с неинъецированных животных (Цифры 4F и 4G). Таким образом, этот метод относительно легко способствует доставку морфолино тканей, которые трудно индивидуально цели, и он позволяет оценить функции генов в различных ткан х в регенерирующей плавника сразу. Чтобы оценить важность конкретных генов, участвующих в регенерации, один хирургическим частично ампутирует личиночной хвостовой плавник (Рисунок 4H), резекции все ткани, которые имеют Incorp ораторствовал морфолинового (рис. 4I). Личиночная finfold восстанавливает свою структуру в течение нескольких дней после ампутации (ДПА) (рис. 4J). Морфолино таргетинг ген необходим для регенерации (неопубликованные данные) приводит к возмущенной реакции регенерации (рис. 4K) по сравнению с неинъецированных (рис. 4J) и несоответствие управления морфолиновые (рис. 4L). Суммарный эффект этих морфолино экспериментов по регенеративной нароста можно измерить с помощью стандартных средств морфометрические в публично доступных программ Фиджи 12 путем отслеживания регенерированных ткани и сравнивая площади (данные 4J-4L). Таким образом, этот метод ген-таргетинга обеспечивает быстрый и относительно легкий анализ, чтобы проверить важность генов в процессе регенерации.
5fig1highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок 1. Подготовка стекло капиллярных игл для инъекций. А) Стекло капиллярная трубка перед вытягивать (выше) и вытащил иглу (см. ниже). Б) Игла аппарат тянет. C) Токарный станок для снятия фаски и заточка стеклянную иглу. Игла рассматривается в бинокль. D) станок является увлажненная резины вращающегося диска. Игла медленно опускают на диске. E) Заостренный игла должна иметь короткую скос, который больше не является (20 мкм), чем в ширину (20 мкм), чтобы минимизировать пространство, необходимое для вставки весь конец иглы в личиночной сердечной желудочек. F) Более высокое увеличение изображение, показывающее кончик иглы. G) Схематическое изображение кончика иглы, показывая форму скоса после заточки.
s/ftp_upload/51595/51595fig2highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Устройство впрыска Рисунок 2. Настроить.) Полный аппарат для инъекции морфолино в данио личинки. Б) Стенд для контроля размещение иглы во время инъекции. C) пико насосов, который регулирует давление воздуха для инъекций. D) Форма пресс используется создать агарозном плесени. Е) Агароза формы используются для стабилизации личинку для инъекций.
Рисунок 3. Инъекция рыбы личинки. А) Размещение иглы по отношению к данио личинки. B) Установка в желудочек сердца. С) флуоресценции морфолино в игле, но отсутствует в желудочке до Injectiна. D) Светлое изображение показывает размер отношения между стеклянной иглы и личиночной желудочка. Е) инъекции флуоресцентного морфолино в желудочка сердца. Масштабные бары равняться 100 мкм.
Рисунок 4. Дисперсия морфолино всей рыбы. A) данио рерио 3 день старый личинка. B) флуоресценции флуоресцеина с метками морфолино по всей сосудистой тела (V) 5 мин после инъекции желудочка. С) дисперсии морфолино во всем животным, включая finfold (FF), мозг (б) в более старых личинка после инъекций морфолино каждые 12 ч D) тканей в личиночной хвостового плавника и туловища:.. хорда (п), спинного мозга (подкожно), пигмента (р), и finfold (и далее) Е) Рассеянный морфолиночерез несколько минут после инъекции в личиночной магистральных тканях, включая finfold. F) Светлое изображение неинъецированных личиночной туловища и хвостового плавника. Пунктирная линия указывает на потенциальный ампутация самолет. G) неинъецированных плавник изображенную с GFP фильтр показывая аутофлюоресценция зеленым (наконечники стрел). Дендритных форма флуоресцирующих структур предполагает, что это пигментные клетки. Н) Светлое изображение хирургическим ампутированной личиночной хвостового плавника через хорды, мышц и спинного мозга. Я) Люминесцентная изображение, показывающее распределение морфолиновое в пне тканей. Морфолино включение в мышцы, спинной мозг, хорда и finfold. J) Регенерированная каудальные finfold структуры дикого типа личинки. Черная линия прослеживает регенерированных тканей для анализа количественного. K) Морфолино опосредованного ингибирования регенерации. Трассировка Черная линия четко подчеркивает снижение регенерации повторноОтклик после морфолино нокдаун. L) Регенерированный хвостовой finfold личинки вводят с контрольной несоответствие морфолино, показывающий подобную реакцию регенерации, как в неинъецированных личинки (J). Масштабные бары равняться 100 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Внутрижелудочковое впрыска обеспечивает быстрый и надежный метод оценки для тестирования функции гена на более поздних стадиях развития или боди гомеостаза, не влияя на функцию гена во время эмбриогенеза. Для обеспечения успеха этого метода, следует иметь в виду из четырех критических точек: 1) размер иглы, 2) сушки из иглы, 3) минимизация объема, и 4) время минимальная выдержка в седации решения. Иглы, которые слишком малы будет забивать часто, в то время как иглы, которые слишком велики повредит желудочек и вызвать чрезмерное кровотечение. В то время как 20 мкм рекомендуется, игла никогда не должно быть больше, чем одна пятая размер камеры желудочка. Вторая критическая точка является сохранение иглу от высыхания и засорения. Небольшой размер иглы и неизбежных частых пауз в степенный, передачи и положение личинки могут предоставить достаточно времени, чтобы позволить морфолино на кончике иглы, чтобы иссякнуть и засорить иглу. Для предотвращенияэто, можно погружать иглу в чашке Петри в 1x PBS. Третий критическая точка является сведение к минимуму вздутие живота желудочка по слишком высокой громкости. Если доза ограничена размером иглы, то увеличение количества инъекций всегда предпочтительнее увеличение объема: большие объемы может привести к травмам растяжения к сердцу. Четвертый критическая точка является степень седации. Время седативный основана на продолжительности времени, необходимого для процедуры. Личинки могут оставаться в седации решения и остаются в отключке в течение нескольких минут, потому что они довольно прочные и реанимировать довольно легко. Однако поддержание рыбу слишком долго в анестезии может привести к его восстановление или слишком короткий заставит их возродить во время инъекции. Таким образом, следует успокоить только количество личинок, что можно придать в течение 4 мин.
Одним из ограничений этого текущего метода является то, что морфолино ориентирована не на функции генов в ткани-Специфическим образом. Два разных модификаций может обеспечить тканеспецифичность: Одна из модификаций заключается в использовании в обойме Morpholinos. После активации лазерным светом с конфокальной микроскопии, эти морфолины препятствовать их целевого гена, поэтому своевременное воздействие конфокальной может обеспечить временную и пространственную управление морфолиногруппой деятельности. Caged морфолины были использованы для генов-мишеней во время раннего развития после инъекции в одно-клеточного эмбриона. В то время как доставка на стадии одноклеточных может работать в генов-мишеней в процессе эмбриогенеза, концентрация морфолино, вероятно, будет слишком низкой на более поздних личиночных стадий из-за количества последовательных клеточных делений как развитие прогрессирует до личиночной стадии 13. Количество морфолино можно вводить в один-клеточной стадии также ограничено токсичностью 13-15. Второй возможной модификацией является непосредственно вводить морфолино в органе или ткани должны быть изучены, когда размер и визуализации позволяют. Данио личинка является прозрачным, поэтому просмотр мест внутренних органов после того как они были разработаны не должно быть проблемой. Флуоресцеина с метками морфолины работать с этим протоколом; Поэтому флуоресценции может быть использована для отслеживания распределение и локализацию тканеспецифической от морфолино. Включение флуоресцеина с метками морфолино в клетки ткани требует присутствия реагента Эндо-Портера, так другой модификации бы ограничить пространственное распределение реагента Эндо-Портера путем введения его в меньших количествах непосредственно в ткани-мишени. Таким образом, пространственное разрешение должно быть возможным с этой техникой.
Есть трансгенные методы избыточная экспрессия, которые обеспечивают временную и пространственную контроль экспрессии экзогенного гена путем объединения тканеспецифические промоутеров с теплового шока или тамоксифен индуцируемых промоторов, которая позволяет анализ функции генов на более поздних стадиях развития или в некоторых тканях с помощью ткани специфические промоторы 16-19. Это включает в себя transgeNIC выражение доминирующим-отрицательных конструкций, предназначенных для создания продукта, который может вытеснять эндогенного гена. Это нокдаун стратегия подвержена вне целевых эффектов, когда трансген производит непропорционально уровни экспрессии трансгенного продукта, который приобретает усиления из-функции эффектов 20 или когда он интегрируется в геном и нарушает эндогенный функцию гена 21, 22. В то время как морфолины также может генерировать от ворот эффекты, можно более легко контролировать и ограничивать эти эффекты с помощью несоответствия Morpholinos управления с аналогичными, но немного измененных последовательностей-мишеней, которые не связывают целевой мРНК, с помощью нескольких антисмысловых Morpholinos, которые предназначаются для различных последовательностей внутри же мРНК и путем тестирования различных концентраций Морфолино 13-15. Кроме того, морфолины могут быть произведены и испытаны намного быстрее и дешевле, чем разработка, поднимая и тестирования различных доминирующих-отрицательных трансгенных линий. Таким образом, вtraventricular инъекция Morpholinos является полезным инструментом, чтобы нокдаун гены на более поздних стадиях развития, когда доминантно-негативный трансгенез невозможно. Когда доминантно-негативный трансгенных стратегия возможна, внутрижелудочковое впрыска морфолино альтернативный подход для подтверждения специфичности суперэкспрессированный доминантно-негативного трансгена.
Вполне вероятно, что эффективные концентрации между различными Morpholinos будет изменяться, как это происходит при их использовании для генной нокдаун в процессе эмбриогенеза 13, 15. Для гена целевой в этом исследовании, мы не наблюдали влияние на регенерацию в дозах более низких, чем 3,5 мм, и неспецифические эффекты не наблюдались в несоответствии контролирует с этой концентрации морфолиногруппой.
Внутрижелудочковая впрыска обеспечивает распределение малых молекул, чтобы оценить активность и эффективность в целой системы животного в режиме реального времени, когда эффективность ограничена Penetнормировать через кожу или пищеварительной системы или на суммы соединения имеющихся. Это также позволяет направленные против тканей, когда они не могут быть направлены на прямых инъекций, как это имеет место для finfold. Этот метод не только служить инструментом для изучения функции генов в ходе плавника регенерации в личиночной стадии. Поскольку морфолино интегрируется в личиночной finfold состоящий мезенхимальные клетки и эпидермис, это также может обеспечить подходящую технику, чтобы исследовать роль генов, которые играют роль в процессе заживления ран или возникновения рака кожи. Инъекция морфолино вместе с Эндо-Porter может также применяться органов-мишеней или тканей в взрослых данио, которые поддаются хирургии и полупрозрачных линий взрослых данио которые доступны. Кроме того, этот способ не ограничивается данио; Дисперсия по внутрижелудочкового введения могут быть использованы на других позвоночных моделей, а, особенно те модели, которые до сих пор отсутствуют эффективные методы рецессивный гентаких как Xenopus, Axolotl и тритона, которые являются также важными моделями для исследований регенерации.
Таким образом, внутрижелудочковое инъекции у рыбок данио предоставляет возможность временно контролировать экспрессию генов с относительно быстрой протокола целевой несколько тканей, а также универсальность этого метода позволяет использовать его с данио трансгенных линий, а также для других организмов, которые не имеют функциональную трансгенеза или ген нокаут стратегии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), мы хотели бы поблагодарить Айеле Tsedeke Taddese за технической поддержкой.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Morpholino with 3´fluorescein tag | Gene Tools Inc. | Customized | More information at www.gene-tools.com |
| Endo-Porter | Gene Tools Inc. | More information at www.gene-tools.com | |
| Agarose | Serva | 120623 | For pouring plates to place the fish during injections and imaging |
| Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate) | Applichem | For anesthesia | |
| E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSO4) | For larval husbandry | ||
| Petri Dishes | Sarstedt | 821.472 | For placing the fish during injections and imaging |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-3 | For preparing injection needles |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5,242,956,003 | For loading the needle |
| Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml) | Brand | 747760/ 74775 | For transfering larva |
| Flaming/Brown needle puller | Sutter | More information at www.sutter.com | |
| Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5) | World Precision Instruments, Inc. | 501985 | To brake the needle before sharpening |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | Part of the whole injection setup |
| Fluorescence camera | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | To image the fluorescence after injeciton |
| PicoNozzle kit (microinjector holder) | World Precision Instruments | 5430-12 | For microinjections |
| Pneumatic PicoPump (microinjector) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For microinjections |
References
- Gemberlin, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6, 2011 (1998).
- Skromne, I., Prince, V. E. Current perspectives in zebrafish reverse genetics: moving forward. Developmental Dynamics. 237, 861-882 (2008).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Protocols. 10, 329-332 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491, 114-118 (2012).
- Kizil, C., IItzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. , (2013).
- Hyde, D., Godwin, A., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. , (2012).
- Thummel, R., Bailey, T., Hyde, D. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. , (2011).
- Rieger, S., Kulkarni, R. P., Darcy, D., Fraser, S. E., Köster, R. W. Quantum dots are powerful multipurose vital labeling agents in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 234, 670-681 (2005).
- Madhavan, M., et al. The role of Pax-6 in lens regeneration. Proceedings of the National Academy of Science U. 103, 14848-14853 (2006).
- Gilmour, D. T., Jessen, J. R., Lin, S. Zebrafish: a practical approach. 261, University Press. Oxford. 121-143 (2000).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense. Development. 135, 1735-1743 (2008).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Hyatt, T. M., Ekker, S. C. Vectors and techniques for ectopic gene expression in zebrafish. Methods Cell Biol. 59, 117-126 (1999).
- Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. Temporally controlled site-specific recombination in zebrafish. PLoS One. 4, (2009).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Liu, S., D, L. S. Zebrafish models for cancer. Annu. Re. Pathol. Mech. Dis. 6, 71-93 (2011).
- Stoick-Cooper, C. L., et al. Distinct Wnt signaling pathways have opposing roles in appendage regeneration. Development. 134, 479-489 (2007).
- Shen, S. P., Aleksic, J., Russell, S. Identifying targets of the Sox domain proteins Dichaete in the Drosophila CNS via targeted expression of dominant negative proteins. BMC Dev. Biol. 13, (2013).
- McNeish, J. D., Scott, W. J., Potter Jr, S. S. Legless, a novel mutation found in PHT1-1 transgenic mice. Science. 241, 837-839 (1988).
- Covarrubias, L., Nishida, Y., Terao, M., D'Eustachio, P., Mintz, B. Cellular DNA rearrangements and early developmental arrest caused by DNA insertion in transgenic mouse embryos. Mol. Cell. Biol. 7, 2243-2247 (1987).
